Name: 기도 상피 세포에 림프 미세 입자 및 아폽토시스 효과의 검출 세대 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: 학습하세요 T 림프구에서 림프 미세 입자를 생산하고 기도 상피 세포에 대한 아폽토시스 효과를 분석하는 방법을. 이 기술은 면역 반응 및 세포 상호작용 연구에 활용됩니다.

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비전 건강 연구 네트워크 -이 작품은 건강 연구 (178918), 퐁 드 공들인 엉 상테 퀘벡의 캐나다 연구소에서 보조금에 의해 지원됩니다.

참고 : 남성 C57BL / 6 마​​우스 (5-7주 이전)의 찰스 리버 연구소 인터내셔널 (. 세인트 - 상수, 퀘벡, 캐나다)에서하고 CHU 셍트 - 저스틴 동물 관리위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 조작 할 수 있습니다. 마우스 기관지 조직 절편은 상피 세포에 LMPs의 아폽토시스 효과를 조사하는 차 기관지 상피 세포의 좋은 소스를 제공합니다. 이 프로토콜은 LMPs의 시험 관내 생성뿐만 아니라 LMPs 처리 기관지 조직 이식편에 대한 상피 세포 자멸사를 검출하기위한 방법을 설명한다. 이 프로토콜은 세 부분으로 구성되어 있습니다. 1. LMPs 생산 및 특성 참고 : 오염을 방지이 실험에 사용 된 모든 재료는 멸균 또는 멸균되어 있는지 확인하십시오. 달리 언급하지 않는 한, 무균 조건에서 생물 안전 캐비닛에 실온에서 모든 단계를 수행합니다. 1.1) 자극과 의원의 컬렉션9 <ol><li> 37 ° C의 수욕 천만 CEM T 세포의 분취 량을 해동. 10ml에 희석 예열 된 무 혈청 200 GX 5 분에서 15 ㎖의 멸균 튜브와 원심 분리기, 예컨대 X-VIVO 같은 조혈 매체. 예열 배지 5ml에 재현 탁하고 세포 상등액을 기음. </li><li> 15 ml의 예열 조혈 같은 X-VIVO와 같은 매체 5 % CO 2와 37 ° C에서 가습 배양기에서 4 일 동안 배양과 (서스펜션 세포) T75 조직 배양 플라스크에 넣고 세포를 전송합니다. </li><li> 사일 후, 100 ㎖의 새로운 배지를 함유하는 T175 조직 배양 플라스크에 모든 배양액과 세포를 옮긴다. 그들은 2 백만 세포 / ml의 밀도로 성장 될 때까지 동일한 조건에서 약 72 시간 동안 계속하여 배양 된 세포. </li><li> 균등 네 T175 플라스크 각각 포함 된 150 ml의 신선한 매체 세포가 200 만 / ml의 농도로 (약 48 시간 배양)를 재배 할 때까지 세포 배양을 계속 사이에 세포를 분리. </li><li&gt; 5 분 동안 200 XG에서 원심 분리하여 각 플라스크로부터 세포를 수집하고, 2 백만 / ml의 세포 밀도를 유지하기 위하여, 150 ㎖의 새로운 배지를 함유하는 새로운 T175 플라스크에 300 × 106 세포를 재현 탁. </li><li> 0.5 ㎍ / ml의 최종 농도로 배지 (2 ㎎ / ㎖로 DMSO에 용해) 티노 마이신 D 첨가하고 24 시간 동안 배양한다. </li><li> 50 ML 원뿔 튜브에 모든 문화 매체를 전송하고 5 분 동안 750 XG에서 세포를 스핀 다운. 15 분 대 세포 파편을 제거하기 위해 1,500 XG에 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 50 분 동안 12,000 XG에 250 ml의 병 및 초 원심 분리기에 뜨는을 전송합니다. 뜨는을 취소하고 알약을 수집합니다. </li><li> 워시 50 분 동안 12,000 XG에서 원심 분리하여 50 ㎖ 튜브에 40ml의 무균 PBS로 펠릿 LMPs이 농후. 두 번이 단계를 반복합니다. </li><li> 마지막 세척 상층 액을 수집; 이는 비히클 대조군으로 사용한다. 1 LMPs 펠렛을 일시 중단㎖의 PBS는 1.5 ml의 멸균 마이크로 튜브로 전송할 수 있습니다. 분취 매장 절연 LMPs는 -80 ° C에서 (다중 자유 - 해동 사이클을 방지하기 위해). </li></ol> FACS 분석 (4)를 통해 의원 1.2) 특성 <ol><li> 염화칼슘이없이 넥신 버퍼의 두 샘플 1과 다른 준비 : 헤 페스 10 mM의 NaCl을 140 mM의 플러스 마이너스 5 mM의 염화칼슘 2. </li><li> 입자를 제거하기 위해 0.22 μm의 필터를 사용하여 아 넥신 FACS 완충액 시스 유동 유체 필터. </li><li> FACS 튜브에 5 mM의 염화칼슘 2 넥신 버퍼의 44 μL에 LMPs 1 μl를 희석. 염화칼슘 2 (음성 대조군)없이 넥신 버퍼의 44 μL에 LMPs 1 μL와 다른 튜브를 준비합니다. </li><li> 각각의 튜브에 넥신 - Cy5에 5 μl를 넣고 잘 섞는다. 어둠 속에서 실온에서 15 분 동안 품어. 