Name: Zebrafish의 애벌레에서 비주얼 응답의 전위도 분석 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: 배우세요 제브라피시 애벌레에서 전기망막도(ERG) 분석을 위한 미세조작 기법을 활용한 시각 기능 평가 방법을. 이 기법은 생체 내 원추세포 시각 기능 연구에 활용됩니다.

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제브라피쉬를 유지해 주신 UNC 제브라피시 양식 시설 구성원들에게 감사드립니다. 또한 ERG 장치 설정에 도움을 주신 Diagnosys, LLC에 감사드립니다. 전기생리학적 방법에 대한 도움을 주신 Portia McCoy 박사와 Ben Philpot 박사의 실험실에 감사드립니다. 우리는 또한 애벌레 제브라피쉬의 삽화에 대해 Lizzy Griffiths에게 감사를 표하고 싶습니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)에서 수여하는 F32 EY022279(J.D.C) 및 R21 EY019758(E.R.W)의 지원을 받았습니다.

동물 보수 및 실험 프로토콜은 채플 힐 노스 캐롤라이나 대학의 기관 동물 케어 및 사용위원회에 의해 승인 및 실험 동물 복지의 NIH 사무실과 평가 및 실험 동물 관리 국제 인증 협회의 모든 요구 사항을 충족했다. 참고 : 표준 제브라 피쉬 사육 및 유지 보수 ERG 분석을위한 유충을 얻으려면, 출판 프로토콜 18을 사용 하였다. 애벌레는 자연 번식을 통해 구입해야하며 14 시간 조명 / 10 시간 어두운주기에 따라 보관되어 있습니다. 이 프로토콜은 포스트 수정 (DPF) 5-7일에서 유충에 최적화 된,하지만 이상적 절차에 작은 수정을 오래된 생선을 수행 할 수 있습니다. 여기, 5 DPF에서 야생 형 제브라 피쉬 애벌레의 TL 균주를 사용합니다. 1. 마이크로 피펫 생산 <ol><li> 화재 연마 붕규산 유리 모세관을 1.5 × 0.86 mm (내경에 의해 외경)를 사용하여 여러 개의 마이크로 피펫을 당겨필라멘트 (821 ° C, 용융 온도)와 P-97 불타는 / 브라운 마이크로 피펫 풀러 상자 열 필라멘트를 장착. 표 1에 설명 된 마이크로 피펫을 도운에 대한 프로그램을 사용하십시오. </li><li> 팁 직경이 10 ~ 15 μm의 것을 보장하기 위해 적절한 계수 선 통치자와 현미경 각 마이크로 피펫을 확인하고 부드러운 선단 구 (즉, 매끄러운 가장자리)가 있습니다. </li><li> 조심스럽게 먼지 팁 손상과 노출을 방지하기 위해 마이크로 피펫을 저장합니다. 스토리지 옵션은 실험실 테이프, 거품 늘어선 상자, 상업적으로 이용 가능한 마이크로 피펫 저장 용기와 배양 접시를 포함한다. 주의 : 다른 마이크로 피펫 풀러 유리 모세관은 정확한 마이크로 피펫의 직경 고품질 팁이 달성되는 한 사용될 수있다. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 압박 </td><td> 열 </td><td> 당기세요 </td><td> 속도 </tD&gt; <td> 시간 </td></tr><tr><td> (500) </td><td> (560) </td><td> - </td><td> (30) </td><td> (200) </td></tr><tr><td> (500) </td><td> (450) </td><td> - </td><td> (30) </td><td> (200) </td></tr><tr><td> (500) </td><td> (410) </td><td> (55) </td><td> (40) </td><td> (200) </td></tr></tbody></table> 표 1 : 상자 열 필라멘트가 장착 된 P-97 불타는 / 갈색 마이크로 피펫 풀러를 사용하여 마이크로 피펫의 생산을위한 프로그램을 마이크로 피펫은 필라멘트에 불을 연마 붕규산 유리 모세관을 1.5 × 1.0 mm 2 (내경에 의해 외경)를 사용하여 만들어집니다. (용융 온도 821 ° C에서). 2. 버퍼 준비 <ol><li> 미세 모세관에서 산소화 금붕어 링거 완충액 (19)를 사용하고, 여과 유충을 실험에 배치되는 폴리 비닐 알코올 (PVA) 스펀지 포화. 또한, E3를 사용<html> 배아 매체 또는 행크의 균형 소금 솔루션. </li><li> pH를 7.8로 조정 한 0.22 μm의 필터를 사용하여 살균 및 4 ℃에서 10 배 주식을 저장 표 2에 설명 된대로 10 배 금붕어 링거액을 준비합니다. </li><li> 탈, 증류수로 1 배 10 배 링어의 솔루션을 희석하여 실험 당일 작업 솔루션을 만듭니다. 0.22 μm의 필터를 사용하여 필터링 시스템. 10 분 동안 95 %의 각 2 O / 5 % CO 2 가스를 버블 링함으로써 네이트. 단단히 나중에 캡 솔루션이 산소 유지되도록합니다. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> 염화나트륨 </td><td> 1.25 M </td></tr><tr><td> 의 KCl </td><td> 26 mM의 </td></tr><tr><td> 염화칼슘 2 </td><td> 25 mM의 </td></tr><tr><td> 의 MgCl 2 </td><td> 10 mM의 </td></tr><tr><td> 포도당 </td><td> 100 mM의 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 100 mM의 </td></tr></tbody></table>jove_content &quot;&gt; 표 2 : 10 배 금붕어 링거 용액의 조제. 3. 전위도 플랫폼 <ol><li> 신호 대 잡음비를 개선하기 위해 패러데이 케이지 안에 방진 테이블 ERG 실험을 수행한다. 육각 너트를 사용한 방진 테이블 정의 강철 플랫폼을 첨부. 광원 아래 테이블에 점탄성 우레탄 폴리머 충격 흡수 바닥으로 이동 플라스틱 플랫폼을 놓습니다. </li><li> 이동 플라스틱 플랫폼에서 아래로 목표 자화 스탠드와 카메라를 배치합니다. 이동 플라스틱 플랫폼의 오른쪽에 두 번째 자화 스탠드 (기록 미세 전극을 개최합니다) 미세 조작기를 놓습니다. 카메라와 미세 조작기가 다른 장비의 이동에 의해 방해되지 않습니다 그들이 광원으로부터 조명을 차단하지 않도록해야합니다. </li><li> 비디오 모니터에 카메라를 연결하고의 눈을 볼을 위치적절한 위치에 전극을 배치하기위한 충. </li><li> 설치가 제대로 구리 와이어 접지되어 있는지 확인합니다. 소음을 확인하려면, 링거액 가득 35mm 페트리 접시에 기록 미세 전극의 기준 전극 팁을 배치합니다. 오실로스코프 또는 ERG 장치의 내장 기능 설정의 전기 노이즈 레벨을 확인합니다. 소음 수준은 기준선 이하 ± 10 μV해야한다. </li></ol> 4. 