Name: 배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: 배우세요 인간 대퇴골 조직 외식 모델을 이용하여 유방암 세포의 증식, 집락 및 이동을 연구하는 방법을. 생체발광 영상과 형광 현미경으로 뼈 전이 틈새에서 암세포 행동을 분석합니다.

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이러한 연구는 대체 연구 개발 재단 (107588), 국립 보건 연구소 (1U54CA136465-04S1) 및 캘리포니아 유방암 연구 프로그램 (201B-0141)에서 보조금에 의해 부분적으로 자금을 지원했다. 우리는 박사 감사합니다. 의 관대 한 기부에 대한 앤드류 윌버와 R. 스콧 McIvor 자신의 <pkt2 lubig=""> transponson과의 pKa ​​/ hUbiC-SB11 트랜스 플라스미드. 우리는 감사 존 Tamaresis, 박사 학위를 인정 통계적 방법에 대한 조언, 티모시 브라운은 유동 세포 계측법을 수행하기위한, 마이그레이션 분석에 대한 조언을 조젯 HENRICH, 낸시 Bellagamba에 대한 THR 표본의 수집을 용이하게. </pkt2>

대퇴 머리는 스탠포드 의과 대학에서 정형 외과의학과 과목 THR 수술을받은 환자에서 수집되었다. 모든 조직은 스탠포드 대학 연​​구 준수 부서의 규정에 따라 드 확인 된 표본으로 수집 하였다. 1. 유방암 세포주 (들)을 선택 <ol><li> 구하는 루시 페라 제 또는 GFP 리포터 구성체 원하는 유방암 세포주 (들)를 형질. 이하의 실험은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 플라스미드 pKT2 / LuBiG로 형질 MDA-MB-231, MCF-7 유방암 세포주 반딧불이 루시퍼 라제의 안정한 발현을 위해 설계 (fLuc) 및 향상된 녹색 형광 단백질 (EGFP)를 사용하여 수행 하였다 및 트랜스 플라스미드 약동학 / hUbiC-SB11 45,46. 주 : 형질 감염된 세포주 MDA-MB-231-fLuc-EGFP 및 MCF-7-EGFP fLuc라고 칭한다. </li></ol> 2. 격리를 조직 F대퇴 머리에서 ragments <ol><li> THR 수술 후 생리 식염수로 채워진 멸균 용기에 폐기 된 대퇴골 두를 수집합니다. 실험실로 시편을 전송하고 수술 1-3 시간 이내에 처리합니다. 주 : 처리 지연이있는 경우, 4 ℃에서 시험편을 배치. </li><li> 실험의 각 유형은 아래 규정 된 멸균 장갑, 수술 rongeur, 집게, 비커를 70 % 이소프로판올로 악기 및 조직 배양 용기를 씻어 : 층류 조직 문화 후드에 흡수 매트에 다음 항목을 배치하여 작업 영역을 준비 . </li><li> 멸균 수술 장갑을 착용 한 손으로 둥근 대퇴골의 머리를 잡아 대퇴골의 노출 된 상부 샤프트에서 원하는 크기 (~ 2-5mm)의 소주 뼈 조각을 추출하는 반면에 rongeur를 사용합니다. 배양 용기 내로 뼈 조각을 전송 (예를 들면, 6, 12, 또는 조직 배양 플레이트 또는 마이그레이션 챔버 24 웰), 증식의 종류에 따라, COL또는 마이그레이션 onization 실험, 단계 3, 4 또는 5에 기재된 바와 같이. 주 : 각 특정 증식, 군체 또는 마이그레이션 분석을위한 초기 단계를 완료 한 후 전술 한 바와 같이 뼈 조직 단편을 수확한다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 단편의 크기의 범위 일 것이다. 파편 전 또는 표준화의 목적으로 다양한 실험을 칭량 할 수있다. </li></ol> 뼈 조각에 인접 3. 공동 배양 유방암 세포는 BLI를 사용하여 유방 세포의 증식을 측정하는 <ol><li> 실험 전에, 2 × 105 유방암 세포 / 50 μL를 함유하는 현탁액을 제조하고, 배양 뼈 조각을 고정 뼈 왁스 플러그를 준비한다. 3 조각으로 P200 마이크로 피펫 팁을 잘라 뼈 왁스의 작은 (~ 35 mg)을 조각을 잘라 &#39;쿠키 커터 (cookie cutter)&#39;방식으로 가장 큰 조각의 좁은 끝을 사용합니다. 페트리 접시에 뼈 왁스 플러그를 꺼내 작은 조각의 넓은 끝 부분을 사용하여저장. </li><li> 각 웰의 12시 방향에 뼈 왁스의 조각을 놓고 부드럽게 멸균 장갑을 낀 검지 손가락으로 누르십시오. </li><li> 피펫 6- 웰 플레이트의 각 웰의 중앙에 DMEM-10 % FBS + 펜 스트렙토 1 × 105 유방암 세포를 포함하는 세포 현탁액 50 μL. (또는 원하는 경우 분산 패턴에 씨앗 세포.) 세포 부착을 촉진하기 위해 45 분 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li><li> 각각의 실험은 물론 뼈 왁스의 1 개에 1 뼈 조각을 배치하고 고정 rongeur와 부드러운 압력을 적용합니다. 아래 세 개의 우물 만 컨트롤과 같은 뼈 왁스를 포함하면서, 주어진 THR 표본에서되도록 3 뼈 조각이 상위 세 우물에 배치됩니다 세중에서 실험을 수행합니다. </li><li> 5 ㎖ 피펫을 사용하여 조심스럽게 천천히 유방암 세포 또는 뼈 조각을 빠지 피하기 위해 각 웰의 측면에 DMEM-10 % FBS 5 mL를 전달한다. 37 접시를 놓고76; 20 ~ 24 시간 동안 C 조직 문화 인큐베이터. </li><li> 생물 발광 이미징을 수행하기 위해 (BLI)는 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고, 각 웰 (300 ㎍ / ml의 농도를 달성하기 위해) 루시페린 기질을 추가한다. 이미지 다음 매개 변수를 사용하여 IVIS 이미징 플랫폼에서 즉시 플레이트 : 1의 f- 스톱, 작은 비닝 (binning), 1 초의 노출 시간, 레벨 D.는 신호 각각의 강도뿐만 아니라 평균 복사 휘도 (광자 / 초 / 제곱 센티미터를 / 측정 스테 라디안). </li><li> 모든 실험 및 제어 우물의 평균 복사 휘도를 정량하는 관심 영역 (ROI)을 정의하는 이미징 소프트웨어를 사용합니다. 엑셀 시트로 내보내기 평균 복사 휘도 값은 통계를 수행하고 그래프를 생성합니다. </li></ol> 뼈 조각에 직접 시드 4. 공동 배양 유방암 세포는 식민과 세포 수를 연구에 <ol><li> 24 웰 조직 배양 플레이트의 웰에 직접 빈 뼈 조각을 배치 (1 단편 / 웰) 집게를 사용한다. </li><li> 삐악 삐악 울다직접 각각의 뼈 조각 위에 한 X 10월 3일부터 6일까지 유방암 세포를 함유하는 DMEM-10 % FBS의 50 μl를 세포 현탁액 액적 ette. 세포 부착을 촉진하기 위해 45 분 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 조심스럽게 조각이 완전히 매체에 빠져들 것을 각 웰 등의 측면에 1-2 ml의 DMEM-10 % FBS를 추가합니다. 20 ~ 24 시간 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어. </li><li> 배양 후, 각 웰에 1 ㎖의 DMEM-10 % FBS를 함유하는 새로운 24 웰 플레이트에 각 골 조직 단편을 전송하는 집게를 사용한다. BLI을 수행하려면, 단계 3.6-3.7 위를 따르십시오. 