배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해

본 실험 절차의 목적은 인간 골 조직 외식편(explan) 모델 시스템에서 유방암 세포의 증식, 군집 형성 및 이동을 연구하는 것입니다. 이를 위해 대퇴골두 수술 검체에서 해면골 조직 조각을 분리하고, 루시퍼레이스(luciferase)와 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)을 발현하는 유방암 세포와 함께 배양합니다. 생체 발광 이미징을 통해 세포의 증식을 측정하고, 골 조직 조각 내 유방암 세포의 군집 형성을 확인합니다.

형광 현미경을 통해 유방암 세포의 군집 형성 패턴을 이미지화합니다. 골수 구획은 유세포 분석, 발광 및 염색 분석을 위해 조각에서 세척하여 회수할 수 있습니다. 조직 배양 상층액 및 뼈 조직 조각을 향한 유방암 세포의 이동은 생물 발광 이미징이 가능한 Transwell 이동 챔버에서 측정합니다. 뼈는 유방암 전이가 가장 빈번하게 일어나는 부위이며, 궁극적으로 이 모델은 뼈 전이 틈새 내의 유방암 세포를 연구할 수 있는 새로운 창을 제공합니다.

이 모델의 큰 장점은 인간 골 조직 조각의 미세환경에 직접 접근할 수 있어, 단기 공배양 실험 동안 유방암 세포의 거동을 쉽게 관찰하고 분석할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 유방암의 골 전이 기저 메커니즘에 관한 핵심 질문을 연구하는 데 사용될 수 있으며, 이를 통해 전이를 효과적으로 예방하고 치료하기 위한 치료 전략을 식별하는 것을 목표로 합니다. 이 모델은 유방암 전이에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 전립선암과 같은 다른 골 친화성 악성 종양을 연구하는 데에도 활용될 수 있습니다.

각 분석 단계의 여러 지점에서 골 조직 조각을 채취해야 합니다. 우선 생리식염수에 담긴 대퇴골 표본을 수집 및 운반하고, 수술용 장갑을 착용한 상태에서 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내의 작업대를 준비합니다. 한 손으로 대퇴골두를 잡고 수술용 톱을 사용하여 해면골을 추출합니다.

파편의 크기는 약 2~5 mm입니다. 이 단계에서는 포셉을 사용할 수 없습니다. 품질이 좋은 외과용 톱이 필요합니다.

본 실험을 위해, 10% FBS가 포함된 DMEM 50 µL당 100,000개의 세포가 포함된 유방암 세포 현탁액을 준비하십시오. 또한, 마이크로 파이펫 팁의 절단된 끝부분을 사용하여 골편을 고정하는 데 사용할 본 왁스 플러그를 제작하고, 이 플러그들을 페트리 접시에 보관하십시오. 그 후 핀셋을 사용하여 플러그를 6-웰 플레이트로 옮기고, 멸균 장갑을 사용하여 플러그를 12시 방향 위치에 눌러 고정하십시오.

다음으로, 각 웰의 중앙에 세포 현탁액 50 µL를 피펫으로 분주합니다. 세포 부착을 촉진하기 위해 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 45분 동안 보관합니다. 플레이트가 배양되는 동안, 세포가 부착된 골편을 추출합니다. 3개의 웰에 있는 본 왁스 위에 골 조직편을 하나씩 올리고 GER을 사용하여 각각 눌러줍니다. 골편이 없는 나머지 3개의 웰은 대조군으로 사용합니다.

다음으로, 각 웰의 벽면을 따라 10% FBS가 포함된 DMEM 5 mL를 천천히 첨가합니다. 이때 본 왁스와 골편이 밀려나지 않도록 주의하십시오. 그 후 배양물을 20~24시간 동안 인큐베이션합니다.

다음 날, 먼저 세포를 이미징합니다. 각 웰에 300 µg/mL의 Lucifer를 첨가한 다음, 즉시 Ivis 이미징 플랫폼으로 플레이트를 이미징합니다. 이 실험에는 이전 실험과 동일한 유방암 세포 현탁액이 필요합니다.

골편을 추출한 후, 포셉을 사용하여 각 골편을 24웰 플레이트의 빈 웰로 옮깁니다. 그다음 각 골편 위에 세포 현탁액 50 µL를 직접 피펫팅하고, 세포 부착을 촉진하기 위해 플레이트를 인큐베이터에서 45분 동안 배양합니다. 세포가 부착되면, 골편이 충분히 잠길 정도로 각 웰에 1~2 mL의 배지를 조심스럽게 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에서 20~24시간 동안 배양합니다.

Ivis 이미징, 형광 이미징 또는 Ivis 이미징 분석을 위한 골수 세포 수집을 준비하려면, 뼈 파편을 24-웰 플레이트로 옮기고 웰당 1 mL의 신선한 배지를 넣습니다. 각 웰에 300 µg/mL의 Lucifer를 첨가하고, 이전에 설명한 형광 현미경 관찰 절차대로 진행합니다. 뼈 파편의 골소주를 표지하기 위해 각 웰에 5 µL의 형광 비스포스포네이트 표지 용액을 피펫으로 넣고 플레이트를 24시간 동안 더 배양합니다.

