Name: 본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: 학습하세요 천공 패치 클램프 기법을 이용하여 마우스 후각 상피에서 특정 후각 수용체를 발현하는 후각 감각 뉴런의 막 특성 변화를 측정하는 방법을. 이 기법은 후각 처리의 세포 수준 이해를 심화시킵니다.

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저자는 OR-GFP 마우스를 관대하게 선물한 Peter Mombaerts에게 감사를 표합니다. 앤 르프랑(Anne Lefranc)과 CSGA 동물 시설은 훌륭한 동물 보호를 제공합니다. 자금은 ATIP 및 ATIP Plus 보조금을 통해 CNRS에서, Conseil Régional de Bourgogne(FABER 및 PARI 보조금), Université de Bourgogne(BQR 프로그램)에서 제공했습니다.

이 프로토콜은 Université 드 부르고뉴의 동물 보호 지침을 다음과 Université 드 부르고뉴 윤리위원회에 의해 승인되었다. 1. 동물 <ol><li> 잭슨 연구소 가능한 유전자 조작 또는-IRES-tauGFP 마우스를 사용합니다. 이러한 마우스는 후각 기관 (19)의 축삭 타겟팅 및 개발을 분석하기 위해 닥터 피터 Mombaerts &#39;실험실에서 개발되었다. 예를 들어, MOR23-IRES-tauGFP 라인, 재고 번호 006643는 공식 변형 이름 B6 곰, 129P2- Olfr16 tm2Mom / MomJ을; 유사하게, SR1-IRES-tauGFP 라인은 재고 번호 6717의 공식 이름 B6 곰, 129P2- Olfr124 tm1Mom / MomJ을. </li><li> 동물의 연령에 대해서는 : 프로토콜의 더 나은 결과를 위해, 생후 2 4 주 사이에 동물을 사용한다. 이 연령 그룹에서 해부 쉽게 (부드러운 뼈, 탄력있는 후각 상피 세포)와 수지상 노브는 양방향입니다입니다gger 오래된 동물에 비교합니다. </li></ol> 전극 및 솔루션 2. 준비 <ol><li> 자극 피펫의 경우 : 구입 피펫을 자극 prepulled. 그렇지 않으면, 수동으로 준비합니다. <ol><li> 화염을 사용하여, 선단에서 약 1cm의 6 1mm 유리 피펫을 구부리. 구멍에 의해 강화 1.5 CM 열 수축 관에이 여섯 피펫 플러스 바로 7 번째를 삽입합니다. </li><li> 열은 배럴 함께 접착을 유지하기 위해 수축 배관. 배럴의 다른 말단에 추가로 열 수축 튜브를 연결합니다. 멀티 배럴 풀러와 함께이 자극 피펫을 당깁니다. </li><li> 굽​​ 팁을 강화하기 위해 구멍 주위에 약간의 흰색 액체 접착제를 추가합니다. 건조 O를 /의 N하자. </li></ol></li><li> 일반 링어의 세포 외 액의 1 또는 2 L 준비 (MM에서 : 염화나트륨 (124)의 KCl 3, 황산 1.3, CaCl2를 2, NaHCO3를 26의 NaH 2 PO 4 1.25, 포도당 (15), pH가 7.6, 305 mOsm). 4 ° C에서 유지사용할 때까지. </li><li> (MM)에 세포 원액 준비 : KCl을 70, KOH (53), 메탄 설 폰산 (30), EGTA 5, HEPES (10), 수 크로스 (70); pH가 7.2 (KOH), 310 mOsm. 사용까지 4 ℃에서 보관하십시오. 몇 주에 대 한 좋은. </li><li> 실험 전에 (마지막 순간) 즉흥적 니 스타틴과 세포 내 기록 솔루션을 준비합니다. <ol><li> DMSO의 50 μl를 추가, 니 스타틴의 3 mg의 무게; 완전히 희석 될 때까지 소용돌이 20 초 후 2 ~ 3 분을 초음파 처리. </li><li> 세포 내 원액 5ml에 DMSO-니 스타틴 용액 20 μl를 추가합니다. 소용돌이 20 초 후 3 분을 초음파 처리. 4 ° C에서이 솔루션을 유지하고 직사광선으로부터 보호, 니 스타틴은 빛에 민감한입니다. 이 용액을 몇 시간 동안 사용할 수있다. 매일 교체합니다. </li><li> 후각 상피 준비가 현미경되면, 전극을 채우기 위해 불꽃 긴 노란색 팁 1 ML의 주사기에이 솔루션의 일부를 가지고; 직사광선으로부터 보호합니다. RT에서, 니 스타틴 용액 일단안정되지; 매 시간마다 주사기 또는 얼음에 보관 ㎖로 1 솔루션을 교체합니다. </li></ol></li><li> 내부 니 스타틴 솔루션을 15 ~ 20 MΩ의 저항과 긴 목과 작은 팁 (~ 2 μm의)를 얻기 위해 풀러와 기록 전극을 당깁니다. </li><li> 흄 후드 아래에 DMSO 0.5 M에서 취제 솔루션을 준비; 나누어지는 및 사용할 때까지 -20 ° C에서 보관하십시오. 