각 튜브에서 FACS 시스 유동 유체의 400 μL와 혼합하여 희석함으로써 반응을 정지. </li><li> 7 μm의 계수 BEA의 10 μL (20 구슬)를 추가합니다각 튜브에서 내부 표준으로서 DS 현탁액 절대 수를 얻었다. </li><li> 상대적 크기의 게이트 (FSC-H, PMT E00, 규모 로그인) 및 상대 단위 (SSC-H, PMT (325), 로그 스케일)의 크기 보정 형광 구슬을 사용하여 흐름 cytometer에 도트 플롯을 설정 1 ㎛ (게이트 1) 7 μm의 (문 2)에서 비즈 게이트를 계산. </li><li> 20,000 카운트 비즈 게이트 2에 도달 할 때까지 신호를 획득함으로써, 도트 플롯 (규모를 기록, PMT 765) 넥신에 대한 설립 게이트 및 FL-4 채널을 사용하여 FSC-H / SSC-H 플롯에 LMPs 샘플을 분석 할 수 있습니다. </li><li> CaCl2를 포함 넥신 버퍼에 LMPs의 긍정적 인 넥신 이벤트를 결정하고 염화칼슘 2 (음성 대조군)없이 넥신 버퍼에 LMPs의 이벤트를 뺍니다. </li><li> 다음의 식에 기초 의원의 절대 수를 계산 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/52651/52651eq1.jpg" /></li></ol> MP P 1.3) 결정rotein 농도 (브래드 포드 분석) <ol><li> 1.25 ~ 20 ㎍ / ml의에서 단백질 표준의 5 연속 희석을 준비합니다. 피펫 중복에 깨끗한 시험관에 각각의 표준 시료 용액 800 μL. 각각의 튜브에 브래드 포드 염색 시약 200 μl를 추가합니다. 믹스 그럼 5 분 동안 실온에서 품어. </li><li> 595 nm에서 흡광도를 측정한다. 표준 곡선의 선형 회귀를 이용 LMPs의 단백질 농도를 결정한다. </li></ol> 2. 기관지 조직 외식 및 LMPs 치료 참고 : 멸균 작업 환경에 특별한주의를 지불하고, 무균 실험을 다음에 사용되는 솔루션과 매체를 준비합니다. , 완전한 치유 미디어를 준비 100ml의 조직 치유 중간 (얼음 해동) 혈청과 조직 치유 중간 보충 교재의 1를 가하여 잘 혼합합니다. 기관지 조직 외식 2.1) 준비 <ol><li> 배양 전에 1cm 2의 6 영역에 흠집메스 블레이드 각각 100mm 조직 배양 접시 표면의 가장자리에 각각. 코트는 각각 배양 접시에 코팅 용액 2 ㎖와 100mm 조직 배양 접시 긁힌, 37 ° C에서 / 가습 CO 2 인큐베이터 O에서 N을 접시를 품어. 진공 잉여 솔루션을 기음과 조직 세척 매체의 15 ml로 접시를 채운다. </li><li> 동물 관리 윤리위원회의 승인을 프로토콜에 따라 공동으로 2 흡입 (5~7주 세) C57BL / 6 마우스를 안락사. </li><li> 무균는 메스, 뒤몽 초 고화질 트위터, 수술 가위로 폐 조직을 해부하다. 조심스럽게 실질 조직과 혈관을 제거합니다. 해당되는 경우, 실험실로 전송을 위해 얼음처럼 차가운 조직 세탁기 중간에 폐 조직을 놓습니다. </li><li> 또한 티슈 세척 매체에 잠긴 해부 기관지 폐 및 말초 조직으로부터 1~2.5 mm의 직경을 분리 기관지. 메스와 ~ 5mm 두께의 기관지 반지에 조각 기관지 조직. </li&gt; <li> 기관지 조각을 픽업하여 요리의 긁힌 부분에 그들을 배치 할 멸균 곡선 microdissecting의 집게로 떠 모션을 사용합니다. </li><li> 조직 세탁기 매체를 제거하고, 그들에게 요리를 준수 할 수 있도록 ~ 5 분 동안 실온에서 조각을 배양한다. </li><li> 각각의 요리에 완전 치유 중간의 10 ML을 추가 및 공기 조절 모듈 형 인큐베이터 실에 배치합니다. 높은 O 2 가스 혼합물 (70 % O 2, 25 % N 2와 5 % CO 2)와 챔버 플러시. 벤치 탑 궤도 인큐베이터에있는 챔버를 놓고 37 ℃에서 흔들어. 매체를 통해 단편 간헐적 흐르게 분당 10 사이클에서 24 시간 동안 흔들어 챔버. </li><li> 24 시간 배양 후, 도립 위상차 광학 현미경 하에서 조직 절편을 관찰한다. 이후 LMPs 치료 완료, 좋은 머리의 움직임과 활기찬 기관지 상피 세포와 기관지 외식을 선택합니다. </li></ol>2.2) LMPs 치료 <ol><li> 다음과 같이 완전한 성장 매체를 준비 : 해동 성장 매체 보충제를 얼음에 혈청 및 섬유 아세포 억제제. 혈청 성장 배지 100 ㎖에 200 μL 억제제 섬유 아세포 성장 배지 보충제 1 ml의 추가; 잘 혼합. 