단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

다음 실험의 전반적인 목표는 쉽게 구할 수 있는 시약을 사용하여 인간 전혈에서 호중구, 세포 외 트랩 또는 그물을 분리하기 위한 간단한 프로토콜을 시연하는 것입니다. 이는 먼저 인간 전혈에서 호중구를 분리하고 두 번째 단계로 차등 원심분리 기술을 사용하여 달성됩니다. 분리된 호중구는 PMa로 자극되어 NETosis라고도 하는 그물 형성을 유도합니다.

다음으로, cell-free 그물 분리물로 플레이트를 준비하고 암세포를 추가하여 그물이 세포의 접착에 어떤 영향을 미치는지 보여줍니다. 그 결과, 그물 단층을 추가하면 5 49개의 암세포의 접착력이 향상되고 그물이 분해될 때 이러한 접착력이 감소하는 것으로 나타났습니다. DNAS one을 사용하여 이 방법을 시각적으로 시연하는 것이 중요합니다.

이 기술의 참신함을 감안할 때, 호중구 xor 세포 트랩의 처리는 이러한 구조가 매우 취약하기 때문에 매우 어렵습니다. 시작하려면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 14개의 헤파린화된 녹색 상관에서 80ml의 신선한 인간 전혈을 얻습니다. 각 튜브를 열고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 5ml를 각 튜브에 첨가합니다.

다음으로, 실온에서 4개의 50ml 원추형 튜브 각각에 15ml의 림프구 분리 매체 또는 LSM을 추가합니다. 그런 다음 60ml 주사기에 장착된 18 게이지 바늘을 사용하여 희석된 혈액을 LSM에 조심스럽게 층을 이루고 날카로운 LSM 혈액 계면을 만들고 튜브를 800배 G로 섭씨 21도에서 30분 동안 원심분리하여 끊어지지 않고 원심분리기를 중지한 다음 조심스럽게 흡인하고 맨 위 두 개의 액체 층과 그 사이의 계면을 버리고 맨 아래 빨간색 층만 남깁니다. 이 펠릿에는 적혈구와 호중구가 포함되어 있습니다.

각 튜브에 PBS 20밀리리터와 6% 덱스트란 용액 20밀리리터를 추가합니다. 각 튜브를 부드럽게 뒤집어 실온에서 30분 동안 그대로 둡니다. 적혈구는 튜브 바닥으로 침전됩니다.

다음으로, 상등액을 새 튜브로 옮기고 팔레트를 버립니다. 상층액을 섭씨 4도에서 450배 G로 5분 동안 원심분리한 다음 상등액을 버리고 호중구가 풍부한 펠릿을 남깁니다. 4.5ml의 멸균수에 0.5ml의 용해 완충액이 포함된 용해 용액을 준비합니다.

각 튜브에 총 5ml의 용해 용액을 추가하고 모든 펠릿을 하나의 플라스크에 모읍니다. 플라스크를 실온에서 10분 동안 어두운 곳에 두어 남아 있는 적혈구를 제거합니다. 호중구를 섭씨 4도에서 450배 G로 5분 동안 원심분리합니다.

상등액을 버리고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 5밀리리터로 펠릿을 세척합니다. 그런 다음 섭씨 4도에서 450배 G로 샘플을 다시 원심분리하고 남은 용해 용액을 포함하는 상등액을 제거합니다. 3% 소 태아 혈청이 보충된 30ml의 차가운 RPMI 배지에 호중구 펠릿을 재현탁하고 튜브를 얼음 위에 올려 호중구 세포 외 트랩 또는 그물 형성을 자극합니다.

150mm x 25mm 편평한 조직 배양 접시에 호중구 현탁액 30리터에 PMA 500나노 몰을 추가합니다. 20mm 그리드를 사용하여 5% 이산화탄소 농도에서 섭씨 37도에서 4시간 동안 세포를 배양합니다. 배양 후에는 배지를 부드럽게 흡인하고 버리고 그물 층을 방해하지 않도록주의하고 호중구가 접시 바닥에 부착되지

그런 다음 피펫을 사용하여 칼슘과 마그네슘이 없는 15ml의 차가운 PBS로 각 접시의 바닥을 씻고 모든 부착 물질을 바닥에서 제거해야 합니다. 세척 현탁액을 15ml 원뿔형 튜브에 모은 다음 450배 G에서 10분 동안 원심분리합니다. 섭씨 4도에서 호중구와 나머지 세포는 바닥에서 펠릿으로 굳습니다.

