Name: 닭에서 인간의 다발성 골수종 이종 이식 모델의 설립은 종양의 성장, 침략과 혈관 신생을 공부하기 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: 학습하세요 닭 배아 이종 이식 모델을 사용하여 인간 다발성 골수종 세포의 종양 성장, 침략 및 혈관 신생을 연구하는 방법을. 이 기술은 항암 약물 효능을 평가하고 새로운 치료법을 개발하는 데 활용됩니다.

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저자는 면역조직화학과 닭 배아 준비에 대한 탁월한 기술적 도움을 준 Cornelia Heis에게 감사를 표하고 싶습니다. 이 연구는 오스트리아 과학 기금(FWF 보조금 번호 P19552)과 유럽 연합(EU FP7 프로젝트 Optatio No: 278570)의 지원을 받았습니다.

실험 동물 복지의 hatching.The NIH 사무실이이 지역 (HTTP 작성 지침을 제공 할 때까지 오스트리아 법, 미국 공중 보건 서비스 조류 배아의 실험 동물 복지 사무소에 따르면 라이브 척추 동물로 간주되지 않습니다 // www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm 및 NIH 출판 번호 : 06-4515). 1. 세포 배양 및 렌티 바이러스 형질 <ol><li> 문화 MM 세포주 OPM-2, RPMI-8226 및 RPMI1640 배지에서 골수로부터 인간 중간 엽 줄기 세포의 존재에서 10 % 소 태아 혈청, 100 IU / ml의 페니실린, 100 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 및 2 mM의 글루타민으로 보충 37 ℃에서 5 % CO 2. </li><li> 형질 감염 5 × 30 μL 리포좀 형질 감염 시약과 형질 매체 (10 mL)을 이용하여 바이러스 포장 믹스 (9 μg의) 및 3 μg의 DNA pLenti6 / V5 DEST eGFP는 벡터 6 HEK 293FT 세포. 12 시간 후 형질 매체를 제거하고10 % 소 혈청 및 1 % 비 필수 아미노산 (NEAA)과 10 ml의 DMEM 배지를 추가한다. </li><li> 오일 후, 수영 세포 (1,000 XG, 5 분)의 원심 분리 후 HEK293FT 세포의 상층 액을 수집합니다. 다른 28 설명 된대로 실시간 PCR에 의해 바이러스 역가를 결정합니다. </li><li> 완전한 성장 배지에서 24 웰 플레이트에 eGFP는 렌티 바이러스 입자 (1 × 10 5 입자) 1 × 10 6 MM 세포를 형질. 삼일 후, 2 μg의가 / ml로 배양 배지에 첨가하여 블라스트 선택 프로세스를 시작한다. 시중에서 판매하는 eGFP는의 렌티 바이러스를 들어, 500 μg의 / ㎖ 네오 마이신을 사용합니다. </li><li> 선택 2 주 후, MM 세포를 표현 eGFP는 클러스터가 나타납니다; 원심 분리 (1,000 XG, 5 분)에 의해 세포를 수집하고 실험 영업 이익률-2 eGFP는 및 RPMI-8226 eGFP는의 서브 라인으로 그들을 확장 (제 2, 3). </li></ol> 2. 3D-다발성 골수종 회전 타원체 모델 <ol><li> 침착 콜라겐 타입 I 용액 및 10 × DMEM 오N 얼음. </li><li> 콜라겐 매트릭스로 10 × DMEM 배지 1/10 볼륨 믹스; 7.4의 pH 값에 콜라겐 산성 용액을 중화시키기에 NaOH (0.2 N)을 추가; 저장 콜라겐 / 얼음 매체 솔루션입니다. </li><li> 형질 전환 MM 세포주 (영업 이익률-2 eGFP는 또는 RPMI-8226 eGFP는을, 회전 타원체 당 25 만) 혼합 인간 중간 엽 세포 (50,000 세포 / 회전 타원체, 즉, 30 μL 드롭)에 있습니다. </li><li> 15ml의 튜브 (1000 XG, 5 분)에서 원심 분리 세포 혼합물, 세포 펠렛을 차가운 제조 콜라겐 혼합물 (1 ㎖)를 첨가하고, (1000 μL 팁으로) 잘 섞는다. </li><li> 즉시 멸균 파라핀 필름에 24 웰 플레이트 (100 ㎕의 팁)와 콜라겐 / 세포 혼합액 30 μL 피펫 세포 / 콜라겐 혼합물을 37 ℃ (도 1a 참조)에서 30 분 동안 중합 할 수있다. </li><li> 1, 10 및 100 nM의 볼테 조미 브를 포함하는 1 ㎖의 배지와 오버레이 MM의 스페 로이드 (도 1b 참조). </li><li> 37 ° C에서 배양 72 시간 후, 문서 회전 타원체로형광 실체 현미경 (도 1C 참조). </li><li> GFP의 측정에 반응 튜브 내의 넓은 플랫 턱 겸자를 이용하여 각각의 회전 타원체로 이동 (도 1d 참조). </li></ol> CAM 3. 