원하는 농도까지 링거액에 부 취제를 희석. 자극 피펫을 채 웁니다. </li></ol> 후각 상피 3. 준비 주 : OR-IRES-tauGFP 마우스는 OR 프로모터의 제어하에 tauGFP 표현. 이 마우스에서 관심의 또는를 표현하는 모든 신경 세포는 GFP로 표시되어 있습니다. 이 프로토콜은 모든 영역에서 발현 논리합하도록 구성된다. 그러나, 해부 및 녹음 등의 영역에서 표현 관찰 보고서에 대한 쉽다. <ol><li> 자일 라진 및 케타민 (150 ㎎ / ㎏ 및 10 ㎎ / ㎏ BOD의 혼합 주사하여 동물을 마취Y 무게, 각각). 참수는 젊은 쥐에 대한 이상 마우스에 대한 제대로 관리 설치류 단두대와 날카로운 가위로 수행 할 수 있습니다. <ol><li> 사용 링 해부 가위는 등쪽 피부를 통해 종 방향 내측 절개를합니다. 그것을 떨어져 당겨 피부를 제거합니다. 가위를 사용하여 턱 관절에서 아래턱을 잘라. 치아 관상 컷 병렬로 위 앞니를 제거합니다. </li><li> 눈 뒤에 머리의 관상 컷을 확인하고 머리의 앞쪽 부분을 유지. 범위에서 해부를위한 얼음처럼 차가운 링거 용액에 담근다. </li></ol></li><li> 범위에서 해부 : 복부 측면에서, 위 턱 / 이빨을 따라 길이 절단을합니다. 비강 배측-외측부 다음, 종 지느러미 뼈를 잘라. 대부분의 뼈와 미각을 제거; 실온에서 산소 벨소리에 부착 된 격벽과 상피 세포를 전송합니다. </li><li> 최종 절개의 경우 : 마우스 오른쪽 버튼으로 녹화를 시작하기 전에세션은, 집게로 기본 격막에서 상피를 벗겨. 집게와의 접착 성이 강한 격막의 앞쪽 부분에 두 4-5mm의 가위 컷 (사용 microvannas 가위)와 상피를 분리합니다. <ol><li> 조심스럽게 중격 상피에 그 등의 연결을 따라 밖으로 절단하여 골코 (vomeronasal) 기관을 제거합니다. 위로 향하게 점액층으로 기록 챔버로 이동 상피; 하프와 챔버에 평면을 유지. </li></ol></li><li> 형광 광학 및 민감한 카메라가 장착 된 수직 현미경 실을 설치합니다. 40X 물 침지 목표 (개구 0.8) 및 확대 렌즈에 의해 달성 여분의 2 배 또는 4 배 확대를 통해 높은 배율에서 컴퓨터 화면의 준비를 시각화. 실온에서 산소 벨소리 (1-2 ml / 분)와 함께 지속적으로 관류. </li></ol> 4. 녹음 세션 <ol><li> 형광 셀에 대한 검색 : 480에서 준비를 자극530-550 nm의 범위에서 발광 용 나노 EGFP; 형광의 밝은 분야에서 확실하게 볼 수 있습니다 하나 수지상 노브를 대상으로. </li><li> 니 스타틴과 세포 내 솔루션 전극을 채우기; 부드럽게 전극에 눌러 거품을 제거합니다. </li><li> , 전극 홀더에 전극을 삽입 피펫에 긍정적 인 압력을 적용; 저항은 15 ~ 20 MΩ해야한다. </li><li> 셀에 가까운 전극을 가져와; 저항 ~ 40 MΩ에 도달하면, 긍정적 인 압력을 해제하고 기가 시일에 도달하려면 약간의 부정적인 압력을 적용합니다. </li><li> 시일에 도달하면, 약 -75 MV의 막 전위를 설정; </li><li> 셀이 열리면 자극 프로토콜 약리 치료 진행. 단일 자극 취제, 기록 자발 활동 200-500 밀리에 대한 응답을 측정하기 위해 500 msec의 자극과 최대 10 초 13 대 세포의 반응을 측정한다. 약물 치료의 경우에서 약리 에이전트를 관류원하는 농도 (20). </li></ol> 5. 데이터 분석 <ol><li> 그 다음으로 취제 자극 유도 전류를 분석 (밀리 초에서 최대 진폭의 90 %에 도달하는데 필요한 시간)의 최대 진폭, 상승 시간, 전체 전류 (PAS의 곡선 아래 영역), 시간을 50 % (개시 및 밀리에서 최대 진폭의 50 %의 응답 시간 사이의 오프셋). <ol><li> 그리는 힐 방정식을 이용하여 투여 량 반응 곡선에 맞는 서로 다른 농도 (최대 진폭에 도달) 피크 전달 전류를 사용 : I = 아이 맥스 / (1 ​​+ (K 1/2 / C) N) I는 피크 전류를 나타내고, , 최대 반응의 절반에 도달되었을 때의 K1 / 2 농도, C 취제의 농도이고; n은 힐 (Hill) 계수를 포화 농도에서 최대 반응을 IMAX. </li></ol></li><li> 최대 탈분극의 현재 클램프자는 tota을 막 전위의 기록을 분석L 전위 (mVsec에서 곡선 아래 면적)를 유발; 30 초 ~ 1 분 녹음을 통해 기록 자발적인 급상승 활동; 전류 (5 ~ 10 PA)의 주입에 의해 유도 스파이크를 통해 기록 흥분. </li></ol>

