아데노 바이러스 혈청 형 5 된 벡터 백신 접근 방법의 개발을위한 항원 캡시드-설립 전략을 활용

본 절차의 전반적인 목표는 항원 캡시드 삽입 전략을 활용하여 아데노바이러스 5형 벡터 백신 접근법을 개발하는 것입니다. 원리 증명을 위해 재조합 2가 아데노바이러스 벡터를 사용하며, 항원 캡시드 삽입 전략을 통해 여러 단계의 클로닝 과정을 거쳐 변형된 플라스미드인 A D five R one K-W-S-H-V-R five hiss를 구축합니다. 다음으로, 2가 아데노바이러스 벡터 R one K was HVR five를 사용합니다.

Hiss를 회수, 증식 및 정제합니다. 그 다음 바이러스 역가와 바이러스 캡시드에 통합된 항원의 항원성 발현을 분석합니다. 마지막으로, 항원 캡시드 통합 전략을 사용하여 2가 아데노 바이러스 벡터가 D 5 양성 혈청에 의한 중화를 회피할 수 있는 가능성을 평가합니다.

수정된 플라스미드인 A D five R one K-W-A-S-H-V-R five hiss를 구축하기 위해 여러 단계의 클로닝 과정이 사용됩니다. 오늘은 항원 캡시드 삽입 전략을 시연하겠습니다. 이 전략은 트랜스진 발현 방법과 같은 다른 전략과 비교했을 때 유익한데, 이는 표적 항원을 아데노바이러스 캡시드에 단백질 형태로 발현시킬 뿐만 아니라, 해당 항원에 대한 강력한 체액성 면역 반응을 유도하기 때문입니다.

캡(cap)을 수정하는 아데노바이러스 생성 단계는 제한 효소의 선택, 관심 에너지의 길이 등 권장 바이러스 벡터 개발에 영향을 미치는 변수가 많아 학습하기 어렵기 때문에, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다. 오늘 절차를 시연할 분들은 제 포스트닥터인 Lin Lin Gu 박사와 Nitra Farrow 박사, 그리고 연구소의 연구원으로 재직 중인 Alexandre Kren입니다. 셔틀 플라스미드를 구축하려면 HVR 1 KWA 단편 6 µg에 GE 1과 CCC 1을 각각 6 unit씩 첨가하십시오.

소화 반응물을 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 2% agarose gel 전기영동으로 소화된 단편을 분리하고, 제조사의 프로토콜에 따라 DNA gel extraction kit를 사용하여 해당 단편을 정제합니다. 다음으로, 정제된 단편 12 ng을 이전에 구축한 셔틀 플라스미드 100 ng의 A1 및 ACC1 부위에 결찰합니다.

HVR five hiss six pH five s와 10 µL의 반응 부피로 상온에서 2시간 동안 반응시킵니다. 그 후, 리게이션 반응액 1 µL를 전기천공 유능 DH5α 세포 50 µL에 첨가하고, SOC 배지 950 µL를 추가하기 전에 전기천공을 수행합니다. 형질전환된 세포를 37 °C, 200 RPM에서 1시간 동안 배양한 후, 배양액 100~200 µL를 LB CANY 플레이트에 도말합니다.

37 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 정제된 셔틀 플라스미드 6 µg을 소화시키기 위해 Echo R1과 PME1을 각각 6 unit씩 사용하여 37 °C에서 3시간 동안 반응시킵니다. 상동 재조합 암(arm)과 이중 변형된 exon 5 유전자를 포함하는 단편을 정제한 후, SUA1을 사용하여 백본 플라스미드인 PAD5, delta H5를 선형화하여 상동 재조합을 수행하십시오.

전기천공법을 사용하여 정제된 셔틀 단편 100 nanograms와 백본 플라스미드 100 nanograms를 각각 50 microliters의 전기천공 가능 BJ 5 180 3 세포에 공동 형질전환합니다. 이 비디오의 앞부분에서 시연한 바와 같이, 다음 날 캔마이신이 포함된 3 milliliters의 액체 LB 배지에서 약 10개의 콜로니를 선택하여 하룻밤 동안 배양한 후, 텍스트 프로토콜에 따라 스크리닝을 수행합니다. 그 다음, 이전에 시연한 방법대로 정제된 플라스미드 100 nanograms를 DH five alpha 세포에 형질전환하여 ad 바이러스 벡터를 회수합니다.

먼저 PAC one을 사용하여 100 µL 부피에서 벡터 15 µL를 선형화합니다. 제한효소 처리 후 37 °C에서 3시간 동안 배양합니다. 흄 후드 아래에서 선형화된 플라스미드를 추출합니다.

반응액에 동일한 부피의 페놀 클로로포름-이소아밀 알코올을 첨가하고 10,000 G에서 1분간 원심분리한 후, 상층액을 수집합니다. 추출된 부피만큼 추출과 원심분리 과정을 반복합니다. 100% ethanol 300 µL와 acetate 10 µL를 첨가하고 10,000 G에서 10분간 원심분리합니다. 이후 상층액을 제거하고 70% ethanol 700 µL를 첨가한 뒤 다시 원심분리합니다.

펠렛을 재부유하고 DNA 양을 정량한 후, 제조사의 지침에 따라 선형화된 플라스미드 3 µg을 상용 리포좀 transfection 시약과 함께 80% 밀도로 증식한 HEK 293 세포가 담긴 기준비된 T 25 플라스크에 transfection합니다. 6시간 동안 배양한 후, transfection 배지를 완전 배지로 교체하고 플라스크를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 무균 후드 내에서 플라크가 완전한 세포병성 효과(CPE)를 나타내면, 플라스크에 남은 세포를 스크레이퍼로 긁어내고 배양액을 300 G, 4 °C에서 10분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 2%FBS가 포함된 배지 1mL를 사용하여 세포 펠렛을 재부유합니다. 이어서, 4회의 동결-해동 과정을 통해 세포를 파쇄한 후, 용해물을 4°C에서 10분간 원심분리합니다. 회수된 바이러스가 포함된 S 상층액을 수집하여 바이러스 벡터를 대량 배양합니다.