3D 다발성 골수종 이종 이식 모델 <ol><li> 3 일 동안 특별한 37 ° C에서 조류 계란 인큐베이터와 70 %의 습도에서 계란을 품어. </li><li> 그 후, 열려있는 계란과 전송 배아는 세포 배양 접시의 뚜껑 에탄올, 광장, 10-CM 플라스틱 무게 보트와 함께 소독하고 캠 (그림 2A 참조) 개발할 수 있도록, 더 육일은 &quot;전 비켜&quot;를 품어. </li><li> 침착 콜라겐 타입 I 용액 및 얼음에 10 × DMEM 7.4의 pH 값으로 산성 콜라겐 용액을 중화 (N 0.2) NaOH를 추가 콜라겐 매트릭스로 10 × DMEM 배지의 1/10 양을 혼합; 저장 콜라겐 / 얼음 매체 솔루션입니다. </li><li> 형질 전환 MM 세포주 (영업 이익률-2 eGFP는 또는 혼합RPMI-8226 eGFP는; 인간 중간 엽 세포와 회전 타원체) 당 250,000 (50,000 세포 / 회전 타원체). </li><li> 15ml의 튜브에서 원심 셀 (1000 XG, 5 분, 각 시험 화합물 1 바이알 용) 세포 펠릿을, (목표 작업 농도) 약물을 1 ㎖를 차가운 준비된 콜라겐 혼합물을 넣고 잘 섞어 (1000 μL의 끝). </li><li> 37 ° C에서 세포 외 기질을 중합 할 수 있도록 30 분 동안 잘 페이트 6 콜라겐 방울 파라 필름에 (30 μL 각)을 놓는다. </li><li> (2cm 떨어진 배아에서) 9 일 된 닭 배아의 캠의 치료 표면에 집게의 사용과 단계 3.6에서 전송 &quot;onplants&quot;(각 닭 배아 4 onplants, 그림 2B 참조) </li><li> 형광 실체 현미경에 의해 생체 내 37 ° C에서 계란 인큐베이터에서 성장과 70 %의 습도, 문서 이종 이식 5 일 후 (그림 2C 참조). 5 시간 동안 냉장고에 4 ° C에서 저체온증으로 닭 배아를 안락사. </li><li> 안과 가위에 의해 바로 아래 CAM 조직과 이종 이식을 제거하고 넓은 평면 턱과 포셉. GFP의 측정을 사용합니다 (제 4 장, 2D 그림 참조) 또는 혈관 및 / 또는 침입 종양 세포 (섹션 5)의 면역 조직 화학 분석. </li></ol> ELISA에 의해 eGFP는 단백질의 정량 4. <ol><li> 0.5 ㎖의 RIPA 버퍼가 200 μg의 / ㎖ 프로테아제 억제제를 포함에 각 MM은 회전 타원체 또는 절제 이종 이식을 전송합니다. </li><li> 얼음에 조직 균질로 회전 타원체 / 이종 이식 균질화. </li><li> 액체 질소에 세 동결 / 해동 사이클 및 37 ° C의 물을 욕조를 수행합니다. </li><li> 20 분 (12,000g) 및 저장 상층 액을 4 ℃에서 원심 분리기 균질. </li><li> 샘플을 ELISA 키트의 분석 버퍼 (200 μL)에 1:20 희석. 제조사의 프로토콜에 따라, 비 오티 닐화 항 GFP 항체를 이용한 ELISA 키트 상업적 GFP-GFP에 의해 레벨을 측정한다. </li></ol> 5. Immunohi혈관에 침입 종양 세포의 stochemical 분석 <ol><li> 4 ° C에서 / 4 % 파라 포름 알데히드 O에서 N을 CAM 지역과 절제 이종 이식을 수정합니다. </li><li> 매립 카세트에 고정 이종 놓고 증가 등급 알코올 시리즈 (50 %, 70 %, 80 %, 95 % 에탄올, 크 실롤 파라핀 각각 단계 60 분)으로 매립 조직 스테이션에 전송할. </li><li> 벤치 탑 로터리 마이크로톰의 사용에 의해 섹션 이종 이식 (5 μm의). 56 ° C에서 유리 슬라이드의 O / N에 파라핀 섹션 굽는다. </li><li> 이중 증류수 감소 등급 알코올 시리즈 의한 Deparaffinize 섹션 (크 실롤, 95 %, 80 %, 70 %, 50 % 에탄올, 이중 증류수, 각 단계에서 10 분). </li><li> 항원 검색 용액 수조 (95 ° C, 20 분간)에 항원 검색을 수행하여 (버퍼 citrate-하여 pH 7.0, 100 μL 부피 참조). </li><li> 30 분 동안 100 ㎕의 3 % H 2 O 2 / 메탄올 내인성 퍼 옥시 데이즈 활성을 차단. </li><li> PBS를 함유하는 차단 부45 분 (부피 100 μL) 10 % 소 태아 혈청. </li><li> PBS는 RT에서 1 % 소 태아 혈청을 함유하는 희석 차 항체 (1μg / ㎖) 100 ㎕와 함께 1 시간 동안 얼룩. </li><li> PBS로 3 회 세척 후, PBS는 RT에서 1 % 소 태아 혈청을 함유하는 비오틴 이차 항체 (0.1 μg의 / mL)로 1 시간 동안 배양. </li><li> PBS로 3 회 세척 한 후 제조자의 지시에 따라 아비딘 / 비오틴 - 복합체 (ABC) 및 디아 미노 벤지딘 (DAB) 기질 용액에 의해 발색 반응을 수행한다. </li><li> 5.11. 헤 마톡 실린으로 두 번 증류수, Counterstain과에 섹션을 전송하여 반응을 중지하고 합성 설치 매체 섹션을 탑재합니다. </li></ol>