스폰지 준비 <ol><li> 35mm 페트리 접시에 딱 맞는 건조 PVA 스폰지의 작은 사각형을 잘라. 스폰지의 두께는 접시의 깊이보다 크지 않아야한다. 절단 깨끗한 면도날 유틸리티 나이프를 사용합니다. </li><li> (스폰지의 바닥 또는 작은 끝 중 하나를 통해 수직으로 잘라 나비 길이 중 하나 얕은 컷) 기준 전극을 수용하기 위해 스펀지에 추가 컷을 확인합니다. </li><li> 화학적 내성 마커를 사용하여카메라를 위치에 사용할 수있는 스폰지 (유충이 배치 될 위치)에 작은 점을 표시합니다. </li><li> 포화 될 때까지 링거액에 PVA 스폰지 십니다. 2 ~ 3 회를 제거하고 종이 타월에 신속시킨다. 깨끗한 35mm 페트리 접시에 스폰지를 놓습니다. </li><li> 마크가 카메라에 의해 가시화 될 수 있도록 플라스틱 플랫폼을 포함하는 스폰지 페트리 접시를 배치. </li></ol> 5. 전극 준비 주 : 피쉬 설치 링거액 포화 PVA 스폰지와 각막에 접촉 기록 전극과 접촉 기준 전극으로 구성. 기준 전극의 Ag / AgCl로 구성되어 펠릿. 기록 전극은 와이어의 Ag를 함유하는 미세 전극 홀더에 의해 링거액 채우고 유지 뽑아 유리 마이크로 피펫이다. <ol><li> 5 분 (기록 MICR 6-9 %의 차아 염소산 나트륨 (표백제)에서 그들을 담가 전극 클로라이드oelectrode 와이어) 또는 15 분 (기준 전극). 5 분 킴에 공기 건조. <ol><li> 단계 4.2에서 만든 컷의 스타일에 따라, 스폰지 (하단에 세로로 얕은 인하) (수직 나비 인하) 또는 아래에 기준 전극의 자세 / AgCl을 펠렛을 배치합니다. 기록 시스템에 기준 전극 리드를 부착. </li><li> ERG 설치 공간의 제약이 있거나의 Ag / AgCl을 전극으로부터 특히 강한 태양 광 인공물이있는 경우 또는, 광로 밖으로 전극을 이동 한천 염다리 통하여 스폰지에 기준 전극을 연결한다. </li></ol></li><li> 5 ml의 비 루어 잠금 주사기 ~ 적당한 크기의 튜브 40cm를 연결합니다. 링거액과 주사기를 입력합니다. 압력 포트는 일반적으로 어댑터와 함께 제공 갖는 미세 전극 홀더, &quot;3/32&quot;1/8 1/16의 내부 직경을 갖는 튜브를 수용 &quot;또는 5/32&quot;합니다. </li><li> 함께 1 ml의 비 루어 로크 시린지를 채우기마이크로 FIL를 사용 링거액하고,주의 깊게 미세 전극 홀더를 입력합니다. 거품의 형성을 방지합니다. </li><li> 튜브와 미세 전극 홀더의 압력 포트에 5 ML의 주사기를 연결하고 미세 전극 홀더 링거액의 전체 있는지 확인하는 데 사용합니다. 링거액 가득 마이크로 FIL 1-ML의 주사기를 사용하여 끝에서 마이크로 피펫 유리를 작성하고 기포가 존재하지 않는 것을 확인합니다. </li><li> 전극 와이어를 똑바로되지 않도록 조심스럽게 미세 전극 홀더에 유리 마이크로 피펫을 연결합니다. 일단, 보안 솔루션의 작은 양 끝에 표시 될 때까지 조심스럽게 미세 전극을 통해 링거액을 강제로 5 ML의 주사기를 사용합니다. 마이크로 피펫 팁에서, 먼지 또는 염 축적으로 인한 기포뿐만 아니라 폐색의 형성을 방지한다 (각막에인가되지 않음) 주사기에 압력을 적용 수시. <ol><li> 이 솔루션은 스트림으로 나오는 경우, g 교체아가씨 마이크로 피펫, 선단 개구가 너무 크거나 손상 때문이다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 미세 조작기의 기록 미세 전극을 배치하고 기록 시스템에 리드를 연결합니다. </li></ol> 6. 전위도 분석 참고 : 녹음을위한 준비가 간접 백색광의 낮은 수준에서 수행 할 때 애벌레 망막의 원추 지배력, 높은 품질의 ERG 결과를 얻을 수 인해 (&lt;1 룩스) 또는 짧은 기간에 높은 강도의 (&lt;1 분) ( ≤250 LUX) 작업 등. 어두운 적응의 짧은 기간이 여전히 기록하기 전에 필요합니다 (단계 6.7 참조​​). 그러나, 실험에 민감한 적외선 카메라를 사용하여 희미 적색 또는 적외선 광 하에서 수행 될 수있다. 모든 실험은 UNC Zebrafish의 양식 시설에서 멸균 필터 (0.22 μm의) 물 시스템에서 수행되었지만 대체 배아 매체가 사용될 수있다. <ol><li> 약 1 측정 잘라 종이 타월 사각형cm 2. </li><li> 절연 콘 질량 수용체 전위를 측정하는 경우, 5 분 동안 500 μM (±) -2- 아미노 -4- phosphonobutyric 산 (APB)으로 시스템 물 3-5 유충 부화. 참고 : APB는 활성 (L)의 라 세미 혼합물 및 AP4의 비활성 (R) 형태이지만, 그것은 L-AP4만큼 효과적이고 저렴합니다. </li><li> 0.02 % 응답, 1 ~ 2 분까지 (w / v)의 Tricaine와 시스템 물에 3-5 애벌레를 마취. </li><li> 신중하게 최소한의 조명 (&lt;1 분 ≤250 럭스)를 사용하여 해부 입체경에서 종이 타월 사각형에 개별 애벌레를 전송하는 파스퇴르 피펫과 피펫 펌프를 사용합니다. 각 유충의 위치를​​ 확인하고 가려지지 않은 눈을 가진 지느러미 쪽을 위로하는 후보를 선택합니다. <ol><li> 확장 된 기록 (&gt; 30 분)의 경우에 몸을 유약하지만 좋은 낙타 털 브러시를 사용하여 3 % 메틸 셀룰로오스와 머리를 포함하지 않음으로써 촉촉한 유충을 유지합니다. </li></ol></li><li> 집게를 사용하면 종이 타월의 오준석를 전송젖은 PVA 스폰지에 유충과 전자. <ol><li> 확장 된 기록 (&gt; 30 분)를 들면, 증류 물을 함유하는 부착 플라스크에 airstone 통해 가스를 버블 링시킴으로써 유충 위에 물 - 포화 된 100 % O 2 가스의 연속적인 흐름을 적용한다. 유충의 머리 근처 가습 된 산소를 전달하는 플라스크 사이드 암에서 나오는 튜브를 배치합니다. 참고 : 단계 6.4.1 단계 6.5.1 물고기 (16)의 수명을 연장합니다. </li></ol></li><li> 최소한의 조명 아래, 코와 눈의 꼬리 끝 사이의 중간 점에 미세 전극 팁의 위치를​​ 미세 조작기 카메라를 사용하여 각막의 등의 제한에 부드럽게 눌러줍니다. 참고 : 각막의 가장 먼 영역에 전극 팁의 오정렬이 반대 극성의 ERG 파형이 발생할 수 있습니다. </li><li> 에 유충 5 ~ 10 분 동안 어두운 - 적응 허용합니다. </li><li> 호 텔를 사용하여 LED 광원 또는 광 자극기에서 제공하는 빛에 기록 테스트 플래시 응답lable가 자극 및 녹음 장비. 이러한 플래시 광량, 플래시 길이 플래시 컬러, 강도와 배경 실험에 맞게 컬러 필터와 같은 설정 프로토콜 파라미터를 조정한다. </li><li> 실험이 완료되면, AVMA / IACUC 지침에 따라 유충을 안락사. </li></ol>