사용하기 전에 10 분 동안 37 ° C에서 완전 성장 배지를 따뜻하게. </li><li> 800 ㎍ / ml의 농도로 LMPs 스톡을 제조 PBS로 새로운 멸균 에펜 도르프 튜브에 절연 LMPs 희석. </li><li> 12- 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 전체 성장 배지 0.5 ㎖의 추가. </li><li> 조직 배양 플레이트의 각 웰에 이전 프로토콜 (2.1)에서 곡선 microdissecting 집게로 선택한 기관지 외식을 전송합니다. </li><li> LMPs 처리 우물과 제어 우물을 식별하기 위해 적절하게 배양 플레이트 레이블. 25 μL 제어 차량 (40 ㎍ / ml의 최종 농도)도 각각 LMPs 처리에 25 μL LMPs 주식을 추가합니다 (LMP<html> 대조군 웰의 생산). </li><li> 부드러운 흔들림와 37 ° C에서 공기 조절 모듈 형 인큐베이터 실에서 배양을 계속합니다. </li><li> 24 시간 후, PBS로 절편을 3 회 세척하고 다음 단계 (4 % 파라 포름 알데히드 [PFA] 고정)를 진행합니다. </li></ol> 3. 조직 병리학 적 검사 3.1) 다음 단계로 진행하기 전에 다음 솔루션을 준비 <ol><li> 137 mM의 NaCl을, 2.7 mM의 KCl을 10 mM의 나 2 HPO 4, 1.76 mM의 KH 2 PO 4, 산도 7.4을 혼합하여 1X PBS 버퍼를 준비합니다. </li><li> 4 % PFA가 교반하면서 60 ℃에서 가열하고, 물 400 ㎖, PFA에서의 20g을 용해 제조하는 단계; 솔루션을 취소 10 M NaOH를 몇 방울을 추가합니다. 다음 1X PBS 버퍼를 추가하고 7.4에 500 ml의 부피와 산도를 조정합니다. 필터와 나누어지는; -20 ° C에서 저장합니다. </li><li> 다음 탈수 나 수분 보충 시약을 준비; 100 %, 90 %, 70 %, 50 % 에탄올, 크실렌. </li></ol>e_step &quot;&gt; 3.2) 이식편을 고정하고 조직 섹션 탈 파라핀 <ol><li> 4 % PFA 1.5 ml로 표시 microcentrifuge 관의 각 절편을 넣고 4 ℃에서 O / N을 배양한다. 1X PBS로 두 번 외식을 씻어. </li><li> 알코올 일련 이식편 탈수 (70 % 에탄올 : 각 3 회 30 분간, 90 % 에탄올 : 각 2 회 30 분 100 % 에탄올을 3 회 30 분 각 후 크실렌 : 3 회 20 분 각). 흄 후드에서 실온에서 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 오븐에서 58 ° C에서 파​​라핀 조직 절편을 임베드. 회전식 마이크로톰을 사용하여 5 μm의 두께 조직 섹션을 준비합니다. </li><li> 56 ° C의 물을 욕조에 섹션을 플로트 한 다음 표시된 조직 학적 슬라이드에 섹션을 탑재합니다. 1 시간 동안 65 ° C에서 수동 염색 랙 및 건조에 슬라이드를 놓습니다. 슬라이드 실온에서 냉각시킵니다. </li><li> 파라핀을 제거하기 위해 10 분마다 자일 렌을 포함하는 4 연속 얼룩 요리 랙을 찍어. 셀만 후 100 %, 95 % : 크실렌을 제거하는 에탄올 시리즈 랙을 찍어다음, 80 %, 70 %,이어서 50 % 에탄올 (단계마다 5 분간) KO. 에탄올을 제거하는 5 분 동안 수돗물 랙을 씻어. </li></ol> 3.3) 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 염색 <ol><li> 고정 된 조직 섹션 작업을 계속; 15 분 동안 마이어의 헤 마톡 실린 가득 염색 접시에 선반을 두십시오. 20 분 동안 헤 마톡 실린을 제거하기 위해 수돗물로 랙을 씻어. </li><li> 30 초 95 % 에탄올 30 sec.Place 증류수에 놓습니다. 1 분 동안 에오신 Y 솔루션 염색 접시에 놓습니다. 2 분마다 95 % 에탄올, 100 % 에탄올, 크실렌이 변화를 통해 탈수. </li><li> 초과 에오신가 제거되었는지 확인하기 위해 현미경으로 빠른 검사를 수행합니다. 커버 유리 커버 한 후, 각각의 슬라이드에 장착 중간 (피셔 SP15-100)의 2 ~ 3 방울을 놓습니다. </li></ol> 3.4) 현장 세포 죽음 검출 : TUNEL 분석 실험 <ol><li> 시작하기 전에, 단백질 분해 효소 K 작업 용액을 제조 : 20 ㎍ / ㎖의에10 mM 트리스 / 염산, pH가 7.4. </li><li> 3.2 절 (이식편 고정 및 조직 섹션 탈 파라핀)의 5 단계 1을 반복합니다. 탈의 H 2 O와 슬라이드를 씻어 </li><li> 10 분 동안 1X PBS로 슬라이드를 담근다. 초과 PBS를 배출합니다. 프로 테이나 제 K 작업 용액으로 RT에서 30 분 동안 조직 섹션을 인큐베이션. 린스는 1X PBS로 두 번 슬라이드. </li><li> 세포 죽음 탐지 키트의 사용 설명서에 기재된 바와 같이 TUNEL 분석을 수행한다. 설치 매체를 이용하여 장착하고 커버 글라스 수동으로 커버 슬립. </li><li> 광학 현미경 샘플을 분석 할 수 있습니다. 갈색 색상의 사멸 세포를 분석하는 프로 이미지 4.5을 ​​사용합니다. </li></ol>