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</ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

올바르게 건강한 OSNs의 특성을 모니터링이 프로토콜의 능력은 제제의 품질에 크게 의존한다. 따라서, 해부 단계는 매우 중요하다. 첫째는 품질 (PH, 삼투압), 산소 및 온도 (빙냉하지만 냉동 생략) 해부 배지에 주목하는 것이 중요하다. 둘째, 해부 도구 상피의 조작 등의 손상을 피하기 위해 가능한 한 제한해야한다. 마지막으로, 가능한 최대 OSN 인구를 액세스하기 위해 가능한 한 평탄 제제를 얻는 것이 중요하다. 해부 품질은 건강한 준비를 얻기 위해 필수적입니다. 해부를 지느러미 여기 우리는 복부를 제공하지만 일부 사용자는 빠르게 비강을 열고 후각 상피의 중격 홈에 빠르게 액세스 할 수있는 해부 등쪽을 시작하는 것을 선호 할 수 있습니다 그러나, 다른 방법은 절개 사용할 수 있습니다. 각 사용자는 따라서 홍보를 적용 할 수 있습니다관심 영역의 제조 건강한 도달하는 가장 효율적인 전략 otocol. 제제 현미경되면 제제의 ...

후각 감각 뉴런 (OSN)는 후각 인식의 첫 번째 단계를 나타냅니다. 설치류의 비강에 선을 긋고있는 후각 상피에 위치한, 그들은 뇌에 자신의 축삭을 통해 전송 활동 전위에 냄새 물질의 화학적 정보를 변환. 더 후각 부호화 메커니즘을 이해하기 위해서는 OSNs의 전달 및 막 특성을 특성화하는 것이 필요하다. 최근까지, 포유 동물 OSNs의 성질을 특성화하기 위해 사용되는 기법은 대부분 해리 OSNs 1-4에서 수행 하였다. 해리 과정은 자신의 환경에서 OSNs을 확보하기 위해 다양한 기계 및 화학 물질 (즉, 효소) 프로세스를 사용합니다. 이러한 과정은 녹화 가능 세포의 낮은 번호를 유도한다. 이러한 낮은 수는 GFP 표지 된 세포의 경우에 훨씬 더 중요 할 수있다. 해리도 및 OSNs surviv 중을 상승시킬 수 후각 상피의 다른 셀 간의 로컬 세포 간 상호 작용을 제거알과 OSNs &#39;속성의 변조. 해리 과정을 생략하기 위해, 제제는 그대로 5 개발되었다. 각 OSN은 큰 multigene 가족 (6)에서 선택 (OR) 하나의 후각 수용체를 표현한다. 마우스의 주요 후각 상피 세포에서 발현 1,000 관찰 보고서는 ~가 있습니다. 인해 야생형 동물 OR의 다수에, 기회는 동일한 발현 OSNs 기록 OR 매우 낮은한다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 유전자 표적으로 마우스를 사용할 수있는 식별 또는 형광 단백질 7-9로 표시되어 표현하는 모든 OSNs. 이 표시 OSNs는 해리 준비 앞에서 언급 한 단점과 7,10,11에 기능 분석을 수행 하였다. 유전자 표지 된 마우스의 상피 손상 5- 따라서 이러한 문제를 회피. 이것은 VI에서에 가까운 환경에서 정확하게 정의 논리합을 표현 OSNs의 활동의 모니터링을 허용가능한 한 VO. 게다가, OSNs의 패치 클램프 녹음도 막 특성, 전달 경로의 약리학, 리간드 / 또는 상호 작용의 정확한 분석을 할 수 있습니다. 이러한 모든 항목은 거의 세포 외 녹음을 사용하여 분석 할 수 없습니다. 우리 취제 수용체 SR1 및 MOR23 12,13 발현 OSNs의 응답을 모니터링하기 위해이 기술을 사용했다. 기술의 실현 가능성은 뉴런 15,16 표현 OSNs 14 발현 MOR23에 다른 그룹뿐만 아니라 다른 논리합에 의해 확인 하였다. OSNs의 정의 인구의 모니터링 (17) 노화, 이러한 개발 (14)와 같은 많은 다른 상황에서 그 특성의 분석으로 이어질 수, 부 취제 유도 소성 (18), 15 코딩 냄새에 후각 수용체의 서열 변화의 역할. 이 프로토콜은, 따라서 멤브레인 레벨에서 정의 OSNs의 기능적 특성을 모니터링하는 강력한 도구를 제공한다.