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<li>Lewis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Celsr3+is+required+for+normal+development+of+GABA+circuits+in+the+inner+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+genetics%22%5BJournal%5D)">Celsr3 is required for normal development of GABA circuits in the inner retina.</a> PLoS. genetics. 7, e1002239(2011).</li>
</ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

이 프로토콜에서 애벌레 제브라 피쉬의 ERG 녹음에 대한 간단한 절차를 자세히 설명되어 있습니다. 명심해야한다 절차를 통해 몇 가지 중요한 단계는이 절차는 시각 function.There의 신속하고 종합적인 분석이 가능하다. 실험이 잠재적 인 약물 치료 중에 죽음을 방지하고 ERG 녹음 중에 장시간 생활을 보장하기 위해 전에 제브라 피쉬의 유충이 건강해야합니다. 또한, 실험에 이용 유충 밀접 연령대 것이 중요하다. 이는 망막 (콘 아형, 즉 차동 개발), 또한 유생의 전체적인 형태 및 생리 급속한 발전이다. 예를 들어, 상피 증산 효율 DPF 7 후에 더 어렵게 살아 물고기를 유지하게 감소한다. 또 다른 중요한 요소는 기록 전극과 기준 전극의 품질이다. 거친 가장자리 t을 방지하기 위해 유리 모세관을 당겨 때주의가 필요하다IPS. 마이크로 피펫 microforge는 신호 수집을 개선하기 위해 전극과 도움을 뽑아 불 닦으에 사용될 수있다. 또한 자세 / AgCl을 전극의 품질을 유지하는 것은 매우 중요하다. 사용...