24시간 후, 핀셋을 사용하여 파편들을 페놀 레드(phenol red)가 없는 배지가 담긴 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음, 485nm에서 이미징하도록 설정된 형광 현미경을 사용하여 GFP를 발현하는 유방암 세포의 군집 위치를 확인하고, 680nm에서 비스포스페이트(bisphosphate)로 표지된 골침(bone spicules)을 식별합니다. 세포 수 또는 특성 분석을 위해 골수 구획을 세척합니다.

조직 조각을 50 mL conical tube 위에 놓인 70 µm strainer로 옮깁니다. 그다음 25G 바늘이 장착된 10 mL 시린지를 사용하여 조직 조각에 10 mL의 PBS를 강하게 분사하여 세척합니다. 현탁액을 실온에서 300 ×g로 3분간 원심분리하여 세포를 펠릿화한 후, 상층액을 흡입하여 제거합니다.

유세포 분석 또는 생존능 분석에 따라 PBS 또는 기타 원하는 용액에서 골수 세포 펠렛을 현탁하십시오. 먼저 골 조직 분쇄물을 생성하는 것부터 시작합니다. 골 파편을 12웰 플레이트의 웰에 넣으십시오.

웰당 2.2 milliliters의 DMEM 10%FBS가 들어 있는 웰 플레이트를 준비하고, 골편이 없는 대조군 웰을 일부 둡니다. 플레이트를 24시간 동안 배양합니다. 그 후 배지를 흡입하여 제거하고 새 배지로 교체한 뒤 24시간 더 배양하며, 배양 전이 후 48시간이 되면 상층액 0.9 milliliters를 수집 플레이트로 옮기고 수집 플레이트를 일시적으로 배양합니다.

빈 24-웰 플레이트에 트랜스웰 인서트를 넣습니다. 그런 다음 각 인서트에 350 µL의 배지로 희석한 유방암 세포 100,000개를 분주합니다. 세포 부착을 촉진하기 위해 플레이트를 45분 동안 배양합니다. 45분 후, 포셉을 사용하여 인서트를 수집 플레이트로 옮깁니다.

인서트를 리시버에 넣을 때 반드시 각도를 기울여서 넣으십시오. 기포가 생기지 않도록 충분히 수평을 맞추십시오. 그 후, 인서트가 포함된 플레이트를 37 °C에서 20시간 동안 배양한 다음 다음 날 확인하십시오.

핀셋을 사용하여 인서트를 제거하고 각각에 300 micrograms per milliliter의 Lucifer를 첨가합니다. 리시버 플레이트에서 생물 발광 이미징을 수행하여 막을 통과해 이동하여 리시버 플레이트 웰 바닥에 부착된 유방암 세포를 검출합니다. 먼저, 리시버 플레이트에 배지를 채우고 이를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다.

인서트를 시딩하기 위해, 뚜껑이 있는 빈 마이크로 퓨즈 튜브 박스에 인서트를 뒤집어 놓습니다. 그런 다음 각 인서트 멤브레인의 외부 바닥 표면에 50 µL에 현탁된 100,000개의 세포를 첨가합니다.

뚜껑을 약간 열어둔 채로 상자를 덮고, 조직 배양 인큐베이터에서 인서트를 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 인서트를 뒤집어 수신 플레이트의 웰로 옮기고, 각 인서트 컵에 10% FBS가 포함된 DMEM 0.45 milliliters를 넣습니다. 이어서 각 인서트에 3 millimeter 크기의 뼈 조각 또는 유리 비드를 넣고 플레이트를 20시간 동안 배양합니다.

다음 날, 포셉을 사용하여 파편과 비드를 1 mL의 신선한 배지가 들어 있는 웰 플레이트로 옮깁니다. 웰당 300 µg/mL의 Lucifer를 추가하고 생체 발광 이미징을 진행합니다. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

유방암 세포의 증식을 측정하기 위해 고정된 뼈 조각에 인접하여 유방암 세포를 공동 배양하였습니다. 24시간 배양 후 생체 발광 이미징 결과, 뼈 조각이 없는 하단 3개 웰에 비해 뼈 조각이 있는 상단 3개 웰에서 유방암 세포 증식이 증가한 것으로 나타났습니다. 세 개의 서로 다른 수술 표본에서 얻은 조각을 이용한 실험 결과, 뼈의 유무에 따라 뼈가 있을 때 증식이 촉진됨을 확인하였습니다.

세 가지 경우 모두, 골 조직 파편 바로 아래에 배치된 MCF seven F Luke EGFP 세포의 군집 형성이 24시간 후 생물발광 이미징을 통해 관찰되었습니다. 48시간 후에는 세포 파종 밀도가 감소함에 따라 신호 또한 감소하는 양상을 보였습니다. 비스포스포네이트 시약으로 표지하여 직접 파종한 파편에서는 광화 구역 및 골수 구역 내에 GFP 양성 유방암 세포가 군집을 형성한 것이 확인되었습니다.

다공성 이동 막을 통해 골 조직 배양 상층액이 있는 상단 3개 웰로의 유방암 세포 이동은 대조군으로의 이동과 비교하여 활발하게 나타났습니다. 하단 3개 웰에는 배지가 보입니다. 특정 THR 검체에서 얻은 3개의 골편으로의 이동 또한 관찰되었으나, 비드로는 이동이 관찰되지 않았습니다.

본 영상을 시청한 후, 귀하는 대퇴골두 표본에서 인간 골 조직 파편을 추출하고, 이를 공배양 분석에 도입하여 이동, 군집 형성 및 증식을 포함한 유방암 세포의 거동을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.