또한, 단편을 형광 현미경을 사용하여 볼, 또는 단계 6에 기재된 유방암 세포 수 및 특성에 대한 분석을위한 인구 골수를 얻기 위해 플러싱 될 수있다. </li><li> BLI, 피펫 형광 라벨링 비스포스포네이트 용액을 5 μL (프리 다음, 형광 현미경으로 질적 평가를 위해 그대로 단편을 제조하기 위하여뼈 조각의 광물의 spicules 레이블을 각 웰에) 제조업체의 지시에 따라 깎았 다. 또 다른 24 시간을위한 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 품어. </li><li> 형광 비스포스포네이트 라벨링 용액 배양 24 시간 이후, 화상 GFP (485 ㎚) 및 비스포스포네이트 라벨 (680 ㎚)로 구성된 형광 현미경을 사용하는 페놀 레드없는 배지 뷰로 함유 조직 배양 플레이트에 프래그먼트를 전송하는 집게를 사용한다. </li></ol> 5. 뼈 조직 파편과 배양 된 뼈 조각 상층 액에 유방암 세포의 마이그레이션을 측정 <ol><li> 뼈 조직 배양 상층 액을 향해 마이그레이션. 주 : 중으로 지정된 THR 시료로부터되도록 세 조각을 실험을 수행 상등액 3을 생성하는데 사용된다. 각 실험의 경우, 마이그레이션 뼈 상층 액 대 제어 매체만을 포함하는 세 우물을 포함하는 세 우물에서 비교된다. <ol><li> 뼈 TIS를 생성웰 당 2.2 ㎖의 DMEM-10 % FBS를 함유하는 12 웰 플레이트에 뼈 조각을 배치하여 상청액 고소. 24 시간 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터 문화. 24 시간에 매체를 철회하고 2.2 ml의 신선한 DMEM-10 % FBS로 교체. DMEM-10 % FBS를 함유하는 동일한 방식으로 치료 대조군 웰. 주 : 매체는 수술로 인한 조직 외상에 반응하여 분비되는 요인을 제거하기 위해 24 시간으로 변경됩니다. 뼈 조직이 상청액에 생성되기 때문에 단지 유방암 세포 이동에 FBS의 기여도를 제어하기 위해 포함 FBS 함유 배지를 함유하는 배지를 웰 FBS 함유. </li><li> 48 시간에서, 수용기 판의 각 웰에 뜨는 / 제어 매질과 0.9 ㎖를 피펫을 모은다. 삽입은 나중에이 우물에 배치됩니다. 인서트 심는 조직 배양 인큐베이터에서 수용기 판을 인큐베이션. 주 : 나머지 상청액 (~ 증발시킨 후 1 ml)을 secretome 사실상의 분석을 위해 수집 될 수있다RS는 경우 44 원했다. </li><li> 트랜스 웰 삽입을 시드, 표준, 빈 24 잘 조직 배양 플레이트에 배치합니다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 각 인서트의 상부, 내부 막 표면 상 DMEM-10 % FBS에서 1 × 105 유방암 세포를 함유하는 350 μL 피펫 세포 현탁액. 첨부 파일을 촉진하기 위해 45 분 동안 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에 시드 삽입을 포함하는 24 웰 플레이트를 놓습니다. </li><li> 셀 인서트에 부착 한 후에, 제조자의 지시에 따른 수용기 판에 인서트를 전송하는 집게를 사용한다. 각도 삽입 막 잘 뜨는 수신기 사이의 거품 형성을 방지하기 위해 잘 수신기로 배치 각 삽입. 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 20 시간 동안 삽입과 수신기 판을 품어. 참고 : 삽입 막 잘 supernatan 수신기 사이의 거품에 대한 수신기 판의 바닥면을 확인t. 기포가 보이면, 특정 삽입물을 제거하고 기포가 존재하지 않을 때까지 잘 수신기에 다시 배치합니다. </li><li> 20 시간 사용 집게 후 수신기 판에서 삽입을 제거합니다. 단계 절차를 사용하여 이미지를 3.6-3.7로 마이그레이션과 수용기 판 웰의 바닥에 부착 한 세포를 BLI을 수행한다. </li></ol></li><li> 뼈 조직편 향해 마이그레이션. 참고 : 중으로 주어진 THR 표본에서되도록 3 조각을 실험을 수행 3 별도의 삽입에 배치하고, 3 유리 구슬은 컨트롤과 같은 3 별도의 삽입에 배치됩니다. <ol><li> 물론 각각에 0.9 ml의 DMEM-10 % FBS를 피펫 팅하여 수신기 판을 준비합니다. 삽입을 준비하는 동안 조직 문화 인큐베이터로 배치합니다. </li><li> 인서트 시드, 뚜껑이있는 플라스틱 미세 원심 분리 관 상자의 표면에 그들을 반전. 1 × 105 유방암 세포 d에 함유 DMEM-10 % FBS의 50 μl를 세포 현탁액 방울을 피펫irectly (역 삽입에 위를 향) 각 삽입 막의 외부, 바닥 표면에. 뚜껑을 미세 원심 튜브 상자가 열려 금이 커버 및 세포 부착을 촉진하기 위해 45 분 동안 37 ° C 조직 배양기로 전송. </li><li> 조직 문화 후드에 미세 원심 튜브 상자로 이동하고, 오른쪽면이 위로 시드 삽입을 켜고 수신기 판의 우물에 전송할 집게를 사용합니다. 각 삽입 컵에 피펫 0.450 ml의 DMEM-10 % FBS. 집게를 사용하여 각 준비 삽입 컵에 하나의 뼈 조직 조각 (~ 3mm)를 전송합니다. 선택적으로, 추가 우물에 유리 구슬에게 부정적인 컨트롤을 사용합니다. 20 시간 동안 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li><li> 이주를 측정하기 위해, 웰 당 1 ㎖의 DMEM-10 % FBS를 함유하는 표준 24- 웰 조직 배양 플레이트를 준비한다. 인큐베이터에서 수신기 판을 제거하고 표준 판의 별도의 우물에 각에서 삽입을 뼈 조각과 구슬을 전송하는 집게를 사용합니다. 루시페린 추가기질을 각 웰에 (300 ㎍ / ml의 최종 농도를 달성하기 위해) 및 단계 3.6-3.7의 절차를 사용하여 수행 BLI. </li></ol></li></ol> 6. 추가 사전 및 사후 실험 분석 <ol><li> 플러시 골수의 분석. <ol><li> 50 ㎖ 원뿔형 튜브의 상단에 배치 된 70 μm의 셀 스트레이너로 뼈 조각을 전송. 격렬 원뿔형 튜브 내에 골수 세포의 현탁액을 수득 PBS 10 mL로 단편을 플러시 25 G 바늘 10 ㎖ 주사기를 사용한다. 원심 분리기는 세포 현탁액 300 XG에 3 분 21 ° C에 대해, 뜨는을 기음과 PBS의 펠렛 세포 또는 유동 세포 계측법에 대한 다른 원하는 솔루션을 재현 탁. 주 : 볼륨 재현 탁하고, 원심 분리하고,인가 후의 세포 펠렛의 크기에 따라 달라진다. </li><li> 생존력 분석법의 PBS ~ 75-300 μL 용량 시판 fluorescenc를 사용 적합하고, 상기 현탁액은 분석 될 수있다E 기반 생존력 분석은 제조자의 지시에 따라, 종래의 혈구에 피펫 및 반전 형광 현미경을 이용하여 세었다. </li><li> 유세포 분석을 위해 또는 GFP 양성 유방암 세포의 검출에 기초하여, 정렬 2 % FBS, 2mM의 EDTA를 함유하는 1 ml의 PBS에서 세포 펠렛을 재현 탁하고, 10 농도가 1 × 106 세포 / ml이다 mM의 HEPES되도록. </li></ol></li><li> H &amp; E 염색과 면역. <ol><li> 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 염색 및 / 또는 면역 조직 화학 염색의 조각을 처리하기 위해 2 연필로 표지 플라스틱 카세트의 조각을 배치하고 24 시간 동안 10 % 포르말린으로 채워진 용기에 잠수함. </li><li> 파라핀 삽입을위한 프로세스 조직 절편 각 조각 내에서 광물의 spicules를 고려하여 탈회 단계를 포함 루틴 프로토콜을 사용하여 염색. </li></ol></li></ol>