전위도 (ERG)은 인간의 망막 기능을 결정하기위한 임상에서 널리 사용되어 전기 생리 비 침습적 방법이다. 광 자극에 응답하여 전기적 활성도는 각막의 외부면에 기록 전극을 배치하여 측정된다. 자극 패러다임과 응답 파형의 특성이 반응에 기여하는 망막 신경 세포를 정의한다. 이 방법은 마우스와 관상어 동물 모델의 수와 함께 사용하도록되어왔다. 일반적인 척추 ERG 응답은 네 개의 주 성분 갖는다 : 시각 세포 유래의 활성 각막 마이너스 전위 파형 발생기; B-파도 극세포 ON으로부터 유도 각막 양의 전위; D-파도 OFF 쌍극 세포의 활동으로 해석 각막 양의 전위; 와 B 파 후 몇 초 발생하고 C-파, 뮐러 아교 세포와 RET 활동을 반영원고 판 색소 상피 1-4. 인간과 모델 동물에서 ERG 분석의 역사와 원리를 이해하기위한 추가 참조는 원칙과 비전 4, 5의 임상 전기 생리학의 연습으로 유타와 텍스트의 대학에서 온라인 교과서, WebVision을이다. 다니오의 레 리오 (rerio) (제브라 피쉬)는 긴 인해 기관 시스템, 행동 분석의 비 침습적 인 형태 학적 분석과 순방향 및 역방향 유전 화면 (검토를 위해, Fadool과를 볼 수 있습니다 급속한 성숙과 투명성에, 척추 개발을위한 모델로 선호되었다 다울 링 6). Zebrafish의 유충, 높은 생산력과 결합 할 때, 그 높은 처리량 생물학적 분석을위한 훌륭한 동물 모델 만드는 유전 및 약리 조작에 매우 의무가 있습니다. 애벌레 제브라 피쉬의 막대에 콘의 높은 비율 - 약 1 : 1 마우스 (~ 3 % 콘에 비해S) - 콘 기능 7-9의 연구에 특히 유용합니다. 척추 동물의 망막에서 콘로드 (10) 전에 개발. 흥미롭게도, 제브라 피쉬 콘은 그 단계 6, 11, 12에 콘의 선택적 전기 생리학 분석을 허용, 이르면 4 DPF로 동작한다. 반면, 막대의 ERG 응답은 11 21 13 DPF 사이에 나타납니다. 따라서, 4-7에서 제브라 피쉬의 유충은 DPF 모든 콘 망막으로 기능적 역할을한다. 그러나 4-7 DPF 유충의 기본 포토 픽 ERG 응답은 B 파에 의해 지배된다. (+) - - 2- 아미노 -4- 포스 포노 부티르산 (L-AP4), 대사성 글루타메이트에 대한 작용제 쌍극 세포에 의해 발현 (mGluR6) 수용체를 효과적으로 차단 예컨대 L로서 생성되는 약물의 응용 B 파의와 격리 된 콘 질량 수용체 가능성, ( &quot;파&quot;) 14 ~ 17을 보여준다. 여기에서 우리는 간단하고 reliabl을 설명제브라 피쉬 애벌레와 함께 사용하도록 적응 된 생쥐와 함께 사용하도록 설계 ERG 시판 장비를 이용하여 ERG의 전자 분석 방법. 이 시스템은 시각 감도 및 빛 적응에 기여 16 신호 전달 경로의 식별을 돕기 위해 연구자, 유전 배경 변화뿐만 아니라 약리학 적 제제로 처리 된 것과 같은 지브라 피쉬의 유충에 이용 될 수있다. 이 프로토콜에 설명 된 실험 절차는 비전에 관한 생물학적 다양한 질문에 대답 ERG 분석의 사용에 수사관을 안내하고, 유연한 ERG 설정의 건설을 시연 할 예정이다.

