아데노 바이러스 혈청 형 5 된 벡터 백신 접근 방법의 개발을위한 항원 캡시드-설립 전략을 활용

이 절차의 전반적인 목표는 항원 캡시드 혼입 전략을 사용하여 재조합 2가 아데노바이러스 벡터를 원리 증명으로 사용하는 아데노바이러스 혈청형 5 벡터 백신 접근법의 개발을 위해 항원 캡 통합 전략을 활용하는 것이며, 여러 클로닝 단계를 사용하여 변형된 플라스미드, A D five R one K-W-S-H-V-R five hiss를 구성합니다. 다음은 2가 아데닐 바이러스 벡터입니다. R one K는 HVR 5였습니다.

히스는 구출되고, 전파되고, 정화됩니다. 그런 다음 바이러스 역가와 바이러스 캡시드에 통합된 항원의 항원 표시를 특성화합니다. 마지막으로, D five 양성 혈청에 의한 중화를 우회할 수 있는 2가 Aden 바이러스 벡터의 잠재력은 항원 캡시드 통합 전략을 사용하여 평가됩니다.

변형된 플라스미드, A D five R one K-W-A-S-H-V-R 5 히스를 구성하기 위해 여러 클로닝 단계가 사용됩니다. 오늘 우리는 항원 캡시드 혼입 전략을 시연할 것입니다. 이 전략은 아데노바이러스 포획물에 대한 관심 항원을 단백질로 표시할 뿐만 아니라 해당 항원에 대한 강력한 체액성 반응을 허용하기 때문에 전이유전자 발현법과 같은 다른 전략에 비해 유용합니다.

캡 변형 아데노바이러스의 생성에 관한 단계는 많은 변수가 제한 효소의 선택, 다른 사람의 관심 에너지 렌즈와 같은 권장 바이러스 벡터의 개발에 기여하기 때문에 배우기 어렵기 때문에 이 방법의 시각적 시연이 중요합니다. 오늘은 두 명의 박사후 연구원인 Lin Lin Gu 박사와 Nitra Farrow 박사입니다. 또한 실험실의 연구원 인 알렉산드르 크렌 (Alexandre Kren)은 셔틀 플라스미드를 구성하기 위해 GE 1 및 CCC 1 6 개 단위를 각각 6 개 단위의 HVR 1 KWA 단편을 6 마이크로 그램으로 첨가합니다.

소화 반응을 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 전기영동으로 2%agros 젤의 소화 단편을 분해하고 제조업체의 프로토콜에 따라 DNA 겔 추출 키트를 사용하여 단편을 정제합니다. 다음으로, 정제된 단편 12나노그램을 이전에 구축된 셔틀 플라스미드 100나노그램의 a G one 및 ACC one 부위에 접합합니다.

HVR 5, 히스 6, pH 5s 및 10마이크로리터 반응 부피를 실온에서 2시간 동안 수행합니다. 그런 다음 50 마이크로 리터의 전기 역량 DH 5 알파 셀, 950 마이크로 리터의 SOC 배지를 추가하기 전에 1 마이크로 리터의 결찰 반응을 추가합니다. 형질전환된 세포를 섭씨 37도 및 200RPM에서 1시간 동안 배양한 후 100-200마이크로리터의 배양액을 LB CANY 플레이트에 펴 놓습니다.

섭씨 37도에서 밤새 배양합니다. Echo R 1 및 PME 1 각각 6 단위를 사용하여 3 시간 동안 섭씨 37도에서 6 마이크로 그램의 정제 된 셔틀 플라스미드를 소화합니다. 상동 재조합 팔과 이중 변형 엑손 5 유전자를 포함하는 단편을 정제 한 후 SUA 1을 사용하여 백본 플라스미드를 선형화하고 PAD 5, 델타 H 5를 사용하여 상동 재조합을 수행합니다.