<table><tbody><tr><td>패러데이 케이지가 있는 진동 테이블</td><td>TMC</td><td>63-500 SERIES</td><td>필요 : 환경에 의해 유발된 진동(실험자의 움직임, 냉각 컴퓨터용 팬과 같은 장비의 진동 등)으로부터 기록 시스템을 격리합니다. 패러데이 케이지와 함께 구입하거나 맞춤형 패러데이 케이지를 장착할 수도 있습니다. 이 케이지는 환경 광학 장치의</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>전기 노이즈를 피하기 위해 권장됩니다.현미경</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>upright microcope, epifluorescence가 장착되어 있습니다. 사용자의 선호도에 따라 고정 또는 이동 스테이지</td></tr><tr><td>LUMPLFL40XW</td><td></td><td>Olympus</td>는 <td>최소 2개의 대물렌즈가 필요합니다: 세포에 대한 거친 접근을 위한 4X 또는 10X, 40X 침수 장거리 예: Olympus LUMPLFL40XW / IR /0,8 / WD:3.3 MM</td></tr><tr><td>돋보기</td><td>Olympus</td><td>U-TVCAC</td><td>필수 사항: 대물렌즈와 카메라 사이의 광 경로에 배치됩니다. 기록 전극 사진기 올림푸스 DP72를 가진 손잡이를 정확하게 도달하기 위하여 스크린에 심상을 확대하는 것을 허용하는</td></tr> 것은 <tr><td></td><td></td><td></td><td>좋은 사진기 형광에 있는 뿐 아니라 밝은 분야에서 신경을 볼 것을 요구된다; 통제 소프트웨어는 간단하 세포에 전극의 접근을 감시하기 위하여 사진을 찍고 살아있는 사진기 심상을 하는 것을 허용한다. 초고감도 카메라는 필요하지 않습니다</td></tr>. <tr><td></td><td>마우스에 사용된 형광 단백질에 따라 Olympus/Chroma를 필터링합니다. GFP의 예: 여기: BP460-490: 방출: HQ530/50m</td><td></td> 증폭기 HEKA EPC10 USB는 기록 전극을 통해 흐르는 전류를 모니터링하고 TTL 신호를 스프리처로 전송하여 퍼핑을 제어합니다. EPC10 설정은 컴퓨터 소프트웨어에 의해 제어됩니다.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td>는 실험 중 증폭기를 제어합니다.</td></tr><tr><td></td><td>Sutter</td><td>MP225</td><td>정밀 미세 조작기는 마이크로미터의 1/10까지 정확한 움직임을 허용합니다; 이 모델은 매우 안정적입니다;</td></tr><tr><td>전극 풀러</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>을 드리프트할 수 있는 유압 조작기를 피하십시오.FT345-B 넓은 트로프 필라멘트 포함; &nbsp; 대략 2&micro의 기록 피펫을 준비하기 위하여; 세포에 도달하는 긴 팁이있는 m 직경; 저항은 15-20Mohm이어야하며 천공 패치 클램프 솔루션</td></tr><tr><td>유리</td><td>Sutter</td><td>BF120-69-10</td> 녹음 <td>조건에서이 유리는 피펫</td></tr><tr><td>녹음 챔버</td><td>Warner Instruments</td><td>RC-26G</td> 챔버를 기록하는 데 <td>이상적이며 챔버는 현미경으로 준비를 설정하는 데 필요합니다. 챔버 중앙에서 준비물을 유지하려면 그물/앵커를 사용해야 합니다.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td>자극</tr><tr><td>유리</td><td>WPI</td><td>TW100F-4</td>는 <td>7개 그룹으로 연결되어 있으며, 이 피펫들은</td></tr><tr>풀과 트위스트의 연관성을 통해 멀티<td>배럴 풀러</td><td>MDI</td><td>PMP-107-Z</td>를 준비하는 데 사용되며<td>, 이 풀러는 우리가 7개의 배럴 정밀 압력 주입기로 퍼핑 전극을 준비할 수 있게 해줍니다</td></tr><tr><td>.</td><td>투히 컴퍼니</td><td>P/N T25-1-900 싱글 채널&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>이 정밀 압력 인젝터는 멀티배럴 풀러에서 분출되는 압력을 제어합니다; 이것은 수동으로 또는 증폭기에 의해 5V&nbsp; TTL</td></tr><tr><td>미세 매니퓰레이터</td><td>Narishige</td><td>YOU-1</td><td>거친 매니퓰레이터는 퍼핑 전극을 기록 사이트 튜빙에 가깝게 가져 오기에 충분합니다</td></tr><tr><td></td><td>: 패딩</td><td></td>의 <td>압력을 퍼핑 피펫</td></tr><tr><td>솔루션 / 관류 / 화학 물질</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>진공 펌프</td><td>Gardner Denver</td><td>300 시리즈</td><td>진동 멤브레인 펌프는 다른 유형의 펌프보다 조용하고 효율적입니다</td></tr>. <tr><td>관류 시스템</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>중력 관류 시스템, 기록 챔버에서 외부 용액을 반입 및 빼내는 폴리에틸렌 튜빙이 있는 시스템,</td></tr><tr><td>니스타틴</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3503</td>, <td>천공 패치 클램프용 내부 용액을 퍼페이퍼하는 데 필수</td></tr>, <tr><td>DIMETHYL SULFOXIDE</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td>천공된 패치에 대한 내부 용액을 위해 Nystatin을 용해하는 데 사용됩니다.</td></tr><tr><td>염화나트륨</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9625</td><td>세포외용액</td></tr> 염화<tr><td>칼</td>륨 <td>시그마-알드리치</td><td>P4504</td><td>세포내/세포외용액</td></tr> 염화<tr><td>칼슘 이수화물</td><td>시그마-알드리치</td><td>C7902</td><td>세포외용액</td></tr><tr><td>인산나트륨 일염기성 일수화물(NaH2PO4)</td><td>시그마-알드리치</td><td>S9638</td><td>세포 외 용액</td></tr><tr><td>: 황산 마그네슘 헵타 하이드레이트 (MgSO4 7H < > 2 O)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>63140</td><td>세포 외 용액</td></tr><tr><td>포도</td>당 <td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>세포 외 용액</td></tr><tr><td>중탄산 나트륨</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>세포 외 용액</td></tr><tr><td>EGTA (에틸렌 글리콜 -비스 (2- 아미노 에틸 에테르) -N, N, N&prime, - 테트라 아세트산)</td> <td>시그마 -알드리치</td><td>E3889</td><td>내부 용액</td></tr><tr><td>수산화 칼륨</td><td>시그마 -알드리치</td><td>P1767</td><td>내부 용액</td></tr><tr><td>메틸 설폭 사이드</td><td>시그마 알드리치</td><td>W387509</td><td>세포 내 용액</td></tr><tr><td>Hepes-Na</td><td>시그마 알드리치</td><td>H7006</td><td>세포 내 용액</td></tr><tr><td>설탕</td><td>시그마-알드리치</td><td>S0389</td><td>세포내 용액</td></tr></tbody></table>

