Zebrafish의 애벌레에서 비주얼 응답의 전위도 분석

이 절차의 전반적인 목표는 유충 얼룩말 물고기에 대한 전기 분석을 수행하는 데 필요한 단계를 설명하는 것입니다. 이는 먼저 적절한 모양과 크기의 유리 마이크로 파이펫을 생성하여 수행됩니다. 두 번째 단계는 참조 전극 및 기록 전극과 같이 실험에 중요한 장비를 신중하게 설정하는 것입니다.

다음으로, 유충 제브라피쉬는 마취되고 자극 및 기록 장비에 비해 적절하게 방향을 잡습니다. 마지막 단계는 유리로 된 마이크로 전극을 유충 얼룩말 물고기의 각막에 적절하게 배치하는 것입니다. 궁극적으로 애벌레 얼룩말 물고기.

ERG 분석은 생체 내에서 모든 원뿔 척추동물 망막의 원뿔 시각 기능을 조사하는 데 유용합니다. 이 방법은 원추세포의 시각적 민감도와 빛 적응에 기여하는 신호 경로의 식별과 같은 시각 과학 분야의 주요 질문에 답하는 데 매우 유용합니다. 이 방법의 시각적 시연은 유충 제브라피시 눈의 크기가 작기 때문에 표본에 기록하는 마이크로 전극의 적절한 위치를 배우기가 어렵기 때문에 중요합니다.

이 절차를 시작하려면 필라멘트가 있는 화염 광택 보로 실리케이트 유리 모세관을 사용하여 여러 개의 마이크로 피펫을 당깁니다. 적절한 눈금자를 사용하여 현미경으로 각 마이크로 피펫을 검사하여 팁 직경이 10 - 15 마이크로미터이고 외관이 균일한지 확인합니다. 실험 당일에 10 x ringer 용액을 1 x로 희석하여 작동하는 용액을 만듭니다.

탈이온화된 증류수 필터를 사용하여 용액을 살균하여 미립자가 마이크로 피펫 팁을 막지 않도록 합니다. 그런 다음 10 분 동안 95 % 산소, 5 % 이산화탄소로 산소화합니다. 용액이 산소로 유지되도록 나중에 용액을 단단히 덮으십시오.

이제 점탄성 우레탄 폴리머 충격 흡수 바닥이 있는 이동식 플라스틱 플랫폼을 광원 아래의 진동 방지 테이블에 놓습니다. 다음으로, 자석 스탠드로 카메라를 배치하고 이동식 플라스틱 플랫폼을 조준합니다. 그런 다음 기록 마이크로 전극의 마이크로 매니퓰레이터를 두 번째 자화 스탠드에 배치합니다.

카메라와 마이크로 매니퓰레이터가 다른 장비의 움직임으로 인해 방해받지 않도록 하고 광원의 조명을 차단하지 마십시오. 그런 다음 카메라를 비디오 모니터에 연결하고 플랫폼 쪽으로 배치합니다. 설정이 구리선으로 올바르게 접지되었는지 확인하십시오.

이 단계에서는 깨끗한 면도날로 35mm 페트리 접시에 꼭 맞는 작은 직사각형의 마른 PVA 스폰지를 자릅니다. 기준 전극을 수용하기 위해 스폰지를 추가로 자릅니다. 그런 다음 내화학성 마커를 사용하여 유충이 배치될 스폰지에 A. 작은 점을 표시합니다.

그런 다음 PVA 스폰지를 링거 용액에 포화 될 때까지 담그십시오. 깨끗한 35mm 페트리 접시에 넣기 전에 종이 타월로 두세 번 빠르게 제거하고 닦아내십시오. 그런 다음 스펀지가 들어 있는 페트리 접시를 플라스틱 플랫폼에 놓아 카메라가 마크를 시각화할 수 있도록 합니다.

다음으로, 전극을 6-9%의 염화나트륨에 담궈 염화물을 염화시킵니다. 그런 다음 Kim 물티슈로 5분 동안 자연 건조합니다. 절단 스타일에 따라 기준 전극의 은, 은염화물 펠릿을 스폰지 내부 또는 아래에 놓고 기준 전극 리드를 기록 시스템에 부착합니다.

다음으로, 5밀리리터 루어 잠금 장치 주사기에 약 40cm의 튜브를 부착하고 주사기에 링거 용액을 채웁니다. 그런 다음 1밀리리터 루어 잠금 주사기에 링거 용액을 채웁니다. 마이크로필을 사용하여 마이크로 전극 홀더를 조심스럽게 채우고 기포 형성을 방지합니다.

그런 다음 마이크로필과 링거 용액으로 채워진 1밀리리터 주사기를 사용하여 튜브가 있는 마이크로 전극 홀더의 압력 포트에 5ml 주사기를 부착합니다. 팁에서 유리 마이크로 피펫을 채우고 기포가 없는지 확인합니다. 다음으로, 유리 마이크로 피펫을 마이크로 전극 홀더에 부착하고 전극 와이어를 똑바로 유지하도록 주의하십시오.

