3 차원 (3D) 종양 회전 타원체 침공 분석

이 절차의 전반적인 목표는 종양 세포 침입에 대한 체외, 반자동, 3차원 마이크로플레이트 분석을 제공하는 것입니다. 이것은 먼저 초저 부착 둥근 바닥 96의 현탁액에서 재현 가능한 크기의 종양 스테로이드를 생성함으로써 달성되며, 각 우물에서 한 번에 스테로이드를 플레이트화합니다. 두 번째 단계는 배지의 일부를 제거하고 매트릭스 또는 BMM과 같은 기저막을 각 웰에 직접 추가하여 종양 세포가 스테로이드체에서 침입하는 반고체 매트릭스를 제공하는 것입니다.

다음으로, 72시간에서 96시간 동안 간격으로 종양 스테로이드 침습을 모니터링하며, 이 기간 동안 이미지 획득은 세포분석기에서 자동으로 또는 현미경에서 수동으로 수행됩니다. 마지막 단계는 자동 세포 분석기 또는 이미징 소프트웨어를 통해 종양 세포 침입을 분석하는 것입니다. 궁극적으로, 3D 종양 스테로이드 침습 분석법은 생리학적으로 더 관련성이 있고 표적 검증 및 약물 스크리닝 연구에 적합한 형식으로 체외 암 침습을 모델링하는 데 사용됩니다.

우리는 이 기술이 생리학적으로 관련된 3차원 형식으로 암 진행의 핵심 측면인 침습을 조사할 수 있게 해주기 때문에 암 연구에서 표적 검증 및 약물 스크리닝에 일반적으로 사용되는 간단한 2차원 세포 증식 분석을 보완한다고 믿습니다. 이 방법에 대한 아이디어는 3D 종양 phe, 즉 마이크로플레이트의 성장을 최적화했을 때 처음 떠올랐습니다. 침공에서도 동일한 설정과 모습을 사용하는 것이 좋을 것이라고 생각했고, 각 우물에서 매체의 일부를 제거하고 기저막과 유사한 매트릭스로 교체하는 것만으로도 결과가 쉬웠습니다.

이 방법의 시각적 시연은 BMM의 전통이 처음에는 어려울 수 있습니다 후 각 우물의 중앙 위치에 스테로이드를 유지하는 것이 필수적입니다. 이로 인해 스테로이드가 다른 초점면에 있기 때문에 최적이 아닌 이미지 분석이 발생할 수 있습니다. 경험이 있습니다.

이런 경우는 거의 발생하지 않지만, 필요한 경우 플레이트를 부드럽게 원심분리하여 프로세스를 촉진할 수 있습니다. 밤새 ICE에서 모든 BMM을 시작하려면 P 10 E 200 및 P 1000 피펫 및 멸균 튜브용 멸균 필터 팁 세트를 섭씨 영하 20도로 유지하십시오. 또한 4일 된 스테로이드가 들어 있는 초저 부착물 96웰 플레이트를 얼음 위에 놓습니다.

멀티채널 피펫을 사용하여 참새 플레이트에서 웰당 100마이크로리터의 성장 배지를 부드럽게 제거합니다. 이 단계의 경우 팁이 U 하단의 내부 벽을 향하도록 각도를 맞춥니다. 글쎄, 우물의 바닥과 sphe의 위치와의 접촉을 피하십시오.

얼음 찬 끝을 사용하여 스테로이드의 소요를 극소화하기 위하여는, BMM를 얼음 찬 관으로 옮기십시오. 사이토카인 유도 침습 또는 약물 평가 연구의 경우, 얼음처럼 차가운 팁을 사용하여 BMM에 시약을 첨가합니다. 예를 들어, 표피 성장 인자(EGF)를 사용하여 Cal S 및 cal r 편평 암종 세포의 침입을 자극합니다.

그런 다음 BMM 100마이크로리터를 ubo에 부드럽게 분배합니다. 우물의 내벽을 향해 끝을 조준합니다. 이 단계가 가장 중요합니다.

광학 이미지 분석에 관해서는, 스테로이드는 우물의 중심에 남아 있어야 합니다. 필요한 모든 웰에 대해 이 단계를 반복하여 조건당 5-6번의 반복을 허용합니다. 필요한 경우 멸균 바늘을 사용하여 갓 식힌 팁으로 교체하십시오.

거품이 있는 경우 제거합니다. 육안으로 스테로이드가 중앙 위치에 있는지 검사하기 위하여 현미경을 이용하십시오, 그들이 이지 않는 경우에, 원심 분리기 G, 4 섭씨 온도의 3 분 동안 판. 이렇게 하면 스테로이드가 각 우물의 중앙에 위치합니다.

다음으로, 플레이트를 섭씨 37도의 인큐베이터로 옮기고 BMM이 1시간 후에 응고되도록 합니다. 멀티채널 피펫을 사용하여 웰당 100마이크로리터를 부드럽게 첨가하여 완전히 성장합니다. 매체 또는 사이토카인 유도 침습 또는 약물 평가 연구.

자동화된 이미지 획득을 위해 배지에 사이토카인 또는 억제제를 포함합니다. 간격을 두고 세포분석기의 플레이트를 스캔합니다. 시간 0에서 시작하여 confluence 응용 프로그램을 선택합니다.

그런 다음 스테로이드에 초점이 맞춰져 있는지 확인하십시오. 필요한 경우 초점을 수동으로 조정하고 초점 오프셋을 수정합니다. 샘플링 설정 아래에서.

