Name: 단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 43 s
Description: 학습하세요 인간 전혈에서 호중구 세포 외 트랩(NETs)을 분리하는 간단한 방법을. 차등 원심분리와 PMA 자극을 통해 NETosis를 유도하고, 암세포 부착 실험에 활용할 수 있습니다.

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저자는 이 작업을 구성하는 데 중심이 된 지도와 멘토링에 대해 Paul Kubes 박사에게 감사를 표합니다.

참고 : 모든 실험이 지역의 기관 윤리 지침에 따라 실시 하였다. 1. 혈액 그리기 <ol><li> 전주 venipucture을 통해 녹색 위쪽 (헤파린) 튜브에 건강한 지원자에서 혈액의 14 튜브를 수집하고 얼음에 정착하기 전에 각 튜브를 반전. 최적의 호중구 수율을 보장하기 위해 실험 15 분 - (10) 내의 혈액을 수집합니다. </li></ol> 전혈 2. 호중구 격리 <ol><li> 혈액을 희석하기 위해 칼슘과 마그네슘이없는 PBS의 5 ml의 혈액의 각 녹색 위쪽 튜브를 씻으십시오. 4 × 50 ML 원뿔 튜브의 각에서, RT에서 림프구 분리 매체 (LSM) 15ml를 추가합니다. 날카로운 LSM-혈액 인터페이스를 생성, 조심스럽게 LSM 위에 희석 된 혈액을 층, 60 ML의 주사기에 장착 된 18 G 바늘을 사용. 주 : 최대한 층의 혼합 피한다. </li><li> 휴식없이 21 ° C에서 30 분 동안 800 XG에 원심 분리기. 참고 : 갑자기 중단 할 수 있습니다다른 레이어의 혼합을 야기한다. </li><li> 맨 아래에있는 적혈구와 호중구 침전물을 준수하십시오. 기음과는 하단 붉은 레이어를 떠나, 림프구 및 단핵구 세포를 포함 이러한 층 사이의 인터페이스를 제거해야합니다 상위 2 층 (플라즈마 및 LSM) 만들기를 폐기합니다. </li><li> 각각의 튜브에, 인산 버퍼 식염수 (PBS) 20 ml의 6 % 덱스 트란 용액 20 ml를 추가합니다. 부드럽게 적혈구 및 호중구의 층과 혼​​합하고 실온에서 30 분 동안 방치시키고 각 튜브를 반전. 주 :이 적혈구 (적혈구) 아래쪽에 침강 것을 허용 할 것이다. </li><li> 30 분 후, 신선한 튜브에 호중구 풍부한 뜨는을 전송하고 RBC 펠렛을 폐기합니다. 5 분 동안 4 ° C에서 450 XG에 원심 분리기 상층 액. 원심 분리 후, 상층 액을 버린다. 펠렛은 주로 호중구 몇 적혈구가 포함됩니다. </li><li> 멸균 수에 4.5 ㎖의 용균 완충액을 0.5 ㎖의 첨가에 의해 용해하는 용액을 준비한다. 로 용해은 t으로 RBC 남아그는 하나의 튜브에 모든 재 부유 알약을 전송, 솔루션을 용해하는 5 mL를 준비했다. 10 분 동안 어둠 속에서 실온에서 용해를 허용합니다. </li><li> 5 분 동안 4 ° C에서 450 XG에 원심 분리기. 상층 액을 버리고 남아있는 용해하는 용액을 제거하기 위해 4 ° C에서 450 XG에서 다시 칼슘과 마그네슘 원심 분리기없이 5 ml의 PBS로 펠렛을 씻는다. 이 시점에서 얻어진 펠렛은 호중구가 포함되어 있습니다. 감기 3 % RPMI의 30 ml의 펠렛을 재현 탁과 얼음에 넣어. 주 : 3 %가 RPMI로 RPMI 매체를 보충함으로써 이루어진다 3 % 소 태아 혈청 (FBS) </li><li> 메틸렌 블루 염색을 사용하여 샘​​플의 순도를 확인합니다. &gt; 세포의 95 %는 다 엽성 핵와 과립구해야합니다. &gt; 확인 세포의 95 % 생존 최종 호중구 수율을 계산하는 트리 판 블루 염색을 사용합니다. 5 × 106 호중구 / ml의 최종 농도를 얻기 위해 빙냉 3 % RPMI 호중구를 희석. </li></ol> 3. 그물 세대 <ol><li> 500 N과 호중구를 자극PMA의 M (호중구 용액 30ml를 당), 37 ° C, 5 % CO 2에서 4 시간 동안 20mm 그리드와 150 X 25mm 평면 조직 배양 접시에 배양한다. 이 NETosis을 수 있습니다. </li><li> 자극의 4 시간 후, 부드럽게 하단에 부착 된 그물과 호중구의 레이어를 떠나, 기음과 미디어를 폐기합니다. 