기도 상피 세포에 림프 미세 입자 및 아폽토시스 효과의 검출 세대

이 절차의 전반적인 목표는 T 림프구 세포주에서 림프구 미세입자 또는 LMP의 체외 생산을 설명하고 기도 상피 세포에 대한 프로 세포사멸 효과를 입증하는 것입니다. 이는 먼저 LMP를 생산함으로써 달성됩니다. 다음으로, 격리된 LMP는 팩스 분석을 특징으로 합니다.

그런 다음 기관지 조직 이식을 배양합니다. 마지막으로 기관지 이식에 대한 LMP 치료를 수행합니다. 최종적으로 hemat, toin, eosin과 같은 조직병리학적 검사와 NC 2세포 사멸 검출을 사용하여 LMP 유도 기관지 상피층 손상 및 상피 세포 사멸을 보여줍니다.

인간 말초 혈액에서 미세입자를 분리하는 것과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포주에서 파생된 미립자를 대규모로 체외 작용으로 생성할 수 있다는 것입니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 기관지 엑스플랜 배양의 중요한 단계를 준비하기가 쉽지 않기 때문에 어려움을 겪을 것입니다. 문화를 시작합니다.

각각 150 밀리리터의 신선, 중간 및 섭씨 37 도에서 밀리리터당 200만 개의 세포 밀도로 배양하는 4개의 T 1 75 플라스크에 있는 CEMT 세포. 5분 동안 200배 G에서 원심분리하여 각 플라스크에서 세포를 모으고, 150밀리리터의 신선한 배지를 함유한 새로운 T 1 75 플라스크로 6개의 세포를 300배 10번 구부립니다. 밀리리터당 200만 개의 세포 밀도를 유지하려면 37.5마이크로리터의 액틴 마이신 D를 밀리리터당 0.5마이크로그램의 최종 농도로 배지에 첨가하고 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양합니다.

모든 배양 배지를 50ml 원추형 튜브로 옮기고 5분 동안 750배 G로 세포를 스핀다운합니다. 그런 다음 상등액을 50ml 원추형 튜브로 옮기고 1500배 G에서 15분 동안 원심분리하여 큰 세포 조각을 제거합니다. 다음으로, 상등액을 250 밀리리터 병에 옮기고 12, 000 번 G에서 50 분 동안 초 원심 분리기

그런 다음 상등액을 버리고 펠릿을 수집합니다. 40ml의 멸균 PBS를 사용하여 50ml 튜브의 LMP 강화 펠릿을 세척하고 50분 동안 12, 000회 G로 원심분리합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.

마지막 세척에서 상등액을 수집하여 1ml의 PBS가 있는 차량 제어로 사용합니다. 펠릿을 현탁시키고 1.5ml 멸균 마이크로 튜브 부분 표본으로 옮기고 분리된 LMP를 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 팩스 분석으로 미세입자를 특성화하려면 먼저 넥신 완충액의 두 샘플, 즉 염화칼슘이 있는 샘플과 칼슘이 없는 샘플을 준비합니다.

팩스 튜브에서 1마이크로리터의 LMP를 44마이크로리터의 넥신 완충액에 염화칼슘으로 희석합니다. 염화칼슘이 없는 넥신 완충액을 사용하여 다른 튜브를 준비합니다. 다음으로, 각 튜브에 X 및 V sci 5 5 마이크로 리터를 넣고 15 분 동안 실온에서 암흑 배양으로 잘 혼합합니다.

배양 후에는 400마이크로리터의 팩스 독감 칼집 액체를 사용하십시오. 반응을 중지하려면 각 튜브에 10마이크로리터의 7미크론 계수 비드 현탁액을 내부 표준물질로 추가합니다. 절대 계수를 얻기 위해 유세포 분석기에 상대 크기, FSCH 및 상대 입도 SSCH 및 점도표의 게이트를 설정했습니다.

게이트 1에 대해 1마이크로미터의 크기에 보정된 형광 비드를 사용하고 7마이크로미터에서 비드를 계산합니다. 게이트 2의 경우, 설정된 게이트를 사용하여 F-S-C-H-S-C-H 플롯에서 LMP 샘플을 분석하고 2보행에서 10, 000 계수 비드에 도달할 때까지 신호를 획득하여 아넥신 도트 플롯에 대한 FL 4 채널을 분석하고, 염화칼슘을 포함하는 넥신 완충액에서 LMP의 ex NV 이벤트에서 양성을 결정하고 염화칼슘이 없는 넥신 버퍼에서 LMP의 이벤트를 뺍니다. 다음 방정식에 따라 LMP의 절대 개수를 계산합니다.