<table><tbody><tr><td>패러데이 케이지</td><td>80/20 Inc</td><td>맞춤형</td><td>맞춤형 알루미늄 "산업용 이렉터 세트" 케이지 프레임워크</td></tr><tr><td>PVA 스폰지</td><td>아마존</td><td>B000ZOWG1C</td><td>제브라피쉬 유충 배치를 위한 부드럽고 촉촉한 플랫폼 제공</td></tr><tr><td>150ml 멸균 필터 시스템</td><td>Corning</td><td>431154</td><td>필터링 솔루션은 작은 관절이 마이크로피펫을 차단하는 것을 방지합니다.</td></tr><tr><td>Espion E2</td><td>Diagnosys, LLC</td><td>연락처</td><td>모든 자극기에 대한 시각적 자극을 생성하고 고유 소프트웨어를 사용하여 반응의 디지털 기록 및 분석을 수행할 수 있는 모듈식 전기 생리학 시스템, 자세한 내용은</td></tr><tr><td>http://www.diagnosysllc.com Colordome</td><td>Diagnosys, LLC</td><td></td><td>Ganzfeld ERG용 RGB LED 및 크세논 광원이 있는 접촉 광 자극기, http://www.diagnosysllc.com</td></tr><tr><td>Micromanipulator에 대한 자세한 정보</td><td>Drummond</td><td>3-000-024-R</td><td>기록 미세 전극</td></tr><tr><td>자기 링 스탠드</td> 고정 <td>및 위치 지정 Drummond</td><td>3-000-025-MB</td><td>카메라 및 굴절 전극 고정 및 위치</td></tr><tr><td>지정 리드 확장</td><td>Grass Technologies</td><td>F-LX</td><td>전극 연결용 예비 암-수 1.5mm 리드 케이블</td></tr> 수 핀 <tr><td>- 암 SAFELEAD 어댑터</td><td>Grass Technologies</td><td>DF-215/10</td><td>2mm 핀을 1.5 헤드보드 핀에 연결</td></tr><tr><td>윈도우 스크린 프레임(금속) 및 스플라인</td><td>Lowes 또는 Home Depot</td><td>다양한</td><td>패러데이 케이지 프레임워크에 구리 메쉬 부착용</td></tr><tr><td>Steriflip 50ml 필터</td><td>Millipore</td><td>SCGP00525</td><td>작은 관절이 마이크로피펫을 막는 것을 방지하기 위한 필터링 솔루션</td></tr><tr><td>BNC 어댑터</td><td>Monoprice</td><td>4127</td><td>BNC 케이블에 카메라 연결</td></tr><tr><td>BNC 케이블</td><td>Monoprice</td><td>626</td><td>카메라를 비디오 어댑터에 연결</td></tr><tr><td>카메라 렌즈</td><td>Navitar</td><td>1582232</td><td>유충 각막에 기록 미세 전극의 위치 시각화</td></tr><tr><td>카메라 커플러</td><td>Navitar</td><td>1501149</td><td>유충 각막에 기록 미세 전극의 위치 시각화</td></tr><tr><td>Luna BNC to VGA + HDMI 변환기</td><td>Sewell</td><td>SW-29297-PRO</td><td>BNC-VGA 어댑터는 카메라 이미지를 컴퓨터 모니터에 투사할 수 있게 해주며</td></tr><tr>,<td>APB</td><td>Sigma</td><td>A1910</td><td>mGluR6 작용제, b-wave를 차단하여 고립된 원뿔 질량 수용체 전위를 분석할 수 있게 해줍니다.</td></tr><tr><td>보로실리케이트 유리</td><td>Sutter</td><td>BF-150-86-10</td><td>파이어폴리싱 붕규산 유리 (측정 온도 = 821°C; C) 필라멘트 및 1.5mm x 0.86mm(내경 기준 외경)의 치수&nbsp;</td></tr><tr><td>P97 화염 / 갈색 풀러</td><td>Sutter</td><td>P97</td><td>유리 마이크로 피펫 당기기 용</td></tr><tr><td>Sorbothane 시트</td><td>Thorlabs</td><td>SB12A</td><td>충격을 흡수하고 미끄러짐을 방지하기 위해 수동 격리 마운트 및 ERG 플랫폼 아래에 배치 된 합성 점탄성 우레탄 폴리머는</td></tr><tr><td>ERG 자극기 및 제브라 피쉬 표본</td><td></td><td></td><td></td> 용 브레드 보드 Thorlabs B2436F 진동 절연 플레이트로</tr> 절단 할 수 있습니다.<tr><td>수동 격리 마운트</td><td>Thorlabs</td><td>PWA074</td><td>브레드 보드에 진동 차단 제공</td></tr><tr><td>구리 메쉬</td><td>TWP</td><td>022X022C0150W36T</td><td>패러데이 케이지</td></tr><tr><td>피펫 펌프</td><td>VWR</td><td>53502-233</td><td>파스퇴르 피펫과 함께 사용하여 제브라 피쉬 유충을 조심스럽게 이송</td></tr><tr><td>파스</td>퇴르 피펫 <td>VWR</td><td>14672-608</td><td>피펫 펌프와 함께 사용하여 제브라 피시 유충을 조심스럽게 이송합니다</td>.</tr><tr><td>Camera</td><td>Watec</td><td>WAT-902B</td><td>유충 각막에 기록 미세전극의 위치 시각화</td></tr><tr><td>트리카인(MS-222),</td> <td>웨스턴 케미컬</td><td>트리카인-S</td><td>, 제약 등급 마취제,</td></tr> <tr><td>Micro-fil</td><td></td><td>WPI MF28G-5</td><td>충전 미세전극 홀더 및 미세전극 유리</td></tr><tr><td>미세전극 홀더</td>, <td>WPI</td><td>MEH2SW15</td><td>유리 미세 전극을 잡고 ERG 장비</td></tr><tr><td>참조 전극</td><td>WPI</td><td>DRIREF-5SH</td>에 연결 <td>케이싱의 마지막 센티미터를 조심스럽게 분리하여 전해질을 배출하고 소결 Ag/AgCl 펠릿 전극</td></tr><tr><td>참조 전극(대안)</td><td></td><td>WPI EP1</td><td>DRIREF-5SH의 대안을 노출시킵니다. 연결 리드에 배선/납땜해야 하는 Ag/AgCl 전극</td></tr><tr>마이크로 전극 홀더 <td>WPI</td><td>13620</td><td>용 저소음 케이블</td><td>녹음 마이크로 전극 홀더를 어댑터/헤드보드에 연결</td></tr></tbody></table>

zebrafish의 애벌레에서 비주얼 응답의 전위도 분석

Electroretinogram Analysis of the Visual Response in Zebrafish Larvae

전위도 (ERG)은 망막의 기능을 결정하기위한 비 침습적 전기 생리 학적 방법이다. 각막의 표면에 전극의 배치를 통해, 전기적 활성도를 측정하여 생체 내에서 망막 세포의 활성을 평가하기 위해 사용할 수있는 광에 응답하여 생성. 이 원고 지브라 피쉬의 시각 기능을 측정 ERG의 사용을 설명한다. Zebrafish의 긴 인해 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오티드 및 약리학 적 유전자 조작에 의한 억제의 용이함 척추 개발을위한 모델로서 이용되어왔다. 5-10 DPF에서, 만 콘 애벌레 망막 기능입니다. 따라서, 제브라 피쉬는 다른 동물과 달리, 생체 내에서 콘 시각 기능의 연구를위한 모델 강력한 시스템이다. 이 프로토콜은 표준 마취, 미세 조작 및 제브라 피쉬의 연구를 수행 실험실에서 흔히 실체 현미경 프로토콜을 사용합니다. 설명 방법은 표준 전기 생리학 EQ를 사용합니다uipment과 저조도 카메라는 애벌레 각막에 기록 미세 전극의 위치를​​ 안내합니다. 마지막으로, 우리는 원래 쥐와 함께 사용하도록 설계된 시판 ERG 자극기 / 레코더 쉽게 지브라 피쉬 함께 사용하도록 적응 될 수있는 방법을 보여준다. 애벌레 제브라 피쉬의 ERG는 모르 폴리 노 올리고 뉴클레오타이드 주입에 의해 수정 된 동물에서 콘 시각​​ 기능을 분석의 우수한 방법뿐만 아니라 아연 핑거 뉴 클레아 제 (ZFNs) 같은 새로운 게놈 엔지니어링 기술을 제공, 전사 활성제와 같은 이펙터 클레아 제 (TALENs) 및 정기적으로 클러스터 Interspaced 짧은 회문 반복 (CRISPR) / 크게 효율성과 제브라 피쉬에서 대상 유전자의 효능을 증가 모두 Cas9. 또한, 우리는 광 응답에 기여하는 분자 성분을 평가하기 지브라 피쉬 유충 침투되는 약물의 능력을 이용한다. 이 프로토콜은 변형 된 연구자에 의해 사용될 수있는 설정을 간략다양한 실험 목표.