이 계층을 중단하지 마십시오. </li><li> 접시 당 칼슘과 마그네슘이없는 차가운 PBS 15 ml의 총을 사용하여, 아래에서 모든 접착 재료를 리프트 오프하기 위해 접시의 저면에 PBS 15 ㎖를 피펫 팅하여 각 접시의 저면을 씻는다. </li><li> 4 ° C에서 450 XG에서 10 분 동안 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기의 각 접시 (단계 3.3) 세척에서 얻은 솔루션을 수집합니다. 호중구 나머지 세포는 무 세포 상청액 NET 풍부한 떠나는 하단 펠렛 것이다. </li><li> 나누기 1.5 ml의 마이크로 원심 분리기 튜브에 뜨는 4 ℃에서 18,000 XG에 10 분 동안 스핀. 이것은 모든 DNA가 펠렛 할 수 있습니다. 참고 : 큰 TU에서 원심 분리BES 달리 고속 마이크로 원심 분리기를 사용하기 위해 더 작은 튜브에 상청을 분할해야한다, 이러한 높은 속도는 일반 원심 분리기에 도달 할 경우 소모 쉽고 적은 시간이다. </li><li> PBS 100 ㎕ 당 2 × 10 7 호중구에 해당하는 농도로 얼음 차가운 PBS에서 함께 얻은 모든 알약을 뜨는을 취소하고 재현 탁. 이 후속 실험에 사용할 수있는 무 세포 NET 스톡을 산출 할 것이다. </li><li> 측정법 또는 다른 DNA 정량 도구를 사용하여 수득 된 샘플에서 DNA 농도를 측정한다. 180 NG / μL - 샘플에서 적절한 농도는 140 사이의 범위해야합니다. </li></ol> 4. NET-암 세포 정적 접착 분석 <ol><li> 어둠 속에서 4 ° C에서 코트 우물 O / N로 96 웰 평평한 바닥 플레이트에 잘 당 이전에 취득한 NET 주식의 100 μl를 추가 할 수 있습니다. </li><li> 이후 12 시간 내지 20 세포의 균일 한 단일 층의 형성을 확인할현미경으로 우물의 바닥에서 무료로 그물 (그림 1). 이 시점에서, 부드럽게 하단에있는 NET 단층을 방해 확실하지 만드는 우물에서 모든 비 접착 물질을 대기음. </li><li> 각 웰에 1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 차단 용액 100 μl를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 둡니다. </li><li> 0.25 % 트립신 용액 2 ㎖를 사용하여 T-75 플라스크에서 A549 폐암 세포를 분리. 일단, 분리 된 5 분 동안 4 ° C에서 450 XG에 트립신 세포와 원심 분리기에 A549 미디어 10 ㎖를 추가합니다. 100 μL 용지 당 4 X10 암세포의 농도를 얻기 위해 용지에 재현 탁하고 세포 상등액을 폐기. 주 : A549 세포 별도로 성장시켰다. 간략하게, 세포를 배양하고, 10 % FBS, 1 % 페니실린 스트렙토 마이신 및 37 ° C에서 5 % CO 2에서 배양 함유 된 DMEM F12 배지에서 유지 하였다. 일단 70 - 80 %의 세포가 합류점에 도달 한, 그들은 0.25 % 트립신 EDTA를 이용하여 분리하고 동일한 배지에서 재현 탁위의 설명. </li><li> 미디어 CFSE 1 ㎖ 당 1 μl를 첨가하고 실온에서 10 분 동안 염색을 남겨 CFSE 사용 얼룩 암세포. 5 분 동안 4 ° C에서 450 XG에 염색, 원심 분리기 다운 후 다음 100 μL 미디어 당이 10 배 4 암 세포의 농도를 얻기 위해 미디어의 초기 볼륨에 뜨는에 resuspend 세포를 폐기합니다. </li><li> 부드럽게 흡인 솔루션을 차단하고 당 잘 NET 단일 층 이상, 100 μL에 해당 미디어에이 10 배 4 암 세포를 추가하고 37 ° C 5 % CO 2에서 90 분 동안 부착 할 수 있도록, 차단 그물 1 시간 후. 조심스럽게 세포를 흡인 및 비 부착 세포를 씻어 각 웰에 PBS 100 ㎕를 추가합니다. </li><li> 일부 우물에서 그물을 저하 세척하기 전에 10 분 동안 잘 당 DNAse1의 1000U를 추가합니다. 이것은 부정적인 제어를 제공합니다. 다른 우물에서, 차량 제어 (VC)이 될 것입니다 10 분, 잘 당 멸균 물 100 μl를 추가합니다. 참고 : 3 공조 당 복제n은 일반적으로 표본의 크기를 증가시키기 위해 수행된다. </li><li> 기음은 우물 바닥에 만 그물과 부착 암 세포를 떠나 모든 솔루션을 버리고. (도 1)에 부착 NETS 암세포를 수정하고 형광 현미경 분석을 읽을 웰당 4 % 포름 알데히드 용액 100 ㎕를 추가한다. 플롯 및 결과를 분석 (도 3). </li></ol>