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<li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112 (7), 2935-2945 (2008).</li>
<li>Jilani, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+binding+of+lectins+to+embryonic+chicken+vasculature%5BTitle%5D)+AND+%22J.Histochem.Cytochem%22%5BJournal%5D)">Selective binding of lectins to embryonic chicken vasculature.</a> J.Histochem.Cytochem. 51 (5), 597-604 (2003).</li>
</ol>

저자는 더 경쟁 금융 이익이 없다

내화성 MM에 대한 새로운 치료제의 개발은 약물에 대한 인간 MM 세포 민감도를 평가하는 데 시간이 덜 소요되고 비용이 생체 시스템을 필요로한다. 지금까지, 단 몇 생체 시스템은 새로운 항 골수종 치료의 임상 평가에 사용할 수 있습니다. 그들 모두는 화합물 라이브러리 (29)의 대규모 스크리닝에 대한 자신의 한계를 가지고있다. 인간의 MM 셀에 대한 가장 좋은 현재의 모델은 높은 면역 결핍 쥐 7,13,30, 터키의 배아 (29)이다. SCID 마우스 및 조류 배아 이종 이식 모델 모두 MM의 생물학을 연구 및 신규 치료 화합물을 시험하기 위해 사용될 수있다. 그러나 쥐의 시스템은 근친 유전자형, 기술적으로 까다로운 절차, 긴 관찰 기간과 높은 비용 등 여러 가지 한계를 가지고있다. 본 연구에서는, 신규 한 3D 타원체 조류 및 이종 이식 모델은 인간 MES의 존재를 포함 인간 MM 세포 생물학 연구를 ...