전기천공법을 사용하여 정제된 셔틀 단편과 백본 플라스미드 각각을 100나노그램씩 50마이크로리터의 전기 유능한 BJ 5 180 3 셀로 동시 변환합니다. 다음 날 이 비디오의 앞부분에서 시연된 바와 같이, 약 10개의 콜로니를 마이신 캔이 함유된 3밀리리터의 액체 LB로 선택하고 텍스트 프로토콜에 따라 스크리닝하기 전에 밤새 성장합니다. 그런 다음 100나노그램의 정제된 플라스미드를 이전에 입증된 바와 같이 DH 5 알파 세포로 변환하여 추가 바이러스 벡터를 구합니다.

PAC one을 사용하여 100마이크로리터 부피에서 15마이크로리터의 벡터를 선형화하는 것으로 시작합니다. 소화 후 섭씨 37도에서 3시간 동안 배양합니다. 흄 후드 아래에서 선형화된 플라스미드를 추출합니다.

10, 1 분 동안 000 G에 반응 분리기에 석탄산 클로로포름, isoamyl 알콜의 동일한 양을 추가하고 추출한 양에 적출 및 회전급강하를 반복하기 전에 상등액을 모으십시오. 100%ethanol의 300 마이크로리터 및 아세테이트 회전급강하의 10 마이크로리터를 10 분 동안 000 G 급강하하십시오. 그런 다음 상등액을 버린 후 다시 회전하기 전에 700 마이크로 리터의 70 % 에탄올을 첨가하십시오.

펠릿이 재현탁되고 DNA가 정량화되면, 제조업체의 지침에 따라 상용 리포솜 형질주입 시약과 함께 3마이크로그램의 선형화된 플라스미드를 80% confluent HEK 2 93 cells의 이전에 준비된 T 25 플라스크에 transfection합니다. 6시간 동안 배양한 후, 플라스크를 인큐베이터로 되돌리기 전에 형질 주입 배지를 완전한 배지로 교체하십시오. 멸균 후드 아래에서 플라크가 완전한 세포요법 효과 또는 CPE를 나타내면 플라스크에서 남은 세포를 긁어내고 배양액을 300G과 섭씨 4도에서 10분 동안 원심분리합니다.

그런 다음 2%FBS를 함유한 배지 1ml를 사용하여 세포 펠릿을 재현탁합니다. 다음으로, 4 차례의 동결 해동을 수행하여 세포를 부술 다음 용해물을 섭씨 4도에서 10 분 동안 원심 분리합니다. 구조된 바이러스를 함유한 S 상등액을 수집하여 바이러스 벡터를 대규모 배양에 전파합니다.

T 25 플라스크에서 HEK 2 93 세포를 포함하는 T 75 플라스크로 모든 바이러스 용해물의 1/3을 추출합니다. 앞에서 설명한 대로 전체 CPE가 발생하고 supinate를 수확한 후 하나 이상의 바이러스로 모든 바이러스의 절반을 전파합니다. 그런 다음 HK 2 93 세포의 T 1 75 플라스크가 1 1 75 플라스크에서 분리된 바이러스를 12개 이상으로 증식시킵니다.

T 1 75 플라스크의 세포를 1 포인트 준비 후 33 밀리리터 당 33 그램 및 1.45 밀리리터 그램. 염화세슘 용액은 초원심분리기 튜브에 4밀리리터, 밀리리터당 1.33그램의 염화세슘을 추가하고 동일한 튜브의 바닥에 4밀리리터, 밀리리터당 1.45그램의 염화세슘을 추가합니다. 동일한 튜브의 상단에 4 밀리리터의 바이러스 용해물 supinate를 추가 한 다음 110, 000G 및 섭씨 4 도에서 튜브를 3 시간 동안 원심 분리하십시오.

이렇게 하면 후드 아래의 결함이 있는 높은 바이러스 밴드와 성숙한 하위 바이러스 밴드가 분리됩니다. 3밀리리터 주사기에 부착된 33게이지 바늘을 사용하여 아래쪽 밴드를 수집합니다. 그런 다음 5 개의 히피를 사용하여 용액을 최대 4 밀리리터까지 가져옵니다.

