마우스의 반복 저산소 전처리 및 과도 중간 대뇌 동맥 폐쇄 후 신경 혈관 보호의 정량화

다음 실험의 전반적인 목표는 경색량과 혈중 뇌 장벽 무결성을 동시에 측정하여 반복적인 저산소증 전처리 또는 RHP 후 신경 보호를 정량화하는 것입니다. 이는 뇌졸중으로부터 신경혈관을 보호하기 위해 기간과 강도가 모두 다른 9가지 확률적 저산소증에 쥐를 노출시킴으로써 달성됩니다. 그런 다음 마우스에 뇌졸중을 유도하고 Evan의 파란색 주사

Evan's blue는 알부민을 선택적으로 결합하고 주사 후 동물을 희생한 후 혈액 뇌 장벽 파괴의 정량화를 허용합니다. 뇌를 제거하고 TTC로 염색하여 경색 부피를 정량화합니다. 결과는 허혈성 뇌졸중 후 마우스에서 반복적 저산소증 사전 조절의 신경 보호 이점을 보여줍니다.

단일 노출 저산소 전치조절과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 RHP가 마우스에서 최소 8주 동안 신경 보호를 생성한다는 것입니다. 이 이중 정량화 방법은 혈액-뇌장벽 파괴에서 경색 부피를 동시에 측정하는 방법과 같은 뇌졸중 연구의 주요 질문에 답할 수 있으며, 이 방법은 허혈성 뇌졸중에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용할 수 있지만 RHP는 다른 CNS 기반 및 전신 전염증성 질환 상태에도 적용할 수 있습니다. 시작하려면 마우스를 두 그룹으로 나눕니다.

8%와 11%의 산소에 노출된 RHP 그룹과 동시에 21%의 산소에 노출된 대조군은 각 케이지의 상단 필터 뚜껑을 제거하고 음식과 물병이 손상되지 않은 케이지를 각각의 산소 탱크에 연결된 챔버에 넣습니다. 챔버의 뚜껑을 닫고 고정합니다. 탱크의 주 가스 밸브를 열고 각 유도 챔버의 초기 유량을 분당 2리터 또는 LPM으로 설정합니다.

5분 동안 노출된 후 나머지 노출 기간 동안 유속을 1LPM으로 줄입니다. 노출이 끝나면 유량을 0 LPM으로 줄이고 가스 밸브를 닫으십시오. 탱크를 위해.

챔버 뚜껑을 열고 각 케이지의 필터 상단 덮개를 교체합니다. 다음 저산소 노출이 있을 때까지 케이지를 표준 하우징에 놓습니다. 사용 후에는 각 인덕션 챔버에 소독제와 탈취제를 뿌립니다.

프로토콜의 2주 동안 하루 중 동시에 RHP와 대조군 마우스를 모두 노출시킵니다. 그런 다음 텍스트에 설명된 대로 일시적인 중대뇌동맥 폐색 또는 A-T-M-C-A-O를 수행합니다. EB 주사는 재관류 후 22시간 후에 시행해야 하며 NTTC 염색을 희생하기 전에 2시간 동안 혈류를 순환해야 합니다.

주사에 필요한 EB의 양을 준비합니다. 그런 다음 원하는 양의 실내 온도를 0.3cc 인슐린 주사기에 넣습니다. 29게이지 바늘로 평평한 바닥 고정 장치를 사용하여 마우스를 고정합니다.

측면 정맥이 가장 위에 오도록 꼬리를 잡습니다. 측면 정맥은 꼬리의 중심선 양쪽에 있습니다. 꼬리 끝을 잡고 주사를 위해 마우스를 안정되게 유지합니다.

바늘을 약 3-5mm 정도의 정맥에 삽입합니다. 정맥에 구멍이 나지 않도록 주의하면서 1분에 걸쳐 모든 염료를 주입합니다. 용액이 정맥으로 들어가는 경우 주사기에 압력이 가해질 때 최소한의 저항이 있어야 합니다.

쥐의 꼬리, 팔다리 및 눈의 즉각적인 색 변화로 EB의 성공적인 전신 정맥 투여를 확인합니다. 꼬리에서 바늘을 제거하고 깨끗한 거즈를 사용하여 부드럽게 압력을 가하여 출혈을 멈춥니다. 타이밍을 시작합니다.

쥐의 피부가 파랗게 변하면 EB가 약해진 혈액 뇌 장벽을 통과할 수 있도록 2시간 동안 순환시킵니다. 관류 및 TTC 염색은 재관류 후 24시간, T-M-C-A-O 후 24시간, EB 투여 후 2시간 후에 발생해야 하며, 작은 유도 챔버에서 불소 과다 투여로 동물을 희생해야 합니다. 관류는 자가 분해를 최소화하기 위해 희생 직후에 시작해야 하며, 이는 사망 후 산소가 없을 때 시작됩니다.

팔뚝을 발에 고정한 상태에서 스티로폼 플랫폼에 동물을 빠르게 고정합니다. 흉곽 바로 아래의 정중선에서 복벽을 통해 측면 절개를 자릅니다. 횡격막을 조심스럽게 잘라 심장을 노출시킵니다.