본래 neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

Perforated Patch-clamp Recording of Mouse Olfactory Sensory Neurons in Intact Neuroepithelium: Functional Analysis of Neurons Expressing an Identified Odorant Receptor

특정 리간드로 자극시 후각 감각 뉴런의 생리적 반응 (OSN)를 분석하는 것은 후각 구동 동작과 그 변조의 기초를 이해하는 것이 중요하다. 이러한 코딩 특성은 냄새 분자와 후각 수용체 (OR) 사이의 초기 상호 작용에 크게 의존하는 OSNs로 표현. 명시 적 또는 중요한의 ID, 특이 리간드 스펙트럼. 또는의 리간드를 찾을 수있는 확률은 상피 내에서 무작위로 선택된 OSN 매우 낮은 표현했다. 이러한 과제를 해결하기 위해,이 프로토콜은 전적으로 정의 논리합의 프로모터의 제어하에 형광 단백질 GFP를 발현하는 태깅 된 마우스를 사용한다. OSNs는 이웃 세포가 자신의 성숙과 기능에 영향을 미치는으로, 비강 안감 꽉 및 조직 상피에 있습니다. 여기에서 우리는 OSNs 전자의 속성을 그대로 후각 상피를 분리하고 패치 클램프 녹음을 기록하는 방법을 설명정의 후각 수용체를 xpressing. 프로토콜은 인접한 조직의 영향을 유지하면서 하나 OSN 막 성질을 특성화 할 수있다. 패치 클램프 결과의 분석은 리간드 / 또는 상호 작용, 전달 경로 및 약리학, OSNs &#39;코딩 특성과 막 수준에서 자신의 변조의 정확한 정량을 산출한다.