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의원 간 크로스 토크의 활성 매개체 및 그들의 연구는 과학의 많은 분야에서 유망된다. (11)이 연구는 사멸의 T 세포주의 시험 관내 LMPs 대규모 생성을위한 상세한 프로토콜을 제시 하였다. 이러한 의원 림프구 분자의 큰 레퍼토리를 발현과 생물학적 세포 및 조직의 항상성 조절에 연루되어있다. 그러나, 서로 다른 소스에서 파생 된 LMPs 생물학적 다를 수 있습니다. 4,9,12,13 LMPs는 시험관 내에서 이들을 생성하는 데 자극 및 이들이 유래 된 세포에 따라 다양한 특성을 표시. 이와 같이, 생체 내에서 생성 된 데이터 LMPs 불멸화 세포주로부터 유래 LMPs를 이용한 시험 관내에서 얻어진 데이터를 외삽주의하여 수행되어야한다. 이 프로토콜은 의원의 분리를 위해 필요한 여러 원심 분리 단계를 설명한다; 따라서, Ca...

미립자(MP)는 세포 활성화 또는 세포사멸 후에 방출되는 생물학적으로 활성화된 초미크론 막 소포입니다. MP는 건강한 세포와 손상된 세포 모두에서 파생되며 많은 생리학적 및 병리학적 과정에 관여합니다. 1 MP는 인간 혈장뿐만 아니라 염증성 및 세포사멸성 조직에서도 검출되었습니다. 세포막 유래 MP의 생물학적 유용성은 세포 신호 전달 모델 및 약리학 도구를 포함한 다양한 환경에서 입증되었습니다. 2,3 우리는 이전에 악티노마이신 D 자극(세포사멸을 유도하기 위해) T 림프구에서 유래한 LMP가 혈관신생을 억제하고 내피 세포의 생존 및 증식을 억제한다는 것을 입증했습니다. 4,5 LMP의 항혈관신생 효과는 in vitro에서 T 림프구를 활성화하는 데 사용되는 자극에 따라 크게 달라질 수 있습니다. 6
기도 상피는 보호, 물리적, 기능적 장벽으로 기능합니다. 기도에 있는 T 림프구의 수가 증가하면 세포 손상과 기도 염증이 발생할 수 있습니다. 7 우리는 LMP가 인간 기관지 상피 세포의 세포사멸을 유도한다는 것을 보여주었으며,8 이는 LMP가 생체 내에서 기관지 상피의 장벽 기능을 변화시킬 수 있음을 나타냅니다. 세포사멸세포는 in situ DNA 단편화를 감지하는 TUNEL 방법을 사용하여 식별할 수 있습니다. 
이 프로토콜의 전반적인 목표는 T 림프구 세포주에서 LMP의 체외 생산을 설명하고 기도 상피 세포에 대한 proapoptotic 효과를 입증하는 것입니다. 제자리 세포 사멸 검출은 LMP가 기도 기관지 상피 세포 사멸을 강력하게 유도하는 것으로 입증되었으며, 이는 LMP에 의한 기도 상피 손상이 손상된 상피의 장벽 기능에 영향을 미칠 수 있음을 시사합니다.