다발성 골수종(MM)은 골수에서 악성 형질 세포의 증식, 뼈 병변 및 면역 결핍을 특징으로 합니다 1. 프로테아좀 억제제(보르테조밉)와 면역조절제(포말리도마이드, 레날리도마이드)와 같은 새로운 치료법이 있지만, MM은 여전히 암울한 예후를 가진 불치의 악성 종양으로 남아 있다 2. 나쁜 예후는 특히 MM 클론의 장시간 치료 및 선택 압력 하에서 치료에 대한 다양한 반응에 기여하는 MM 세포 클론의 특별한 이질성에 의해 설명될 수 있습니다 3.
체외 및 생체 내 신약 및 조합의 전임상 검사는 미래 약물 개발을 위한 중요하고 시간이 많이 소요되는 단계입니다. 따라서 질병의 생물학을 더 잘 이해하고 신약을 발견할 수 있도록 MM의 유용한 생체 내 모델이 필요합니다. 실제로, 혈액 악성 종양 및 치료제에 가장 적합한 이종 이식 모델은 중증 복합 면역 결핍 (SCID) 마우스 4-7, 비만 당뇨병 / SCID (NOD / SCID) 마우스 8,9 또는 β-microglobulin-knockout NOD / SCID 마우스 10,11.
일부 측면에서 인간 MM의 쥐 모델은 인간 질병의 표현형과 유사할 수 있지만 면역이 결핍된 마우스는 근친 교배이므로 약물에 대한 단일 반응만 시뮬레이션하고 비용이 매우 높습니다. 면역 억제로 인해 동물은 특별한 유지 관리 조건이 필요하며 세포를 더 낮은 동물 생존율로 기술적으로 까다로운 절차를 사용하여 골수에 직접 이식하지 않는 한 마우스에서 인간 MM의 생착은 6 주에서 2 개월이 필요합니다 9, 12 7, 13. 따라서, 줄기세포 기반 오가노이드 모델(organoid model)14, 조직 공학(tissue engineering)15 또는 정교한 3D 세포 배양 모델(16)을 사용하는 새로운 방법이 확립되었습니다. 그들은 가까운 장래에 전임상 약물 테스트를 위한 고전적인 동물 실험과 경쟁할 것이지만 살아있는 유기체의 전신 독성 테스트를 대체할 수는 없습니다.
닭 배아는 17-19세가 부화할 때까지 적응 면역 반응이 부족하기 때문에 인간 세포와 조직의 이종 이식에 적합한 유기체임이 이전에 입증되었습니다. 더욱이, 각 닭 배아는 닭 집단 내의 유전적 다양성으로 인해 적용된 약물 또는 종양 세포에 대한 개별 반응을 반영합니다. 융모대질막(CAM)은 종양 의존성 혈관신생 20-22를 연구하기 위한 잘 정립된 시스템입니다. 고형 종양을 CAM에 이식하면 증식, 침습, 혈관 신생 및 전이를 포함한 생체 내 암의 많은 특성을 나타냅니다 23-27. 
CAM 이종 이식 모델20,26,27에 대한 우리 그룹의 이전 경험을 바탕으로 인간 3D 배양 시스템의 장점과 닭 배아 발달 전 모델을 결합한 인간 MM 모델이 수립되었습니다. 이 MM 모델 시스템을 사용하면 MM 성장 진행, 세포 질량 정량화 및 전임상 약물 검사의 실시간 모니터링을 수행할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>RPMI-8226 세포</td><td>DSMZ</td><td>ACC 9</td><td>STR 프로파일</td></tr><tr><td>OPM-2 세포</td><td>DSMZ</td><td>ACC 50</td><td>STR 프로파일 인간</td></tr><tr><td>중간엽 줄기 세포&nbsp;</td><td>PromoCell</td><td>PC-C-12974</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT 셀&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640 중간 크기의</td><td>시그마 Aldrich</td><td>R0883</td><td></td></tr><tr><td>태아 소 세럼&nbsp; HyClone</td><td>ThermoScientific</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>L-Glut- Pen- Strep 솔루션</td><td>Sigma</td><td>G6784</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium</td><td>Gibco</td><td>31966</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>Transfection Medium/Opti-MEM&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>51985</td><td></td></tr><tr><td>eGFP 렌티바이러스 입자</td><td>GeneCopoeia</td><td>LPP-EGFP-LV105</td> 사용 <td>준비 완료 바이러스 입자</td></tr><tr><td>pLenti6/V5Dest6 eGFP 벡터</td><td>Invitrogen</td><td>PN 35-1271</td><td>저자로부터의</td></tr><tr><td>ViralpowerTM 패키징 믹스&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>P/N 35-1275</td><td></td></tr><tr><td>트랜스펙션 시약/ Lipofectamin 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invitrogen</td><td>R210-01</td><td></td></tr><tr><td>Neomycin</td><td>Biochrom</td><td>A2912</td><td></td></tr><tr><td>Collagen-Type1&nbsp; 쥐 꼬리</td><td>BD Biosciences</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 분말</td><td>Life Technologies</td><td>Art.Nr. 10338582</td><td></td></tr><tr><td>플리티뎁신</td><td>Pharmamar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>bortezomib</td><td>LKT Lab., Inc.</td><td>B5871</td><td></td></tr><tr><td>SPF-white hen eggs</td><td>Charles River</td><td></td><td>Fertilized&nbsp; white Leghorn&nbsp; chicken eggs</td></tr><tr><td>Plastic weighing boats</td><td>neoLab</td><td>Art.Nr. 1-1125</td><td>ex-ovo culture</td></tr><tr><td>Petridish square (Lids)</td><td>Simport</td><td>D210-16</td><td>ex-ovo culture</td></tr><tr><td>RIPA Buffer (10x)</td><td>Cell Signaling</td><td>#9806</td><td></td></tr><tr><td>Protease 억제제 정제</td><td>Roche</td><td>11 836 170 001</td><td></td></tr><tr><td>완전한 미니 EDTA 프리</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GFP ELISA</td><td>Cell Biolabs, Inc.</td><td>AKR-121</td><td></td></tr><tr><td>Histocette II</td><td>Simport</td><td>M493-6</td><td></td></tr><tr><td>PFA&nbsp; 37%</td><td>Roth</td><td>7398.1</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-512F</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 앱솔루트</td><td>Normapur</td><td>20,821,321</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Histol</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6640.4</td><td></td></tr><tr><td>Paraplast</td><td>Sigma</td><td>A6330</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost 현미경 슬라이드</td><td>R. Langenbrinck&nbsp;</td><td>예술 .-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>Labor- u. Medizintechnik</td><td>03-0060</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DakoCytomation 세척 버퍼 10x</td><td>DakoCytomation</td><td>코드-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 3006</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>타겟 회수 용액 (10x)&nbsp; pH 6,1</td><td>DAKO</td><td>Code-Nr.</td><td></td></tr><tr><td>S 1699</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>H2O2</td><td>Merck</td><td></td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu ASMA 클론 1A4</td><td>DAKO</td><td>M0851</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu CD138 클론 MI15</td><td>DAKO</td><td>M7228</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Vimentin 클론 V9</td><td>DAKO</td><td>M0725</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Desmin 클론 D33</td><td>DAKO&</td><td>nbsp; M0760</td><td></td></tr><tr><td>m-a-hu Ki67&nbsp; 클론 MIB-1&nbsp; &nbsp;</td><td>다코</td><td>&nbsp; M7240</td><td></td></tr><tr><td>비오틴화 염소 - 안티 마우스 IgG</td><td>Vector Laboratories Inc.</td><td>BA-9200</td><td></td></tr><tr><td>Vectastain Elite ABC 키트</td><td>Vector Laboratories Inc.</td><td># PK-6100</td><td></td></tr><tr><td>FAST DAB 태블릿 세트.</td><td>시그마 생화학 물질</td> <td># D4293</td><td></td></tr><tr><td>Mayer ' s haemalaun 솔루션</td><td>Merck</td><td>1,092,490,500</td><td></td></tr><tr><td>Roti Histokitt</td><td>Roth</td><td>Art.Nr.6638.2</td><td></td></tr><tr><td>벤치 탑 로터리 마이크로톰</td><td>Thermo Electron, Shandon Finesse ME+</td><td></td><td></td></tr><tr><td>조직 임베딩 스테이션</td><td>Leica, TP1020</td><td></td><td></td></tr><tr><td>달걀 부화기</td><td>Grumbach&nbsp;</td><td>BSS160</td><td></td></tr><tr><td>스테레오 형광 현미경은 디지털 카메라(Olympus E410)와 유연한 냉광과 연결되어 있습니다.</td><td>올림푸스, SZX10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>울트라 터락스&nbsp;</td><td>IKA T10</td><td></td><td>균질화기</td></tr></tbody></table>

