본래 Neuroepithelium에서 마우스 강한 감각 뉴런의 천공 패치 클램프 녹음 : 확인 된 부 취제 수용체를 발현 뉴런의 기능 분석

이 절차의 전반적인 목표는 냄새 자극제에 대한 반응으로 후각 감각 뉴런의 막 특성의 변화를 측정하는 것입니다. 이것은 먼저 후각 상피를 절개하여 관류실로 이동시킴으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 현미경으로 관심 있는 OSN을 찾아 선택하는 것입니다.

그런 다음 선택한 OSN의 수지상 손잡이를 패치 클램핑하고 냄새 물질로 자극하면서 분석합니다. 궁극적으로, OSN 수지상 손잡이의 천공 패치 클램핑은 멤브레인 수준에서 OSN의 기능적 특성을 특징짓습니다. 이 방법은 후각, 감각 뉴런 기록, 정의된 냄새 예술 수용체 발현 및 패치 클램프 기록과 같은 후각 분야의 주요 질문을 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이러한 뉴런의 막 속성에 대한 정보를 제공합니다. 1mm 유리에서 자극적인 피펫을 준비하거나 화염을 사용하여 미리 잡아 당기는 것을 구입하십시오. 팁에서 약 1cm 떨어진 6개의 피펫을 45도 각도로 구부립니다.

그런 다음 구멍을 가이드로 사용하여 6개의 구부러진 팁 피펫을 7번째 직선 피펫 주위에 배치하고 열 수축 튜브로 감쌉니다. 피펫의 다른 쪽 끝에 있는 수축 랩을 가열합니다. 수축 포장을 더 많이 적용합니다.

이것은 prepo 7 배럴 자극 피펫을 만듭니다. 이제 멀티 배럴 폴라를 사용하여 7 개의 배럴 자극 피펫을 당깁니다. 당기면 구멍 주위에 흰색 접착제로 어셈블리를 강화합니다.

그런 다음 접착제가 필요한 용액을 밤새 건조시키도록 합니다. 니스타틴 용액은 사용하기 직전에 새로 만들어야 합니다. 필요한 경우 3mg의 니스타틴을 계량하여 50마이크로리터의 DMSO에 첨가합니다.

그런 다음 20초 동안 소용돌이 혼합물을 사용합니다. 다음으로, 혼합물을 2-3분 동안 초음파 처리하여 완전히 희석합니다. 이제 20마이크로리터의 혼합물을 5ml의 세포 내 스톡 용액에 추가합니다.

Vortex를 20 초 동안 믹스 한 다음 2-3 분 동안 초음파 처리하십시오. 그런 다음 작업 용액을 얼음으로 식히고 준비된 빛으로부터 차폐된 상태로 유지하십시오. 이렇게하면 작업 솔루션이 몇 시간 동안 좋습니다.

마이크로필름이 장착된 주사기에 작동하는 용액을 넣습니다. 사용할 때까지 한 시간 동안 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 장전된 주사기는 얼음 위에 보관하여 보관하십시오.

이제 긴 목과 2미크론 구멍이 있는 녹음 전극을 당깁니다. 목표는 Nystatin 용액이 로드되면 15-20메가 옴의 저항을 얻는 것입니다. 마지막으로, 자극 피펫에 링거에 희석된 냄새 물질을 로드합니다. 용액.

이 프로토콜의 경우 생후 2주에서 4주 사이에 마우스를 사용할 수 있습니다. 본 발표에서는 마우스 발현 또는 IRES 타우 GFP 마우스를 사용하거나 IS 타우 GFP 마우스를 사용한다. 관심 있는 or을 발현하는 모든 뉴런은 GFP로 표지됩니다.

이 방법은 모든 영역에 대해 사용되거나 표현될 수 있습니다. 그러나 등쪽 영역에서 발현되는 OR의 경우 해부 및 기록이 더 쉬울 것입니다. 먼저 쥐를 마취한 다음 목을 베십시오.

이 프로토콜의 결과는 해부의 품질에 따라 달라집니다. 이러한 해부 단계는 가능한 한 짧고 정확해야 합니다. 수술을 시작하려면 해부 가위를 사용하여 등쪽을 따라 세로로 자릅니다.

