Name: 3LIFE의 분석을 사용하여 높은 처리량 miRNA의 표적의 탐지 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: 학습하세요 3'LIFE 기법을 사용하여 miRNA 표적을 고효율로 탐지하는 방법을. HEK293 세포와 듀얼 루시퍼라제 분석을 활용하여 수백 개의 3'UTR 라이브러리에서 번역 억제를 측정하고 유전자 조절 네트워크를 규명합니다.

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조언과 토론을 해주신 Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer에게 감사드립니다. Karen Anderson, John Chaput, Josh LaBaer는 시약 및 기기 공유를, Michael Gaskin과 Andrea Throop은 기술 자문 및 프로토콜을 제공했습니다. 저스틴 월터(Justin Wolter)는 마허 장학생이며 마허 가족의 관대한 지원에 감사를 표합니다.

<html> 1. 세포 배양 (24 ~ 48 시간 형질 전환 이전) <ol><li> 종래 형질 전환 종자에 24-48 시간은 96 웰 플레이트의 수에 기초 HEK293T 세포, 충분한 양의 형질 감염된다. 참고 : 일관성있는 형질의 경우, 충분한 밀도 판 세포는 빠르게 분열을 선호하는, 아직 형질의 번에 두 개 이상의 70-90%의 포화 상태에있을 수 없습니다. </li><li> 각 96 웰 플레이트 (저장 및 멀티 채널 피펫의 사용을 설명하기 위해 잘 당 75,000 세포 및 플레이트 당 120 우물) 9 × 10 6 세포를 필요로한다. HEK293 세포 (일반적으로 ~ 20 시간)의 배가 시간을 계산하고, 세포의 적절한 수는 트랜시 적어도 9 × 106 세포를 수득 시드. 새로운 플레이트를 다시 시드 나머지 세포 ~ 10 %, ~ 90 % 컨 플루 언시로 성장 145mm 원형 배양 플레이트는 통상적으로 3 96- 웰 형질에 충분하다. </li></ol> 형질 2. 준비 이전 _content &quot;&gt; 참고 :이 시약의 준비 시간이 소요될 수 있기 때문에 단계 2.0-2.2의 버퍼와 플라스미드 DNA의 준비는 이전에 형질 전환에 일을 수행해야한다. <ol><li> 3&#39;LIFE 분석과 호환되는 인간의 3&#39;UTR 클론 공개 플라스미드 저장소 (30)를 통해 사용할 수 있습니다. 수동 또는 액체 핸들링 로봇 DNA 플라스미드를 정제. 형질 등급 알칼리 용해 미니 준비 96 웰 키트를 사용하고 제조업체의 지침을 따릅니다. 잘에 ~ 100 NG / μL 당 정제 된 벡터를 재현 탁. 참고 : 플라스미드 농도가 아래 40 NG / μL를 떨어지면 부족 루시 페라 제 신호가 발생합니다. </li><li> pLIFE-miRNA의 그림 1B (24)의 파이프 라인을 사용하여 30 또는 복제를 벡터 얻습니다. 각각의 miRNA와 빈 제어 플라스미드 500 NG / μL의 농도로 재현 탁 벡터. </li><li> nucleofection 버퍼 조건의 민감성으로 인해, 다음을 확인(세포 플라스미드를 포함) 형질 물질의 총 부피는 96 웰 형질 플레이트의 각 웰에 전체 액체의 10 %를 초과하지 않는다. 이를 달성하기 위해, 적어도 500 NG / μL의 농도로 pLIFE-miRNA의 플라스미드 스톡을 농축시킨다. </li><li> 배 반딧불이 루시퍼 라제 시약 완충액 (표 1), 및 최대 6 개월 동안 저장 될 수 1X 레 닐라 루시퍼 라제 시약 완충액 (표 2)를 준비한다. 참고 : 반딧불 루시 페라 제 버퍼에 DTT는 단일 사용 씩 -20 ℃로 솔루션에 저장 될해야합니다. </li></ol> 3. 형질 직전에 다음 항목을 준비합니다 <ol><li> PBS를 포함하는 형질 전환 버퍼, 1.5 % HEPES, pH가 7.0을 준비합니다. 이 형질 전환 효율이 눈에 띄게 감소없이 4 ° C에서 최대 1 달 동안 저장 될 수 있지만,이 신선한 준비합니다. 버퍼와 플라스미드 DNA 볼륨을 공식화에서, SU 각 96 웰 플레이트 (120) 반응을 가정fficiently 피펫 및 액체 저수지 및 멀티 채널 피펫을 사용하여 손실 된 볼륨의 오류를 차지한다. 나누어지는 잘 형질 버퍼 당 18 μL (/ 96 웰 플레이트 (120) 우물 = 플레이트 당 2.16 ㎖), 따로 설정합니다. 주 : 세포 - 전기 장치가 세포를 형질하는 데 사용되는 버퍼 조건에 매우 민감하다. 준비 버퍼가 장비의 일관된 성능을 보장 정확도. 구체적으로는 그 버퍼가 마이크로 원심 튜브, 96 웰 플레이트, 저수지와 전극 판에 폭로 방치 시간을 최소화함으로써, 버퍼의 증발을 방지하기 위해 분석을 수행 할 때 여분의주의를 기울여야한다. </li><li> 예약 다음과 같은 컨트롤을위한 네 개의 우물, 아니 pLIFE-3&#39;UTR (루시 페라 제 분석의 배경을 측정하기), pLIFE-SV40 3&#39;UTR (음의 목표 제어), miRNA의 # 1에 대한 긍정적 인 제어, miRNA의 번호에 대한 양성 대조군 2. 참고 :이 벡터는 30 공개적으로 사용할 수 있습니다. 또한, 이전에 검증 대상양성 대조군으로 사용할 수있다. </li><li> 따뜻한 미디어, 37 ° C의 트립신 (0.25 %). </li><li> DMEM은 10 % FBS, 1 % 펜 / 스트렙토 보충 된 96 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 200 μL를 추가 한 다음 형질 사용할 37 ° C의 배양기에 두었다. </li><li> 지원 소프트웨어 다음 모든 세포의 전기 장치의 전원을 켭니다. HEK293T 세포와 PBS / HEPES 완충 용 펄스 코드 FF120를 사용합니다. </li></ol> 플라스미드 DNA와 세포 혼합물 4. ​​준비 참고 : 다음 프로토콜은 두 가지의 miRNAs (miRNA- # 1 miRNA- # 2)가 화면에 대해 하나의 실험에서 세 96 웰 플레이트를 형질 가정합니다. 각 플레이트는 pLIFE-3&#39;UTR 플라스미드 동일한 96- 웰 플레이트에 대응되며, pLIFE-miRNA의 공백 pLIFE-miRNA- # 1 또는 pLIFE-miRNA- # 2로 3 회 처리한다. <ol><li> 각각의 miRNA에 대한 pLIFE-miRNA의 + 형질 버퍼의 3 주식을 준비합니다. 