세균의 사체 분석 사례 연구에 대한 빠르고 안정적인 파이프 라인 : 세린에 의존하는 유전자 조절에 폐렴 구균
2015년 4월 25일
이 원고는 DNA 마이크로어레이가 제공하는 최첨단 기술의 사용을 설명합니다. 마이크로어레이는 특정 조건에서 발생한 박테리아의 전사체 변화에 대한 개요를 제공합니다. 또한 편리한 사내 개발 소프트웨어 패키지를 사용하여 많은 양의 데이터를 쉽게 분석할 수 있다는 점을 강조합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 특정 조건에서 발생한 박테리아의 전사체 변화에 대한 개요를 제공하는 것입니다. 이것은 먼저 특정 조건에서 박테리아 세포를 성장시키고 수확함으로써 달성됩니다. 다음으로, 수확된 세포에서 총 RNA를 분리하고 RNA에서 CDNA를 만듭니다.
그런 다음 CDNA를 라벨링하고 사내에서 만든 마이크로 분석 슬라이드에 하이브리드화합니다. 마지막으로, 슬라이드를 세척한 후 슬라이드를 스캔하고 분석합니다. 궁극적으로, 마이크로어레이는 특정 조건에서 박테리아 세포의 전사체 변화를 보여주는 데 사용됩니다.
QPCR 또는 북부 더럽히기 같이 유전자 표정 공부를 위한 다른 기존하는 방법에 DNA microarray 기술의 주요 이점은, 특정한 조건 하에서 부딪힌 모든 transcriptomic 변화의 세계적인 개관을 제공한다 이다. 빠르고 안정적이며 상대적으로 저렴합니다. 절차를 시연하는 것은 분자 유전학에 있는 나의 실험실에서 PSD 학생인 Mohammed Sal과 Airon Manzu일 것입니다.해동 후, s pmo, ED 39 세포 펠릿 및 텍스트 프로토콜에 따라 400 마이크로리터의 te에 현탁하는 Resus, RNA 프리 스크류 캡 튜브, 0.5g의 유리 구슬, 50 마이크로리터의 10% SDS 500 마이크로리터의 이전에 준비된 페놀 클로로포름 및 재현탁 세포 펠릿.
세포를 끊기 위하여는, 관을 구슬 치는 기계로 두고 60 초 동안 두번 균질화하십시오, 맥박 사이 1 분 동안 얼음에 그(것)들을 각각 두고, 그 후에 10 분 동안 10의, 000 Gs 및 4 섭씨 온도에 표본을 원심 분리하십시오. 상부상을 새 튜브로 옮기고 500 마이크로 리터의 클로로포름 i, a, a 및 원심 분리기를 추가로 5 분 동안 옮깁니다. 상부에서 새 튜브까지 500 마이크로 리터의 피펫
.두 부피의 lysis binding buffer를 추가하고 위아래로 피펫팅하여 혼합합니다. 그런 다음 RNA 분리 키트를 사용하여 RNA에서 오염된 DNA를 제거하기 위해 제조업체의 프로토콜에 따라 전체 RNA를 분리합니다. D a's one mix 100 마이크로리터를 넣고 섭씨 15-25도에서 20-30분 동안 배양합니다.
RN a의 키트를 사용하여 세척된 RNA를 세척하고 50마이크로리터 부피로 용출하여 300마이크로리터 PCR 튜브에서 무릎 꿇기 반응을 수행합니다. 총 RNA를 2마이크로리터의 무작위 단량체와 혼합하고 필요한 경우 뉴클레아제가 없는 물을 사용하여 부피를 최대 18마이크로리터까지 가져옵니다. 무릎을 꿇고 있는 혼합물을 섭씨 70도에서 5분 동안 배양합니다.
그런 다음 실온에서 10분 동안 반응을 식히고 튜브를 최소 1분 동안 얼음 위에 놓기 전에 빠르게 회전시킵니다. CDNA를 역전사하려면 역전사 혼합물을 준비하고, 18마이크로리터의 혼합물을 12마이크로리터의 마스터 혼합물과 결합한 다음 섭씨 42도에서 2시간 동안 반응을 배양합니다. 2.5몰과 OH로 구성된 3마이크로리터를 첨가하여 반응에서 mRNA를 분해하고 약 15분 동안 섭씨 37도에 둡니다.
그런 다음 15마이크로리터의 2몰 힙 유리 산을 첨가하여 NAOH를 중화합니다. 그런 다음 PCR 클린업 컬럼을 사용하여 분광 광도계로 CDNA를 정제한 후 CDNA 농도를 측정하여 CDNA를 라벨링합니다. 5마이크로리터의 am 평균 반응성 염료를 CDNA 마이크로리터당 20-60나노그램에 추가합니다.