<table><tbody><tr><td>LMP 생산 및 특성화</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CEM T 세포&nbsp;</td><td>ATCC&nbsp;</td><td>CCL-119</td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 미디엄&nbsp;</td><td>Cambrex, Walkersville</td><td>04-744Q</td><td></td></tr><tr><td>플라스크 T75</td><td>Sarstedt</td><td>83.1813.502</td><td></td></tr><tr><td>플라스크 T175</td><td>Sarstedt</td><td>83.1812.502</td><td></td></tr><tr><td>Actinomycin&nbsp; 디&nbsp;</td><td>시그마 케미컬</td><td>A9415-2mg</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lifetechnologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &마이크로; m 필터</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>Annexin-VCy5</td><td>BD Pharmagen&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>559933 FACS 유동 용액</td><td>BD Bio-sciences</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>형광 마이크로비즈(1 &micro; m)</td><td>분자 프로브&nbsp;</td><td>T8880</td><td></td></tr><tr><td>폴리스테렌 카운팅 비드 (7 &마이크로; m)</td><td>Bangs laboratories</td><td>PS06N/6994</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 FACS 튜브</td><td>Falcon</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>1ml 피펫</td><td>Fisher</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>5ml 피펫</td><td>Falcon</td><td>357543</td><td></td></tr><tr><td>25ml 피펫</td><td>Ultident</td><td>DL-357551</td><td></td></tr><tr><td>1.5ml 원추형 폴리프로필렌 마이크로 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>72.690</td><td></td></tr><tr><td>15ml 원추형 폴리프로필렌 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.205</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원추형 폴리프로필렌 튜브</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.205</td><td></td></tr><tr><td>50ml 고속 폴리프로필렌 공중합체 튜브</td><td>Nalgene</td><td>3119-0050</td><td></td></tr><tr><td>250ml 고속 폴리프로필렌 병</td><td>Beckman</td><td>356011</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분석(Bradford 분석)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>단백질 분석 표준 II</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>500-0007</td><td></td></tr><tr><td>시험관 16 x 100</td><td>VWR</td><td>47729-576</td><td></td></tr><tr><td>시험관 12 x 75</td><td>Ultident</td><td>170-14100005B</td><td></td></tr><tr><td>세포 인큐베이터&nbsp;</td><td>Mandel</td><td>Heracell 150</td><td></td></tr><tr><td>저속 원심분리기</td><td>IEC</td><td>Centra8R</td><td></td></tr><tr><td>고속 원심분리기</td><td>Beckman</td><td>Avanti J8</td><td></td></tr><tr><td>고속 로터 250ml 병용</td><td>Beckman</td><td>JLA16.250</td><td></td></tr><tr><td>고속 로터 50ml 튜브용</td><td>Beckman</td><td>JA30.50</td><td></td></tr><tr><td>Fow 세포분석&nbsp;</td><td>BD Bio-sciences</td><td>FACS Calibur</td><td></td></tr><tr><td>분광 광도계</td><td>Beckman</td><td>시리즈 600</td><td></td></tr><tr><td>기관지 조직 외식 및 절편&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스 (5-7주령)&nbsp; &nbsp;</td><td>찰스 리버 연구소, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>마우스 기도 PrimaCell&trade; 시스템 :</td> <td>CHI Scientific, Inc.</td><td>2-82001</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 립백 탄소강 메스 블레이드</td><td>Becton Dickinson AcuteCare</td><td>371310</td><td>#10</td></tr><tr><td>메스 핸들</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>10003-12</td><td>#7</td></tr><tr><td>위상차 도립 현미경</td><td>Olympus Optical CO., LTD.&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>CK2</td><td></td></tr><tr><td>높은 O2 가스 혼합물&nbsp;</td><td>VitalAire 캐나다 Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>모듈식 인큐베이터 챔버</td><td>Billups-Rothenberg Inc.</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>MaxQ 4000 인큐베이션 오비탈 쉐이커</td><td>Barnstead Lab-Line,&nbsp;</td><td>SHKA4000-7</td><td></td></tr><tr><td>12웰 조직 배양 플레이트</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>플라스틱 조직 배양 접시(100mm)</td><td>Sarstedt, Inc.</td><td>83.1802</td><td></td></tr><tr><td>수술용 가위</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>14060-09</td><td>직선, 날카롭고, 9cm 길이의</td></tr><tr><td>반곡선 Graefe 집게</td><td>Fine Science Tools Inc.&nbsp;</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>가습 CO2 인큐베이터</td><td>Mandel Scientific Company Inc.&nbsp;</td><td>SVH-51023421</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 조직병리학적 검사&nbsp;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>포르말린 포름알데히드</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>HT5011</td><td></td></tr><tr><td>파라핀</td><td>피셔 과학&nbsp; 인터내셔널, Inc.</td><td>T555</td><td></td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>Merck KGaA, 다름슈타트</td><td>EX0278-1</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 글루타르알데히드&nbsp;</td><td>시그마-알드리치, Inc.&nbsp;</td><td>G6403</td><td></td></tr><tr><td>카코딜레이트</td><td>시그마-알드리치, Inc.&nbsp;</td><td>31533</td><td></td></tr><tr><td>현미경 슬라이드</td><td>VWR Scientific Inc.&nbsp;</td><td>48300-025</td><td>25x75 mm</td></tr><tr><td>자일렌</td><td>피셔 과학&nbsp; 인터내셔널, Inc.</td><td>X5-4</td><td></td></tr><tr><td>Mayer의 헤마톡실린</td><td>Sigma-Aldrich, Inc.&nbsp;</td><td>MHS16</td><td>깔때기(여과지 포함)&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>HCl&nbsp;</td><td>피셔 사이언티픽&nbsp; 인터내셔널, Inc.&nbsp; &nbsp;</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>이온&nbsp;</td><td>시그마-알드리치, Inc.&nbsp;</td><td>HT110116</td><td>여과지가 있는 깔때기&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Permount&trade; 장착 매체</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.&nbsp;</td><td>SP15-100</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버슬립</td><td>수술 경로 의료 산업, Inc.</td><td>84503</td><td>24&times; 24&nbsp;#1&nbsp;</td></tr><tr><td>TUNEL 검출 키트</td><td>현장 세포 사멸 감지, POD</td><td>11 684 817 910</td><td></td></tr><tr><td>오븐</td><td>Despatch Industries Inc.</td><td>LEB-1-20</td><td></td></tr><tr><td>로터리 마이크로톰</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>RM2145</td><td></td></tr><tr><td>여과지</td><td>Whatman International Ltd.</td><td>1003150</td><td>#3</td></tr><tr><td>현미경</td><td>니콘 이미징 재팬 Inc.</td><td>E800</td><td></td></tr><tr><td>염색 접시 완료</td><td>Wheaton Industries, Inc.</td><td>900200</td><td>접시, 랙, 커버</td></tr><tr><td>포함 1.5ml 에펜도르프 튜브</td><td>Sarstedt Inc.&nbsp;</td><td>72.69</td><td>39x10 mm</td></tr><tr><td>궤도 및 왕복 수조</td><td>ExpotechUSA</td><td>ORS200</td><td></td></tr><tr><td>인산염 완충 식염수&nbsp; &nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>흄 후드</td><td>Nicram RD 서비스</td><td>3707E</td><td></td></tr></tbody></table>

기도 상피 세포에 림프 미세 입자 및 아폽토시스 효과의 검출 세대

Generation of Lymphocytic Microparticles and Detection of their Proapoptotic Effect on Airway Epithelial Cells