선택기는 하나의 중앙 시야각을 스캔합니다. BMM 추가 후 종양 스테로이드는 중앙 위치에 남아 있어야 합니다. 따라서 소프트웨어에서 전체 웰을 스캔할 필요가 없습니다.

플레이트 맵에서 스캔할 웰을 강조 표시하여 정의합니다. 그런 다음 스캔 시작을 클릭합니다. 자동화된 이미지 분석을 위해 confluence 응용 프로그램을 선택하십시오.

분석 탭에서 응용 프로그램 설정을 조정하여 BMM으로 확장되는 세포 프로세스 및 침입자 포디아를 포함하여 스테로이드 주변의 정확한 세분화를 생성합니다. 각 종양 세포주 및/또는 다양한 시점에 대한 설정을 조정합니다. 몇 가지 다른 웰을 클릭하여 분석 설정이 플레이트의 다른 스테로이드에 적합한지 확인하십시오.

세분화가 스테로이드의 윤곽을 정확하게 나타내지 않으면 응용 프로그램 설정을 추가로 조정하십시오. 결과 탭에서 분석 시작을 클릭합니다. 웰 레벨 데이터를 스프레드시트 프로그램으로 내보내기 전에 여러 웰을 확인하여 분석 품질을 확인합니다.

모든 시점에 대해 분석을 반복한 다음 막대 차트에서 반복 유정에 대한 평균 합류 백분율 및 시간에 대한 침습을 계산합니다. 수동 이미지 획득을 위해 선택한 과학 그래프 및 통계 소프트웨어를 사용하여 10 x 대물렌즈가 장착된 도립 현미경을 사용하여 각 스테로이드 종양에 대한 이미지를 일정 간격으로 기록합니다. T에서 시작하여 T가 72시간에서 96시간 사이가 된 후 0과 같습니다.

해당 세포 내벽의 침입 속도에 따라, 침입 영역이 너무 커서 10 x 시야 내에서 완전히 캡처할 수 없는 경우 Forex 대물렌즈를 사용하십시오. 수동 이미지 분석을 위해 획득한 각 개별 이미지를 저장합니다. 스테이지 그래프 이미지를 이미징 분석으로 엽니다.

캘리브레이션을 위해 선택되는 소프트웨어는 스테이지 그래피 테이킹의 이미지입니다. 10 x 및 4 x 대물렌즈를 모두 사용합니다. 그래픽 측정, 단위 및 사용된 목표를 입력하고 보정을 수행합니다.

이 단계는 후속 이미지 분석을 위해 한 번만 필요합니다. 필요한 보정 설정을 다시 로드하기만 하면 됩니다. 다음으로, Invasion Assay 이미지를 열고 이미지를 획득하는 데 사용된 현미경 대물렌즈에 따라 보정 설정을 선택합니다.

여기에 사용 된 소프트웨어에서 스테로이드가 적용되는 영역을 측정하십시오. 측정으로 이동하여 카운트 크기를 선택합니다. while then load 설정을 선택하고 사전 결정된 assay 설정을 선택합니다.

그런 다음 개수를 선택합니다. 그런 다음 스테로이드를 정확하게 분류해야 합니다. 측정값을 스프레드시트에 내보내는 것은 서로 다른 매개변수이며 관련 이미지 정보를 스프레드시트에 기록합니다.

마지막으로, 과학적인 그래프 작성 및 통계 소프트웨어를 사용하여 시간 대비 복제 스테로이드 또는 침입의 평균 면적을 표시합니다. 다음은 U 87 MG 교모세포종 세포주에서 관찰된 암세포 침입의 예로서 뇌종양 침입을 예시하는 데 사용될 수 있습니다. 일단 전형적인 별폭발 침입 패턴으로 퍼져 있는 BMM 세포에 삽입되면, 이 과정은 72시간에 걸쳐 추적됩니다.

완전 자동화된 이미지 분석. 이미지 유세포 분석기를 사용하면 세포 돌출부 주위를 분할하고 종양 세포 침입을 정밀하게 정량화할 수 있습니다. 이 세포주의 경우, 스테로이드체는 침입 영역의 측정에서 제외됩니다.

완전 자동화된 이미지 분석을 쉽게 수행할 수 있으며 시간 경과에 따른 종양 세포 침습을 정량화할 수 있습니다. 세포 침입의 다른 패턴은 인간 편평, 머리 및 목 동형성에 의해 나타납니다. 암 세포주 Cal S는 EG FFR 티로신 키나아제 억제제에 민감하고 CAL R은 내성이 있습니다.

EGF가 없는 경우, Cal ars 스테로이드의 본체에서 압출된 EGF 손가락 모양의 돌기가 있는 상태에서 어느 세포주도 BMM으로 침입하지 않았습니다. Cal 세포는 72시간 후에 덜 침습적이었지만, 이 경우의 이미지는 이미지 세포분석기를 사용하여 빠르게 획득되었으며 대체 방법을 예시하기 위해 독립형 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 침습 정도를 수동으로 정량화했습니다.이 절차를 시도하는 동안 각 세포주가 스테로이드를 형성하는 능력에 맞게 최적화되어야 한다는 점을 기억하는 것이 중요합니다. 세포 파종 밀도, 매트릭스 조성, 이미지 및 분석 설정 이 절차를 따릅니다. 예를 들어, 배아체와 공동 배양된 종양이 복잡한 조직 또는 신경교종에 대한 성상세포와 같은 다른 오가노이드, 위장암에 대한 crypt 배양 또는 간세포 암종 및 대장암 전이에 대한 간과 같은 다른 오가노이드를 사용하여 3D 조직 침습을 평가하는 데에도 적용할 수 있는 동일한 방법입니다.