일반적으로, 망막 전위는 많은 연구가이 단계 9, 16, 20에서 ERG 녹음을 게시 한 이후, 5 DPF에서 zebrafish의 유충으로 기록됩니다. 유생 응답은 백색 LED 광의 20msec의 자극을 이용하여 설정된 배경 조명 암순응 조건으로 측정 하였다. 우리 Ganzfeld 광 자극기 및 컴퓨터 제어기 / 레코더 이루어진 시판 ERG 시스템을 이용했다. 자극기는 배경 및 플래시 자극 모두의 휘도를 제어하는​​ 고유 엄격하게 제어 펄스 폭 변조 (PWM) 시스템을 사용한다. 응답은 디지털 변환기 (ADC)에 대한 16 비트 아날로그 구동 하드웨어 안티 앨리어싱 필터와 독점적 완전 차동 증폭기를 사용하여 기록 하였다. 자극 및 응답 녹음하여 제조사의 프로토콜에 따라 기기에 포함 된 전용 소프트웨어에 의해 제어되었다. 우리의 장비는 1 kHz의 샘플링 레이트를 이용하도록 프로그램 된 디지털 베셀 CASC에이드 필터는 0.312 Hz에서 300 Hz에서, 과도한 노이즈를 제거하기위한 60 Hz에서 노치 필터...

우리는 미세 조작 및 전기 망막검사 기술을 사용하여 제브라피시 유충의 전기망막검사(ERG) 분석 방법을 제시합니다. 이것은 생체 내에서 제브라피시 유충의 시각 기능을 분석하는 간단하고 간단한 방법입니다.

Zebrafish의 애벌레에서 비주얼 응답의 전위도 분석

The electroretinogram (ERG) is a noninvasive electrophysiological method for determining retinal function. Through the placement of an electrode on the ...