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메라 ​​등. 이전 고품질 조직을 드러내는 전이성 프로세스 (47)을 연구하는 자가골 샘플의 사용의 유효성을 검사, 부검시 수확 전이성 전립선 암 환자의 사후 수집 및 뼈 시료 분석을 설명 하였다. 여기에 우리가 수집, 처리 및 유방암 세포의 이동, 정착 및 확산을 연구하는 단기 공동 문화 시스템에서 THR 수술 후 폐기 대퇴골에서 얻은 인간의 뼈 조직 조각을 사용하는 프로토콜을 설명했다. 약 30 만 고관절 교체 수술은 미국 (정형 외과 의사의 미국 아카데미; Orthoinfo.aaos.org)에서 매년 실시하고 있으며, 이들 표본은 일반적으로 폐기됩니다. 수술이 가장 빈번한 나타내는 지표 관절통 결과 대퇴골을 덮는 연골 표면의 점진적인 파괴로 이어지는 고관절의 골관절염이다. 고관절 replacem 중ENT 수술은 위 대퇴골의 작은 부분은 대퇴골과 함께 제거된다. 대퇴골 유방암 전이 48의 일반적인 사이트이며, 이들 표본은 소주 뼈 조직, 전이성 유방암 세포 집락의 사이...

종양 미세 환경 널리 유방암 진행성 전이성 암세포 중에 거동의 중요한 결정 인자로 인식되고 1-3 확산. 여기에 제시된 방법의 목적은 인간의 뼈 조직, 유방암 전이 4-6의 가장 빈번한 위치의 미세 환경 내에서 유방암 세포의 연구를 촉진 할 것이다. 뼈는 전이성 진행 (10, 11)에 연루 세포와 분비 요인 항구 둘 광물 및 골수 구획 7-9으로 구성되어 있습니다. 널리 생체 마우스 모델에서 사용하지만 전이 과정 12 ~ 15의 체계적인 연구를 촉진, 골격 내에서 세포 상호 작용은 관찰과 직접 섭동에 대해 쉽게 액세스 할 수 없습니다. 연구 및 마우스 골조직과 마우스 골수 세포를 배양 모델 시스템은 더 액세스를 제공하고 유방암 세포의 기초 m 많은 크로스 토크에 관한 통찰력과 메커니즘을 수득 한쥐의 골격 16-22 etastasis. 그러나, 연구는 뼈 조직 (23, 24)에 대해 osteotropism 종의 특정 패턴이있을 수 있음을 제안 하였다. 이러한 패턴은 뼈의 가능성 결정 인자 모두는 고유의 종 특이 골조직 특성의 차이, 면역 결핍 마우스 (11)에 변경된 골수 개체군 인한 차이들, 및 / 또는 실험에 사용 된 마우스의 비교적 어린 나이를 반영 할 수 미세. 시험 관내에서 통상적으로 골수 유래 골아 세포 또는 단층 배양 한 간질 세포 나 설계된 3 차원 모델 시스템 25-35 내의 특정 뼈 세포 유형에 집중 한 자가골 공동 배양에서 유방암 세포를 연구를 위해 접근한다. 2 차원 세포 배양 모델에서 시험 관내의 대들보를 형성 암 연구에 접근 하였지만, 그것은 롱 셀의 동작은 기본적으로 m에서 변경되는 것을 인식되어왔다문화 시스템 18,36,37 onolayer. 이것은 매트릭스 - 및 콜라겐 등의 천연 소재로 이루어지는 지지체 기반 모델을 포함하여 3 차원 살아있는 조직의 복잡성을 모방 설계된 미세 환경의 개발을 주도하고있다, 또는 합성 중합체는 조직 형 미세 환경을 만들기 위해 특정 유형의 세포로 시딩 36-41. 엔지니어링 접근 방법도 제어하고 미세 18,19,41-43의 호르몬 환경을 연구하는 생물 반응기 플랫폼의 사용을 포함했다. 생체 모방 모델 생물 반응기가 제어 된 환경에서 복잡한 미세 조직의 많은 요소를 제공하고, 성공적으로 뼈 18,19,35,42,43 유방암 전이 학습을 사전에 적용되었지만, 모델 설계된 시스템은 일반적으로 포함하지 않는다 뼈 네이티브 환경 내 존재하는 세포 형태 및 세포 외 기질 성분의 전체 스펙트럼. 최근까지, 유방암세포는 인간 뼈 조직의 네이티브 그대로 3 차원 미세 환경 내 연구되지 ​​않았다. 최근 우리는 (THR) 수술 44 시편 고관절 여분로부터 단리 인간 뼈 조직 단편을 사용하여 공 배양 모델의 개발을보고 하였다. 이 표본은 모두에게 단기 문화 마이크로 전이 기전을 연구하는 데 필요한 광물과 골수 구획을 항구. 이전 연구에서 우리는 뼈 조각 (44) (MDA-MB-231-fLuc) 공 배양 루시페라아제 발현 유방암 세포의 증식을 모니터링하는 생물 발광 영상 (BLI)을 사용하기위한 원칙의 증명을 수립. 여기에서 우리는 인간의 뼈 조직 이식편을 사용하여 원시 미세 환경의 컨텍스트 내에서 유방암 세포 암의 증식, 식민지 및 마이그레이션 연구를위한 실험 프로토콜을 상세하게 제시한다. 먼저 우리는 유방을 측정하는 골편에 인접한 공동 배양 유방암 세포에 대한 프로토콜을 제시BLI를 사용하여 세포 증식. 이 섹션에서는, 유방암 세포 현탁액은 뼈 왁스의 조각에 의해 고정되어 뼈 조각에 인접 6 웰 플레이트의 세포 명소​​로 씨앗을 품고있다. 제어 우물은 뼈 왁스,하지만 뼈 조각이 포함되어 있습니다. 셀 반점 부착하면 배지를 첨가하고, 플레이트를 측정한다 BLI 생물 발광 신호 강도 (셀 번호와 관련된) 24 시간 후, 배양이다. 다음 단계에서는 집락 증식을 연구하는 골편에 직접 파종 공동 배양 유방암 세포에 대한 방법을 제시한다. 여기 유방 세포 현탁액은 세포 집락 수를 추적하기 위해 시간에 걸쳐 BLI 및 형광 현미경에 의해 모니터되는 배양 골조직 단편에 직접 피펫 팅한다. 이 방법에서는, 골수 구획 유세포 식민지 유방암 세포 분석을위한 임의의 시점에서 뼈 조각에서 플러시, 골수 또는 생존력 분석 될 수있다. 또, 디유방암 세포의 이동을 측정하기위한 두 가지 접근법 스크라이브. 첫 번째 방법의 단계는 뼈 조직 배양 상청액을 향해 이동을 측정하기위한 나와있다. 없이 Transwell의 내부, 상부면이 8 ㎛의 공경을 멤브레인에 삽입 (도 1a에 도시 된 바와 같이)이 프로토콜에서 유방암 세포를 시딩 하였다. 이어서 인서트 골조직 상등액 또는 제어 매질을 포함하는 웰을 가진 수용기 판에 배치된다. 20 시간의 잠복기의 과정 동안, 유방암 세포의 작은 숫자는 아래가 BLI에 의해 검출 첨부 낮은 조직 문화의 우물에 삽입 세포막을 통해 이동한다. 두 번째 방법에서는 이주 유방암 세포없이 Transwell 인서트 막의 하부, 외부 표면 상에 시딩 하였다. 골 조직 단편을 삽입 컵에 배치되고, 유방암 세포 (도 1b에 도시 된 바와 같이) 뼈 조각에 정착하는 멤브레인을 통해 이동하는다음 BLI를 사용하여 몇 군데 있습니다.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td>모든 DMEM에 10%의 태아 소 세럼과 1%의 Pen/Strep</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium (1X)</td><td>Life Technologies</td><td>16600-082</td><td>모든 McCoy's에 10%의 소 태아 세럼과 1%의 Pen/Strep</td></tr><tr><td>태아 소 세럼</td>을 보충하십시오. <td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillen Streptomycin</td><td>Life Technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>블라스토시딘 (10 mgl/ml)</td><td>InvivoGen&nbsp;</td><td>ant-bl</td><td>형질주입된 세포주에 사용되는 보충제 배지.</td></tr><tr><td>팔콘&reg; 투명 PET 멤브레인이 있는 24웰 플레이트용 세포 배양 인서트(8.0 & m pore size)</td><td>Corning Incorporated</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&reg; 24 Well TC-Treated 폴리스티렌 세포 배양 인서트 컴패니언 플레이트</td><td>Corning Incorporated</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *포유류 세포용*</td><td>Invitrogen Detection Technologies</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferin 반딧불이, 칼륨 염 5 g (30 mg/ml)</td><td>Life Technologies</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>멸균 세포 여과기 70 &mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>6웰 TC 처리 세포 배양 클러스터</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>12웰 TC 처리 세포 배양 클러스터</td><td>Corning Incorporated</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24웰 TC 처리 세포 배양 클러스터</td><td>Corning Incorporated</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>Fine Science Tools</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>뼈 왁스</td><td>수술 전문 회사</td><td>903</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 50 이미징 플랫폼</td><td>캘리퍼 생명 과학/PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>라이브 이미지 소프트웨어 프로그램&nbsp;</td><td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td><td>133026</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL 이미징 시스템</td><td>Life Technologies</td><td>버전 4.2</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680 EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 유방암 세포</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 유방암 세포</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>단클론 마우스 항인간 사이토케라틴 항체</td><td>DAKO Cytomation</td><td>Clone (AE1/AE3)</td><td></td></tr></tbody></table>