이 프로토콜의 결과는 절개의 품질에 따라 달라집니다. 이 해부 단계는 짧은 (이하 10 분 ~ 15) 및 (즉, 상피 세포의 손상을 방지하기 위해) 정확해야합니다. 그림 1은 이상적인 준비가 다른 배율 수준에서처럼 보이는 방법을 보여줍니다. 밝은 필드 아래 낮은 배율 (예컨대 세포를지지 OSNs의 손잡이와 같은) 다른 유형의 세포는 구별 (도 1A)이다. 최대 배율 수준에서, 일반적으로 80X 160X에, 밝은 필드에 OSNs의 수지상 노브는지지 세포 (그림 1B)에서 명확하게 구별해야한다. 형광등 아래 만 수지상 노브와 GFP 표지 세포의 섬모 (그림 1C) 볼 수 있습니다. 두 이미지를 비교함으로써, 표지화 된 세포는 기록 피펫 (도 1D)으로 접근 할 수있다. 해부의 온도 때문에lution과 절개의 타이밍...

후각 감각 뉴런의 생리학적 특성을 분석하는 것은 여전히 기술적 한계에 직면해 있습니다. 여기에서 우리는 유전자 표적 마우스의 후각 상피의 온전한 준비에서 천공된 패치 클램프를 통해 기록합니다. 이 기술을 사용하면 정의된 후각 수용체를 발현하는 뉴런의 특정 리간드에 대한 멤브레인 특성과 반응을 특성화할 수 있습니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

Analyzing the physiological responses of olfactory sensory neurons (OSN) when stimulated with specific ligands is critical to understand the basis of ...