피부를 당겨 제거합니다. 그런 다음 아래턱을 따라 자르고 치아와 평행하게 관상 모양을 자릅니다. 따라서 위쪽 앞니를 제거하십시오.

이제 머리 주위, 눈 뒤를 관상 동맥 절단하고 뒤쪽 머리를 버리고 앞쪽 부분을 얼음처럼 차가운 링거로 옮깁니다. 이제 해부 현미경으로 5-10분 이내에 중격을 분리하십시오. 복부 쪽을 따라 세로로 절단하는 것으로 시작합니다.

그런 다음 비강의 등쪽 측면을 따라 등뼈를 세로로 자릅니다. 다음으로 대부분의 뼈와 입천장을 제거합니다. 분리된 중격을 옮기고 상피를 실온에서 산소가 공급된 링거 용기에 부착합니다.

5분 이내에 녹음하기 전에 최종 준비를 합니다. 용액이 너무 뜨거워서는 안 되며 그렇지 않으면 준비물이 손상된 것처럼 보일 수 있습니다. 기록을 위해 신경 상피에 접근하기 위해.

먼저 겸자로 밑에 있는 중격에서 상피를 벗겨냅니다. 그런 다음 마이크로 Vanna 가위를 사용하여 중격의 앞쪽 끝을 잘라 상피를 풀어줍니다. 이제 보머 코 기관을 조심스럽게 제거합니다.

등쪽에 부착된 부분을 잘라냅니다. 이제 분리된 상피를 점액 쪽이 위로 향하는 기록 챔버로 이동할 수 있습니다. 제자리에 고정되면 하프를 사용하여 조직을 평평하게 만듭니다.

그런 다음 챔버를 정립 현미경으로 옮깁니다. 40배 침수 대물렌즈 아래에서 신경 상피를 시각화하는 동시에 실온에서 새로운 링거로 지속적으로 관류합니다. 이 경우 EGFP를 발현하는 관심 세포를 검색하기 시작하기 위해 480 나노 미터 광을 사용하여 530-550 나노 미터 범위의 광을 방출하는 세포를 스캔합니다.

명시야에서 80-160 x에서 검토했을 때 표적 수지상 손잡이와 osn은 지지 세포와 명확하게 구별할 수 있어야 합니다. 이제 전극에 S 스타틴 용액을 로드합니다. 형성되는 기포를 두드리고 전극을 홀더에 부착합니다.

이제 약간의 긍정적 인 압력을 가하십시오. 예상 저항은 15에서 20메가옴 사이입니다. 그런 다음 양압을 유지하면서 전극을 셀로 가져옵니다.

저항이 약 40메가옴으로 증가하면 압력을 해제하고 약간의 음압을 가합니다. 기가 씰이 만들어지면 멤브레인 전위는 약 음의 75밀리볼트로 고정되어야 합니다. 이제 셀이 열렸으므로 실험을 진행합니다.

자극, 프로토콜 및 관류를 적용하고 필요에 따라 약물 치료와 함께 관류하여 단일 냄새 물질로 테스트합니다. 200-500밀리초의 자발적인 활동을 기록합니다. 500밀리초 동안 냄새 물질을 도포한 다음 설명된 프로토콜을 사용하여 최대 10초 동안 반응을 측정합니다.

EGFP로 표지된 뉴런을 발현하는 MOR 23을 상이한 농도의 al로 패치하고 자극하였다. 전류 클램프 모드에서 lyal은 MOR 23의 리간드입니다. 대안적으로, 셀은 전압 클램프 모드에서 시뮬레이션되었습니다.

전압 클램프 모드 기록에서 다양한 특성을 모니터링했습니다. 최대 진폭 반응을 사용하여 전기생리학에서 고전적으로 수행된 반응을 정량화하기 위해 용량 반응은 hill 방정식을 사용하여 표시되었습니다. 이러한 결과는 감지 임계값, 시간, 동적, 동적 범위 및 채도 수준을 포함하는 각 OSN의 인코딩 속성에 대한 정보를 제공합니다.

일단 숙달되면이 기술의 해부 부분은 10-15 분 이내에 완료 할 수 있습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 마우스에서 정의된 냄새 수용체를 발현하는 후각 감각 뉴런의 기능적 특성을 탐색하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.