배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

뼈 유방암 전이의 가장 흔한 위치이다. 이것은 널리 미세 영향 암세포 동작 것이 허용되어 있지만, 약간의 인간 뼈 조직의 기본 미세 환경 내에서 유방암 세포의 특성과 동작에 대해 잘 알려져있다. 우리는 추적 정량화의 미세 환경 내에서 인간 유방암 세포를 조절하는 방법을 개발했다 고관절 교체 수술을 다음 폐기 대퇴골에서 분리 배양 된 뼈 조직 조각. 유방암 세포 루시페라아제 위해 설계 및 녹색 형광 단백질 (EGFP) 식을 확장을 사용하여, 우리는 재현성 후 유방암 세포를 형광 현미경을 이용하여 뼈 조각 내에 생물 발광 영상을 이용하여 이동 및 증식 패턴 (BLI), 트랙 세포 상호 작용을 정량하고, 평가할 수있다 유동 세포 계측법과 식민지. 이 모델의 주요 장점은 다음과 같습니다 : 1) 기본, 구조적 손상 조직 microe중요한 인간 세포 유형을 포함하며, 신속한 정량적 모니터링 및 유방 및 뼈 세포 특성, 동작 및 상호 작용의 섭동을 용이하게 미세 환경, 2)에 직접 액세스 nvironment. 기본 제한은 현재의 단기 배양 연구에 윈도우를 한정 조직편, 유한의 생존이다. 모델 시스템의 애플리케이션 내 틈새 전이성 유방암 및 기타 뼈 추구 악성 종양 기초 생물학을 연구하고 효과적으로 골조직의 유방암 표적 세포 치료 전략의 개발이 포함된다.