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</ol>

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이 비디오에서 보여 호중구 세포 외 트랩 격리 프로토콜은 호중구 격리 및 NET 형성을위한 문헌에 사용 된 다른 기술을 결합한다. 그것은 매우 복잡하고 변화하는 프로세스를 간소화하고 다른 프로토콜보다 적은 단계를 정제 무 세포 그물을 분리하는 매우 안정적이고 복제 방법을 제공합니다. 또한, 쉽게 사용할 시약은 프로토콜의 단순성에 추가 채용 크게 비용을 줄일 수있다. 정적 접착 분석 향해 그물 애플리케이션 NET 농도는 쉽게 특정 목표 (17)에 적합하도록 조작 될 수있는 한,이 분리 기술에 의해 제공되는 융통성을 증명하는 역할을한다. 따라서, 격리 기술에 의해 증명 그물 유동 세포 계측법뿐만 아니라 전통적인 웨스턴 블롯 분석법 동적 밀착성, 이주 분석법, 증식 분석법 및 면역 형광 공 초점 영상, 전자 현미경 분석법을 포함하여 다양한 유형에 사용될 수있다. </p&gt; 그것의 성공에 중요이 프로토콜의 단계들이있다. 먼저, 실수 호중구 아폽토시스 선도의 분리 과정에서 활성화 될 수있...