이 주식은 각각의 전체 부피의 50 % (10 μL)를 차지한다물론, 120 우물을 곱한. 따라서, 각각의 주가는 1.08 ml의 버퍼 + 120 μL 플라스미드 DNA (pLIFE-miRNA의)를 포함해야합니다. </li><li> 미디어를 용출 PBS로 부드럽게 세척하고, 37 ℃에서 5 분 ~ 5 ml의 0.25 % 트립신으로 처리하여 145mm 배양 접시에서 세포를 제거합니다. 5 분 동안 300 XG에 동일한 미디어 부피, 펠렛 세포를 트립신 중화. </li><li> 5 ~ 10 ml의 미디어 (셀 밀도와 세포 카운터의 정확한 범위에 따라) ~에 트립신 / 미디어, 그리고에 resuspend 펠렛을 제거합니다. </li><li> 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트. 95 % 가능한 기계의 정확한 범위 내에서&gt; 세포가 있는지 확인합니다. 참고 : 부정확 한 세포 수는 매우 높은 세포 농도 (&gt; 6.0 배 (10) 6 / ㎖)에서 발생할 수 있습니다. 세포의 비율 및 / 또는 형질 전환 효율을 감소 : 형질 너무 많은 세포 플라스미드를 대폭 줄임으로써 타겟팅 된 miRNA의 효율을 감소시킬 수있다. </li><li> 세 나누어 각 튜브 함유 9 × 106 세포, 세포 r에 대응한 96 웰 플레이트의 형질 전환을위한 equired. 3 분 동안 300 XG에 세포를 스핀. </li><li> 용지를 제거합니다. 초과 용지는 형질 전환 효율에 영향을 미칠 수있는 펠릿의 최소한의 방해와 가능한 한 많은 매체를 제거해야합니다. </li><li> 1.2 ml의 형질 전환 버퍼 / miRNA의 플라스미드 혼합물, 따로 설정에 재현 탁 세포. </li><li> 다음은 형질 버퍼에 pLIFE-3&#39;UTR 플라스미드의 세부 부유 단계를 반복합니다. 이 96 웰 플레이트에서 발생하는 것처럼, 항상 판을 덮어 버퍼의 증발을 방지하기 위해주의를 기울입니다. <ol><li> 멀티 채널 피펫을 사용하여 96 웰 PCR 플레이트의 각 웰에 형질 버퍼 μL 32.4 이동 ([형질 전환 당] 9 μl를 * 3 판] * 1.2 [피펫 오류를 설명합니다). </li><li> 각 웰에 3.6 μL 미니 수험 공부를 pLIFE-3&#39;UTR 플라스미드 (~ 100 NG / μL)를 추가하고 철저하게 섞는다. </li><li> 피펫 96- 웰 플레이트와 형질 커버의 각 웰에이 혼합물을 10 μL. </li></ol></li></ol><ol><li> 저수지에 첫 번째 셀 / 버퍼 / pLIFE-miRNA의 플라스미드 혼합물의 1.2 mL로 이동합니다. 잘 섞는다. </li><li> 이미 10 μL 형질 버퍼 / pLIFE-3&#39;UTR을 포함하는 제 96 웰 접시에 트랜 스펙 션 혼합물의 10 μL를 추가한다. 최대 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 잘 섞는다. 참고 : 버퍼에있는 세포의 평등 서스펜션도 확인하고 큐벳을 통해 전류의 철저한 통로 형질 전환 효율을 극대화합니다. </li><li> 셀 전기 천공 장치에서 96- 웰 플레이트 형질 놓고 형질을 개시. </li><li> 형질 전환이 완료되면, 96 웰 형질 플레이트의 각 웰에 96 웰 배양 플레이트에서 예열 매체의 100 μl를 넣고 잘 섞는다. 96 웰 배양 플레이트에 각 우물에서 100 μl를 이동합니다. </li><li> 세포는 w의 양측에 응집하는 경향이있는 바와 같이, 웰의 중앙에 수직으로 위치 된 피펫 배양 접시에 세포를 섞는다엘 적절하게 혼합되지 않는. </li><li> 나머지 두 판에 대한 5.1-5.5를 반복합니다. </li><li> 청소 96- 웰 플레이트 형질 <ol><li> 96- 웰 플레이트를 형질 전환 실험 간의 핵산 위에 캐리 없도록 70 % EtOH로 세척하여 재활용 할 수있다. 완전히 전극 부재에 과량의 EtOH를 닦고 (하부 측)와 배양 후드에서 완전히 건조시킨 형질 전환 플레이트를 허용함으로써 각 웰을 채우기 위해 분 무병을 사용하여 두 개의 70 % EtOH로 세척을 수행한다. 참고 : 우리가 더 플라스미드 DNA와 70 % EtOH로 하나의 세척, 및 제 형질 다음, HEK293T 세포로 각각의 플라스미드 pmaxGFP 2 μg의와 12 우물을 형질로 이월 DNA 오염에 대한 테스트했습니다. 이 극히 높은 플라스미드 농도, 매우 밝은 리포터 및 단일 워시, 복제 형질 12 중 어느 하나의 관측 형광이 없었다. </li></ol></li><li> 이중 lucif 다음 37 ℃에서 48 ~ 72 시간 동안 배양 세포,분석을 지 웁니다. </li></ol> 6. 세포 루시 페라 제 분석을위한 해물 준비 <ol><li> 4 부 물, 저수지 패시브 용해 완충액 1 배 부분 용해 완충액을 희석. 26 μL가 / 잘 ~ 20 여분의 볼륨을 추가하는 저수지의 손실을 고려하여 계산한다. 주 : -20 ºC 버퍼에 저장되며, 피펫의 정확도를 향상시킬 실온 접근하는 배 버퍼를 허용하는 종래 따라서, 매우 점성 일 수있다. </li><li> 형광 현미경을 사용하여 트랜 스펙 션 효율을 각 웰을 분석한다. 효율적으로 형질하지 않은 우물에 불일치 (&gt; 90 %의 형질 전환 효율을) 참고 또는 혼잡 또는 미디어 고갈을 나타내는 RFP의 낮은 수준을 표현하고 있습니다. 분석에서이 우물을 제거합니다. </li><li> 완전 세포 분리의 원인이되는 너무 빨리 용출 않도록 조심하면서 세포에서 용지를 제거합니다. 참고 : 남은 용지가 experime에서 값에 해물과 원인 변동을 희석한다국세청. </li><li> 20 ~ 30 분 ~에 대한 낮은 / 중간 속도로 판 쉐이커 / 로커에 각 웰, 장소에 용해 버퍼의 26 μl를 추가합니다. , 루시 페라 제 버퍼를 준비 루미 (들)을 씻어 총리, 불투명 측정 판에 해물을 전송하려면이 시간을 사용합니다. </li></ol> 7. 