닭에서 인간의 다발성 골수종 이종 이식 모델의 설립은 종양의 성장, 침략과 혈관 신생을 공부하기

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

다발성 골수종 (MM), 악성 형질 세포 질환, 난치성 유지 및 신규 약물은 환자의 예후를 개선하기 위해 요구된다. 인해 골 미세 자동 / 분비 성장 인자의 부족으로 인간 MM 세포는 배양하기 어렵다. 따라서, 인간의 MM 세포에 새로운 치료제의 작용을 연구하기 위해 시험 관내 및 생체 내 배양 시스템에서 적절한 확립이 절실히 요구되고있다. 여기서 우리는 시험 관내 및 생체 내에서 복잡한 3D 환경에서 인간 다발성 골수종 세포를 성장 모델을 제시한다. MM 세포주 OPM-2 및 RPMI-8226를 형질 전환 유전자 GFP를 발현하는 형질 감염시키고 인간 중간 엽 세포와 콜라겐의 존재 하에서 배양 하였다 타입 I 입체 타원체로 매트릭스합니다. 더하여, 구 상체는 닭 배아 융모 막 (CAM)에 그래프트 된 종양 성장은 스테레오 형광 현미경에 의해 모니터 하였다. 두 모델 모두 새로운 치료 DRU의 연구를 허용복잡한 3D 환경 및 트랜스 특정 GFP-ELISA에서의 균질화 이식 후 종양 세포 질량의 정량화에 GS. 또한, 직하 숙주 조직으로 호스트 및 종양 세포의 침윤 혈관 신생 반응을 입체 현미경으로 매일 모니터링 및 인간 종양 세포 (기-67, CD138, 멘틴) 또는 호스트 벽화 세포 덮는 혈관에 대해 면역 조직 화학 염색에 의해 분석 될 수있다 (최근 desmin / ASMA). 결론적 onplant 시스템은 복잡한 3 차원 환경에서 MM 세포 성장 및 혈관 신생을 연구 할 수 있으며 MM 세포의 생존과 증식을 치료 표적 신규 화합물에 대한 스크리닝을 가능하게한다.

3D 다발성 골수종 타원체 내 분석 대상 화합물의 시험 관내 분석에서 때문에 체외에서 일차 인간 MM 세포 배양의 한계로는 골수에서 세포 성장 매트릭스 및지지 차 인간 중간 엽 세포 이용하게 인간 MM 세포 라인에 대한 새로운 3D 체외 배양 모델을 확립 (도 1a를, B). EGFP 유전자 MM 셀 라인은 회전 타원체의 3D 성장 후 시각화 및 MM 종양 질량의 정량화 할 수 있습니다. 두 MM 세포주 OPM -2- eGFP는 및 RPMI-8226 eGFP는 스테레오 형광 현미경에 GFP의 발현에 의해 가시화 하였다 볼테 조미 브 및 종양의 증가 농도 (1~100 ㎚)의 존재하에 3 일간 배양 하였다 (도 1C) . 종양 세포 덩어리 GFP-ELISA (도 1에 의해 ...

인간 다발성 골수종 (MM) 세포는 간엽 세포의 생존과 증식을위한 세포 외 매트릭스 성분의지지 미세 환경을 필요로한다. 우리는 종양의 성장, 침윤 및 혈관 신생에 항암제의 효과를 연구하기 위해 접목 인간 골수종 및 중간 엽 세포와 생체 내 닭 배아 모델을 설립했다.

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...