호중구 세포 외 트랩 (그물) 새로 단백질과 히스톤의 수백에 의해 장식 된 세포 외 DNA의 가닥으로 구성 호중구 파생 요소를 발견한다. 이들은 특정 자극에 따라 감염 및 염증의 맥락에서 호중구에 의해 분비되며, 이들은 초기 감염에 대한 호중구의 방어 메커니즘의 일부로 인식 하였다. 그들은 처음 박테리아, 바이러스, 곰팡이 1-3 등 다양한 미생물 침략자의 트래핑을 촉진 것으로 나타났다. 미생물의 트래핑 후 그 파괴에 직접적으로 NET 관련 단백질 3,4에 의해 간접적으로 식세포 5,6의 현지 채용을 통해 이어질 것입니다. 그물의 역할은 그러나 방어를 호스트하기 위해 제한 될 것 같지 않습니다. 보다 최근에, 그들은, 9 혈전증,자가 면역 질환 7,8에서 중요한 역할을하는 임신 관련 질환 (10) 및 심지어 암의 진행을 도시 한(11, 12). 따라서, 그물 다양한 생리 현상 큰 숫자에서 중요한 역할을하는 것으로 보인다. 그러나, 이러한 연구의 신규 한 특성으로 인해, 많은 그물 그 효과를 발휘하는 기전과 관련하여 설명 될 남아. 여기서, 호중구의 부재 그물 분리를 위해 단순화 된 방법을 제시한다. 다음 비디오는, 인간 전혈로부터 분리 그물을 간단하고 쉬운 방법을 보여준다. 무 세포 그물은 접착 성, 증식 및 이주 등의 분석법 번호뿐만 아니라 블로 팅 염색 imuunofluorescence 비롯한 시험 관내 실험에 사용될 수있다. 다른 프로토콜 그러나 그들은 일반적으로, 긴 복잡하고 비싼, 자주, 낮은 수율 13 아르, 13, 19 존재한다. 이 단순화 된 프로토콜 따라서 procedu의 길이를 최소화 염기성 시약을 사용하여 호중구를 분리하는 데 필요한 단계의 수를 감소수율을 극대화하면서 다시. 다음의 방법은 호중구 격리를위한 다양한 기술들이 앞서 라이브 호중구 매​​우 순수한 샘플을 수득 간단한 프로토콜을 수득 문헌에 기재된 결합한다. 문헌에서 제안 된 바와 같이, 정맥 혈액을 EDTA 튜브에 수집하고, 호중구 활성화 (14)을 방지하기 위해 10 분 이내에 사용된다. 우리는 헤파린 처리 전혈 초기 Boyum 등 15에 의해 설명 피콜 밀도 원심 분리 기법에서 적응 방법에서 과립구 및 적혈구를 분리 림프구 분리 매체 (LSM) 밀도 구배 원심 분리를 사용한다. LSM은 나트륨 metrizoate 나트륨 diatrizoate 대입 16-18 호중구를 분리 많은 연구에서 성공적으로 사용되어왔다 Boyum 제형의 변형 예이다. 차동 밀도 원심 분리, 단핵구와 림프구가 삭제됩니다 다음; 적혈구는 침강6 % 덱스 트란 용액 (14)을 사용하고, 나머지 적혈구는 트리 판 블루와 메틸렌 블루 염색 확인 순수한 호중구의 인구를 얻기 위해 용해된다. 에이전트는 다수의 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) 및 포르 볼 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) 및 인터루킨 (IL-8) -3,5,6- 비롯한 시험 관내 및 생체 내 NETosis을 유도하기 위해 사용되어왔다. 다음 프로토콜에 고립 된 호중구 세포 자멸사 (19, 20)을 홍보하지 않고 일관성과 신뢰성을 NET 형성을 허용하는 적절한 농도로 표시되었습니다 4 시간, 500 nM의 PMA로 자극한다. 분리 후, 우리는이 프로토콜에서 얻은 무 세포 그물 부착 분석에서 사용할 수있는 방법을 보여준다. DNAse1 소화 및 전술 한 바와 같이 그물을 분해하는 데 사용하므로 제어 2,3,11 역할을한다. 다른 옵션 NET formati을 억제 호중구 엘라 스타 제 억제제 (NEI)의 사용을 포함목표는 NET 형성을 억제하기보다는 저하 (11)에 영향을하는 것입니다 허용 대안 인에. 네이는 다양한 기능을 가지고 있지만, 이전에 증착 NET 염색질 decondensation, 탈과립 핵 호중구 사멸 (12)의 막힘을 통해 네이 의해 억제 될 수 있음을 보여왔다

<table><tbody><tr><td>둘베코' s 인산염 완충 식염수(PBS), 개질, 염화칼슘 및 염화마그네슘 없음</td><td>Wisent</td><td>311-425-CL</td><td></td></tr><tr><td>림프구 분리 배지(LSM)</td><td>Wisent</td><td>305-010-CL</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란 염산염(분말)</td><td>스펙트럼</td><td>DE130</td><td>6% 덱스트란 용액은 PBS에 Ca와 Mg를 6% 덱스트란 분말로 보충하여 만듭니다</td></tr>. <tr><td>RPMI-1640 배지에 L-글루타민</td><td>Wisent</td><td>를 첨가합니다.350-000-CL</td><td>3% RPMI 용액은 RPMI에 3% 소 태아 혈청</td></tr><tr><td>BD Pharm Lyse 용해 완충액</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma-Alrdrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>DNAse1</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>F12 DMEM</td><td>Wisent</td><td>319-075-CL</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td>을 보충하여 만듭니다.<td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Invitrogen</td><td>C1157</td><td></td></tr><tr><td>0.25% 트립신-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>20mm 그리드(150 x 25mm)가 있는 Integrid 조직 배양 접시</td><td>Falcon</td><td>353025</td><td></td></tr></tbody></table>

