자동 젤 사이즈 선택은 환경 물 샘플에서 준비 차세대 시퀀싱 라이브러리의 질을 향상시키기 위해

이 비디오에서는 차세대 염기서열 분석(NGS) 플랫폼에서 더 나은 리드(read)를 얻기 위해 자동화된 겔 크기 선택 장치를 사용하는 방법을 보여줍니다. 먼저 환경 수질 샘플을 수집하고 일련의 필터에 통과시켜 진핵생물, 세균 및 바이러스 크기의 입자를 체계적으로 분리합니다. 회수된 세균은 원심분리를 통해 추가로 농축합니다.

그 다음으로 박테리아 DNA를 추출합니다. 추출된 DNA는 단편화된 DNA에 어댑터와 인덱스가 삽입된 라이브러리를 제작하는 데 사용됩니다. 이후 PCR을 통해 DNA를 증폭시키고, 샘플을 전기영동 워크스테이션에 로딩합니다.

그 후 특정 범위 내의 DNA 단편들이 자동으로 선택됩니다. 칩 기반 모세관 전기영동의 트레이스 분석과 추가적인 생물정보학 분석 결과, 이 방법은 200 base pairs 미만의 원치 않는 단편들의 클러스터링을 최소화하면서 후속 분석에 적합한 양의 DNA 단편을 생성한다는 것이 입증되었습니다. 자동화된 Electrophoresis square station 또는 상자성 비드 및 기타 상용 시스템의 주요 장점은 선택 범위를 더 좁고 정밀하게 설정할 수 있으며, 한 번의 가동으로 최대 96개의 샘플을 처리할 수 있다는 점입니다.

이 방법은 담수 샘플 내의 미생물 군집에 대한 통찰을 제공할 수 있지만, 해수, 폐수 처리, 식물 샘플, 퇴적토 또는 미생물 매트와 같이 특정 크기 범위의 좁은 선택이 필요한 거의 모든 DNA 샘플과 같은 다른 시스템에도 적용할 수 있습니다. 우리는 MySEQ 플랫폼 시퀀싱에서 짧은 단편들을 확인했을 때 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 우리는 다양한 종류의 파라 비드(para beads)와 비율을 이용한 여러 크기 선택 접근 방식뿐만 아니라 수동 젤 크기 선택 방식도 시도하였습니다.

그 후 우리는 Ranger 기술을 제공하는 브리티시컬럼비아주의 민간 기업인 Coastal Genomics와 협력하여 해당 절차를 시연하게 되었습니다. 오늘의 시연자는 제 실험실의 연구 기술자인 Michael Chan, 제 실험실의 박사후 연구원인 Miguel Yi, 그리고 Coastal Genomics의 엔지니어인 Jared Sloan입니다. 본 영상에서는 0.2 micron 필터에서 회수된 물질, 주로 자유 생활 박테리아의 정제 및 분석 과정만을 설명하겠으나, 필터에서 회수된 다른 입자들에 대해서도 유사한 접근 방식을 사용할 수 있음을 유념하시기 바랍니다.

위생 처리된 20리터 카보이(carboy)를 사용하여 여러 환경 지점에서 40리터의 담수 시료를 수집함으로써 본 절차를 시작합니다. 105 micrometer spectrum mesh 폴리프로필렌 필터를 사용하여 현장에서 시료를 사전 여과합니다. 여기서는 도시 및 농업의 영향을 받는 유역에서 시료를 수집합니다.

수집 후, 샘플을 쿨러에 넣고 실험실로 운송하십시오. 샘플을 4 °C에서 보관하십시오. 다음 날.

시료 수집용 카보이가 연동 펌프를 통해 1µm Envirocheck 샘플링 캡슐에 연결된 여과 시스템을 구축합니다. 샘플링 캡슐을 0.2µm 디스크 필터에 연결하고, 이를 다시 두 번째 연동 펌프를 통해 30kDa 접선 흐름 여과기(tangential flow filter)에 연결합니다. 연동 펌프를 작동시켜 시료가 일련의 필터를 통과하게 하면, 샘플링 캡슐을 통과하는 과정에서 진핵세포가 분리됩니다.

박테리아 분획은 멤브레인 디스크 필터에서 분리하고, 바이러스 입자는 접선 흐름 필터(tangential flow filter)에서 분리합니다. 수질 여과 시스템에서 0.2 µm 멤브레인 필터를 제거하십시오. 그런 다음 필터를 반으로 접어 50 mL 튜브에 넣습니다.