다음 실험의 전반적인 목표는 인간 골수종 세포와 중간엽 세포가 이식된 생체 내 닭 배아 모델을 구축하여, 암 치료제가 종양 성장, 침습 및 혈관 신생에 미치는 영향을 연구하는 것입니다. 이는 3D in vitro 및 in vivo 모델 분석을 위해 형질 전환된 인간 다발성 골수종 세포를 생성함으로써 달성됩니다. 세포에는 시각화를 위한 GFP와 형질 전환된 세포의 선택을 위한 blastin 내성을 제공하는 렌티바이러스가 트랜스펙션됩니다.두 번째 단계로 3D 바이로이드를 제작합니다. 형질전환된 세포를 통해 중간엽 세포와 세포외 기질이 생성되며, 이를 통해 복잡한 3D in vitro 환경에서 항암제에 대한 대규모 스크리닝이 가능해집니다. 다음으로 3D 종양을 제작합니다.PHE는 신약이 종양 성장, 침윤 및 혈관 신생에 미치는 영향을 테스트하기 위해 닭 배아 내에서 in vivo로 배양될 수 있습니다. 최종적으로 종양 크기와 혈관 신생 반응을 매일 그리고 안락사 후에 기록할 수 있습니다. 종양은 GFP, Eliza 및 면역조직화학법을 통해 검사할 수 있습니다.이 기술이 제노그라프트 모델 미러링과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은 인간 종양의 처리 및 이미징에 있어 ECX를 활용한다는 점입니다. 지지 역할을 하는 인간 혈전 세포 및 세포외 기질 화합물을 포함한 인간 종양 세포는 적응 면역 반응이 아직 형성되지 않은 닭 배아 내에서 생체 내(in vivo) 성장이 가능합니다. 이 방법은 새로운 치료법 개발에 도움을 줄 수 있으며, 다발성 골수종 환자 치료를 위한 신속한 전임상 스크리닝을 가능하게 합니다.인간 다발성 골수종 세포는 스트레스에 의해 쉽게 아포토시스(apoptosis)가 일어나며, 닭 배아는 부적절한 외배양 조건이나 취급 부주의로 인해 사망할 수 있으므로 이 방법의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 본 실험실의 숙련된 기술자인 Cornelia Hes가 전체 과정과 모든 핵심 단계를 시연할 것입니다. 이 프로토콜을 위해 다발성 골수종 세포주인 OPM-2(RPMI 1640 배지)와 골수 유래 인간 중간엽 줄기세포 배양물을 준비하십시오. 텍스트 프로토콜에 따라 보충 배지에서 세포를 정상적으로 배양한 후, 100,000개의 렌티바이러스 입자로 1,000,000개의 다발성 골수종 세포를 형질전환시키십시오.완전 성장 배지가 담긴 24웰 플레이트에서 3일 후, 배양액 1mL당 2µg의 blastin을 첨가하여 형질전환된 세포의 선택을 시작하거나, 시판되는 EGFP 렌티바이러스를 사용한 경우에는 1mL당 500µL의 neomycin을 사용합니다. 2주간의 선택 과정 후, EGFP를 발현하는 세포 군집을 찾습니다. 부유 또는 부착된 세포 군집을 조심스럽게 회수하여 원심분리 튜브에 재부유시킨 후, 1000×g에서 5분간 원심분리하여 EGFP 발현 세포를 펠릿화하고 이를 하위 세포주로 확장 배양합니다. GFP를 발현하는 다발성 골수종 세포의 선택 및 증식 후에는, 추가 실험에 사용하기 전 항상 그 능력을 확인하십시오.먼저 type I 콜라겐 용액과 10X DMEM을 얼음 위에서 냉각합니다. 냉각이 완료되면, 10X DMEM 배지를 콜라겐 용액에 1:10 부피비로 혼합합니다. 그다음 0.2N 수산화나트륨을 한 방울씩 첨가하여 용액의 pH를 7.4로 중화합니다.용액을 얼음에 보관하고 테스트 스트립으로 pH를 확인하십시오. 다음으로, 형질전환 다발성 골수종 세포주와 인간 중간엽 세포를 혼합합니다. 이제 세포 혼합물을 15 milliliter 튜브에 넣고 1000 Gs에서 원심분리하십시오. 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거하고, P 1000 피펫을 사용하여 펠렛을 1 milliliter의 차가운 콜라겐 혼합물에 다시 현탁합니다.P 100 팁을 사용하여 혼합물 30 µL씩을 멸균 파라핀 위로 즉시 옮깁니다. 24웰 배양 플레이트에서 혼합물을 37 °C로 30분 동안 중합시켜 스테로이드를 형성합니다. 다음으로, 서로 다른 처리 조건이 포함된 준비된 배지 1 mL를 스테로이드 위에 덮어줍니다.예를 들어, 약물을 서로 다른 농도로 처리할 수 있습니다. 37°C에서 72시간 동안 배양한 후, 형광 실체 현미경을 통해 PHE를 기록합니다. 그런 다음 넓고 평평한 턱을 가진 포셉을 사용하여 각 스테로이드를 반응 튜브로 옮겨 GFP 발현량을 측정합니다.