이 절차의 전체적인 목적은 제브라피쉬 유생에 대해 전신도 분석을 수행하는 데 필요한 단계들을 설명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 적절한 형태와 크기의 유리 마이크로 피펫을 제작합니다. 두 번째 단계로는 기준 전극 및 기록 전극과 같이 실험에 필수적인 장비들을 세심하게 설정합니다.다음으로, 제브라피시 치어를 마취시키고 자극 및 기록 장비에 맞춰 적절하게 정렬합니다. 마지막 단계는 제브라피시 치어의 각막 위에 유리 미세전극을 정확하게 배치하는 것입니다. 최종적으로 제브라피시 치어 단계가 완료됩니다.ERG 분석은 모든 원추세포 척추동물 망막의 원추세포 시각 기능을 생체 내(in vivo)에서 조사하는 데 유용합니다. 이 방법은 원추세포의 시각적 민감도와 빛 적응에 기여하는 신호 전달 경로의 식별과 같이 시각 과학 분야의 핵심 질문에 답하는 데 매우 유용합니다. 제브라피시 치어의 눈 크기가 매우 작기 때문에 기록용 미세 전극을 시료 위에 적절하게 배치하는 방법을 익히기가 어려우므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.이 절차를 시작하려면, 필라멘트를 사용하여 화염 연마된 붕규산 유리 모세관으로 마이크로 피펫을 여러 개 당겨 만듭니다. 각각의 마이크로 피펫을 적절한 눈금자로 현미경 하에서 확인하여 팁의 직경이 10 to 15 µm이며 외관상 균일한지 확인합니다. 실험 당일에 10x Ringer 용액을 1x로 희석하여 작업 용액을 제조합니다.탈이온 증류수 필터를 사용하여 용액을 멸균함으로써 입자가 마이크로 피펫 팁을 막지 않도록 합니다. 그런 다음 95% oxygen, 5% carbon dioxide로 10분 동안 산소 공급을 합니다. 이후 용액의 산소 포화 상태를 유지하기 위해 용액의 캡을 단단히 닫습니다.이제 점탄성 우레탄 폴리머 충격 흡수 바닥면이 있는 가동식 플라스틱 플랫폼을 광원 아래의 진동 방지 테이블 위에 놓으십시오. 다음으로, 자석 스탠드를 이용해 카메라를 배치하고 가동식 플라스틱 플랫폼을 향하게 하십시오. 그런 다음 기록용 미세 전극의 마이크로 매니퓰레이터를 두 번째 자석 스탠드 위에 배치하십시오.카메라와 마이크로 조작기가 다른 장비의 움직임에 의해 방해받지 않도록 하고, 광원으로부터 오는 조명을 가리지 않게 하십시오. 그 후, 카메라를 비디오 모니터에 연결하고 플랫폼 방향으로 배치하십시오. 설정 장치가 구리선으로 적절히 접지되었는지 확인하십시오.이 단계에서는 깨끗한 면도날을 사용하여 35 mm 페트리 접시에 딱 맞게 들어갈 크기의 작은 직사각형 모양으로 건조한 PVA 스펀지를 자릅니다. 기준 전극을 배치할 수 있도록 스펀지에 추가로 절개선을 만듭니다. 그런 다음 화학 내성 마커를 사용하여 유충이 놓일 위치에 스펀지 위에 작은 점 A를 표시합니다.그 후, PVA 스펀지를 링거액(ringer solution)에 충분히 적셔질 때까지 담가둡니다. 스펀지를 꺼내어 페이퍼 타월로 빠르게 두세 번 눌러 닦아낸 다음, 깨끗한 35 millimeter 페트리 접시에 넣습니다. 이어서 스펀지가 담긴 페트리 접시를 카메라로 표시를 확인할 수 있도록 플라스틱 플랫폼 위에 배치합니다.다음으로, 전극을 6~9% 염화나트륨 용액에 담가 염화 처리합니다. 그런 다음 킴와이프(Kim wipe) 위에서 5분 동안 자연 건조합니다. 절개 방식에 따라 기준 전극의 은-염화은 펠릿을 스펀지 내부 또는 아래에 배치하고, 기준 전극 리드선을 기록 시스템에 연결합니다.다음으로, 약 40cm 길이의 튜브를 5mL 논루어락(non lure lock) 주사기에 연결하고 주사기에 링거액을 채웁니다. 그 후, 1mL 논루어락 주사기에 링거액을 채웁니다. 마이크로필(microfill)을 사용하여 마이크로 전극 홀더를 조심스럽게 채우고 기포가 생기지 않도록 합니다.그런 다음 마이크로필(microfill)을 사용하여 5 mL 주사기를 튜브로 마이크로 전극 홀더의 압력 포트에 연결하고, 링거 용액(ringer solution)이 채워진 1 mL 주사기를 연결합니다. 유리 마이크로 피펫의 팁 부분부터 용액을 채우고 기포가 없는지 확인합니다. 다음으로, 유리 마이크로 피펫을 마이크로 전극 홀더에 부착하며, 이때 전극 와이어가 직선을 유지하도록 주의하십시오.고정이 완료되면, 5 mL 주사기를 사용하여 링거액을 미세 전극을 통해 조심스럽게 밀어 넣어 팁 끝에 소량의 용액이 보일 때까지 진행합니다. 이제 기록용 미세 전극을 마이크로 매니퓰레이터에 조심스럽게 배치하고, 리드선을 기록 시스템에 연결하여 시스템 노이즈를 확인합니다. 기준 전극과 기록용 미세 전극의 팁을 링거액이 채워진 35 mm 페트리 접시에 넣습니다.오실로스코프 또는 ERG 장비의 내장 기능을 사용하여 설정의 전기적 노이즈 수준을 확인하십시오. 노이즈 수준은 기저선으로부터 ±10 µV 이내여야 합니다. 이 절차에서는, 1 cm² 크기의 종이 타월 조각을 여러 개 자르고, 35 mm 페트리 접시에 3~5마리의 유충을 넣은 후 trica를 최종 농도 0.02%가 되도록 첨가하고 1~2분 동안 기다려 마취시킵니다.그 후, 조명 강도를 최소화한 해부 현미경 하에서 개별 유충을 종이 타월 조각 위로 조심스럽게 옮깁니다. 30분 이상 지속되는 기록 세션의 경우, 눈이 가려진 채 등 쪽이 위를 향하고 있는 개체를 후보로 선택하여 유충의 위치를 확인합니다. 가는 낙타털 브러시를 사용하여 몸에 3% methylcellulose를 도포함으로써 유충이 촉촉한 상태를 유지하도록 합니다.그런 다음 유충이 놓인 정사각형 종이 타월을 젖은 PVA 스펀지로 옮깁니다. 이어서, 증류수가 담긴 사이드암 플라스크의 에어스톤을 통해 가스를 버블링하여 100% 산소로 포화된 물을 유충 위에 지속적으로 흘려줍니다. 최소한의 조명 아래에서 튜브를 사용하여 플라스크 사이드암에서 나오는 가습된 산소를 유충의 머리 근처에 배치합니다.마이크로 매니퓰레이터와 카메라를 사용하여 마이크로 전극 팁을 눈의 비측(nasal) 끝과 미측(caudal) 끝의 중간 지점에 위치시키고, 각막의 등쪽 한계점에 부드럽게 누릅니다. 유충이 어둠에 5분에서 10분 동안 적응하도록 둡니다. 그런 다음 LED 광원 또는 광학 자극기에서 제공되는 빛에 대한 테스트 플래시 반응을 기록합니다.이 그림은 수정 후 5일(DPF) 된 제브라피시 치어의 전형적인 ERG 기록을 보여줍니다. 암적응된 물고기에 0초 시점에서 백색 LED 광자극을 20밀리초 동안 조사하였으며, 광강도는 1에서 5,000 canula per square meter 범위였습니다. 음의 전위인 a파는 구별하기 어려우나, 양의 전위인 b파가 파형의 지배적인 피크로 나타납니다.이 삽입도는 Naka-Rushton 식을 사용하여 피팅한 평균 B파 응답 진폭을 보여줍니다. 이 그림은 PB로 처리된 암적응 상태의 5 DPF 제브라피쉬 유충에서 측정된 전형적인 ERG 기록을 나타냅니다. 제브라피쉬는 1에서 5,000 cd/m² 범위의 강도를 가진 LED 백색광에 20 밀리초 동안 노출되었으며, 파형의 지배적인 요소는 분리된 원추세포 집단의 수용기 전위입니다. 이 삽입도는 Naka-Rushton 식을 사용하여 피팅한 PB 처리 제브라피쉬 유충의 평균 응답 진폭을 보여줍니다.이 그림은 이중 플래시 패러다임을 사용하여 5 D-P-F-A-P-B 처리된 제브라피시 치어에서 기록한 전형적인 망막전위도(ERG)를 보여줍니다. 암적응된 물고기에 20 millisecond의 백색광을 연속적으로 조사하였습니다.LED는 1000 canula per square meter의 강도로 점멸하며, 점멸 간의 ISI는 2초입니다. 각 빛 자극의 시작 시점이 여기에 표시되어 있습니다. 이 그림은 ISI가 증가함에 따라 첫 번째 자극 대비 두 번째 자극의 최대 단일 원추세포 집단 수용체 전위 반응 비율을 보여주며, 이는 광수용체 민감도의 점진적인 회복을 나타냅니다.이 절차를 시도할 때는 기록의 품질이 전극과 각막 연결의 무결성 및 유충의 건강 상태에 의해 결정된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술의 개발은 시각 과학 분야의 연구자들이 척추동물 망막 내의 원추세포 적응 및 회복을 in vivo로 탐구할 수 있는 능력을 크게 향상시켰습니다.