단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

호중구 세포 외 트랩 (그물)이 최근 호중구의 항균 필수품 전반의 한 부분으로 확인되었다. 그렇다 감염 싸움에서 자신의 역할에서, 최근의 연구는 암의 진행을 포함하여 많은 다른 질병 과정에 관여 될 수 있음을 보여 주었다. 정제 그물을 분리하는 것은 이러한 기능에 대한 연구를 허용하는 중요한 요소이다. 이 비디오에서는, 우리는 쉽게 사용할 시약을 사용하여 인간의 전체 혈액에서 세포 무료 NET 분리의 단순화 된 방법을 보여줍니다. 고립 된 그물은 면역 형광 염색법, 모래 바닥 또는 다양한 기능 분석에 사용할 수 있습니다. 이는 호중구 자신의 전위 교란 효과의 부재에서의 생물학적 특성의 평가를 가능하게한다. 밀도 구배 분리 기술은 건강한 기증자로부터 전혈 호중구를 분리하는데 사용된다. 고립 된 호중구는 포르 12 MYR에 의해 자극istate 13 아세테이트 (PMA)는 NETosis을 유도합니다. 활성화 된 호중구는 폐기되고, 무 세포 NET 콘텐츠가 얻어진다. 그런 다음 A549 인간 폐암 세포와 접착 분석에서 사용할 수있는 방법을 보여 격리 그물. NET 스톡 코트에 첨가되는 96 웰 세포 배양 플레이트 O / N, 그리고 웰의 저부에 적절한 NET 단층 형성을 확인한 후 CFSE 개 A549 세포의 웰을 사용한다. 부착 세포는 니콘 TE300 형광 현미경을 사용하여 정량한다. 일부 우물에서, 1000U DNAse1는 그물을 저하 계산하기 전에 10 분 추가

그물 정적 유착 검정 성공적인 획득은 암세포의 첨가 이전 그물 단층 (도 1)과의 웰 적절한 코팅을 필요로한다. 이후의 모든 단계는 층을 방해하지 않도록주의하여 수행해야합니다. 그물의 적절한 층을 형성 할 때, 그것은도 2A 및 2C에 도시 된 바와 같이 그물 상당한 암 세포의 부착을 볼 것으로 예상된다. 이 효과는도 2B 및 2D에 도시 된 바와 같이 그물 저하 DNAse1의 첨가에 의해 폐지된다. 반대로, 차량 제어 (도 3)의 존재에 그물 A549 밀착성 현저한 감소가 없어야한다. 고전력 장 (HPF) 당 평균 암 세포 유착의 양호한 추정을 획득하기 위해서는 웰 당 적어도 4 개의 랜덤 HPFS 카운트 것을 권장한다. 물론 기술적 인 문제로 인해 그물에 코팅되지 않은 필드 coun에 대한 고려해서는 안이들과 같은 팅 결과를 위조 수 있습니다....

다음 프로토콜에서 우리는 쉽게 사용할 시약을 사용하여 인간의 전체 혈액에서 호중구 세포 외 트랩 (그물을) 분리하는 아주 간단한 방법을 설명합니다. 우리는 그 다음 절연 그물 암세포 밀착성 시험 관내 분석에서 사용하는 방법을 보여준다.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