그런 다음 두 가지 더 염화 세슘 구배를 준비한 후 희석된 바이러스를 맨 위에 로드하고 하룻밤 동안 110, 000G 및 섭씨 4도에서 구배를 원심분리합니다. 내부적으로. 방금 시연한 대로 바이럴 밴드를 수집하십시오.

그런 다음 33게이지 바늘과 3밀리리터 주사기를 사용하여 바이러스 용액을 투석 카세트에 주입합니다. 텍스트 프로토콜에 따라 준비된 700ml의 1 x 투석 버퍼에 카세트를 넣고 3시간마다 4회 버퍼를 교체했습니다. 그런 다음 바늘과 주사기를 사용합니다.

카세트에서 바이러스 용액을 수집하여 바이러스 물리적 역가를 측정합니다. 바이러스 용해 완충액을 사용하여 백그라운드 컨트롤로 사용되는 바이러스와 투석 완충액을 모두 1에서 10 및 1에서 20으로 희석하고 모든 튜브를 섭씨 56도에서 10분 동안 배양합니다. 바이오 광도계를 켜고 흡광도 모드를 260나노미터의 광학 밀도로 설정합니다.

1에서 10으로 희석된 투석 버퍼를 사용하여 빈 버튼을 클릭하여 배경 신호의 균형을 맞춥니다. 생체 광도계 화면에 10 더하기 90을 입력합니다. 튜브를 1 대 10으로 희석 된 바이러스 튜브로 교체하고 1 대 10으로 희석 된 바이러스의 신호를 읽습니다.

1에서 20까지의 희석량을 측정하려면 1에서 20으로 희석된 투석 버퍼를 사용하여 배경의 균형을 맞추고 화면에 5와 95를 입력한 후 버퍼 튜브를 1에서 20의 희석된 바이러스 튜브로 교체하고 신호를 읽습니다. 두 바이러스 판독 수치에 1.1 곱하기 10을 12에 곱하고 두 dilu의 두 개별 역가를 기준으로 밀리리터당 VP 단위로 평균 역가를 계산합니다. 구출된 바이러스가 바이러스 캡시드 표면에 항원성 HIV 항원 및 히스트 태그를 표시하는지 여부를 입증하기 위해 텍스트 프로토콜에 따라 마우스의 바이러스를 평가합니다.

중요한 단백질 Heon 5. Eliza는 본 명세서에 나타난 바와 같이 각각 human two F five monoclonal antibody 및 mouse anti hiss tag monoclonal anti anti를 사용하여 수행하였으며, human two F five 항체 및 mouse anti hiss 항체는 모두 2가에 결합된 5개의 바이러스 입자를 첨가하는 반면, 음성 대조군에는 결합이 없었다. 인간 2 F 5 항체와 마우스 안티 히스 항체가 모두 약 117 킬로달톤의 특정 대역만 검출됨에 따라 E iza 데이터를 확인하기 위해 5 벡터 서양 혈액 분석을 사용했습니다.

DIVALENT에서 Heon 5 단백질의 크기에 해당하는 5 개의 바이러스를 추가합니다. 구성된 add five 바이러스의 가능성을 평가하기 위해 add five positives를 추가하여 중화를 회피할 수 있는 가능성을 평가하기 위해 neutralization assay를 수행했습니다. 그 결과, 대조군이 5 양성 혈청을 첨가하지 않고 치료했을 때 상대적 발광 단위 또는 rlu가 혈청으로 처리되었을 때보다 12배 더 높았으며, 이는 바이러스가 중화되었음을 시사합니다.

대조적으로, 처리된 샘플과 처리되지 않은 샘플 간에 구성된 2가 AD five 바이러스에 대한 R 사용에는 거의 차이가 없었으며, 이는 구성된 바이러스가 중화를 회피했음을 시사합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 5가지 벡터를 추가하는 백신 개발을 위한 항원 캡시드 통합 접근법에 대해 더 잘 이해하게 될 것입니다. 현재 우리는 이 전략을 희귀 혈청형 벡터와 함께 사용하고 있습니다.

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