대퇴 머리에서 조직 파편을 분리 대퇴 머리는 남성과 스탠포드 의과 대학에서 정형 외과의학과 과목 고관절 교체 수술을받은 여성 환자 (나이 44~90년) 같은 수의에서 수집 하였다. 각각의 폐기 대퇴골은 광물의 spicules 및 골수 구성 소주 뼈 조직을 품고 상부 대퇴골의 작은 부분이 포함되어 있습니다. 이 조직은 작은 조각들을 추출하는 수술을 사용 rongeur 샤프트 (도 2a)의 외과 적 노출 단면을 통해 접근 할 수있다. 추출 된 부분의 조직학은 광물과 골수 구성 요소를 공개,도 2b에 도시된다. 도 2c에 도시 된 바와 같이 추출 된 부분의 외관은 골수의 지방 세포 함량에 따라 황색에서 적색에 이르는 상이한 환자로부터 수득 대퇴골, 걸쳐 변한다. W즉 루시 페라 EGFP 발현 설계 유방암 세포 동적 상호 작용을 측정하기 위해 단기 분석법 이러한 골 조직 단편의 사용을 입증한다...

프로토콜 인간 뼈 조직 이식편 모델 시스템에서 유방암 세포의 이동, 증식 및 집락 공부 설명된다.