다음 실험의 전체적인 목표는 쉽게 구할 수 있는 시약을 사용하여 사람의 전혈에서 호중구 외세포 트랩(neutrophil extracellular traps) 또는 NETs를 분리하는 간단한 프로토콜을 시연하는 것입니다. 이를 위해 먼저 차등 원심분리 기술을 사용하여 사람의 전혈에서 호중구를 분리합니다. 분리된 호중구는 PMA로 자극하여 NETosis라고도 불리는 NET 형성을 유도합니다.다음으로, 세포가 없는 네트 분리물을 사용하여 플레이트를 준비하고 암세포를 추가하여 네트가 세포 접착에 어떤 영향을 미치는지 입증합니다. 결과에 따르면, 네트 단층의 추가는 5 49 암세포의 접착을 향상시키며, 네트가 분해되면 이러한 접착이 감소하는 것으로 나타났습니다. DNase I을 사용하여 이 방법의 시각적 시연을 수행하는 것이 중요합니다.이 기술의 참신함을 고려할 때, 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps)은 그 구조가 매우 취약하기 때문에 다루기가 극도로 어렵습니다. 우선, 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 헤파린 처리된 green top 튜브 14개에 신선한 인간 전혈 80 milliliters를 준비하십시오. 각 튜브를 열고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 5 milliliters를 각 튜브에 추가하십시오.다음으로, 실온에서 50 mL 원추형 튜브 4개에 림프구 분리 배지(lymphocyte separation media, LSM)를 각각 15 mL씩 넣습니다. 그런 다음 60 mL 주사기에 장착된 18게이지 바늘을 사용하여 희석된 혈액을 LSM 위에 조심스럽게 층을 이루어 얹어, LSM과 혈액 사이에 명확한 경계면을 형성합니다. 튜브를 21 °C에서 800 ×g로 30분 동안 제동 없이 원심 분리합니다. 원심 분리기를 정지시킨 후, 상위의 액체 두 층과 그 사이의 경계면을 조심스럽게 흡입하여 제거하고 하단의 붉은 층만 남깁니다. 이 펠릿에는 적혈구와 호중구가 포함되어 있습니다.각 튜브에 20 milliliters의 PBS와 20 milliliters의 6% dextran 용액을 추가합니다. 각 튜브를 부드럽게 뒤집어 섞어준 후 실온에서 30분 동안 방치합니다. 그러면 적혈구가 튜브 바닥으로 침전됩니다.다음으로, 상층액을 새 튜브로 옮기고 펠릿은 폐기합니다. 상층액을 4°C에서 450 ×g로 5분 동안 원심분리한 후, 상층액을 제거하여 호중구가 풍부한 펠릿만 남깁니다. 멸균수 4.5 mL에 용해 버퍼 0.5 mL를 섞어 용해액을 준비합니다.각 튜브에 총 5 mL의 용해액을 추가하고 모든 펠릿을 하나의 플라스크에 모읍니다. 남은 적혈구를 용해시키기 위해 플라스크를 상온의 암소에 10분 동안 둡니다. 호중구를 4 °C에서 450 ×g로 5분 동안 원심분리합니다.상층액을 버리고 칼슘과 마그네슘이 없는 PBS 5 mL로 펠렛을 세척합니다. 그 다음, 샘플을 4 °C에서 450 ×g로 다시 원심분리하여 남은 용해액이 포함된 상층액을 제거합니다. 호중구 펠렛을 3% 태아 송아지 혈청이 첨가된 차가운 RPMI 배지 30 mL에 재현탁하고, 튜브를 얼음에 두어 호중구 세포외 트랩(neutrophil extracellular traps) 또는 nets의 형성을 유도합니다.150 mm x 25 mm 평평한 조직 배양 접시에 담긴 30 L의 호중구 현탁액에 500 nM의 PMA를 첨가하십시오. 20 mm 그리드를 사용하여, 37 °C, 5% CO2 조건에서 세포를 4시간 동안 배양하십시오. 배양 후, 접시 바닥에 부착된 그물망(nets)과 호중구 층이 손상되지 않도록 주의하며 배지를 조심스럽게 흡입하여 제거하십시오.그런 다음 피펫을 사용하여 각 디쉬의 바닥을 칼슘과 마그네슘이 없는 차가운 PBS 15 milliliters로 세척하며, 바닥에서 모든 부착 물질이 제거되어야 합니다. 세척 현탁액을 15 milliliter 원추형 튜브에 수집한 다음 450 times G에서 10분 동안 원심 분리합니다. 4 degrees Celsius에서 호중구와 나머지 세포들이 바닥에 펠렛 형태로 가라앉게 됩니다.세포가 없는 NET 풍부 상청액을 남긴 후, 상청액을 여러 개의 1.5 mL 튜브에 나누어 담고 4 °C에서 18,000 ×g로 10분간 원심분리합니다. DNA를 펠렛화하기 위해 상청액을 제거하고, PBS 내 중성구 농도가 100 µL당 2 × 10⁷개가 되도록 펠렛을 PBS에 재현탁합니다. 이렇게 준비된 세포 없는 NET 스톡은 후속 실험에 사용할 수 있습니다.분광광도법을 사용하여 시료의 DNA 농도를 측정합니다. 적절한 농도는 140에서 180 ng/µL 사이여야 하며, 96웰 평底 플레이트의 각 웰에 정제된 net 스톡 100 µL를 넣고 4 °C의 암소에서 하룻밤 동안 배양하여 웰을 코팅합니다. 12~20시간 후, 현미경을 사용하여 웰 바닥에 cell-free net의 균일한 단층이 형성되었는지 확인합니다. 단층 형성이 확인되면, 웰 내의 모든 비부착 물질을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.바닥의 단일층이 손상되지 않도록 주의하십시오. 이는 본 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 적절한 순 단일층을 유지하려면 플레이트를 매우 조심스럽게 다뤄야 합니다.모든 시약과 세포를 웰의 측면에 천천히 가하고, 매우 조심스럽게 흡입하며, 흡입 팁이 웰 바닥에 닿지 않도록 주의하십시오. 비부착 물질이 제거되면 각 웰에 1% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin) 블로킹 용액 100 µL를 조심스럽게 가하고 상온에서 1시간 동안 둡니다. 플레이트를 흔들거나 진동시키지 마십시오. 이는 단층막(mono layer)을 손상시킬 수 있습니다.다음으로, 70~80% 합류도(confluent)에 도달했을 때 5 49 암세포를 수확하여 준비합니다. 표준 기술을 사용하여, 세포를 100 µL당 2 × 10⁴ cells 농도의 배지로 재부유시킵니다. 배지 1 mL당 1 µL의 CFS e를 첨가하여 세포를 염색하고, 상온에서 10분 동안 방치합니다.다음으로, 세포를 4°C에서 450 ×g로 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거하고, 배지 100 µL당 2 × 10⁴개의 암세포 농도를 유지하도록 초기 배지 부피로 세포를 재현탁합니다. Net 코팅 플레이트를 꺼내 블로킹 용액을 조심스럽게 흡입하여 제거합니다.그 다음, 각 웰에 100 µL의 암세포 현탁액을 넣고 37 °C, 5% CO₂ 조건에서 90분 동안 세포가 플레이트에 부착되도록 합니다. 액체를 완전히 흡입하여 제거한 후, 일부 웰에는 NETs를 분해하기 위해 1000 units의 DNase I을 넣고 10분 동안 처리합니다. 대조군으로 사용할 다른 웰에는 웰당 100 µL의 멸균수를 넣고 10분 동안 둡니다. 이어서, 각 웰의 액체를 조심스럽게 흡입하여 제거하고 100 µL의 PBS로 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거합니다.5-49번 웰의 세포 상층액을 흡입하여 버리고, 바닥에 그물망과 부착된 암세포만 남깁니다. 그런 다음 세포를 고정하기 위해 웰당 100 µL의 4% formaldehyde 용액을 첨가합니다. 즉시 플레이트를 형광 현미경으로 옮겨 분석 결과를 판독한 후, 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 결과를 도식화하고 분석합니다.세포가 없는 그물망을 5 49 암세포를 이용한 정적 부착 분석에 사용하였습니다. 광학 현미경 관찰 결과, 암세포가 그물망 단층에 강하게 부착되는 것이 확인되었습니다. In vitro.네트 단층이 DNAase I에 의해 분해된 후 이러한 접착력이 감소했으며, 표지된 A549 암세포의 형광 현미경 관찰을 통해 이 결과가 확인되었습니다. 네트 단층에 결합한 A549 세포의 수는 고배율 시야당 세포 수를 측정하여 정량화했습니다. 여기에서 보듯이, 대조군에서는 네트에 대한 암세포 접착에 변화가 없었습니다.그러나 DNAse가 존재할 때 그물망(nets)에 대한 암세포 부착이 유의미하게 감소했습니다. 이 영상을 시청한 후에는 전혈에서 그물망을 분리하고 처리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이렇게 분리된 세포 없는 그물망 분리물은 면역형광법, 공초점 현미경법, 전자 현미경법 및 웨스턴 블로팅을 포함한 다양한 기술에 사용될 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