본 절차를 준비하기 위해, 닭 알을 난포 배양기에서 37 °C의 온도와 70% 습도로 3일 동안 배양하십시오. 그다음 알을 열어 배아를 멸균된 10 cm 정사각형 플라스틱 무게 측정용 보트에 옮깁니다. ex ovo 배양 시 닭 배아의 생존율을 높이기 위해, 10 cm 조직 배양 접시 대신 플라스틱 무게 측정용 보트를 사용하십시오.또한, 사용 전 PBS로 멸균 및 사전 처리한 대기 보트를 준비하십시오. CAM이 발달할 수 있도록 난자 외(in ovo) 배양을 6일 더 계속합니다. 이제 이전 절차와 동일하게 다발성 골수종 및 중간엽 세포 PHE를 준비하되, 6-웰 플레이트를 사용하십시오. 그 후 핀셋을 사용하여 스테로이드 식재물을 9일 된 닭 배아의 배아로부터 약 2cm 떨어진 CAM의 처리되지 않은 표면으로 옮깁니다.각 닭 배아 위에 식물을 네 군데에 배치합니다. 식물이 배치된 ex ovo 배아를 알 부화기에서 5일 동안 배양합니다. 그 후 형광 실체 현미경을 사용하여 이종이식편을 기록합니다.기록을 마친 후, 안과용 가위와 핀셋을 사용하여 주변 캠프 조직 일부와 함께 제노그래프트를 제거합니다. GFP 발현을 측정하거나 면역조직화학 분석을 수행하려면, 각 다발성 골수종 스테로이드 또는 절제된 제노그래프트를 프로테아제 억제제가 포함된 RIPA 0.5 milliliters에 옮기는 것으로 시작합니다. 그런 다음 얼음 위에서 균질기를 사용하여 조직을 혼합하고, 균질화가 완료되면 액체 질소와 37 degrees Celsius 항온수조를 사용하여 균질액을 동결 및 해동합니다.이 과정을 세 번 반복한 후, 균질액을 4 °C에서 12,000 G로 20분 동안 원심분리하고 상층액을 보관하십시오. 다음으로, ELISA 키트의 분석 버퍼를 사용하여 상층액 일부를 1:20 비율로 희석합니다. 그 후 키트를 사용하여 비오틴화된 anti-GFP 항체로 GFP 수준을 측정합니다.절제된 제노그라프트를 파라포름알데히드에 넣고 하룻밤 동안 고정하는 것으로 시작합니다. 다음 날, 고정된 제노그라프트를 탈수 및 포매합니다. 먼저, 이를 카세트에 넣습니다.그 후 카세트를 단계별 알코올 시리즈로 이동시킵니다. 각 배스에서 1시간 동안 충분히 반응시킨 후 파라핀 포매로 과정을 마무리합니다. 다음으로, 벤치탑 로터리 마이크로톰을 사용하여 5 micron 두께의 제노그라프트 절편을 제작하고, 수집된 파라핀 절편을 유리 슬라이드 위에 올려 56 °C에서 하룻밤 동안 굽습니다.다음 날, 알코올 농도가 점차 낮아지는 단계별 알코올 시리즈와 2회 증류수를 사용하여 절편의 탈파라핀 과정을 진행합니다. 각 용액당 슬라이드 침지 시간은 10분으로 합니다. 그 후 텍스트 프로토콜에 따라 각각의 1차 및 2차 항체로 인큐베이션하고, 항체 염색 후 효소와 기질을 이용한 비색 검출을 수행합니다. 마지막으로 헤마틴으로 대조 염색을 하고 합성 봉입제로 절편을 봉입합니다.EGFP를 발현하는 두 종류의 다발성 골수종 세포주를 약물이 존재하는 환경에서 3일 동안 배양하였습니다. 이후 보르테조밉(Bortezomib)과 스테로이드 처리된 종양 세포를 입체 형광 현미경을 통해 GFP 발현으로 시각화하였습니다.약물 처리 후의 종양 세포 질량은 PHE를 균질화하고 A GFP Eliza를 통해 EGFP 함량을 측정하여 정량화하였습니다. 또 다른 실험에서는 부화 3일 된 닭 배아를 6일 동안 ex ovo 방식으로 배양하였습니다. 9일째에 다발성 골수종 세포의 PHE를 이식하였습니다.각 배아에 4개의 식물 접편을 부착하였습니다. 표적 물질인 bortezomib를 1 mol 농도로 국소 도포한 후 5일이 지나자, 대조군과 비교하여 식물 접편에 종양이 형성되었습니다. 형광 종양 덩어리의 시각화를 통해, bortezomib가 접편 내 다발성 골수종 세포의 성장을 억제했음을 확인하였습니다.세 마리의 서로 다른 동물로부터 단일 이식편을 절제하여 균질화한 후, GFP Eliza로 측정하였습니다. 대조군과 비교했을 때, bortezomib 처리 조직의 골수종 세포 질량이 유의하게 적었습니다. 이 영상을 시청한 후에는, 관심 있는 암세포를 배양된 닭 배아에 이식하여 종양의 성장과 발생, 그리고 발달 후 숙주 조직으로의 침습을 분석하는 실험 수행 방법을 충분히 이해하게 될 것입니다.이 기술은 다발성 골수종 분야의 연구자들이 전임상 약물 테스트에 필수적인, 다루기 쉬운 모델 생물을 통해 새로운 화합물이나 약물을 탐색할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