듀얼 루시 페라 제 분석 참고 : 여러 개의 판이 한 루미에 순차적으로 측정되는 경우, 즉시 각 판을 사용하기 전에 pH를 조절 한 다음이 시약을 추가, ATP와 기판을 제외한 모든 것을 버퍼 마스터 믹스를 만들 수 있습니다. ATP 및 기질은 시간이 지남에 따라 저하 될 수있다; 이들 시약은 상기 버퍼에있는 시간의 양에 일관성이 여러 플레이트의 일관성을 개선한다. <ol><li> 루시퍼 1X 버퍼 준비 (표 1) : <ol><li> 기판 민감한 빛을 수있는 바와 같이, 알루미늄 호일로 개똥 벌레와 레 닐라 버퍼를 포함하는 두 개의 튜브 (일반적으로 50분의 15 ml의 원심 분리기 튜브)를 감싸. </li><li>1X 반딧불 루시 페라 제 버퍼를 준비합니다. 최종 1 배 농도로 5 ML의 H 2 0, EGTA 마지막으로 추가, 각각의 다섯 배 반딧불 루시 페라 제 시약의 1 ML을 추가합니다. <ol><li> 반딧불 버퍼 1X 10 ml의 0.025 g의 ATP를 추가합니다. 수회 반전 섞는다. 항상 얼음에 ATP를 유지합니다. ATP이 저하되므로, 하나 이상의 플레이트를 순차적으로 측정하는 경우, 버퍼는 각 추가 플레이트에 대해이 단계에서 새로운 시작을해야합니다. </li><li> 버퍼의 pH를 기반으로 노란 색으로 변경해야합니다 (100) 딱정벌레 루시페린 (기판) (표 1)의 100 μl를 추가합니다. </li></ol></li><li> 1X 레 닐라 루시퍼 버퍼 재구성 : 96 웰 플레이트, 나누어지는 1 10 ㎖ 당 &quot;레 닐라는 버퍼&quot;. <ol><li> BSA 100 ㎕ (44 ㎎ / ㎖ 주식을)를 추가합니다. </li><li> 하나 이상의 판, 10 mL의 분액에 별도의 마스터 믹스를 선별합니다. </li><li> 버퍼링 코 엘렌 테라의 100 μl를 추가합니다 (이전에 분주하고 100 배의 진한에 저장됩니다.) </li></ol></li> &lt;리&gt; 수산화 나트륨과 염산을 사용하여 5.0 1X 레 닐라 버퍼 다음, 반딧불 8.0 버퍼 1X의 산도를 조정합니다. 주 : 각 버퍼의 활동 및 반딧불 루시퍼 라제 활성을 종결 레 닐라 버퍼의 능력은 산도에 크게 의존한다. 일관성있는 결과에 대해이 단계에서 매우 정확. </li><li> 루미 프라이밍를 수용 10.5 mL를 (1 96- 웰 플레이트에 대응) 각각의 버퍼의 양을 준비한다. </li></ol></li><li> 불투명 한 흰색 번호판에 해물을 전송 :이 시점에서 세포가 20 분 ~에 대한 용해 버퍼에 있​​어야합니다. 각이 잘 멀티 채널 피펫을 사용하여 25 μl를 타고, 세포의 덩어리를 분쇄하고 해물을 균질화 아래 철저까지 피펫해야 할. </li><li> 루미를 준비합니다. 루미의 전원을 켜고 &quot;이 주사와 DLR&quot;라는 DLR 폴더에있는 프로토콜을 선택합니다. 다른 포맷은 데이터 분석 파이프 라인 (아래)와 호환되지 않습니다. <ol><li> T로 우물을 선택ested (모든 우물이 기본값입니다). </li><li> (설명을 29 참조) 10 초 측정 시간 5 초 설정을 &#39;측정하기 전에 지연&#39;을 확장합니다. </li><li> 모세관 세척 단계 : 물 3 배, EtOH로 배, 물 배, 마른 배. 백 버퍼 튜브에 한 번 폐기물로 국무 버퍼, 다음 주요 두 번째 혼합 보장합니다. 오른쪽 모세관에 레 닐라 다음 왼쪽 모세관에 처음과 주요 반딧불 버퍼를 주입한다. </li></ol></li><li> 루시퍼 라제 분석을 시작합니다. 각각의 판을 읽을 ~ 48 분 소요됩니다. 완료 후 먼저 파일을 저장 한 다음 세척 단계를 반복하고 루미을 차단. 참고 : 루미 프로그램이 충돌 할 경우 여러 판 읽고 동일한에 저장된 데이터는 파일을 능가 할 수는 문제가 여러 개의 판으로 발생할 수 있습니다 그러나 읽습니다. 측정 사이의 모든 데이터를 저장하고 저장이 가능하기 전에 프로그램이 충돌하는 경우 스크린 샷을해야합니다. <ol><li> 이전 버퍼를 교체새와 새 판을 시작하기 전에 최소한 두 번 새로운 버퍼와 주요해야되고. </li></ol></li></ol> 8. 데이터 분석 <ol><li> 에서 사용할 수 - 그리고 &quot;다판 분석 3&#39;LIFE&quot;- 엑셀 테이블 &quot;하나의 플레이트 분석 3&#39;LIFE&quot;활용 <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com을</a> . 스프레드 시트 - &quot;하나의 플레이트 분석 3&#39;LIFE&quot;에 부정적인 조건, miRNA의 # 1, 및 miRNA의 # 2에 해당하는 위치에 루미 출력 파일에서 반딧불과 레 닐라 루시퍼 라제 측정을위한 원시 데이터를 복사합니다. </li><li> 스프레드 시트가 자동으로 반딧불 / 레 닐라 비율을 계산하고 적절한 음성 대조군에 각각의 miRNA의 정상화, 각각의 접시에 걸쳐 억압 값을 정상화됩니다. 참고 :이 스프레드 시트가 자동으로 크게 억압 우물을​​ 강조, 낮은 루시 페라 제 신호에 우물을 식별하고 repressi의 조치를 제공 할 것입니다전체 판에서에. 통계 분석의 자세한 설명은 (24)을 참조하십시오. <ol><li> 각 시험의 miRNA에 대한 # 1을 복제에 대응하는 위치에 - &quot;다판 분석 3&#39;LIFE&quot;스프레드 시트에 해당하는 세포로, &quot;정상화 RI 색인&quot;상자에서 값을 복사합니다. 다른 일에 수행 한 모든 생물 복제에 대해 반복합니다. </li></ol></li><li> 원하는 경우, 각각 열 B와 D의 유전자 이름과 대상 예측 상태를 삽입합니다. <ol><li> 스프레드 시트가 자동으로 모든 판의 평균을 계산하도록 허용합니다. 열지도로 96 웰 형식 (그림 2)의 데이터를 관찰한다. 파일은 또한리스트 형식의 데이터 (도 2)를 배치한다. 주 : 억압 지수 추정 miRNA의 타겟을 식별하는 데 사용되는 계수이다. 다른 파라미터는 엄격 개인 선호도에 기초하여, 사용할 수있다. 평균적으로 우리는 0의 억압 지수 아래의 가능성이 안타를 고려한다.8 T 테스트 (P - 값 &lt;0.05)로 통계적으로 유의. 그림에 나타낸 바와 같이 이러한 기준에 따라 3 잠재적 인 목표는 빨간색으로 강조 표시됩니다. </li></ol></li></ol>