호중구 세포 트랩 (그물) 병원성 박테리아, 곰팡이 및 기생충에 대항하는 중요한 타고난 면역 메커니즘입니다. 여기 우리는 인간의 피를에서 호중구 granulocytes을 분리하고 그물을 형성 그들을 활성화하는 방법을 설명합니다. 우리는 빛과 전자 현미경의 그물을 시각화하기 위해 준비 기술을 제시한다.

호중구 세포 트랩 : 그들을 생성 및 시각화하는 방법

이 비디오는 호중구 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 분리하는 시험관 기술을 보여줍니다. 호중구는 말초 혈액에서 분리되고 phorbol myristate acetate (PMA)로 자극되어 NET을 생성합니다. 배양 과정에서 호중구는 세포 사멸 과정(NETosis)을 거쳐 과립 세포질 단백질과 혼합된 응축된 염색질로 구성된 NET을 방출합니다.

인간 호중구 세포 외 트랩을 생성하는 In vitro 기술

이 비디오는 항호중구 세포질 항체가 포함된 환자 혈청을 사용하여 사전 라벨링된 호중구에서 호중구 세포외 트랩 또는 NET의 유도 및 시각화를 보여줍니다. 또한 불침투성 DNA 염료와 형광 현미경을 사용하면 NET을 시각화할 수 있습니다.