얼음처럼 차가운 0.01 몰 인산염 완충 식염수 또는 27 게이지 날개 주입 바늘에 연결된 PBS로 채워진 60cc 주사기를 사용하여 분당 5ml의 유속으로 관류 펌프를 시작합니다. 바늘 끝을 심장의 좌심실에 약 0.5cm 정도 놓고 우심방을 자릅니다.관류 중에 점진적으로 희석된 정맥혈이 심방에서 흘러나와 정맥혈이 나타날 때까지 해야 합니다. 무색 트랜스 심장 e는 심장을 통해 30ml의 0.01 어금니 PBS를 관류했습니다.

다음으로, 투명한 20개의 섬광 병에 5ml의 TTC 용액을 추가합니다. 관류 직후 동물의 목을 베고 필요한 경우 작은 가위와 주걱을 사용하여 뇌를 해부합니다. 폐색된 중대뇌동맥과 반대쪽 반구가 창백해 보이는지 확인하고 눈에 띄는 EB 누출이나 부종이 없는지 확인합니다.

다음으로, PBS를 1.0mm 두께의 쥐 뇌 절편을 만들도록 설계된 아크릴 뇌 매트릭스에 넣는다. 뇌의 등쪽을 위로 향하게 하여 기질에 넣고 즉시 PBS를 뇌에 붓습니다. 뇌를 촉촉하게 유지하십시오.

0.21mm 두께의 스테인리스 딜을 매트릭스의 로스트랄 쪽에서 두 번째 슬롯에 삽입하여 후각 전구를 제거합니다. 그런 다음 매트릭스의 코들 쪽에서 네 번째 슬롯에 블레이드를 삽입하여 소뇌를 제거합니다. 매트릭스에 있는 나머지 슬롯의 중간 슬롯에 블레이드를 삽입합니다.

그런 다음 나머지 블레이드를 고르게 삽입하고 나머지 조직을 이등분하여 자르는 동안 조직이 가장 고르게 분포되도록 합니다. 모든 면도날을 삽입하고 나면, PBS를 1-2방울 떨어뜨려 뇌를 촉촉하게 한다. 다음으로, 로스트랄 영역부터 시작하는 매트릭스에서 블레이드를 한 번에 하나씩 제거합니다.

TTC 분석을 위해 처음 7개 슬라이스를 유지합니다. T-M-C-A-O 후 작은 주걱을 사용하여 칼날에서 TTC가 채워진 바이알로 조각을 조심스럽게 옮깁니다. 모든 섹션이 바이알에 들어간 후 뚜껑을 닫고 섹션이 분홍색으로 변할 때까지 따뜻한 물에 넣습니다.

고르지 않은 얼룩으로 이어질 수 있는 섹션이 겹치는 것을 방지하기 위해 필요한 경우 욕조에서 병을 부드럽게 뒤집으십시오. 그런 다음 TTC를 폐기하고 4% 파라폼 알데히드 용액을 바이알에 부어 뇌 부분을 덮습니다. 이것은 TTC 화학 반응을 종료합니다.

즉시 깨끗한 1 x 3인치 유리 슬라이드에 섹션을 정렬하고 섹션이 슬라이드에 정렬될 때 rostral에서 coddle로 섹션을 배치합니다. 슬라이드를 스캔합니다. 표준 스캐너를 사용하여 이미지 분석을 위해 해상도를 최소 600DPI로 설정합니다.

스캔한 이미지에 동물의 이름과 미터법 눈금자를 포함해야 합니다. 마지막으로 슬라이드를 뒤집고 뒷면을 스캔하여 모든 데이터가 수집되었는지 확인합니다. RHP는 대조군 마우스에 비해 경색 부피를 46% 감소시키지만, 동일한 동물의 TTC 데이터에서 파생된 반구 팽창에는 영향을 미치지 않습니다.

RHP는 RHP 처리 및 21% 산소 노출 대조군 모두에서 반대쪽 반구 대표적인 TTC 염색으로 정규화된 Evans Blue 누출에 의해 정의된 바와 같이 혈액 뇌 장벽 파괴를 감소시킵니다. 마우스는 해당 경색 부피와 함께 표시되며 Evans blue leak은 여기에서 각 샘플 아래에 나열되어 있습니다. 동측은 뇌의 허혈성 반구이고 반대측은 뇌의 영향을 받지 않는 쪽입니다.

이 절차를 시도하는 동안 융합 후 22 시간 후에 Evan의 파란색을 주입하고 발달 후 동물 희생 전에 2 시간 동안 순환하도록하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 전임상 뇌졸중 연구 분야의 연구자들이 생쥐의 뇌졸중으로부터 내인성 보호 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 동영상을 시청한 후에는 혈액-뇌장벽 무결성 및 경색 용적의 이중 정량화를 통해 RHP의 신경 보호 효과를 측정하는 방법을 명확하게 이해하게 될 것입니다.