PR 클린업 컬럼을 사용하여 분광 광도계로 50 마이크로 리터의 진화 완충액에서 회피하는 CDNA로 표시된 염료를 정제하기 전에 혼합물을 어둡고 배양 된 실온에 60-90 분 동안 배치하고, 표지 된 CDNA의 농도가 총 50 마이크로 리터의 부피에서 마이크로 리터 당 0.5 피코 몰 이상인지 확인하십시오. shy buffer를 준비한 후 텍스트 프로토콜에 따라 buffer를 섭씨 68도에서 최소 30분 동안 예열합니다. 샘플을 준비하려면 라벨링된 CDNA를 동일한 양으로 결합한 다음 고온에서 진공 농축기를 사용하여 부피를 7마이크로리터 이하로 줄입니다.
그 동안 배경 신호를 줄이기 위해 리프터 슬립을 청소하려면 비누와 충분한 수돗물을 사용한 다음 리프터 슬립을 드라이 한 후 100% 에탄올을 사용하고 흰색 테프론 라이닝이 아래를 향하도록 슬라이드에 놓습니다. 다음으로, 건조된 염료 샘플을 7마이크로리터의 H2O에 용해시키고 섭씨 94도에서 2분 동안 배양합니다. 즉시 35마이크로리터의 예열된 수줍은 완충액을 넣고 부드럽게 섞은 다음 1분 동안 최대 속도로 돌립니다.
펠릿 침전물을 적재하기 전에 프로브를 섭씨 68도에서 약 5분 동안 예열합니다. 슬라이드와 리프터 슬립을 조립하려면 하이브리드화 슬라이드 홀더를 섭씨 50도의 열 블록에 놓으십시오. 가열된 하이브리드화 슬라이드 홀더에 리프터 슬립이 있는 DNA 마이크로어레이 슬라이드를 놓고 리프터 슬립으로 슬라이드를 1분 동안 예열합니다.
그런 다음 가능한 한 빨리 샘플 타겟 40마이크로리터를 슬라이드 끝에 추가합니다. 액체가 모세관력에 의해 유리 표면 사이로 흐르도록 합니다. 이제 혼성화 오븐에서 예열 혼성화 카세트를 제거하고 기계를 닫습니다.
그런 다음 2 개의 XSSC의 3 밀리리터에 적신 여과지를 혼성화 카세트에 놓습니다. 슬라이드가 있는 하이브리드화 슬라이드 홀더를 하이브리드화 카세트에 부드럽게 놓습니다. 혼성화 카세트를 닫고 혼성화 오븐에 다시 넣고 16-18시간 동안 배양합니다.
슬라이드를 세척하려면 새 세척 버퍼 1, 2, 3을 준비하고 섭씨 30도에 놓습니다. 배양이 완료되었을 때 SDS가 용해되도록 하려면 유리가 튜브 바닥에 놓일 때까지 50ml의 세척 버퍼로 채워진 Falcon 튜브에 가능한 한 빨리 슬라이드를 부드럽게 담그십시오. 리프터가 미끄러진 후 어레이를 긁지 않고 튜브 바닥으로 가라앉고 핀셋을 사용하여 슬라이드를 제거하고 세척 스테이션의 랙에 넣습니다.
즉시 500ml의 세척 버퍼를 사용하여 슬라이드를 5분 동안 세척합니다. 그런 다음 슬라이드를 세척 버퍼 2로 옮기고 20-30분 동안 500ml의 세탁 버퍼 3으로 5분 동안 옮깁니다. 마지막으로, 마이크로어레이 분석을 수행하기 전에 2000RPM에서 슬라이드를 2분 동안 건조시킵니다.
S 폐렴의 전체 전사체에 대한 L serin의 영향을 연구하기 위한 텍스트 프로토콜에 따라, 150 마이크로몰의 L Seine으로 CDM에서 성장한 D39 균주와 동일한 배지에서 10 millimolar l Seine에서 성장한 것과 비교하여 D 39 Wildtype strain microarray 분석을 수행했습니다. 이 표는 이 그림과 같이 각 배양에서 분리된 총 RNA의 농도를 나열합니다. DNA를 제거한 후 RNA의 품질을 검사했습니다.
이 두 레인은 150마이크로몰 센 강에서 추출한 RNA를 나타내며, 이 두 레인은 10 밀리몰 센 강으로 성장한 배양물에서 추출한 것입니다. 두 개의 명확한 띠가 있다는 것은 양질의 RNA를 나타냅니다. total RNA에서 합성된 cDNA의 농도가 이 column에 기록되어 있으며 AM mean reactive dye labeled samples가 여기에 나열되어 있습니다.
이 그림에서는 AM 평균 반응성 다이 비율의 산점도 분석을 볼 수 있으며, 노이즈를 줄이기 위해 데이터를 추가로 분석했습니다. 이 표는 2배 차이보다 크거나 같은 기준과 0.001 미만의 P 값을 적용한 후 마이크로어레이 연구의 결과를 요약합니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 많은 유전자가 이 절차에 따라 최대 L serin과 비교하여 최소 L serin의 존재 하에서 차등적으로 발현되었습니다.
beag, electrocytes assay, QPCR, knockout 및 또는 발현 강도와 같은 다른 방법을 사용하여 개발 후 향후 질문에 답할 수 있습니다. 이 기술을 통해 분자 및 세포 생물학 분야의 VFR 연구원들은 RAM 포지티브의 조절 네트워크와 메커니즘을 탐구할 수 있었습니다.