개구부가 위로 향하게 합니다. 튜브에 tween이 포함된 PBS 5 mL를 넣습니다. 여과 과정에서 하나 이상의 필터를 사용한 경우, 각 필터마다 별도의 튜브를 사용하십시오.

필터는 4°C에서 보관하거나 다음과 같이 즉시 처리할 수 있습니다. 다음으로, 멸균 포셉을 사용하여 50 mL 튜브에서 멤브레인 필터를 꺼내어 멸균 포셉과 멸균 가위가 준비된 페트리 접시에 놓습니다. 샘플 사이의 필터를 1 cm × 1 cm 크기로 자릅니다.

기구들을 70% isopropanol에 담그고 DNA 표면 오염 제거제로 닦아낸 후, type one 초순수로 헹구어 소독합니다. 필터 조각들을 동일한 50 milliliter 튜브에 다시 넣습니다. 멸균 핀셋을 사용하여 tween이 포함된 PBS 10 milliliters를 첨가해 버퍼의 총 부피를 15 milliliters로 맞춥니다.

각 50 mL 튜브에 지름 3mm의 깨끗한 텅스텐 비드 6개를 넣습니다. 튜브를 파라필름으로 덮고 20분 동안 격렬하게 볼텍싱합니다.

볼텍싱 후 각 샘플의 모든 현탁액을 하나의 깨끗한 50 milliliter 튜브에 모읍니다. 튜브를 4 °C에서 3,300 GS로 15분 동안 원심 분리합니다. 원심 분리가 끝나면 상층액을 제거하고 펠렛을 재현탁합니다.

5 mL의 PBS 용액에 포함된 박테리아 세포를 1 mL씩 1.7 mL 마이크로 원심분리 튜브에 나누어 담고, 마이크로 원심분리기를 사용하여 10,000 g에서 10분 동안 원심분리합니다. 원심분리 후, 피펫을 사용하여 상층액을 200 µL만 남기고 모두 제거합니다. 샘플을 -80 °C에서 보관하거나, 시판되는 DNA 분리 키트를 사용하여 박테리아 DNA를 추출하십시오.

박테리아 DNA 추출 시, 음성 추출 대조군으로는 PBS 또는 물을 사용하고, 양성 추출 대조군으로는 e coli를 사용하십시오. DNA 추출 절차 후, 동일한 시료의 분주액들을 10 mM tris 완충액이 담긴 하나의 2 mL 튜브에 모으십시오. 그런 다음 10% 3 M sodium acetate 용액, 2배 부피의 100% ethanol 및 5 µL의 linear acrylamide를 첨가하여 하룻밤 동안 침전시키십시오. 시료는 -80 °C에서 보관하십시오.

다음 날, 4°C에서 17,000 g로 30분 동안 샘플을 원심 분리합니다. 원심 분리 후, 펠릿을 1mL의 얼음처럼 차가운 70% 에탄올로 세척하고, 생물안전작업대 내에서 5분 이내로 펠릿을 공기 건조시킵니다.

그 다음 DNA 펠렛을 10 millimolar tris-CL에 재현탁합니다. 마지막으로 고감도 형광 핵산 정량 분석 후 마이크로 볼륨 분광법을 수행하여 DNA의 양과 질을 결정합니다. 각 샘플의 DNA 양을 결정한 후, 각 튜브에 적절한 양의 물을 첨가하여 농도를 약 0.2 nanograms per microliter로 맞춥니다.

시판 키트를 사용하여 1 ng의 박테리아 DNA로부터 인덱싱된 단편의 DNA 라이브러리를 준비합니다. 여기서는 DNA를 동시에 단편화하고 어댑터 서열을 삽입하는 'mentation'으로 알려진 트랜스포제이스 기반 방법이 적용됩니다. 그 다음 PCR을 수행하여 DNA 샘플을 동시에 증폭하고 인덱싱함으로써, 각 단편에 특정 바코드를 제공하고 시퀀싱 플랫폼에서 읽을 수 있는 클러스터 형성에 필요한 서열을 제공합니다.