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

본 실험 절차의 목적은 인간 골 조직 외식편(explan) 모델 시스템에서 유방암 세포의 증식, 군집 형성 및 이동을 연구하는 것입니다. 이를 위해 대퇴골두 수술 검체에서 해면골 조직 조각을 분리하고, 루시퍼레이스(luciferase)와 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein)을 발현하는 유방암 세포와 함께 배양합니다. 생체 발광 이미징을 통해 세포의 증식을 측정하고, 골 조직 조각 내 유방암 세포의 군집 형성을 확인합니다.형광 현미경을 통해 유방암 세포의 군집 형성 패턴을 이미지화합니다. 골수 구획은 유세포 분석, 발광 및 염색 분석을 위해 조각에서 세척하여 회수할 수 있습니다. 조직 배양 상층액 및 뼈 조직 조각을 향한 유방암 세포의 이동은 생물 발광 이미징이 가능한 Transwell 이동 챔버에서 측정합니다. 뼈는 유방암 전이가 가장 빈번하게 일어나는 부위이며, 궁극적으로 이 모델은 뼈 전이 틈새 내의 유방암 세포를 연구할 수 있는 새로운 창을 제공합니다.이 모델의 큰 장점은 인간 골 조직 조각의 미세환경에 직접 접근할 수 있어, 단기 공배양 실험 동안 유방암 세포의 거동을 쉽게 관찰하고 분석할 수 있다는 점입니다. 이 방법은 유방암의 골 전이 기저 메커니즘에 관한 핵심 질문을 연구하는 데 사용될 수 있으며, 이를 통해 전이를 효과적으로 예방하고 치료하기 위한 치료 전략을 식별하는 것을 목표로 합니다. 이 모델은 유방암 전이에 대한 통찰력을 제공할 뿐만 아니라, 전립선암과 같은 다른 골 친화성 악성 종양을 연구하는 데에도 활용될 수 있습니다.각 분석 단계의 여러 지점에서 골 조직 조각을 채취해야 합니다. 우선 생리식염수에 담긴 대퇴골 표본을 수집 및 운반하고, 수술용 장갑을 착용한 상태에서 생물안전작업대(biosafety cabinet) 내의 작업대를 준비합니다. 한 손으로 대퇴골두를 잡고 수술용 톱을 사용하여 해면골을 추출합니다.파편의 크기는 약 2~5 mm입니다. 이 단계에서는 포셉을 사용할 수 없습니다. 품질이 좋은 외과용 톱이 필요합니다.본 실험을 위해, 10% FBS가 포함된 DMEM 50 µL당 100,000개의 세포가 포함된 유방암 세포 현탁액을 준비하십시오. 또한, 마이크로 파이펫 팁의 절단된 끝부분을 사용하여 골편을 고정하는 데 사용할 본 왁스 플러그를 제작하고, 이 플러그들을 페트리 접시에 보관하십시오. 그 후 핀셋을 사용하여 플러그를 6-웰 플레이트로 옮기고, 멸균 장갑을 사용하여 플러그를 12시 방향 위치에 눌러 고정하십시오.다음으로, 각 웰의 중앙에 세포 현탁액 50 µL를 피펫으로 분주합니다. 세포 부착을 촉진하기 위해 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에 45분 동안 보관합니다. 플레이트가 배양되는 동안, 세포가 부착된 골편을 추출합니다. 3개의 웰에 있는 본 왁스 위에 골 조직편을 하나씩 올리고 GER을 사용하여 각각 눌러줍니다. 골편이 없는 나머지 3개의 웰은 대조군으로 사용합니다.다음으로, 각 웰의 벽면을 따라 10% FBS가 포함된 DMEM 5 mL를 천천히 첨가합니다. 이때 본 왁스와 골편이 밀려나지 않도록 주의하십시오. 그 후 배양물을 20~24시간 동안 인큐베이션합니다.다음 날, 먼저 세포를 이미징합니다. 각 웰에 300 µg/mL의 Lucifer를 첨가한 다음, 즉시 Ivis 이미징 플랫폼으로 플레이트를 이미징합니다. 이 실험에는 이전 실험과 동일한 유방암 세포 현탁액이 필요합니다.골편을 추출한 후, 포셉을 사용하여 각 골편을 24웰 플레이트의 빈 웰로 옮깁니다. 그다음 각 골편 위에 세포 현탁액 50 µL를 직접 피펫팅하고, 세포 부착을 촉진하기 위해 플레이트를 인큐베이터에서 45분 동안 배양합니다. 세포가 부착되면, 골편이 충분히 잠길 정도로 각 웰에 1~2 mL의 배지를 조심스럽게 첨가합니다. 그런 다음 플레이트를 조직 배양 인큐베이터에서 20~24시간 동안 배양합니다.Ivis 이미징, 형광 이미징 또는 Ivis 이미징 분석을 위한 골수 세포 수집을 준비하려면, 뼈 파편을 24-웰 플레이트로 옮기고 웰당 1 mL의 신선한 배지를 넣습니다. 각 웰에 300 µg/mL의 Lucifer를 첨가하고, 이전에 설명한 형광 현미경 관찰 절차대로 진행합니다. 뼈 파편의 골소주를 표지하기 위해 각 웰에 5 µL의 형광 비스포스포네이트 표지 용액을 피펫으로 넣고 플레이트를 24시간 동안 더 배양합니다.24시간 후, 핀셋을 사용하여 파편들을 페놀 레드(phenol red)가 없는 배지가 담긴 플레이트로 옮깁니다. 