정량 PCR을 사용하여, 우리는 잘 설립된 여자 CAM 모델이 양적 먼 기관으로 인간의 종양 세포의 전이를 분석하는 데 사용할 수있는 방법을 보여줍니다.

조류 엠브료 모델을 사용하여 암 전이의 정량 분석

이 동영상은 닭 융모막막혈관 구조에 암세포를 정맥 주사하여 CAM 암 전이 모델을 생성하는 절차를 보여줍니다. 주입된 세포는 결국 흩어져 있는 단일 암 세포 군체를 형성하여 암 침습 및 전이에 대한 연구를 가능하게 합니다.

닭 융모대질막막혈관구조에 암세포를 정맥 주사: 암 침입 및 전이를 연구하기 위한 융모대립막암 모델을 확립하는 절차

면역 결핍 쥐에서 인간 종양 이종 이식은 암 생물학을 연구하는 중요한 도구입니다. 인간의 간세포 암 세포 또는 종양 파편에서 피하 및 간내 이종 이식을 생성하는 특정 프로토콜이 설명되어 있습니다. 받는 사람 생쥐의 부분 간 절제술에 의해 유도 된 간 재생은 간내 생착을 촉진하기위한 전략으로 제시된다.

면역 결핍 마우스의 피하 및 간내 인간의 간세포 암 이종 이식의 생성

차 침략 동 소성 방광 암 이종 이식을 접종하는 설치 방법은 개복 수술과 방광의 동원을 필요로한다. 이 절차는, 마우스에 상당한 이환율을 입히고 기술적으로 어렵고 시간 소모적이다. 따라서 우리는 경피적 접근 방식은 초음파 안내를 이용하는, 높은 정밀도를 개발했다.

쥐과 동 소성 방광 이종 이식의 최소 침습 설립

병아리 융모대질막(CAM)은 면역결핍이며 혈관화가 심하여 종양 성장 및 혈관 신생의 자연스러운 생체 내 모델입니다. 이 프로토콜에서는 CAM 분석을 사용하여 3차원, 혈관화된 간세포 암종(HCC) 종양을 성장시키는 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.

<em&gt; 비켜에서</em간세포 암의 효율적인 이종 이식 모델로&gt; 병아리 융모 막 (CAM) 분석

전립선암은 미국에서 암 관련 사망의 두 번째로 흔한 원인입니다. 정소성 암 모델은 전립선암의 생물학을 이해하고 치료 요법의 효능을 평가하는 데 유용한 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜은 정형소 전립선암 마우스 모델을 확립하는 데 필요한 자세한 단계를 설명합니다.

인간의 전립선 암의 전 임상 동소 이식 쥐 모델

전이성 맑은 세포 신장 세포 암은 철저한 전임상 조사를 위한 포괄적인 동물 모델이 없는 질병이다. 이 프로토콜은 질병에 대한 두 가지 새로운 동물 모델을 보여줍니다: 정형 이식 마우스 모델과 닭 융모난토막 모델, 둘 다 임상 사례를 닮은 폐 전이를 보여줍니다.

마우스 신장과 닭 융모알란투암 막에 설립된 전이성 맑은 세포 신장 세포 암종 모델 비교

우리는 부인과 및 비뇨기과 암 세포주 및 환자 유래 종양의 이식에 대한 대안, 이식 가능한 생체 내 모델로 닭 융모알구암 막 모델을 제시합니다.

비보 모델에서 닭 융모난토암 막을 사용하여 부인과 및 비뇨기과 암을 연구

본 프로토콜은 인간 골육종 조직을 이용하여 환자 유래 이종이식(PDX) 마우스 모델을 확립하는 방법을 설명한다.

인간 골육종 조직을 이용한 환자 유래 이종이식 마우스 모델 구축

이 프로토콜은 주사 후 4일 후에 발생하는 환자 유래 B- 및 T- 급성 림프구성 백혈병(ALL) 세포의 난자 이종이식을 설명합니다.

오보에 위치 환자 유래 급성 림프구성 백혈병(ALL) 세포의 이종이식 (PDX-ALL)

학습하세요 닭 배아 이종 이식 모델을 사용하여 인간 다발성 골수종 세포의 종양 성장, 침략 및 혈관 신생을 연구하는 방법을. 이 기술은 항암 약물 효능을 평가하고 새로운 치료법을 개발하는 데 활용됩니다.

닭에서 인간의 다발성 골수종 이종 이식 모델의 설립은 종양의 성장, 침략과 혈관 신생을 공부하기

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