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이 작업은 애리조나 주립대학교의 교양 및 과학 대학과 바이오디자인 연구소의 자금과 NIH 탐색/개발 연구 보조금 1R21CA179144-01A1의 지원을 받습니다.

3&#39;LIFE 분석은 높은 처리량에 3&#39;UTRs에 기능 miRNA의 목표를 식별합니다. 이 분석은 실험적으로 관심에 대한 자신의 miRNA 추정 대상의 다수를 식별 할 목적으로 연구에 유용하다. 3&#39;LIFE 분석은 분석이 miRNA의 타겟팅의 기능 측정, 자신있게 해결할 수있는 하나의 miRNA에 대한 3&#39;UTR :: 단일 기자의 이진 테스트를 제공한다는 점에서 3&#39;UTR 중심의 규제를 조회 할 수있는 강력한 방법이다 개별 유전자의 표적 상태. 이 방법을 확인하기 위해, 우리는 275 3&#39;UTRs의 패널을 상영하고 두 miRNA에 대해, 렛 7C 미르-10B를하고,이 라이브러리에서 10 이전에 검증 대상 유전자를 포함. 이러한 열 유전자 중 8 억압 (24)을 나타내었다. 우리는 또한 검증되지 않은 bioinformatically 예측 대상의 중요한 농축, 그리고 우리의 최고 히트 곡 중 정규 씨의 요소를 포함 예상치 못한 3&#39;UTRs을 관찰,...