그런 다음, 485nm에서 이미징하도록 설정된 형광 현미경을 사용하여 GFP를 발현하는 유방암 세포의 군집 위치를 확인하고, 680nm에서 비스포스페이트(bisphosphate)로 표지된 골침(bone spicules)을 식별합니다. 세포 수 또는 특성 분석을 위해 골수 구획을 세척합니다.조직 조각을 50 mL conical tube 위에 놓인 70 µm strainer로 옮깁니다. 그다음 25G 바늘이 장착된 10 mL 시린지를 사용하여 조직 조각에 10 mL의 PBS를 강하게 분사하여 세척합니다. 현탁액을 실온에서 300 ×g로 3분간 원심분리하여 세포를 펠릿화한 후, 상층액을 흡입하여 제거합니다.유세포 분석 또는 생존능 분석에 따라 PBS 또는 기타 원하는 용액에서 골수 세포 펠렛을 현탁하십시오. 먼저 골 조직 분쇄물을 생성하는 것부터 시작합니다. 골 파편을 12웰 플레이트의 웰에 넣으십시오.웰당 2.2 milliliters의 DMEM 10%FBS가 들어 있는 웰 플레이트를 준비하고, 골편이 없는 대조군 웰을 일부 둡니다. 플레이트를 24시간 동안 배양합니다. 그 후 배지를 흡입하여 제거하고 새 배지로 교체한 뒤 24시간 더 배양하며, 배양 전이 후 48시간이 되면 상층액 0.9 milliliters를 수집 플레이트로 옮기고 수집 플레이트를 일시적으로 배양합니다.빈 24-웰 플레이트에 트랜스웰 인서트를 넣습니다. 그런 다음 각 인서트에 350 µL의 배지로 희석한 유방암 세포 100,000개를 분주합니다. 세포 부착을 촉진하기 위해 플레이트를 45분 동안 배양합니다. 45분 후, 포셉을 사용하여 인서트를 수집 플레이트로 옮깁니다.인서트를 리시버에 넣을 때 반드시 각도를 기울여서 넣으십시오. 기포가 생기지 않도록 충분히 수평을 맞추십시오. 그 후, 인서트가 포함된 플레이트를 37 °C에서 20시간 동안 배양한 다음 다음 날 확인하십시오.핀셋을 사용하여 인서트를 제거하고 각각에 300 micrograms per milliliter의 Lucifer를 첨가합니다. 리시버 플레이트에서 생물 발광 이미징을 수행하여 막을 통과해 이동하여 리시버 플레이트 웰 바닥에 부착된 유방암 세포를 검출합니다. 먼저, 리시버 플레이트에 배지를 채우고 이를 조직 배양 인큐베이터에 넣습니다.인서트를 시딩하기 위해, 뚜껑이 있는 빈 마이크로 퓨즈 튜브 박스에 인서트를 뒤집어 놓습니다. 그런 다음 각 인서트 멤브레인의 외부 바닥 표면에 50 µL에 현탁된 100,000개의 세포를 첨가합니다.뚜껑을 약간 열어둔 채로 상자를 덮고, 조직 배양 인큐베이터에서 인서트를 45분 동안 배양합니다. 그런 다음 핀셋을 사용하여 인서트를 뒤집어 수신 플레이트의 웰로 옮기고, 각 인서트 컵에 10% FBS가 포함된 DMEM 0.45 milliliters를 넣습니다. 이어서 각 인서트에 3 millimeter 크기의 뼈 조각 또는 유리 비드를 넣고 플레이트를 20시간 동안 배양합니다.다음 날, 포셉을 사용하여 파편과 비드를 1 mL의 신선한 배지가 들어 있는 웰 플레이트로 옮깁니다. 웰당 300 µg/mL의 Lucifer를 추가하고 생체 발광 이미징을 진행합니다. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.유방암 세포의 증식을 측정하기 위해 고정된 뼈 조각에 인접하여 유방암 세포를 공동 배양하였습니다. 24시간 배양 후 생체 발광 이미징 결과, 뼈 조각이 없는 하단 3개 웰에 비해 뼈 조각이 있는 상단 3개 웰에서 유방암 세포 증식이 증가한 것으로 나타났습니다. 세 개의 서로 다른 수술 표본에서 얻은 조각을 이용한 실험 결과, 뼈의 유무에 따라 뼈가 있을 때 증식이 촉진됨을 확인하였습니다.세 가지 경우 모두, 골 조직 파편 바로 아래에 배치된 MCF seven F Luke EGFP 세포의 군집 형성이 24시간 후 생물발광 이미징을 통해 관찰되었습니다. 48시간 후에는 세포 파종 밀도가 감소함에 따라 신호 또한 감소하는 양상을 보였습니다. 비스포스포네이트 시약으로 표지하여 직접 파종한 파편에서는 광화 구역 및 골수 구역 내에 GFP 양성 유방암 세포가 군집을 형성한 것이 확인되었습니다.다공성 이동 막을 통해 골 조직 배양 상층액이 있는 상단 3개 웰로의 유방암 세포 이동은 대조군으로의 이동과 비교하여 활발하게 나타났습니다. 하단 3개 웰에는 배지가 보입니다. 특정 THR 검체에서 얻은 3개의 골편으로의 이동 또한 관찰되었으나, 비드로는 이동이 관찰되지 않았습니다.본 영상을 시청한 후, 귀하는 대퇴골두 표본에서 인간 골 조직 파편을 추출하고, 이를 공배양 분석에 도입하여 이동, 군집 형성 및 증식을 포함한 유방암 세포의 거동을 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