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개요
이 원고는 박테리아의 전사체 변화를 분석하기 위해 DNA-마이크로어레이가 제공하는 최신 기술의 사용을 설명합니다. 이 과정에는 특정 조건에서 박테리아 세포를 성장시키고, 총 RNA를 분리하고, 데이터 분석을 위해 자체 개발한 소프트웨어를 사용하는 단계가 포함됩니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 미생물학
- 유전체학
- 생물정보학
배경
- DNA-마이크로어레이는 유전자 발현을 연구하는 강력한 도구입니다.
- 전사체 분석은 환경 변화에 대한 박테리아의 반응을 이해하는 데 도움이 됩니다.
- 자체 소프트웨어는 대규모 데이터 세트의 분석을 용이하게 할 수 있습니다.
- 이 연구는 박테리아 세포에 영향을 미치는 특정 조건에 초점을 맞추고 있습니다.
연구 목적
- 박테리아의 전사체 변화에 대한 개요를 제공합니다.
- 유전자 발현 분석에 DNA-마이크로어레이의 효과를 입증합니다.
- 사용자 정의 소프트웨어를 사용한 데이터 분석의 용이성을 강조합니다.
사용된 방법
- 특정 조건에서 박테리아 세포의 성장 및 수확.
- 수확된 세포에서 총 RNA의 분리.
- RNA를 cDNA로의 변환.
- cDNA의 마이크로어레이 슬라이드에 대한 라벨링 및 하이브리드화.
주요 결과
- RNA의 성공적인 분리 및 cDNA로의 변환.
- 마이크로어레이 슬라이드에 cDNA의 효과적인 하이브리드화.
- 분석 결과 중요한 전사체 변화가 나타났습니다.
- 데이터 분석은 자체 개발한 소프트웨어를 사용하여 간소화되었습니다.
결론
- DNA-마이크로어레이는 박테리아 전사체학 연구에 효과적입니다.
- 사용자 정의 소프트웨어는 데이터 분석 능력을 향상시킵니다.
- 이 방법론은 다양한 박테리아 연구에 적용할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
DNA microarray technology enables rapid, cost-effective global transcriptome profiling in bacterial systems, supporting target validation and mechanistic de-risking in antimicrobial discovery. By capturing genome-wide transcriptional responses to environmental stimuli such as nutrient availability, the method provides predictive confidence in pathway modulation and gene regulatory networks. This facilitates early-stage hypothesis triage and portfolio prioritization in antibacterial R&D pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of transcriptional responses to serine availability, clarifying gene regulatory networks in S. pneumoniae.
- Operational Value: Provides a standardized workflow from cell harvest to data analysis using optimized RNA isolation and labeling protocols.
- Predictive Value: Identifies differentially expressed genes with ≥2-fold change and p<0.001, supporting confidence in target modulation under defined conditions.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative, genome-wide expression profiles enabling comparison of transcriptional states across growth conditions.
- Operational Value: Utilizes homemade microarray slides and standardized hybridization/wash buffers to ensure reproducibility and low background signal.
- Scalability: Supports parallel processing of multiple samples via vacuum concentration and automated scanning for downstream analysis.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links in vitro transcriptional responses to potential in vivo relevance by modeling nutrient stress conditions encountered during infection.
- Mechanistic De-risking: Clarifies serine-dependent gene regulation, reducing uncertainty in target essentiality and pathway inhibition strategies.
- Preclinical Alignment: Enables identification of co-regulated gene clusters that may represent druggable pathways or virulence modulators.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the early discovery continuum, supporting hypothesis generation in target validation and informing lead identification through mechanistic insights into bacterial adaptation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and functional target validation by revealing condition-specific transcriptional reprogramming.
- Screening: Delivers standardized, quantitative outputs suitable for assay readiness and cross-condition comparison in antimicrobial screening campaigns.
- Analytics: Employs Microprep for preprocessing and Cyber-T for statistical analysis, enabling robust identification of significant expression changes.
- Translational Research: Connects laboratory observations to pathogenic relevance by modeling host-associated metabolic pressures.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for transcriptome profiling across bacterial strains and growth conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies through unbiased, global expression profiling.
- Operational Value: Ensures reproducibility via standardized RNA quality checks, dye labeling thresholds, and slide washing protocols.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing early evidence of target engagement and pathway modulation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted advancement by highlighting condition-specific essential genes and regulatory hubs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culture, RNA handling, and microarray hybridization techniques.
- Dependent on access to microarray scanning equipment and spectrophotometric quantification tools.
- Necessitates cross-team standardization of RNA isolation, labeling efficiency, and data preprocessing workflows.
- Involves adaptation considerations when extending to Gram-negative or fastidious bacterial models.
- Limited by the requirement for prior sequence knowledge to design homemade microarray probes.