electroretinogram-analysis-of-the-visual-response-in-zebrafish-larvae

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 빛의 단위 및 감소에 대응하기 애벌레 zebrafish의 모터 출력을 quantitate하는 비주얼 모터 응답을 개발했습니다. 우리는 또 다른 비전 분석, optokinetic 반사에 의해 시험을 할 때 상당히 운이 좋았다고 생각했던 optokinetic 응답 (NRC) 돌연변이, 아무도를 포함하여 zebrafish 비전 돌연변을 조사.

라이트 농도의 변화에​​ Zebrafish의 응답을 측정하기 위하여 행동 어세이

Optokinetic 응답 널리 애벌레 zebrafish의 시각 기능을 평가하기 위해 사용되고 있습니다. 그럼에도 불구하고, 애벌레 물고기를위한 표준 프로토콜은 아직 성인에 즉시 적용되지...

zebrafish의 시각 기능을 연구하기 위해 optokinetic 응답을 사용하여

VisioTracker는 안구 운동의 기록을 바탕으로 애벌레의 작은 성인 물고기의 시각적 성능의 정량 분석​​을위한 자동화 된 시스템입니다. 이 같은 시각 시스템 개발 및 기능, 약리학, 신경 회로 연구와 sensorimotor 통합 등의 분야에서 높은 처리량 연구를 활성화, 시각 자극 속성과 실시간 분석에 대한 모든 권한을 제공합니다.

VisioTracker, 눈 돌림 분석에 대한 혁신적인 자동화 된 접근

이 비디오는 자동 추적 소프트웨어를 사용하여 제브라피시와 팻헤드 미노 유충의 광운동 반응 분석을 설명합니다. 이 프로토콜은 조명 조건의 갑작스런 변화에 따른 애벌레 물고기의 행동 반응을 측정합니다.

Photomotor Response Assay: 조명 조건의 급격한 변화에 대한 애벌레 제브라피시의 행동 반응을 측정하는 방법

이 비디오는 제브라피쉬의 광역학 반응 분석을 설명합니다. 이 비디오는 시각적 움직임 자극을 기반으로 반사적 안구 움직임을 측정하고 제브라피쉬의 시력을 측정합니다.

Optokinetic Response Assay: 제브라피시의 시력을 측정하는 방법

이 비디오는 형광 칼슘 지시약 복합체를 발현하는 뉴런을 이용한 칼슘 지표 기반 형광 이미징을 사용하여 형질전환 제브라피시 유충의 시각적 먹이 감지를 연구하는 방법을 보여줍니다.

형질전환 제브라피시 유충에서 먹이가 유발하는 뉴런 활동 분석

제브라 피쉬는 많은 연구 분야를위한 유용한 도구가되고있다. 여기서 우리는 시각적 인 반응을 유도하고 성인 제브라 피쉬의 기능 시력을 계산하는 방법을 보여줍니다.

Zebrafish의 시력의 정량적 측정과 Optokinetic 응답

우리는 성체 제브라피쉬에서 망막 신경절 세포(RGC)를 역행하는 효율적인 방법을 소개합니다.

형광 염료와 성인 Zebrafish의 망막 신경절 세포의 퇴행성 라벨링

여기서, 우리는 DEPDC5 유전자의 일시적인 억제로 인한 간질의 제브라피시 모델의 개발 및 특성화를 위한 프로토콜을 제시한다.

간질의 제브라피시 모델의 행동 및 생리학적 분석

여기, 선물이 애벌레 zebrafish에서 빛 갖는 electroretinogram 응답의 측정을 간소화 하는 프로토콜. 소설 원뿔 모양의 스폰지 팁 전극에 electroretinogram를 사용 하 여 신뢰할 수 있는 결과 낮은 비용으로 달성 하기 쉽게 하는 애벌레 zebrafish에 시각적 개발의 연구를 만들기 위해 도울 수 있다.

스폰지 팁 전극 A 소설 원추형을 사용 하 여 애벌레 Zebrafish에 기록 하는 Electroretinogram

이 기사는 망막 입력이 광학 텍텀의 성장과 발달에 어떻게 영향을 미치는지 조사하기위한 첫 번째 단계로 살아있는 제브라 피쉬 유충에서 눈을 외과 적으로 제거하는 방법을 설명합니다. 또한이 기사는 애벌레 마취, 고정 및 뇌 해부에 대한 정보를 제공하고 면역 조직 화학 및 공초점 이미징을 제공합니다.

살아있는 제브라 피쉬 유충의 눈 제거는 시각 시스템의 신경 의존적 인 성장과 발달을 조사합니다.

배우세요 제브라피시 애벌레에서 전기망막도(ERG) 분석을 위한 미세조작 기법을 활용한 시각 기능 평가 방법을. 이 기법은 생체 내 원추세포 시각 기능 연구에 활용됩니다.

Zebrafish의 애벌레에서 비주얼 응답의 전위도 분석

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