T 25 플라스크의 모든 바이러스 용해물 중 3분의 1을 HEK 2 93 세포가 들어 있는 T 75 플라스크에 옮깁니다. 완전한 CPE가 발생할 때까지 기다린 후 이전에 설명한 방식대로 상층액을 수확하고, 모든 바이러스의 절반을 하나 이상의 T 1 75 HK 2 93 세포 플라스크에서 증식시킵니다. 그 다음, T 1 75 플라스크에서 분리한 바이러스를 12개 이상의 플라스크에서 증식시킵니다.

1.33 g/mL 및 1.45 g/mL의 염화세슘 용액을 준비한 후 T 75 플라스크의 세포를 처리합니다. 초원심분리관에 1.33 g/mL 염화세슘 4 mL를 넣고, 동일한 관의 바닥 부분에 1.45 g/mL 염화세슘 4 mL를 조심스럽게 추가합니다. 동일한 관의 맨 위에 바이러스 용해물 상층액 4 mL를 넣은 다음, 110,000 ×g, 4 °C 조건에서 3시간 동안 원심분리합니다.

이를 통해 내부적으로 성숙한 하단 바이러스 밴드와 결함이 있는 상단 바이러스 밴드를 분리할 수 있습니다. 3 mL 주사기에 장착된 33 gauge 바늘을 사용하여 하단 밴드를 수집하십시오. 그 후 5 \mu L의 용액을 추가하여 전체 용량을 4 mL로 맞추십시오.

그런 다음 세슘 클로라이드 밀도 구배를 두 개 더 준비하고, 희석된 바이러스를 상단에 로딩한 뒤 110,000 G, 4 °C에서 하룻밤 동안 원심분리합니다. 기기 내부에서 작동시킵니다. 방금 시연한 대로 바이러스 밴드를 수집하십시오.

그런 다음 33 gauge 바늘과 3 mL 주사기를 사용하여 바이러스 용액을 투석 카세트에 주입하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 준비된 1x 투석 완충액 700 mL에 카세트를 넣고, 3시간마다 완충액을 총 4회 교체하십시오. 그 후 바늘과 주사기를 사용하여 수행하십시오.

바이러스 물리적 역가를 결정하기 위해 카세트에서 바이러스 용액을 수집합니다. 바이러스 용액과 배경 대조군으로 사용된 투석 버퍼를 모두 바이러스 용해 버퍼를 사용하여 1:10 및 1:20 비율로 희석한 후, 모든 튜브를 56 °C에서 10분 동안 배양합니다. 바이오 포토미터를 켜고 흡광도 모드를 260 nm의 광학 밀도로 설정합니다.

blank 버튼을 클릭하여 1:10으로 희석한 투석 완충액을 사용하여 배경 신호를 보정합니다. 바이오 포토미터 화면에 10 plus 90을 입력합니다. 튜브를 1:10으로 희석한 바이러스 튜브로 교체하고 1:10으로 희석한 바이러스의 신호를 측정합니다.

1:20 희석액을 측정하려면, 1:20으로 희석한 투석 버퍼를 사용하여 화면에 5+95를 입력해 배경값을 맞춘 다음, 버퍼 튜브를 1:20으로 희석된 바이러스 튜브로 교체하여 신호를 읽습니다. 두 바이러스 판독 값에 1.1 × 10¹²을 곱하고, 두 희석액에서 얻은 개별 타이터의 평균을 계산하여 VP/mL 단위의 평균 타이터를 구합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 마우스에서 바이러스를 평가하여, 복구된 바이러스의 바이러스 캡시드 표면에 항원성 HIV 항원과 hist tag가 나타나는지 확인합니다.

주요 단백질 Heon five. 여기에서 보여지는 바와 같이, human two F five 단클론 항체와 mouse anti hiss tag 단클론 항체를 사용하여 각각 ELISA를 수행하였습니다. human two F five 항체와 mouse anti hiss 항체 모두 이가 add five 바이러스 입자에 결합한 반면, 음성 대조군인 A five 벡터에는 결합하지 않았습니다. human two F five 항체와 mouse anti hiss 항체 모두 약 117 kilodaltons 부근에서만 특이적 밴드를 검출하였으며, 이를 통해 ELISA 데이터를 Western blot 분석으로 확인하였습니다.

DIVALENT에 Heon five 단백질의 크기에 해당하는 add five 바이러스를 추가합니다. 제작된 add five 바이러스가 add five 양성 혈청에 의한 중화를 회피할 수 있는 가능성을 평가하기 위해 중화 분석을 수행하였습니다. 결과에 따르면, 대조군 add five 벡터를 add five 양성 혈청으로 처리했을 때보다 처리하지 않았을 때의 상대 발광 단위(rlu)가 12배 더 높게 나타났으며, 이는 바이러스가 중화되었음을 시사합니다.

반면, 처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플 사이의 구축된 2가 AD5 바이러스의 R 사용량에는 거의 차이가 없었으며, 이는 구축된 바이러스가 중화를 회피했음을 시사합니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 AD5 벡터 백신 개발을 위한 항원 캡시드 통합 접근법에 대해 더 깊이 이해하게 될 것입니다. 현재 저희는 이 전략을 희귀 혈청형 벡터와 결합하여 사용하고 있습니다.

이 방법 또한 가능합니다.