메스 dumont 초미세 핀셋과 수술용 가위를 사용하여 폐 조직을 무균 적으로 절개합니다. 실질과 혈관을 조심스럽게 제거합니다. 조직 세척 매체에 잠긴 기관지를 더 나아가 절개하고 말초 폐 조직에서 직경 1-2.5mm의 기관지를 분리합니다.

메스를 사용하여 멸균 곡선 미세 절개 겸자로 퍼내는 동작을 사용하여 기관지 조직을 약 5mm 두께의 기관지 등급으로 자릅니다. 기관지 조각을 집어 미리 준비한 접시의 긁힌 부분에 놓습니다. 텍스트 프로토콜에 따라 조직 세척 매체를 제거하고 조각을 실온에서 약 5분 동안 배양하여 접시에 부착되도록 합니다.

각 접시에 10ml의 완전 치유 배지를 추가하고 고산소 가스 혼합물이 있는 제어된 분위기의 모듈식 인큐베이터 챔버에 넣고 챔버를 플러시한 다음 벤치탑 궤도 인큐베이터에 넣고 섭씨 37도에서 분당 10주기로 24시간 동안 흔들어 배지가 단편 위로 간헐적으로 흐르도록 합니다. 배양 후, 위상차 및 도립 광 현미경 하에서 조직 설명을 관찰하십시오. 후속 LMP 치료를 위해 완전한 가는 모발 움직임과 활기찬 기관지 상피를 갖춘 기관지 엑스플란을 선택하십시오.

LMP를 치료하려면 방금 선택한 기관지 엑스플랜을 세고 12웰 조직 배양 플레이트의 각 웰을 표시합니다. 각 엑스플랜에 대해 0.5ml의 완전 성장 배지를 멸균 einor 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 처리 계획당 25마이크로리터의 l 및 p 스톡을 추가하거나 25마이크로리터의 제어 차량을 추가합니다.

대조군은 튜브를 가볍게 두드려 잘 섞습니다. 혼합된 배지를 곡선형 마이크로 절제 겸자가 있는 표시된 12웰 조직 배양 플레이트의 각 웰로 옮깁니다. 선택된 각 기관지 x 엑스플을 조직 배양 플레이트의 각 웰로 옮깁니다.

섭씨 37도의 제어된 분위기의 모듈식 인큐베이터 챔버에서 24시간 후에 부드럽게 흔들어 배양을 계속합니다. PBS를 사용하여 EXPLAN을 세 번 세척하고 고정 h 및 e 염색 및 터널 분석을 진행합니다. 여기에 표시된 텍스트 프로토콜에 따라 LMP는 팩스 분석을 통해 nexin V 염색으로 특성화되었으며 mps의 97%가 nexin V sci-fi positive인 1마이크로미터 비드를 사용하여 게이트를 분석했습니다.

일반적으로 이 프로토콜에 따라 약 2.5mg의 LMP를 얻었습니다. C57 블랙 6 마우스의 기관지 조직 익스플랜을 차량 및 LMP 치료를 받았습니다. 이 그림에서 기관지 단면의 조직병리학적 분석은 기관지 상피의 구조적 무결성에 대한 LMP의 효과를 보여줍니다.

통제할 수 있습니다. 예를 들어, 기관지 상피는 대체로 손상되지 않았습니다. 그러나 LMP 처리한 외식에서는 표재성 상피 세포층이 손상되거나 손실되었으며 여기에서 볼 수 있듯이 상피 세포 높이와 밀도가 크게 감소했습니다.

세포사멸(apoptosis)에 대한 마커인 터널 양성 염색은 대조 조직에 비해 LMP 처리된 기관지 상피에서 더 뚜렷하게 나타났습니다. 이 절차를 시도하는 동안 미세입자를 생산하고 조직 엑스플랜 배양을 수행할 때 무균 상태에서 작업해야 한다는 것을 기억하는 것이 중요합니다.