이 방법의 전체 목표는 정확히 감지하고 높은 처리량에서 마이크로 RNA (miRNA의) 대상을 매핑하는 것이다. 의 miRNAs는 ~ 길이 22 뉴클레오티드 내인성 비 코딩 RNA를합니다. 전사 처리에 따라, 성숙의 miRNAs는 단백질 복합체에 포함되는 복잡한 (RISC)를 침묵 유도 된 RNA를했다. 각각의 miRNA는 번역 억압 또는 mRNA의 절단 1 중 하나의 결과로, 주로 메신저 RNA를의 &#39;비 번역 영역 (3&#39;UTRs) (의 mRNA를)에있는 요소를 대상으로 RISC를 안내합니다. U는 염기쌍을 동요하고있다 퇴화를 자연에서 여러 일치하지 않는 염기 쌍을 포함하는 지역을 불룩 : miRNA의 표준 왓슨 - 크릭 및 G에 기초하여 대상 사이트를 인식하고 있습니다. 대부분의 miRNAs는 크게 그들이 생물학적 역할의 다양한 범위를 재생할 인간 2,3에 식물에서 보존된다. 후생 동물에서의 miRNA는 세포의 운명 결정 4, 발달시기 (5) 등 다양한 생물학적 과정에 영향을 미칠 수있다 </sup&gt; 자주 조직 특이 적 발현 양상 6,7을 나타낸다. 의 miRNA misexpression 또한 표적 유전자의 기능만을 기준 셀의 동작에 상당한 영향을 미칠 수있는 비정상적인 유전자 조절, 발생할 수있다. 이와 같이, 신경 퇴행의 miRNAs는 8,9, 당뇨병, 암 (10) (11)을 포함하여 다양한 질환에 연결되어있다. 생물 정보학 및 습식 벤치 방법은 각각의 miRNA는 높은 처리량 또는 게놈 넓은 접근 방식이 잠재적 인 상호 작용이 큰 풀을 조사하는 데 필요한 것을 나타내는 별개의 mRNA 12-14 수천 수백을 대상으로 할 수 있음을 시사한다. 표적 유전자를 확인하는 것은 기계적으로 정의 miRNA의 기능의 중요한 요소이며, 그렇게 연구자 대규모 타겟을 계시 할 수 있어야한다. 몇몇 접근법은 생물 정보학적인 예측 알고리즘을 포함하여 miRNA의 타겟을 식별하기 위해 개발 된, 높은 처리량 시퀀싱의 mRNA를 표적으로하고, 기자가 분석을 기반으로. 이러한 접근 방식은 각각 고유의 강점과 약점을 가지고있다. miRNA의 타겟팅이 순서 특이성에 의해 인도되는 것을 감안할 때, 특히 뉴클레오티드의 miRNA의 2-6의 여러 알고리즘은 많은 생물의 게놈을 통해 miRNA의 목표를 예측하기 위해 개발되었다 (시드 지역을 지칭). 이 알고리즘은 검증의 miRNA 대상의 관찰베이스 페어링 모티브를 사용하여 훈련, 자주 등의 엄격한 씨 페어링, 현장 보존 및 / 또는 열역학적 안정성 15 매개 변수를 사용하고 있습니다. 이러한 필터는 단지 높은 신뢰 대상에 충분한 상보성을 가진 추정 대상의 다수를 구체화 반면, 최근 증거는 16-24 만연 시사 종 특이적이고 비정규의 miRNA 표적 부위를 제외 할 수있다. 더욱이,이 예측은 이러한 대안 폴리아 데 닐화와 같은 miRNA의 표적 부위를 제외 mRNA의 계정 처리 메커니즘을 고려하지 않는다25, RNA 편집 (26), RNA 메틸화 (27), 협력 바인딩. 따라서, 높은 위양성과 위음성 율은 많은 알고리즘 22,24,28보고되고있다. 이러한 알고리즘은 후속 실험 검증을 위해 후보 miRNA의 타겟을 식별하는 데 유용하지만, 이러한 높은 에러율 체계적인 miRNA의 타겟 검출을위한 생물 정보학적인 방법의 유효성을 제한한다. 체계적으로 특정 miRNA의 사이의 상호 작용 및 잠재적 대상 3&#39;UTRs에 대해 조사하기 위해 우리는 3&#39;UTRs (3&#39;LIFE) 24 기능 요소의 발광 식별라는 높은 처리량 분석을 개발했습니다. 상기 분석 수단의 상호 작용과 직접 이중 루시페라아제 리포터 시스템을 이용하여 miRNA의 쿼리 테스트 3&#39;UTR의 병진 억압. 이 시스템에서, 관심의 유전자의 3&#39;UTR은 개똥 벌레 루시퍼 라제 (fluc) 리포터 판독 프레임의 하류에 클로닝된다. 기자의 단점truct는 HEK293T 세포에서 쿼리의 miRNA에 동시 형질 감염된된다. miRNA의 타겟팅 테스트 fluc :: 3&#39;UTR 기자와 제 비특이적 레 닐라 루시퍼 라제 리포터의 상대적인 변화를 측정함으로써 결정된다. 중요한 것은, 루시 페라 제 분석은 기자의 병진 출력에 영향을 미치는 기능의 miRNA / mRNA의 상호 작용을 검출한다. 이는이 3&#39;UTR 기반 규제의 독립적 인 단백질 풍부 mRNA의 분해와 번역 억압의 차이뿐만 아니라, 변화를 무시, 이러한 RT-qPCR에 서양 말과 같은 miRNA의 규제를 감지하는 기존의 방법에 비해 큰 장점이다. 루시페라아제 분석법 널리 소모성 시약과 관련된 높은 비용에 의해 제한되기 때문에 상대적 단순성과 감도이면서 높은 처리량 스크린에서 그 사용 직접적인 miRNA의 대상을 확인하는 데에 이용되는, 공개 출처 3&#39;UTR 라이브러리의 부족, 부재 표준화 된 루시 페라 제 제자의ocols, 여러 데이터 세트에 걸쳐 기능 억압 비교에 어려움을 선도. 3&#39;LIFE 분석의 사용을 용이하게하기 위해, 우리는 정기적으로 업데이트 팽창 3&#39;UTR 라이브러리를 만들어 실험 설계 비상업적 형질 24 루시퍼 라제 시약 (29)의 이용의 간소화에 중점을 넣고,를 통해 사용할 수있다 공개 플라스미드 저장소 (30). 3&#39;LIFE 분석의 확장 성 bioinformatically 확인 된 유전자으로 화면을 바이어스없이 특정 miRNA의 타겟팅에 대한 큰 3&#39;UTR 라이브러리의 검사를 할 수 있습니다. 정규 예측과 상호 작용을 시험 이외에, 체계적인 접근법 비정규 및 / 또는 종 특이 적 상호 작용을 통해 구동되는 신규 대상의 식별을 허용한다. 중요한 단백질 생산에 타겟팅 된 miRNA의 효과는 일반적으로 적당한 병진 억압 15,31 &lt;발생하는 것으로 이해된다/ SUP&gt;, miRNA의 규제의 주요 역할, 단백질 출력 미세 조정 유전자 발현의 비정상적인 수준을 방지하고, 특정 프로그램 (32, 33)를 셀에 견고 함을 제공하는 것을 제안. 3&#39;LIFE 화면에 음의 miRNA / mRNA의 상호 작용의 본질적으로 다수의 결합 루시페라아제 분석의 민감도의 miRNA 유전자의 다수의 타겟팅의 미묘한 효과를 검출하고, 유전자 네트워크의 여러 구성 요소들의 식별을 허용하는 특정 miRNA의 (24)에 의해 조절된다. 여기에서 우리는 3&#39;LIFE 프로토콜을 설명하고 275 인간 3&#39;UTRs (그림 1)의 패널에 대해이 잘 특성화의 miRNAs 미르-10B 및하자-7C를 선별하여이 가능성의 보여줍니다.