광학 프로젝션 Tomography를 사용하여 인간 유방암 표본과 그 분석의 장기 문화

이 비디오는 인간 뼈 조직 이식 모델 시스템에서 암세포 증식 및 집락화를 측정하기 위해 대퇴골 이식에 인접한 유방암 세포를 배양하는 방법을 설명합니다.

BC 세포 공동 배양: 암세포 증식을 연구하기 위해 뼈 조각과 함께 유방암 세포 배양

표준 배양 방법에 세포 생리 학적 환경 꺼내하고 접시의 플라스틱 표면에 성장합니다. 일차 인간 골수 세포의 거동을 연구하기 위해, 우리는 세포가 조직의 미세 환경을 네이티브 recapitulating 조건에서 재배되는 3-D 배양 시스템을 만들었다.

차 사람 골수 및 악성 종양을 연구하는 세 가지 차원 조직 배양 모델

손상 조직을 사용 organoids 차 세포 배양은 다세포 생체 내 미세 환경을 모방 모델 시스템을 제공한다. 우리는 효소 조직을 중단하지 않고 형태를 차별화 혼합 세포 배양 계통 및 전시회를 영속 무 혈청 차 유방 상피 조직 배양 모델을 개발했다. 유방 organoids&gt;는 6 개월 가능한 남아있다.

비 효소, Mammospheres의 자연 발생에 대한 사전 침습 유방 병변의 혈청이없는 조직 문화

여기에서는 다세포 상호 작용 및 암세포 행동의 세포 외 기질 의존적 조절을 조사하는 데 유용한 3차원에서 공동 배양하는 프로토콜을 제시합니다. 이 실험 모델에서는 인간 암 관련 섬유아세포가 내장된 콜라겐 겔에서 암세포를 배양합니다.

종양 기질 상호 작용에 대한 세 가지 차원의 공동 문화 모델

이 원고는 생쥐의 림프절, 뼈, 폐 및 뇌에서 파생된 장기 조절 매체로 구성된 생체 외 모델 시스템을 설명합니다. 이 모델 시스템은 장기 유래 용해성 인자와 그 요인이 암세포의 장기 영양성 및 전이성 행동에 미치는 영향을 식별하고 연구하는 데 사용할 수 있습니다.

유방암 전이성 행동에 장기 별 영향 유학을위한 장기 에어컨 미디어 및 응용 프로그램의 생성

암세포를 콜라겐 겔에 삽입한 다음 무세포 피브린 겔에 끼워 넣어 위성 종양의 침습성과 형성을 모니터링할 수 있는 3D 배양 시스템을 생성합니다.

암 세포 침윤 및 위성 종양 형성을 탐색하는 문화 분석 세 가지 차원

이 실험 프로토콜은 BCSC 표현형 및 기능을 평가하는 데 사용할 수 있는 시험 관 내 및 생체 내 분석뿐만 아니라 유방암 세포 및 조직 샘플에서 BCSC의 분리를 설명합니다.

세포 및 조직 샘플에서 인간 유방암 줄기 세포의 분리 및 기능 평가

이 원고는 전이성 캐스케이드의 모든 단계에서 개입할 수 있는 orthotopically 주입된 유방 종양의 자발적 폐 전이의 확립 및 종단 성장 모니터링을 위한 방법론을 설명합니다.

생체 내 Orthotopically injected breast tumor cells의 자발적 폐 전이를 측정하기 위한 이미징

암 전이를 연구하기 위해 이세포성 누화를 캡처하는 3D 암 모델이 매우 필요합니다. 우리의 연구는 침입 및 세포 공간 분포를 연구하는 데 사용할 수 있는 골격 및 골격이 없는 환경에서 이종 다세포 기질-상피의 생성을 제시합니다.

상피암 세포의 스캐폴드가 없는 3D 배양에서 이종다세포 기질 세포(Heteromulticellular Stromal Cells in Scaffold-free 3D Cultures of Epithelial Cancer Cells to Drive Invasion)

이 프로토콜은 체외/생체 내 기능 분석, 전사체학 및 컴퓨터 분석을 포함하여 쥐 CAF를 배양, 조작 및 분석하는 방법을 간략하게 설명합니다. 또한, 인간 유방암 종양 컬렉션에서 레이저 캡처 미세 절개 기질 및 상피 구성 요소의 공개적으로 사용 가능한 전사체를 분석하기 위해 개발된 웹 기반 플랫폼에 대해 설명합니다.

Cancer-Associated Fibroblasts from Mouse Mammary Tumors as Tools for Molecular and Computational Studies(분자 및 컴퓨터 연구를 위한 도구로서의 마우스 유방 종양에서 유래한 암 관련 섬유아세포)

배우세요 인간 대퇴골 조직 외식 모델을 이용하여 유방암 세포의 증식, 집락 및 이동을 연구하는 방법을. 생체발광 영상과 형광 현미경으로 뼈 전이 틈새에서 암세포 행동을 분석합니다.

배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해

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