Induction and Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Pre-Labeled Neutrophils

여기, 우리는 인간의 저밀도 호 중구 (LDN), 수술 후 복 막 게 액체에서 회복 대규모 호 중구 extracellular 함정 (그물)를 생산 하 고 이후에 성장 하는 무료 종양 세포를 효율적으로 트랩 방법을 제시.

호 중구 Extracellular 함정 밀도가 낮은 호 중구에 의해 생성 된 종양 세포 성장 및 첨부 파일 중재 하십시오 복 막 게 액체에서 얻은

여기에서는 면역형광 이미지에서 NET를 정량화하기 위한 완전 자동 소프트웨어 옵션인 NEUTrophil 세포 외 트랩(NET)을 생성하고 NETQUANT를 운영하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

NETQUANT를 사용한 호중구 세포외 트랩의 자동 이미지 기반 정량화

이 프로토콜 면역 형광 3 차원 confocal 현미경 검사 법에 의해 ex vivo 그물 형성의 반자동된 정량화에 대 한 매우 민감하고 높은 처리량 호 중구 extracellular 함정 (그물) 분석 결과를 설명합니다. 이 프로토콜 네트워크 형성 및 다른 자극 후 저하를 평가 하는데 사용 될 수 있습니다 그리고 잠재적인 NET 타겟 치료를 공부 하는 데 사용할 수 있습니다.

평가 하 고 호 중구 Extracellular 함정 대형 계량 높은 처리량 분석 결과

호중구 세포 외 트랩 (NETs)은 자극 된 호중구 과립구에 의해 생성 된 3 차원 구조입니다. 최근 몇 년 동안 NET가 다양한 질병에 관여하고 있음이 분명해졌습니다. 조직에서 NET를 검출하는 것은 진단 관련성이 있을 수 있으므로 NET 성분을 라벨링하기 위한 표준화된 프로토콜이 필요합니다.

파라핀 내장 된 조직에서 인간과 뮤린 호중구 세포 외 트랩의 면역 형광 라벨링

여기에 제시된 것은 시험관 내 호중구 세포 외 트랩 (NET)의 유도 및 분석을위한 프로토콜입니다. DNA, 카텔리시딘(LL37) 및 효소 활성의 정량화는 유사한 통제 조건에서 미생물 및 화학적 자극에 의해 유도된 NET의 구성 및 형태의 가변성을 보여주는 데이터를 산출했습니다.

미생물 및 화학적 자극에 의해 유도 된 호중구 세포 외 트랩의 형태 학적 및 조성 분석

이 연구는 쥐의 골수에서 풍부한 호중구 세포외 트랩(NET)을 분리하는 두 가지 기술을 간략하게 설명합니다. 한 가지 방법은 상용 호중구 분리 키트와 밀도 구배 원심분리를 결합하는 반면, 다른 방법은 밀도 구배 원심분리만 사용합니다. 두 접근법 모두 말초 혈액 호중구의 NET을 능가하는 기능적 NET을 산출합니다.

비슷한 용량의 쥐 골수 호중구를 분리하기 위한 독특한 접근법

당사는 막 투과성 의존성 이중 염료 접근법과 결합된 살아있는 세포 분석 시스템을 활용하여 호중구 세포외 트랩(NET)을 정량화하는 자동화된 고처리량 방법을 제시합니다.

인간 호중구에서 호중구 세포외 트랩 형성을 정량화하기 위한 실시간 고처리량 기법

이 정의된 프로토콜은 in vitro에서 인간 호중구 세포외 트랩(NET) 방출을 시각화하고 정량화하기 위한 실시간 고처리량 현미경 접근 방식을 설명합니다. 재현 가능한 방법을 통해 뚜렷한 NETosis 유도 인자를 자극 시 NET 방출의 특성과 동역학을 조사할 수 있으며 NETosis 길항제의 약리학을 평가할 수 있습니다.

Human Neutrophil Extracellular Trap release의 실시간 고처리량 현미경 정량화 및 길항제의 약리학 평가

학습하세요 인간 전혈에서 호중구 세포 외 트랩(NETs)을 분리하는 간단한 방법을. 차등 원심분리와 PMA 자극을 통해 NETosis를 유도하고, 암세포 부착 실험에 활용할 수 있습니다.

단순화 된 인간 호중구 세포 외 트랩 (그물)의 분리 및 처리

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