세포 자유로운 순수한 부유한 상등액을 남겨두고, 다음 다수 1.5 밀리리터 관으로 상청액을 기울이고 8 18, 000 시간 G에 4 섭씨 온도에 10 분 동안 원심분리기를 기울인다. DNA를 펠릿화하려면 상등액을 버리고 농도가 PBS 100마이크로리터당 7번째 호중구의 2배에 해당하는 농도가 되도록 PBS에 펠렛을 재현탁합니다. 이 무세포 순 스톡은 후속 실험에 사용할 수 있습니다.

분광 광도계를 사용하여 샘플의 DNA 농도를 측정합니다. 적절한 농도는 100 마이크로 리터의 그물 스톡에서 마이크로 리터 당 140-180 나노 그램 범위로 96 웰 평평한 바닥 플레이트의 각 웰에 들어가야하며 어둠 속에서 섭씨 4 도에서 밤새 플레이트를 배양하여 12-20 시간 후에 웰을 코팅하고 현미경을 사용하여 웰 바닥에 무세포 그물의 균일 한 단층의 형성을 확인합니다. 단층이 확인되면 웰에서 모든 비접착성 물질을 부드럽게 흡인합니다.

하단의 단층을 방해하지 않도록 합니다. 이것은 이 절차의 가장 어려운 측면입니다. 적절한 그물 단층을 유지하려면 플레이트를 매우 조심스럽게 다루어야 합니다.

웰 측면에 모든 시약과 세포를 천천히 추가하고 매우 부드럽게 흡인하고 흡입 팁으로 웰 바닥을 만지지 마십시오. 비접착성 물질을 제거한 상태에서 각 웰에 100마이크로리터의 1% 소 혈청 알부민 차단 용액을 부드럽게 첨가하고 실온에서 1시간 동안 그대로 둡니다. 네트 모노 층을 방해할 수 있으므로 플레이트를 휘젓거나 흔들지 마십시오.

다음으로, 5 49 개의 암 세포가 70-80 % 융합 될 때 수확하여 준비합니다. 표준 기술을 사용하여 100 마이크로 리터 당 네 번째 세포에 10의 2 배의 농도로 배지에서 세포를 다시 현탁시킵니다. 배지 1밀리리터당 1마이크로리터의 CFS e를 첨가하여 세포를 염색하고 10분 동안 실온에 둡니다.

다음으로, 섭씨 4도에서 450배 G로 세포를 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 배지의 초기 부피에서 세포를 재현탁시켜 배지 100 마이크로리터당 4번째 암세포의 2배의 농도를 유지한다. 그물 코팅된 플레이트를 잡고 차단 용액을 부드럽게 흡입합니다.

그런 다음 각 웰에 100마이크로리터의 암세포 현탁액을 추가하고 세포가 섭씨 37도에서 90분 동안 플레이트에 부착되도록 하고 5%의 이산화탄소가 액체를 완전히 흡인하고 10분 동안 일부 웰에 하나씩 1000개의 DNA를 추가하여 다른 웰의 그물을 분해합니다. 차량 제어로 100분 동안 우물당 10마이크로리터의 멸균수를 추가합니다. 다음으로, 각 웰의 액체를 부드럽게 흡입하고 100마이크로리터의 PBS로 세척하여 비부착물을 제거합니다.

A 5 49 세포는 우물에 있는 모든 용액을 흡인하고 버리고 그물과 부착 암세포만 바닥에 남습니다. 그런 다음 웰당 100마이크로리터의 4% 포름알데히드 용액을 첨가하여 세포를 고정하고 플레이트를 형광 현미경으로 옮겨 분석을 판독한 다음 결과를 플롯 및 분석합니다. 데이터 분석 소프트웨어를 사용합니다.

cell-free 그물은 5,49개의 암세포를 가진 정적 접착 분석에 사용되었습니다. 광학 현미경 검사는 암세포가 그물 단층에 강하게 부착하는 것을 보여주었습니다. 시험관 내.

이 접착력은 DNA에 의해 그물 단층이 분해 된 후 감소했으며, 5 49 개의 암 세포로 표지 된 형광 현미경 검사에서 이러한 결과를 확인했습니다. 5 49 셀의 net mono layer에 결합하는 것은 고출력 필드 당 셀의 수를 계산하여 정량화되었습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, 차량 제어에서 그물에 대한 암세포 부착에는 변화가 없었다.

그러나 DNA 1이 있는 경우 그물에 대한 암세포 접착력이 크게 감소했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 전혈에서 그물을 분리하고 처리하는 방법에 대해 잘 알게 될 것입니다. 이러한 무세포 그물 분리물은 면역 형광, 공초점 현미경, 전자 현미경 및 웨스턴 블로팅을 포함한 다양한 기술에 사용할 수 있습니다.