정위 사출 기술을 적용하는 것은 동물의 행동에 유전 적 영향을 연구하기

이 절차의 전반적인 목표는 표적 부위의 유전자 발현을 조절하는 것이 동물의 행동에 어떤 영향을 미치는지 평가하는 것입니다. 이는 먼저 렌티바이러스(lentivirus)를 생성하여 표적 유전자의 발현을 조절함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 정위 주사를 사용하여 렌티바이러스를 ER 설치류의 특정 뇌 영역에 주입

다음으로 불안 및 우울증과 같은 행동은 확립된 행동 패러다임을 사용하여 정량적으로 측정할 수 있습니다. 마지막 단계는 올바른 주사 부위를 확인하기 위해 조직학을 수행하는 것입니다. 궁극적으로, 행동 평가와 쌍을 이루는 정위 주입은 목표 영역의 특정 유전자가 쥐의 행동에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 보여줄 수 있습니다.

기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 과학자들이 작은 표적 영역에서 단일 유전자의 발현을 변경한 다음 쥐의 행동 변화를 평가할 수 있다는 것입니다. 이 절차를 시작하려면 마취된 마우스를 정위 장치에 놓고 앞니를 전방 클램프에 걸고 턱을 고정합니다. 그런 다음 이어바를 외이도에 삽입하여 머리를 완전히 안정시킵니다.

그런 다음 마우스 아래에 가열 패드를 놓아 체온을 조절합니다. 절차 전반에 걸쳐 건조를 방지하기 위해 설치류의 눈에 인공 눈물을 놓습니다. 그 후, 먼저 10% 포비돈 요오드를 면봉으로 원을 그리며 문질러 수술 부위를 깨끗이 닦습니다.

그런 다음 같은 방식으로 수술 부위에 70% 에틸 알코올을 문지릅니다. 이 청소 절차를 두 번 더 반복합니다. 마우스가 준비되면 멸균 장비 백을 엽니다.

기구를 만지기 전에 장갑을 교체하십시오. 그런 다음 멸균 천을 꺼내 천 위에 기구를 놓습니다. 이제 혈액 끝 집게로 마우스의 피부를 부드럽게 잡고 메스를 사용하여 절개하십시오.

귀 위 약 1.5cm 절개를 시작으로 귀 아래 약 0.5cm 지점까지 확대하여 bgma를 노출시킵니다. bgma가 시각화되면 멸균 면 팁을 사용하여 두개골 표면을 덮고 있는 혈액을 부드럽게 제거합니다. 그런 다음 두 개의 면 끝을 사용하여 피부를 머리 옆으로 밀어 넣습니다.

다음으로, 흄 후드에 주사기에 주입할 바이러스를 채웁니다. 내부에 기포가 갇혀 있지 않은지 확인하십시오. 그런 다음 주사기를 정위 장치에 놓고 완전히 고정되었는지 확인합니다.

그런 다음 주사기가 두개골 표면 바로 위에 올 때까지 주사기를 천천히 내립니다. 그런 다음 멸균 주사기 바늘의 끝을 B bgma와 inter rural line의 교차점으로 이동합니다. 이 점을 0으로 설정합니다.

그런 다음 관심 영역의 좌표를 설정합니다. 주사기의 바늘을 뚫을 대상 위치로 이동합니다. 그런 다음 드릴 비트를 두개골과 45도 각도로 대상 부위 바로 위에 놓고 드릴링을 시작합니다.

피질 손상을 방지하기 위해 뇌를 뚫지 않도록 주의한다. 그런 다음 멸균 면봉으로 구멍에서 혈액을 닦아냅니다. 주사기 끝이 뇌 표면에 바로 오도록 주사기를 내립니다.

DV 좌표를 0으로 설정한 다음 주사기를 원하는 깊이로 내립니다. 이제 분당 0.2 마이크로 리터의 속도로 주입을 시작하십시오. 주사가 끝난 후 잔류 바이러스가 흡수되었는지 확인하기 위해 약 2분 정도 기다립니다.

그런 다음 천천히 주사기를 들어 올립니다. 면 팁을 사용하여 주입 부위에서 액체를 청소하십시오. 그 후, 피부를 봉합하고 정위 시스템에서 동물을 제거하십시오.

깨어날 때까지 마우스를 가열 패드에 올려 놓고 필요할 때 추가 진통제를 투여합니다. 이 절차에서 플라스틱 사각형 경기장을 얻습니다. 실험하기 전에 70%에틸 알코올로 경기장을 청소하십시오.

그런 다음 경기장을 바닥에 놓고 그림자와 눈부심을 최소화하도록 조명이 설정되어 있는지 확인합니다. 그런 다음 마우스가 화면에 표시되도록 감지 설정을 조정합니다. 그런 다음 카메라를 켜서 행동 작업을 기록하고 마우스가 벽을 향하도록 경기장 중앙 전면을 향해 마우스를 놓습니다.

타이머를 5분으로 맞추고 경기장에서 물러나거나 방을 나갑니다. 5분 후 마우스를 케이지로 다시 옮깁니다. 다음 동물로 진행하기 전에 70% 에틸 알코올을 사용하여 밭을 철저히 청소하십시오.

이제 2리터 투명 양동이에 22도의 물을 채웁니다. 양동이를 바닥에 놓고 그림자와 눈부심을 최소화하도록 조명이 설정되어 있는지 확인하십시오. 추적 소프트웨어를 사용하는 경우 카메라를 버킷 바로 위에 배치하십시오.

마우스가 화면에 쉽게 보이도록 소프트웨어 설정을 조정합니다. 그런 다음 카메라를 켜서 동작 작업을 기록합니다. 앞발이 나오도록 물통 중앙에 마우스를 부드럽게 놓습니다.

먼저 물을 만지고 머리가 잠기지 않도록 하십시오. 그런 다음 행동 영역에서 멀어지기 전에 타이머를 6분 동안 설정하십시오. 6분 후 양동이에서 마우스를 꺼내고 케이지에 다시 넣기 전에 과도한 물을 닦아냅니다.

다음은 치상회(dentate gyrus)에 바이러스를 성공적으로 주입하는 것을 보여주는 대표적인 뇌 절편입니다. 이 그림은 대조군 마우스와 실험용 마우스가 새로운 열린 필드의 중심에서 보낸 시간을 보여줍니다. 실험용 마우스는 경기장 중앙에서 훨씬 적은 시간을 보냈는데, 이는 불안의 표현형을 나타내며, 이 그림은 강제 수영 테스트에서 대조군 마우스와 실험용 마우스가 움직이지 않는 시간을 보여줍니다.

실험용 마우스는 움직이지 않는 데 보낸 시간의 양에서 대조군과 크게 다르지 않았습니다. 이 비디오를 시청한 후 시청자는 설치류 행동을 평가하기 위해 정위 주사를 사용하는 방법에 대해 잘 알게 될 것입니다.