마우스의 반복 저산소 전처리 및 과도 중간 대뇌 동맥 폐쇄 후 신경 혈관 보호의 정량화

다음 실험의 전반적인 목표는 경색 부피와 혈뇌장벽(blood brain barrier) 무결성을 동시에 측정하여, 반복적 저산소 사전처리(repetitive hypoxia preconditioning, RHP) 이후의 신경 보호 효과를 정량화하는 것입니다. 이는 뇌졸중으로부터 신경혈관 보호 기능을 제공하기 위해 지속 시간과 강도가 서로 다른 9회의 무작위 저산소 노출을 마우스에게 가함으로써 수행됩니다. 그 후 마우스에 뇌졸중을 유도하고 에반스 블루(Evan's blue)를 주입합니다.

Evans blue는 알부민과 선택적으로 결합하여, 동물 희생 후 주입을 통해 혈뇌장벽 손상 정도를 정량화할 수 있게 합니다. 뇌를 적출하고 TTC로 염색하여 경색 부피를 정량화합니다. 결과는 반복적인 저산소성 사전조건화가 허혈성 뇌졸중 모델 마우스에서 신경 보호 효과가 있음을 보여줍니다.

단일 노출 저산소 사전처리와 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 RHP가 생쥐에서 최소 8주 동안 신경 보호 효과를 생성한다는 점입니다. 이 이중 정량화 방법은 혈뇌장벽 붕괴 시 경색 부피를 동시에 측정하는 방법과 같이 뇌졸중 연구의 핵심 질문에 답할 수 있습니다. 이 방법은 허혈성 뇌졸중에 대한 통찰력을 제공하는 데 사용될 수 있을 뿐만 아니라, RHP는 다른 중추신경계 기반 및 전신성 염증성 질환 상태에도 적용될 수 있습니다. 시작하려면 생쥐를 두 그룹으로 나눕니다.

8% 및 11% 산소에 노출되는 RHP 군과 동시에 21% 산소에 노출되는 대조군에 대하여, 각 케이지의 상단 필터 덮개를 제거하고 사료 및 물병이 들어있는 상태의 케이지를 각각의 산소 탱크와 연결된 챔버에 넣습니다. 챔버의 덮개를 닫고 고정합니다. 탱크의 메인 가스 밸브를 열고 각 유도 챔버의 초기 유량을 2 liters per minute 또는 LPM으로 설정합니다.

5분 동안 노출시킨 후, 남은 노출 시간 동안 유량을 1 LPM으로 줄입니다. 노출이 끝나면 유량을 0 LPM으로 줄이고 가스 밸브를 닫습니다. 탱크의 경우입니다.

챔버 덮개를 열고 각 케이지의 필터 상단 덮개를 교체하십시오. 다음 저산소 노출 시까지 케이지를 표준 사육 환경에 두십시오. 매 사용 후에는 각 유도 챔버를 소독제와 탈취제로 분무 소독하십시오.

프로토콜의 2주 과정 동안 RHP군과 대조군 마우스를 매일 같은 시간에 노출시키십시오. 그런 다음 본문에 설명된 대로 일시적 중대뇌동맥 폐쇄(tMCAO)를 수행하십시오. EB 주입은 재관류 22시간 후에 수행해야 하며, 희생 및 NTTC 염색 전까지 혈류 내에서 2시간 동안 순환해야 합니다.

주사에 필요한 양의 EB를 준비합니다. 그런 다음 실온 상태의 EB를 원하는 양만큼 0.3 cc 인슐린 주사기에 취합니다. 29게이지 바늘을 사용하여, 바닥이 평평한 보정기로 마우스를 고정합니다.

측지정맥이 위로 오도록 꼬리를 잡습니다. 측지정맥은 꼬리 중심선의 양측에 위치합니다. 주사 시 마우스가 움직이지 않도록 꼬리 끝부분을 잡으십시오.

바늘을 정맥에 약 3~5mm 정도 삽입합니다. 정맥을 관통하지 않도록 주의하며 1분에 걸쳐 염료를 모두 주입합니다. 용액이 정맥으로 제대로 들어가고 있다면, 주사기에 압력을 가할 때 저항이 거의 없어야 합니다.

마우스의 꼬리 사지와 눈에서 즉각적인 색 변화가 나타나는 것을 통해 EB의 전신 정맥 투여가 성공적으로 이루어졌음을 확인하십시오. 꼬리에서 바늘을 제거하고, 출혈을 멈추기 위해 깨끗한 거즈로 부드럽게 압박하십시오. 시간을 측정하기 시작하십시오.

마우스의 피부가 푸르게 변하면, 약화된 혈뇌장벽(blood brain barrier)을 통과할 수 있도록 EB를 2시간 동안 순환시킵니다. 관류 및 TTC 염색은 재관류 후 24시간, 즉 T-M-C-A-O 후 24시간 및 EB 투여 2시간 후에 수행해야 하며, 소형 유도 챔버에서 이소플루란(isof fluorine)을 과량 투여하여 동물을 희생시킵니다. 관류는 사망 후 산소 결핍으로 인해 시작되는 자기분해를 최소화하기 위해 희생 직후 즉시 시작해야 합니다.