PCR 완료 후, 표준 PCR 후 정제 단계는 생략하고 각 샘플에 3.5 µL의 로딩 버퍼를 추가하여 총 부피를 28.5 µL로 맞춥니다. 그 다음 샘플을 96-웰 플레이트에 옮깁니다. Ranger 소프트웨어 사용자 인터페이스에서 1.5% 아가로스 프리캐스트 카세트가 장착된 전기영동 워크스테이션에 96-웰 플레이트를 로드합니다.

크기 선택 대상(size selection target)을 500에서 800 base pairs로 지정하십시오. 추출 부피를 300 µL로 설정하십시오. 런(run)을 시작하십시오.

전기영동 워크스테이션이 aros 카세트에 샘플을 자동으로 로딩합니다. 그 후 카세트에 전압이 인가되며, 갠트리 장착 이미징 시스템을 사용하여 aros 내 샘플 DNA의 위치를 확인합니다. 이는 전체 실행 과정 동안 이루어집니다.

Ranger 소프트웨어는 이미지를 캡처하고 내부 표준물을 사용하여 각 샘플 내 크기가 선택된 타겟의 위치를 추정합니다. 타겟이 식별된 후, Ranger 소프트웨어는 각 샘플에 인가되는 전압을 조절하여 타겟들이 카세트 추출 웰(extraction wells)에 동시에 도착하도록 동기화합니다.

마지막으로, 전기영동 워크스테이션이 추출 웰에서 TBE 내의 표적물을 흡입하여 새로운 96웰 플레이트에 분주함으로써 가공되지 않은 출력물을 농축합니다. 소듐 아세테이트와 에탄올, 선형 아크릴아마이드를 사용하여 -80 °C에서 하룻밤 동안 가공되지 않은 용출액 부피를 침전시킵니다. 샘플을 17,000 g에서 30분 동안 다시 원심분리합니다. 원심분리 후 상청액을 버리고 1 mL의 차가운 70% 에탄올로 DNA 플레이트를 세척한 후 원심분리합니다.

샘플을 17,000 g에서 30분 동안 원심분리한 후, 상층액을 버리고 펠렛을 건조시킨 다음, 최종적으로 DNA 펠렛을 10 mM Tris-Cl에 재현탁하십시오. 그 다음 transpose on-base 라이브러리 제작 키트에 포함된 라이브러리 정규화 비즈를 사용하여 샘플을 정규화하십시오. 마지막으로, 차세대 염기서열 분석 플랫폼을 사용하여 DNA 시퀀싱을 진행함으로써 시퀀싱 라이브러리의 품질을 개선하고, 차세대 염기서열 분석 플랫폼에서 더욱 유용한 리드(read)를 얻으십시오.

8곳의 서로 다른 유역 지점에서 수중 샘플을 채취하였으며, 분리된 박테리아 분획으로부터 인덱스 DNA 라이브러리를 제작하였습니다. 이 전기영동도에서 나타난 바와 같이, PCR 이후 자동 크기 선택 전의 담수 샘플 유래 DNA 라이브러리는 50 base pairs에서 3000 base pairs까지의 크기 범위를 가진 조각들로 구성되었습니다. 고처리량 자동화 플랫폼을 이용한 크기 선택 후, 샘플들은 500에서 800 base pairs 사이의 좁은 범위의 DNA 조각들을 나타냈습니다. 따라서, 이 자동화 겔 크기 선택 플랫폼의 활용을 통해 적절한 수율을 얻었으며 200 base pairs 미만의 불필요한 조각들이 밀집되는 현상을 최소화하였습니다.

aluminum MiSeq에서 이 라이브러리의 DNA 서열 분석을 수행한 결과, 제곱밀리미터당 1198 K의 클러스터 밀도가 생성되었습니다. 필터를 통과한 클러스터의 비율은 84.2%였으며, 추정 수율은 9.2 gigabytes였습니다. 또한, 7.4 gigabytes 또는 리드의 82.8%가 30 이상의 품질 점수를 나타냈습니다.

이는 수정된 프로토콜을 사용하여 환경 수질 시료에 적용해 시퀀싱한 염기의 약 83%가 최소 99.9%의 염기 호출 정확도를 나타냈음을 의미합니다. 이 영상을 시청한 후에는 시퀀싱 라이브러리로부터 어떻게 더 유익한 데이터를 생성할 수 있는지에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때는 목표로 하는 미생물 분획, 라이브러리 준비 방법의 선택, 표적 단편 길이 및 시퀀싱 플랫폼을 기억하는 것이 중요합니다.