세포 간 통신 세포막 유래 소체의 생물학적 역할에 대한 관심이 최근 증가하고있다. 미세 입자 (의원) 1 ㎛, 0.1 ㎛의 범위에서 직경이, 소체의 하나의 이러한 유형이며, 통상적으로 활성화 또는 사멸을 겪는 진핵 세포의 세포막에서 나타냈다. 여기에서 우리는 D. LMPs는 다단계 차동 원심 분리 과정을 통해 고립되고 유동 세포 계측법하여 특성화 티노 마이신 자극 세포 사멸 CEM T 세포에서 T 림프구에서 유래 미세 입자 (LMPs)의 생성을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 마우스 호흡기 차 기관지 조직 이식편 유래의 기관지 상피 세포에서의 아폽토시스 LMPs 효과를 입증하기위한 인 시츄 세포 사멸 검출 방법을 제안한다. 여기에 설명 된 방법은 체외에서 세포 사멸 림프구에서 LMPs의 풍부한 수량을 분리하기위한 재현 과정을 제공합니다. LMPs 유도이와 같이 각종 질병 모델의 특성을 평가하는 데 사용되며, 약리학 및 독성학 테스트 할 수있다. 기도 상피는 외부 환경과 하부 조직 사이의 보호 물리적 및 기능적 장벽을 제공 감안할 기관지 조직 이식편보다는 불멸화 상피 세포주를 사용기도 관 조직을 요구 수사 효과적인 모델을 제공한다.

LMPs 형광 활성화 셀 (FACS) 분석을 정렬 및 의원 (≤1 μm의)의 97 %가 넥신-V-Cy5에 긍정적 된 1 μm의 구슬 사용 정문에 의해 넥신 V 염색 (10) 특성화되었다 (그림 1A 및 1B). 일반적 LMPs 약 2.5 mg을이 프로토콜 다음 얻었다. C57BL 기관지 조직 이식편은 / 6 마​​우스는 비히클 및 LMPs 처리를 실시 하였다. 기관지 섹션의 조직 병리학 적 분석은 기관지 상피 세포의 구조적 무결성에 LMPs의 효과를 한 것으로 밝혀졌습니다. 제어 외식에서 기관지 상피 세포 (그림 2A) 크게 손상되지 않은이었다; 그러나 LMPs 처리 이식편에서, 표면 상피 세포층이 손상되거나 손실 및 상피 세포 밀도 및 높이 (도 2B)에서 상당한 감소가 있었다 하였다. TUNEL 양성 염색 (세포 사멸의 마커)를 더 제어에 비해 LMPs 처리 기관지 상피 세포에서 발음되었다 ( <strong&gt;...

세포막 창 고 미립자 (의원) 절연 및 병태 생리 학적 효과는 다양한 모델에서 조사 할 수있는 활성 생물학적 소포입니다. 여기에서 우리는 T 림프구 (LMPs)에서 파생 된 의원을 생성하고기도 상피 세포에 자신의 아폽토시스 효과를 입증하는 방법을 설명합니다.

Interest in the biological roles of cell membrane&#8211;derived vesicles in cell&#8211;cell communication has increased in recent years. Microparticles ...