이 프로시저의 전반적인 목적은 후각 자극제에 반응하는 후각 신경세포의 막 특성 변화를 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 후각 상피를 박리하여 관류 챔버로 옮깁니다. 그 다음 단계로 현미경 하에서 관심 있는 후각 신경세포(OSN)를 찾아 선택합니다.선택한 OSN의 수지상 돌기 결절(dendritic knob)을 패치 클램프(patch clamp)하고 취향 물질로 자극하며 분석합니다. 최종적으로, OSN 수지상 돌기 결절의 천공 패치 클램프(perforated patch clamping)를 통해 막 수준에서의 OSN 기능적 특성을 규명합니다. 이 방법은 특정 후각 수용체를 발현하는 후각 감각 뉴런의 기록 및 패치 클램프 기록과 같이 후각 분야의 핵심적인 질문들을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.이 뉴런들의 막 특성에 관한 정보를 제공하십시오. 1mm 유리관으로 자극용 피펫을 제작하거나, 화염 연마(flame-pulling)가 완료된 기성 제품을 구매하십시오. 6개의 피펫을 팁에서 약 1cm 떨어진 지점에서 45도 각도로 구부리십시오.그런 다음 아이렛을 가이드로 삼아 6개의 굽은 팁 피펫을 7번째 직선 피펫 주위에 배치하고 수축 튜브로 감쌉니다. 피펫의 반대쪽 끝부분의 수축 튜브에 열을 가합니다. 수축 튜브를 추가로 적용합니다.이를 통해 7배럴 자극 피펫을 제작합니다. 이제 멀티 배럴 폴러를 사용하여 7배럴 자극 피펫을 당겨 만듭니다. 당긴 후에는 아이렛 주변에 흰색 접착제를 발라 조립체를 보강하십시오.그 후 필요한 용액들의 접착제가 하룻밤 동안 마르도록 둡니다. Nystatin 용액은 사용 직전에 신선하게 조제해야 합니다. 필요할 때 Nystatin 3 mg을 정량하여 50 µL의 DMSO에 첨가합니다.그 다음 혼합물을 20초 동안 볼텍싱합니다. 이어서, 완전히 희석되도록 혼합물을 2~3분 동안 초음파 처리합니다. 이제 혼합물 20 µL를 5 mL의 세포 내 스탁 용액(intracellular stock solution)에 첨가합니다.20초 동안 Vortex로 혼합한 후, 2~3분 동안 초음파 처리합니다. 그런 다음 작동 용액을 얼음 위에서 냉각시키고 빛이 차단된 상태로 준비해 둡니다. 이렇게 하면 작동 용액을 몇 시간 동안 사용할 수 있습니다.마이크로필름 장착 주사기에 작업 용액을 채웁니다. 채운 용액은 사용 시점까지 한 시간 동안 유효합니다. 단, 충전된 주사기는 얼음 위에 보관하여 보존하십시오.이제 목이 길고 구경이 2µm인 기록 전극을 뽑아냅니다. Nystatin 용액을 채웠을 때 저항값이 15~20 MΩ이 되도록 하는 것이 목표입니다. 마지막으로, 링거 용액(ringer solution)으로 희석한 냄새 물질을 자극 피펫에 채웁니다.이 프로토콜을 위해 생후 2주에서 4주 사이의 마우스를 준비하십시오. 본 영상에서는 or IRES tau GFP를 발현하는 마우스를 사용합니다. or IS tau GFP 마우스를 사용함으로써, 관심 있는 or을 발현하는 모든 뉴런이 GFP로 표지됩니다.이 방법은 모든 구역에서 사용하거나 발현시킬 수 있습니다. 하지만 배측 구역(dorsal zone)에서 발현된 OR의 경우 해부와 기록이 더 용이합니다. 먼저 마우스를 마취한 후 안락사(decapitation)시키십시오.이 프로토콜의 결과는 해부의 품질에 따라 달라집니다. 이러한 해부 단계는 가능한 한 짧고 정밀하게 수행되어야 합니다. 수술을 시작하려면 해부용 가위를 사용하여 등쪽을 따라 세로로 절개하십시오.피부를 당겨 제거합니다. 그런 다음 하악을 따라 절개하고 치아와 평행하게 관상 절개를 수행합니다. 이렇게 하여 상악 절치를 제거합니다.이제 눈 뒤쪽에서 머리 부분을 관상면으로 절단하여 후두부를 제거하고, 전두부를 얼음처럼 차가운 링거액(ringers)으로 옮깁니다. 그런 다음 해부 현미경 아래에서 5~10분 이내에 격막을 분리합니다. 복측을 따라 종단면으로 절단하는 것부터 시작하십시오.그 다음 비강의 배외측을 따라 등쪽 뼈를 세로로 절개합니다. 이어서 대부분의 뼈와 입천장을 제거합니다. 분리된 비중격과 부착 상피를 상온의 산소 공급 링거 용액이 담긴 용기로 옮깁니다.녹화를 시작하기 전 5분 이내에 최종 준비를 마칩니다. 용액의 온도가 너무 높으면 표본이 손상된 것처럼 보일 수 있습니다. 기록을 위해 신경 상피에 접근합니다.먼저, 핀셋을 사용하여 하부 비중격에서 상피를 벗겨냅니다. 그런 다음 micro Vanna 가위를 사용하여 비중격의 앞쪽 끝을 절단하여 상피를 분리합니다. 이제 서골비기관을 조심스럽게 제거합니다.등 쪽에 부착된 부분을 절단합니다. 분리된 상피 조직을 점액질 면이 위로 향하도록 하여 기록 챔버로 옮깁니다. 적절한 위치에 놓이면 하프를 사용하여 조직을 평평하게 폅니다.그다음 챔버를 정립 현미경으로 옮깁니다. 실온의 신선한 링거액을 계속해서 관류시키면서 40 x 수침 대물렌즈로 신경 상피를 관찰합니다. 관심 세포를 찾기 시작하는데, 이 경우에는 EGFP를 발현하므로 480 nanometers 광원을 사용하여 530에서 550 nanometer 범위의 빛을 방출하는 세포를 스캔합니다.명시야 하에서 80~160배 배율로 관찰했을 때, 표적이 되는 수지상 돌기 결절(dendritic knobs)과 후각신경세포(osn)가 지지 세포와 명확히 구분되어야 합니다. 이제 전극에 S statin 용액을 채웁니다. 형성된 기포를 톡톡 두드려 제거한 후, 전극을 홀더에 부착합니다.이제 양압을 가합니다. 예상 저항값은 15~20 MΩ 사이입니다. 그런 다음 양압을 유지하면서 전극을 셀로 가져옵니다.저항이 약 40 mega ohms까지 증가하면, 압력을 해제하고 약간의 음압을 가합니다. 기가실(giga seal)이 형성되면, 막전위를 약 -75 millivolts로 고정해야 합니다. 이제 세포가 개방되었으므로 실험을 진행하십시오.단일 취기제로 테스트하기 위해 필요에 따라 자극과 프로토콜을 적용하고 약물 처리를 통해 관류합니다. 200에서 500밀리초 동안의 자발적 활동을 기록합니다. 설명된 프로토콜을 사용하여 500밀리초 동안 취기제를 처리한 후 최대 10초 동안 반응을 측정합니다.EGFP가 표지된 뉴런을 발현하는 MOR 23을 패치 클램프하고 서로 다른 농도의 al로 자극하였습니다. 전류 고정(current clamp) 모드에서 lyal은 MOR 23의 리간드로 작용합니다. 또는, 전압 고정(voltage clamp) 모드에서 세포를 시뮬레이션하였습니다.전압 고정 모드 기록에서는 다양한 특성들이 모니터링되었습니다. 최대 진폭 반응을 이용한 전기생리학의 고전적 방식과 같이 반응을 정량화하기 위해, Hill 방정식을 사용하여 용량-반응 곡선을 도식화하였습니다. 이러한 결과는 각 OSN의 검출 임계값, 시간적 특성, 동적 특성, 동적 범위 및 포화 수준을 포함한 부호화 특성에 대한 정보를 제공합니다.이 기술의 해부 과정은 숙달되면 10분에서 15분 이내에 완료할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 마우스에서 특정 후각 수용체를 발현하는 후각 신경세포의 기능적 특성을 탐구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

perforated-patch-clamp-recording-mouse-olfactory-sensory-neurons

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

electroolfactogram (EOG) 녹음은 후각 상피의 수준에서 후각 기능을 평가의 유익 - 실시 - 쉽고 안정적​​인 방법입니다. 이 프로토콜은 녹음 설정, 마우스 조직 준비, 데이터 수집, 그리고 기본적인 데이터 분석을 설명합니다.