<table><tbody><tr><td>시약</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>글리실 글리신</td><td>시그마</td><td>G1127-25G</td><td></td></tr><tr><td>Kx PO4</td><td>시그마</td><td>P2222</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>시그마</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>시그마</td><td>FLAAS</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>시그마</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>시그마</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>CoA</td><td>시그마</td><td>C4282</td><td></td></tr><tr><td>루시페린</td><td>시그마</td><td>L9504</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>시그마</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Na2EDTA</td><td>시그마</td><td>E0399</td><td></td></tr><tr><td>K H2 P O4</td><td>시그마</td><td>1551139</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>시그마</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>시그마</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>콜렌테라진</td><td>시그마</td><td>C3230</td><td></td></tr><tr><td>PBS/HEPES</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>시그마</td><td>D5546</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>시그마</td><td>F2442</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>시그마</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>트립신</td><td></td><td>T2600000</td><td></td></tr><tr><td>소모품</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MaxiPrep Kit</td><td>Promega</td><td>A2392</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 미니프렙 플레이트</td><td>Pall</td><td>8032</td><td></td></tr><tr><td>96-웰 셔틀 플레이트</td><td>Lonza</td><td>V4SP-2096</td><td></td></tr><tr><td>5x 용해 버퍼</td><td>Promega</td><td>E1941&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>악기</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-well GloMax 플레이트 리더</td><td>Promega</td><td>E9032</td><td></td></tr><tr><td>Biomech FX 액체 핸들러 로봇</td><td>Beckmann</td><td>A31842</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector 코어 유닛</td><td>Lonza</td><td>AAF-1001</td><td></td></tr><tr><td>96-well 셔틀 시스템</td><td>Lonza</td><td>AAM-1001</td><td></td></tr><tr><td>세포 계수기 Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10227</td><td></td></tr></tbody></table>