본 절차의 전반적인 목적은 T 림프구 세포주로부터 림프구 미세입자(lymphocytic microparticles, LMPs)를 인비트로(in vitro) 방식으로 생산하는 과정을 설명하고, 이것이 기도 상피세포에 미치는 세포 사멸 촉진 효과를 입증하는 것입니다. 이는 먼저 LMPs를 생산함으로써 이루어집니다. 그다음, 분리된 LMPs를 FACS 분석을 통해 특성 분석합니다.그런 다음 기관지 조직 외식편을 배양합니다. 마지막으로, 기관지 외식편에 LMP 처리를 수행합니다. 최종적으로, hematoxylin, eosin 및 NC 두 가지 세포 사멸 검사와 같은 조직병리학적 검사를 통해 LMP가 유도한 기관지 상피층 손상 및 상피세포 세포사멸을 확인합니다.인간 말초혈액에서 미세입자를 분리하는 것과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 시험관 내(in vitro) 작용을 통해 세포주로부터 유래된 미세입자를 대량으로 생성할 수 있다는 점입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 사람들은 기관지 설명 배양의 핵심 단계들을 준비하는 것이 쉽지 않기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 배양을 시작하려면 다음과 같이 합니다.150 mL의 신선한 배지가 담긴 4개의 T 175 플라스크에 CEMT 세포를 분주하고 37 °C에서 1 mL당 200만 개의 세포 밀도가 될 때까지 배양합니다. 각 플라스크의 세포를 200 ×g에서 5분 동안 원심분리하여 수집하고, 300 × 10⁶ 개의 세포를 150 mL의 신선한 배지가 담긴 새 T 175 플라스크에 다시 현탁합니다. 1 mL당 200만 개의 세포 밀도를 유지하기 위해, 최종 농도가 0.5 µg/mL가 되도록 37.5 µL의 actinomycin D를 배지에 첨가하고 37 °C에서 24시간 동안 배양합니다.모든 배양액을 50 mL 원심분리관(conical tubes)으로 옮기고, 750 ×g에서 5분 동안 원심분리합니다. 그 다음 상층액을 50 mL 원심분리관으로 옮겨 1500 ×g에서 15분 동안 원심분리하여 큰 세포 파편을 제거합니다. 이어서 상층액을 250 mL 병에 옮기고 12,000 ×g에서 50분 동안 초원심분리합니다.그런 다음 상층액을 버리고 펠릿을 수집합니다. 50 mL 튜브에 담긴 LMP 농축 펠릿을 40 mL의 멸균 PBS로 세척하고 12,000 ×g에서 50분 동안 원심분리합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.1 mL의 PBS와 함께 vehicle 대조군으로 사용할 마지막 세척 상층액을 수집합니다. 펠렛을 현탁하여 1.5 mL 멸균 마이크로 튜브 분주관에 옮기고, 분리된 LMP를 -80 °C에서 보관합니다. FACS 분석을 통해 미세입자를 특성화하려면, 먼저 염화칼슘이 포함된 것과 포함되지 않은 것 두 가지 버전의 nexin 버퍼 시료를 준비합니다.랙 튜브에 calcium chloride가 포함된 nexin 버퍼 44 µL와 LMPs 1 µL를 넣어 희석합니다. calcium chloride가 없는 nexin 버퍼를 사용하여 또 다른 튜브를 준비합니다. 다음으로, 각 튜브에 X and V sci five 5 µL를 추가하고 잘 섞은 후, 실온의 암소에서 15분 동안 배양합니다.배양 후, 400 µL의 fax flu sheath fluid를 사용하십시오. 반응을 중단시키기 위해, 각 튜브에 내부 표준물질로서 7 µm 카운팅 비드 현탁액 10 µL를 첨가합니다. 절대 수를 구하기 위해, 유세포 분석기에서 상대적 크기인 FSCH와 상대적 과립성인 SSCH 및 도트 플롯(dot plot)의 설정된 게이트(gate)를 사용하십시오.게이트 1을 위해 1 µm 크기의 보정용 형광 비드와 7 µm 카운팅 비드를 사용합니다. 게이트 2의 경우, 설정된 게이트를 사용하여 FSC-H/SSC-H 플롯에서 LMP 샘플을 분석하고, 게이트 2에서 카운팅 비드가 10,000개에 도달할 때까지 신호를 수집하여 FL4 채널의 annexin 도트 플롯을 분석합니다. 염화칼슘이 포함된 nexin 버퍼 내 LMP의 annexin 양성 이벤트를 측정하고, 염화칼슘이 없는 nexin 버퍼 내 LMP의 이벤트를 차감합니다. 다음 식을 바탕으로 LMP의 절대 수를 계산합니다.메스, dumont 초미세 핀셋 및 수술용 가위를 사용하여 폐 조직을 무균적으로 박리합니다. 실질과 혈관을 조심스럽게 제거하십시오. 조직 세척액에 잠긴 상태에서 기관지를 추가로 박리하여, 직경 1~2.5 mm의 기관지를 말단 폐 조직으로부터 분리합니다.메스를 사용하여 기관 조직을 약 5mm 두께의 기관 층으로 절단하며, 이때 멸균된 곡선형 미세 해부용 핀셋으로 긁어내는 동작을 사용합니다. 절단된 기관 조각들을 집어 올려 미리 준비한 디쉬의 긁힌 부위에 배치합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 조직 세척액을 제거하고, 조각들이 디쉬에 부착될 수 있도록 실온에서 약 5분 동안 배양합니다.각 디쉬에 10 milliliters의 완전 회복 배지를 넣고 고농도 산소 가스 혼합물이 들어 있는 제어 분위기 모듈형 인큐베이터 챔버에 넣습니다. 챔버를 플러싱한 다음, 벤치탑 궤도 인큐베이터에 넣고 37 degrees Celsius에서 24시간 동안 분당 10 cycles로 흔들어 배지가 조각 위로 간헐적으로 흐르게 합니다. 배양 후, 위상차 및 도립 광학 현미경으로 조직 절편을 관찰합니다. 미세모의 움직임이 완전하고 기관 상피가 활성 상태인 기관 절편을 선택하여 후속 LMP 처리에 사용합니다.LMP를 처리하기 위해, 방금 선택한 기관 조직편(bronchial explan)의 수를 세고 12-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 표시합니다. 각 조직편당 0.5 milliliters의 완전 성장 배지를 멸균 에펜도르프 튜브에 옮깁니다. 그런 다음 처리군 조직편당 25 microliters의 l 및 p 스톡을 추가하거나 25 microliters의 대조군 용매(control vehicle)를 추가합니다.대조군 외식편의 경우 튜브를 가볍게 두드려 잘 섞어줍니다. 혼합된 배지를 곡선형 미세 해부 핀셋을 사용하여 표시된 12-웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 옮깁니다. 선택한 각 기관지 외식편을 조직 배양 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.24시간 후, 37°C의 제어 분위기 모듈형 인큐베이터 챔버에서 부드럽게 흔들어주며 배양을 지속합니다. PBS를 사용하여 절편(EXPLAN)을 3회 세척하고, 고정, H&E 염색 및 TUNEL 분석을 진행합니다. 여기에 제시된 텍스트 프로토콜에 따라, LMP는 FACS 분석을 통한 Annexin V 염색으로 특성을 분석했으며, 1 µm 비드를 사용하여 게이팅한 결과 MP의 97%가 Annexin V 양성임을 확인하였습니다.일반적으로 본 프로토콜을 통해 약 2.5 mg의 LMP를 얻었습니다. C 57 black six 마우스에서 적출한 기관지 조직에 vehicle 및 LMP 처리를 수행하였습니다. 이 그림에서 기관지 절편의 조직병리학적 분석을 통해 LMP가 기관지 상피의 구조적 무결성에 미치는 영향을 확인할 수 있습니다.대조군 조직편에서 기관지 상피는 대부분 손상되지 않은 상태였습니다. 그러나 LMP 처리된 조직편에서는 표면 상피 세포층이 손상되었거나 소실되었으며, 여기에서 볼 수 있듯이 상피 세포의 높이와 밀도가 유의미하게 감소했습니다.세포 사멸의 마커인 Tunnel 양성 염색은 대조군 조직에 비해 LMP 처리된 기관 상피에서 더 뚜렷하게 나타났습니다. 이 절차를 수행할 때, 마이크로입자를 제조하고 조직 외식 배양을 진행하는 동안 멸균 상태에서 작업하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

여기, 우리는 폐에 타고난 면역 세포를 거주하고 polyanhydride의 nanoparticles와 공동으로 문화에 대한 응답으로 자신의 활성화를 검토하고 있습니다 murine 폐포 macrophages를 수확을위한 프로토콜을 설명합니다.