고정되면 5ml 주사기를 사용하여 팁에 소량의 용액이 보일 때까지 미세 전극을 통해 링거 용액을 조심스럽게 밀어 넣습니다. 이제 마이크로 매니퓰레이터에 기록 마이크로 전극을 조심스럽게 놓고 리드를 녹음 시스템에 연결하여 시스템 소음을 확인합니다. 기준 전극과 기록 마이크로 전극의 끝을 링거 용액으로 채워진 35mm 페트리 접시에 놓습니다.

오실로스코프 또는 ERG 장치의 내장 기능을 사용하여 설정의 전기 노이즈 수준을 확인하십시오. 소음 수준은 기준선에서 ±10마이크로볼트를 넘지 않아야 합니다. 이 절차에서는 1 평방 센티미터 종이 타월 사각형 여러 개를 자르고 35mm 페트리 접시에 트리카를 0.02 %의 최종 농도에 첨가하여 3-5 마리의 유충을 마취하고 1-2 분 동안 기다립니다.

그 후, 최소한의 조명으로 해부 입체경 아래의 종이 타월 사각형에 개별 유충을 조심스럽게 옮깁니다. 유충의 위치를 확인하고 30분 이상 지속되는 세션을 기록하기 위해 눈을 가린 등 쪽이 위로 향하는 후보를 선택합니다. 고운 낙타 털 브러시를 사용하여 3% 메틸셀룰로오스로 몸을 윤기내어 유충을 촉촉하게 유지하십시오.

그런 다음 유충이 있는 종이 타월 사각형을 젖은 PVA 스폰지로 옮깁니다. 다음으로, 증류수가 들어있는 사이드암 플라스크의 에어스톤을 통해 가스를 버블링하여 유충 위에 100% 산소로 포화된 물의 지속적인 흐름을 적용합니다. 플라스크 사이드암의 가습된 산소를 최소한의 조명 아래에서 튜브가 있는 유충 머리 근처에 배치합니다.

마이크로 매니퓰레이터와 카메라를 사용하여 마이크로 전극 팁을 눈의 코끝과 코끝의 중간 지점에 배치하고 각막의 등쪽 한계를 부드럽게 누릅니다. 유충이 5-10분 동안 어둠에 적응할 수 있도록 합니다. 그런 다음 LED 광원 또는 광학 자극기에서 제공되는 빛에 대한 테스트 플래시 응답을 기록합니다.

이 그림은 5마리의 DPF 유충 얼룩말 물고기에서 일반적인 ERG 기록을 보여줍니다. 어둡게 적응한 물고기는 0초에서 빛 자극이 시작되는 평방 미터당 1에서 5, 000 캐뉼라에 이르는 강도로 20밀리초 동안 백색 LED 빛에 노출되었습니다. 음의 전위 A 파동은 구별하기 어려운 반면, 양의 전위 B 파동은 파동 형태의 지배적인 피크입니다.

이 삽입은 NACA rushed in 방정식을 사용하여 피팅된 평균 B 파 응답 진폭을 보여줍니다. 이 그림은 PB로 처리된 어둡게 적응된 5개의 DPF 유충 얼룩말 물고기에서 기록하는 일반적인 ERG를 보여줍니다. 물고기는 1에서 5, 평방 미터 당 000 캐뉼라에 이르는 강도로 20 밀리 초 동안 LED 백색광에 노출되며, 고립 된 원뿔 질량 수용체 전위는 파형의 지배적 인 요소입니다. 이 삽입은 NACA rushed in 방정식을 사용하여 적합해진 PB 처리된 유충 얼룩말 물고기의 평균 응답 진폭을 보여줍니다.

이 그림은 5마리의 D-P-F-A-P-B 처리된 유충 얼룩말 물고기에서 일반적인 ERG 기록을 보여줍니다. 듀얼 플래시 패러다임 사용. 어둡게 적응한 물고기는 연속적으로 20밀리초의 백색광에 노출됩니다.

LED는 평방 미터당 1000캐뉼라의 강도로 깜박이고 깜박임 사이의 ISI는 2초입니다. 각 빛 자극의 시작이 여기에 표시됩니다. 이 그림은 ISI가 증가함에 따라 두 번째 자극의 최대 격리된 원뿔 질량 수용체 전위 반응의 비율을 보여주며, 이는 광수용체 민감도의 점진적인 회복을 나타냅니다.

이 절차를 시도하는 동안 기록의 품질은 전극, 각막 연결의 무결성 및 유충의 건강에 의해 결정된다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술의 개발은 생체 내에서 척추동물 망막의 원뿔 적응 및 회복을 탐구하는 시각 과학 분야의 연구자들의 능력을 크게 향상시켰습니다.