3&#39;life의 분석을 사용하여 높은 처리량 mirna의 표적의 탐지

Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

3&#39;UTRs의 기능 요소의 발광 식별 (3&#39;LIFE는) 쿼리 3&#39;UTRs 수백의 배열 내의 특정의 miRNAs의 목표의 신속한 식별 할 수 있습니다. 대상은 식별 된 miRNA 타겟팅의 판독 기능을 제공 병진 출력을 측정함으로써 mRNA의 수준에서 결합 검출 듀얼 루시퍼 라제 분석에 기초한다. 3&#39;LIFE은 게놈 와이드 화면을 비 독점 버퍼 및 시약, 그리고 공개적으로 사용할 수 기자 라이브러리를 사용 가능하고 비용 효율적인. 3&#39;LIFE 표준 실험실 환경에서 수행 중 또는 액체 처리 로봇 및 기타 높은 처리량 장비를 사용하여 확장 할 수 있습니다. 우리는 인간의 96 웰 플레이트에 복제 3&#39;UTRs, 2 개의 시험의 miRNAs의 데이터 집합을 사용하는 방법을 설명, 렛 7C 미르-10B. 우리는 96 웰 형식 DNA 준비, 형질 전환, 세포 배양 및 루시퍼 라제 분석을 수행하고, 데이터를 툴을 제공하는 방법을 보여분석. 결론적으로 3&#39;LIFE 매우 재현 신속하고 체계적이며, 높은 신뢰성 목표를 식별합니다.

루미 출력 파일은 모두 개똥 벌레와 레 닐라 루시퍼 라제 단백질 원료 측정이 포함되어 있습니다. 와 - Mangone 랩 웹 사이트 (에서 사용 가능한 &quot;3&#39;LIFE 다판 분석&quot;스프레드 시트 -이 원시 형식은 &quot;단판 분석 3&#39;LIFE&quot;와 호환 <a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> ). 단판 분석 스프레드 자동 반딧불이 / 레 닐라 비율을 계산 적절한 음성 대조군 miRNA를 각각 정규화하고, 각각의 플레이트에 걸쳐 억압 값을 정규화한다. 스프레드 시트를 자동 낮은 레 닐라 루시퍼 신호 웰을 식별 음성 대조군에 비해 억제를 나타내는 웰을 강조하고, 전체 판에 걸쳐 억압 수단 (도 2)을 제공한다. 통계 분석의 자세한 설명은 (24)을 참조하십시오. 여러 복제 분석 ...

3' 미번역 영역(3'UTR)(3'LIFE)에서 기능 요소의 발광 식별은 miRNA 또는 기타 조절 요인에 의한 3'UTR의 기능 조절을 식별하는 기술입니다. 이 프로토콜은 96-well transfection 및 luciferase assay와 같은 고처리량 방법론을 활용하여 기능적 억제에 대한 수백 개의 추정 상호 작용을 스크리닝합니다.

3&#39;LIFE의 분석을 사용하여 높은 처리량 miRNA의 표적의 탐지

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

다음 실험의 전반적인 목적은 3' 비번역 부위(untranslated regions, 3' UTR) 라이브러리 내에서 micro RNA 표적을 식별하는 것입니다. 이는 대규모의 편향되지 않은 스크리닝을 용이하게 하기 위해, HEK 293 세포에 micro RNA 발현 플라스미드와 3' UTR이 융합된 루시퍼레이스(luciferase) 리포터 플라스미드를 공동 형질전환(co-transfecting)함으로써 수행됩니다. 형질전환은 두 번째 단계로 96-웰 플레이트에서 진행됩니다. 이후 세포는 micro RNA에 의한 3' UTR의 전사 후 조절을 측정하는 이중 루시퍼레이스 분석(dual Lucifer assay)을 거치게 됩니다.다음으로, 수백 개의 3' UTR 결과 풀(pool) 중에서 신뢰도가 높은 microRNA 표적을 식별하기 위해 여러 반복 실험 및 여러 플레이트에서 얻은 데이터를 분석합니다. dual Luciferase assay로 측정된 번역 억제를 기반으로, 각 microRNA가 고유한 3' UTR 세트를 표적으로 한다는 결과가 도출됩니다. 3' UTR 분석법은 관심 있는 microRNA에 대해 다수의 표적 유전자를 식별함으로써 microRNA 생물학의 핵심 질문에 답할 수 있으며, 후속 검증 실험의 방향을 제시하는 데이터를 제공합니다. transfection 24~48시간 전에 transfection할 96-well 플레이트 수에 맞춰 충분한 양의 HEK 293 T 세포를 준비하십시오. 각 96-well 플레이트당 9 million cells이 필요합니다.본 시연에서는 특성이 잘 규명된 두 종류의 microRNA를 275종의 인간 3' UTR 패널을 대상으로 스크리닝합니다. 따라서 3개의 96웰 플레이트가 사용됩니다. 일반적으로 145mm 원형 배양 플레이트 하나면 3개의 96웰 플레이트를 수용하기에 충분합니다.세포가 약 90% 정도의 합류도(confluency)에 도달했을 때 트랜스펙션을 수행하며, 모든 버퍼와 플라스미드 DNA는 트랜스펙션 전에 준비해야 합니다. 인간 3' UTR 클론은 96-well 플레이트의 well당 약 100 ng/µL가 되도록 재부유시키고, microRNA 벡터는 500 ng/µL 농도로 재부유시킵니다. 각 microRNA 및 공백 대조군 플라스미드에 대해 10x firefly luciferase 버퍼와 1x vanilla luciferase 버퍼 제조를 위한 시약을 미

detection-of-mirna-targets-in-high-throughput-using-the-3-life-assay

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

여기 샘플 제한된 양의 작업 특히, microRNA (miRNA) 표현 수준에 대해 비용과 시간 효율 높은 처리량 검사 도구로 microfluidic 플랫폼와 함께 최적화된 멀티 플렉스 반전 transcriptase 정량 PCR (qRT - PCR) 프로토콜을 설명합니다.