Polyanhydride의 Nanoparticles에 의해 유도된 Murine Macrophages 폐포 수확 및 평가 세포 활성화

이 비디오는 악티노마이신-D로 치료한 후 T 림프구에서 T 림프구 유래 미립자(LMP)의 생성 및 분리를 보여줍니다.

In vitro에서 Apoptotic T 림프구에서 유래한 미세입자의 분리

우리는 정밀 컷 폐 조각 (PCLS)를 생성하고, 폐에 다양한 면역 세포 유형의 현지화를 시각화하도록 면역 염색하는 방법을 설명합니다. 우리의 프로토콜은 다양한 조건 하에서 위치와 다양한 세포 유형의 기능을 시각화 할 수 있도록 확장 할 수 있습니다.

정밀 절단 라이브 폐 수지상 세포를 시각화하기 위해 마우스 폐 슬라이스

새로운 프로토콜 분리 하 고 인간에서 파생 된 미의 특성 설명 및 마우스 호 중구. 이러한 프로토콜 활용 ultracentrifugation, cytometry, 기술과 immunoblotting microparticle 콘텐츠를 분석 하 고 세포질 기능에 다양 한 셀 형식에서 파생 된 미의 역할을 연구 하기 사용할 수 있습니다.

절연 및 특성화 Neutrophil 파생 된 미의 기능 연구

형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 및 활성 caspase-1와 어댑터, ASC에 대 한 얼룩 세포질 기준 NLRP3 inflammasome 활성화의 탐지를 설명 합니다. 젖 산 효소 자료 분석 결과 인구 기준 pyroptotic 세포를 감지 하 여. 이 기술은 inflammasome 생물학의 여러 측면을 연구 적응 될 수 있다.

Inflammasome 활성화 및 Pyroptotic 세포 죽음 Murine 골 수 유래 세포에서의 검출

여기 소개 된 프로토콜 vivo에서 염증 성 조건 하에서 기본 인간 림프 톨의 폐 유도 용량 특성을 수 있습니다. 알레르기 염증의 마우스 모델에서 adoptively 전송된 인간의 면역 세포의 폐 침투 몇 군데 하 고 화학적으로 허가 폐 조직의 빛 시트 형광 현미경 검사 법에 의해 측정할 수 있습니다.

고급 폐 유도 빛 시트 현미경 검사 법에 따라 알레르기 염증의 Vivo 모델에서 실험에서 인간 림프 톨의 이미징

이 원고는 오존에 노출 여부를 결정하기위한 프로토콜을 설명, 기준 대기 오염 물질, 생체 내에서 폐포 대식세포 efferocysis를 손상. 이 프로토콜은 일반적으로 사용되는 시약 및 기술을 활용하고 폐 포상 손상의 여러 모델에 적응하여 폐포 대식세포 효능에 미치는 영향을 결정할 수 있습니다.

오존 노출 에 따른 폐포 대식세포 비세포증의 생체내 평가

당사는 CFBE41o-세포, THP-1 대식세포 및 슈도모나스 아에루기노사(공기-액체인터페이스)에 설립된 감염된 기도의 3차원 공동 배양 모델에 대한 프로토콜을 설명합니다.- 이 모델은 항생제 효능, 상피 장벽 기능 및 염증 성 마커를 동시에 테스트하는 새로운 플랫폼을 제공합니다.

P. 아루기노사 감염된 3D 기관상피세포 및 대식세포의 공동 배양

결합 된 오존과 세균성 내독신 노출 마우스는 호중구의 것을 포함하여 광범위한 세포 죽음을 보여줍니다. 우리는 세포 골격 라멜레포디아의 중단, 기관지 폐포 라베이지의 복잡한 V ATP synthase 서브유닛 β 및 혈관 스타틴의 세포 발현 증가, 폐 면역 반응 억제 및 지연 된 호중구 모집과 같은 세포 적응을 관찰했습니다.

결합 된 오존 과 LPS 유도 뮤린 급성 폐 부상 동안 폐 세포 적응 시각화

여기에 제시된 것은 장기 바이오뱅킹을 위한 원발성 기관지 상피 세포의 분리 및 확장과 공기-액체 계면에서 배양에 의한 분화된 상피 세포의 생성을 위한 재현 가능하고 저렴하며 강력한 방법입니다.

바이오뱅킹을 위해 절제된 폐 조직에서 기관지 상피 세포를 분리하고 잘 분화된 공기-액체 계면 배양을 확립합니다.

학습하세요 T 림프구에서 림프 미세 입자를 생산하고 기도 상피 세포에 대한 아폽토시스 효과를 분석하는 방법을. 이 기술은 면역 반응 및 세포 상호작용 연구에 활용됩니다.

기도 상피 세포에 림프 미세 입자 및 아폽토시스 효과의 검출 세대

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