동물을 스티로폼 플랫폼 위에 빠르게 고정하고 앞발을 통해 전완을 고정합니다. 늑골 바로 아래 정중선부터 복벽을 통해 측면 절개를 실시합니다. 횡격막을 조심스럽게 절개하여 심장을 노출시킵니다.

27게이지 나비 바늘(winged infusion needle)에 연결된, 얼음처럼 차가운 0.01 M 인산염 완충 식염수(PBS)가 채워진 60 cc 주사기를 사용하여 분당 5 mL의 유량으로 퍼퓨전 펌프를 작동시킵니다. 바늘 끝을 심장의 좌심실에 약 0.5 cm 깊이로 삽입하고 우심방을 절개합니다. 퍼퓨전이 진행되는 동안 우심방에서 점차 희석된 정맥혈이 흘러나오며, 최종적으로는 정맥혈이 무색으로 보일 때까지 계속됩니다. 심장을 통해 총 30 mL의 0.01 M PBS를 관류시킵니다.

다음으로, 20 투명 신틸레이션 병에 5 mL의 TTC 용액을 넣습니다. 관류 직후, 동물의 목을 절단하고 필요한 경우 작은 가위와 스파출라를 사용하여 뇌를 적출합니다. 폐색된 중대뇌동맥의 반대측 뇌반구가 뚜렷한 EB 누출이나 부종 없이 창백하게 보이는지 확인합니다.

다음으로, 마우스 뇌의 1.0 millimeter 두께 관상면 절편을 만들기 위해 설계된 아크릴 뇌 매트릭스에 PBS를 붓습니다. 뇌의 등쪽이 위로 향하게 하여 매트릭스에 넣고 즉시 뇌 위에 PBS를 붓습니다. 뇌가 건조해지지 않도록 유지하십시오.

매트릭스의 rostral 측에서 두 번째 슬롯에 0.21 mm 두께의 스테인리스강 블레이드를 삽입하여 후각구(olfactory bulbs)를 제거합니다. 그런 다음 매트릭스의 caudal 측에서 네 번째 슬롯에 블레이드를 삽입하여 소뇌(cerebellum)를 제거합니다. 매트릭스에 남은 슬롯 중 중앙 슬롯에 블레이드를 삽입합니다.

그런 다음, 슬라이싱 시 조직이 가장 균일하게 분포되도록 남은 조직을 균등하게 이등분하여 나머지 블레이드들을 삽입합니다. 모든 블레이드 삽입이 완료되면, 뇌에 PBS를 한두 방울 떨어뜨려 적셔줍니다. 다음으로, 로스트럴(rostral) 영역부터 시작하여 매트릭스에서 블레이드를 하나씩 제거합니다.

처음 7개의 절편은 TTC 분석을 위해 보관합니다. T-M-C-A-O 이후, 작은 스패출러를 사용하여 절편들을 블레이드에서 TTC가 채워진 바이알로 조심스럽게 옮깁니다. 모든 절편을 바이알에 넣은 후, 뚜껑을 닫고 절편이 분홍색으로 변할 때까지 온수조에 둡니다.

단면이 겹쳐 염색이 불균일해지는 것을 방지하기 위해 필요한 경우 배스(bath) 내의 병을 부드럽게 돌려줍니다. 그런 다음 TTC를 폐기하고 4% paraform aldehyde 용액을 바이알에 부어 뇌 절편을 덮습니다. 이를 통해 TTC 화학 반응이 종료됩니다.

절편들을 깨끗한 1x3인치 유리 슬라이드 위에 즉시 배치하고, 슬라이드에 배치할 때 절편의 방향을 머리 쪽(rostral)에서 꼬리 쪽(caudal)으로 정렬하십시오. 슬라이드를 스캔합니다. 표준 스캐너를 사용하여 이미지 분석을 위한 해상도를 최소 600 DPI로 설정하십시오.

스캔 이미지에 동물의 이름과 미터법 자를 반드시 포함하십시오. 마지막으로, 슬라이드를 뒤집어 뒷면을 스캔하여 모든 데이터가 수집되었는지 확인하십시오. RHP는 대조군 마우스에 비해 경색 부피를 46% 감소시켰으나, 동일한 동물의 TTC 데이터에서 도출된 뇌반구 부종에는 영향을 미치지 않았습니다.

RHP는 반대측 대뇌 반구로 정규화된 Evans Blue 누출로 정의되는 혈뇌장벽 파괴를 감소시키며, 이는 RHP 처리군과 21% 산소 노출 대조군의 대표적인 TTC 염색 결과입니다. 마우스 이미지와 함께 각각의 경색 부피 및 Evans Blue 누출량이 각 샘플 아래에 나열되어 있습니다. Ipsilateral은 뇌의 허혈성 반구이며, contralateral은 뇌의 영향을 받지 않은 쪽입니다.

이 절차를 수행할 때, 융합 22시간 후에 Evans blue를 주입하고, 동물을 희생시키기 전 약물이 충분히 퍼질 수 있도록 2시간 동안 순환시키는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 기술은 전임상 뇌졸중 연구 분야의 연구자들이 마우스에서 뇌졸중에 대한 내인성 보호 기전을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 혈뇌장벽 무결성과 경색 부피의 이중 정량을 통해 RHP의 신경 보호 효과를 측정하는 방법에 대해 명확히 이해하게 될 것입니다.