높은 처리량 MicroRNA의 프로파일 : 최적 멀티 플렉스 플루 동적 ArrayTM의 IFCs에 Nanoliter의 규모 qRT - PCR

대상 아이디 라이브러리 miRNA 목표를 식별하는 데 사용 복제된 cDNA의 플라스미드 기반의 게놈 전체 모음입니다. 여기는 이용 및 응용 프로그램을 보여줍니다.

선교 대상 아이디 라이브러리를 사용하여 miRNA 목표를위한 게놈 - 와이드 스크린

MicroRNAs는 (miRNAs) 유전자 발현의 중요한 규제하고 다양한 생물 학적 과정에서 역할을 보여왔다. 더 miRNA - UTR의 상호 작용을 이해하기 위해서, 우리는 소설 루시페라제 유전자와 분석 시약, LightSwitch 시스템과 결합하여 3 UTR 루시페라제 기자의 게놈 - 광범위한 컬렉션을 만들었습니다.

3&#39;UTR - 기자의 구성과 microRNA를 사용하여 LightSwitch의 루시페라제 분석 시스템과 인간 microRNAs의 확인 대상이 자기편 세포의 모방

에스트로겐과 마이크로 RNA 모두를 통해 신호 분자는 유방암의 발전과 성장에 중요하다. 에스트로겐은 전사 인자이다 에스트로겐 수용체를 활성화합니다. 많은 전사 인자는 마이크로 RNA의 발현을 조절할 수 있으며, 에스트로겐 조절 마이크로 RNA는 다른 대규모 기법을 사용하여 프로파일 링 할 수있다.

유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

순환 마이크로 RNA는 최근 각종 암 및 기타 질환에 대한 유망한 새로운 바이오 마커로 등장했다. 이 문서의 목적은 세 가지 다른 프로브 기반의 실시간 PCR 플랫폼 및 정량화 및 마이크로 RNA 순환의 풍요 로움을 결정하는 데 사용할 수있는 방법을 논의하는 것입니다.

프로브 기반의 실시간 PCR은 마이크로 RNA의 정량 측정을위한 접근 방법

우리는 증폭 없이 생물학적 기질에서 분자를 바코딩하고 계수하여 유전자 발현을 정량화하는 multiplexed high-throughput 유전자 발현 플랫폼의 사용을 설명합니다. 우리는 이 플랫폼을 사용하여 과민성 대장 증후군이 있거나 없는 피험자의 전혈에서 microRNA(miRNA) 발현을 정량화했습니다.

과민성 대장 증후군에서의 miRNAs 순환의 교란은 멀티 플렉스 높은 처리량 유전자 발현 플랫폼을 사용하여 감지

이 보고서 mRNA 표적 세포 miRNAs의 유효성 검사에 대 한 신속 하 고 신뢰할 수 있는 방법을 설명 합니다. 잠겨 핵 산 LNA 기반 miRNA 합성 biotinylated 캡처를 모방한 메서드 사용 대상 mRNA. 그 후, 자석 구슬 streptavidin 입히는 풀 다운 고용 되어 대상 mRNA 정량 연쇄 반응에 의해 정량화에 대 한.

Biotin 기반 풀 다운 유효성 검사 mRNA를 표적 세포 miRNAs 분석 결과

우리는 암 환자에서 플라즈마 샘플에 예측에 관한 (miRNAs) 순환의 식 수준을 평가 하는 프로토콜을 제시. 특히, 우리는 순환 미르 추출 및 반전 녹음 방송에 대 한 상용 키트를 사용 합니다. 마지막으로, 우리는 실시간으로 미리 발견된 프로브 사용자 지정 접시를 사용 하 여 24 선택한 miRNAs의 패널 분석.

전이성 대 장 암 환자에서 순환 예측에 관한 사용자 정의 패널의 검출

이 프로토콜은 프로브 기반 실시간 중합효소 연쇄 반응(PCR), 설포호다민 B(SRB) 분석, 3' 번역되지 않은 영역(3' UTR) 클로닝 및 루시퍼라제 분석제를 사용하여 관심 있는 miRNA의 표적 유전자를 확인하고 miRNA의 기능을 이해합니다.

종양 세포에서 MicroRNA 수준, 기능 및 관련 표적 유전자를 평가하기 위한 시험관 내 프로토콜

여기에서는 1) 알려진 miRNA와 새로운 miRNA를 보다 정확하게 식별할 수 있고 2) 완전히 자동화되어 자유롭게 사용할 수 있는 새롭고 완전히 자동화된 miRNA 파이프라인인 mirMachine을 제시합니다. 이제 사용자는 간단한 제출 스크립트를 실행하여 완전히 자동화된 mirMachine 파이프라인을 실행할 수 있습니다.

미르머신: 식물 miRNA 주석을 위한 원스톱 상점

이 프로토콜은 마이크로RNA와 다중화된 단백질을 동시에 검출하고 정량화하기 위해 포르말린 고정 파라핀 포매 조직을 사용한 탠덤 면역형광 혼성화 분석을 설명합니다.

새로운 검출 및 정량화 방법으로서의 Locked-nucleic-acid In situ Hybridization을 통한 MicroRNA 증폭 및 인식

학습하세요 3'LIFE 기법을 사용하여 miRNA 표적을 고효율로 탐지하는 방법을. HEK293 세포와 듀얼 루시퍼라제 분석을 활용하여 수백 개의 3'UTR 라이브러리에서 번역 억제를 측정하고 유전자 조절 네트워크를 규명합니다.

3'LIFE의 분석을 사용하여 높은 처리량 miRNA의 표적의 탐지

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