에어 - 상 Electroolfactogram 기록을 사용하여 마우스 강한 감각 뉴런의 분석 응답

후각 수용체 뉴런 (ORNs)는 수용체에 첫 소절에 후각 망울에서 두 번째 주문 뉴런에 전달 아르 액션 잠재력을 실행하는 현재의 냄새 신호를 변환합니다. 여기 동시에 odorant 유발 수용체 마우스 ORNs의 현재와 실천 가능성을 기록 할 수있는 흡입 피펫 기술을 설명합니다.

흡입 피펫 기법을 사용하여 강한 수용체 뉴런에서 기록 Odorant 유발 응답

이 비디오는 천공 패치 클램프 기술을 사용하여 마우스의 후각 감각 뉴런(OSN)을 전기생리학적으로 기록하는 방법을 보여줍니다. 형광단이 부착된 냄새 수용체를 가진 OSN을 포함하는 후각 상피는 마우스에서 분리되어 기록 챔버에 고정됩니다. 기록 피펫은 OSN의 수지상 손잡이에 고정되고 피펫 내의 니스타틴은 멤브레인에 구멍을 뚫어 세포와 전기적 연결을 형성합니다. 마지막으로, 다른 피펫을 사용하여 냄새 자극제를 전달하고 패치된 세포의 전기 생리학적 활성을 기록합니다.

생쥐의 후각 감각 뉴런에 대한 천공된 패치 클램프 기록

프로토콜 비디오는 마우스의 vomeronasal organ(VNO)의 감각 뉴런에서 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프를 설정하는 방법을 설명합니다. 형광 표지된 감각 뉴런이 있는 코로나 VNO 슬라이스가 기록 설정에 배치됩니다. 표지된 뉴런은 화학적 자극에 대한 반응으로 전기생리학적 기록을 위해 전체 세포 구성의 기록 피펫으로 패치됩니다.

Vomeronasal Sensory Neuron의 전기생리학적 기록을 위한 전체 세포 패치 클램프 구축

우리는 invertebrate 후각 경로의 처음 세 단계에서 냄새 evoked 응답을 특징하는 세포 다중 단위 기록 기술의 변화를 보여줍니다. 이 기술은 쉽게뿐만 아니라 다른 신경 시스템에서 앙상블 활동을 검토하도록 구성 할 수 있습니다.

메뚜기에 신경 활동을 특성화하기 위해 다중 단위 기록 방법 (<em&gt; Schistocerca 아메리카나</em&gt;) 강한 회로

보존 해부 조직 본래대로 마우스 비강 조직을 준비하는 효과적인 수동 발골 방법

후각 감각 뉴런의 섬모는 신호 전달 캐스케이드의 단백질을 포함하고 있지만, 냉동 절편에서 그 분포에 대한 자세한 공간 분석은 어렵습니다. 여기에서는 전체 마운트 라벨링 및 섬모 단백질의 얼굴 시각화를 위한 최적화된 접근 방식에 대해 설명합니다.

마우스의 메인 후각 시스템의 섬모의 전체 마운트 라벨링

여기에서는 전체 세포 패치-클램프 기록을 사용하여 마우스 조개 기관의 급성 관상 조직 절편에서 정의된 감각 뉴런 집단을 식별하고 심층 분석할 수 있는 생리학적 접근 방식을 설명합니다.

마우스 보습 코 기관의 급성 조직 조각에서 정의 된 세포 집단의 심층 생리 학적 분석

Odorant 수용 체의 기능을 특성화 deorphanization 과정에서 필수적인 부분을 제공 합니다. 우리 캠프 분석 결과 사용 하 여 실시간으로에서 odorant 수용 체의 활성화를 측정 하는 방법을 설명 합니다.

라이브 셀 측정의 Odorant 수용 체 활성화를 사용 하 여 분석 결과 실시간 캠프

후각 감각 뉴런은 적절한 신경 회로를 만들기 위해 다양한 축삭 정렬 분자를 발현합니다. 이 프로토콜은 후각 감각 뉴런의 축삭 종말에 축삭 - 정렬 분자의 조합 표현을 시각화하기 위해 면역 조직 화학 염색법을 설명합니다.

후각 감각 축색 돌연변이 분자 식별 코드의 시각화를위한 뒷 전구의 4 배 면역 면역 측정법

학습하세요 천공 패치 클램프 기법을 이용하여 마우스 후각 상피에서 특정 후각 수용체를 발현하는 후각 감각 뉴런의 막 특성 변화를 측정하는 방법을. 이 기법은 후각 처리의 세포 수준 이해를 심화시킵니다.

본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

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