3 차원 조직 공학 인간의 식도 점막 모델의 제조, 특성 및 사용 가능성

이 절차의 전반적인 목표는 실험 플랫폼으로 사용하기 위해 인간 식도 상피의 3D 조직 엔지니어링 모델을 제작하는 것입니다. 이는 먼저 인간 식도 조직 샘플에서 정상적인 인간 식도 섬유아세포와 상피 세포를 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 섬유아세포를 상피 세포, 기공 기호, 식도 골격에 파종하고 7일 동안 배양합니다.

다음으로, 골격을 뒤집고 분리된 인간 식도 상피 세포를 4일 동안 배양에 추가합니다. 마지막 단계에서는 모델을 공기 액체 계면으로 이동하여 5일 동안 추가로 배양하여 성숙한 성층 상피가 발달할 수 있도록 합니다. 궁극적으로, 면역조직화학(immunohistochemistry)은 모델 상피 세포에 의해 발현되는 증식 및 분화의 핵심 마커를 특성화하는 데 사용됩니다.

기존 2D 세포 배양에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포가 생체 내에서 가질 수 있는 세포, 세포 및 세포 기질 상호 작용을 할 수 있다는 것입니다. 그리고 이 기술을 사용하면 정상 식도와 유사한 성숙한 성층 편평 상피를 생성할 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 세 가지 이유로 어려움을 겪을 것입니다.

첫째, 대부분의 상피 세포가 골격에 포함되기 전에 분화하지 않도록 하는 것이 어려울 수 있습니다. 둘째, 상피가 성숙하는 기간 동안 올바른 공기 액체 계면이 제공되도록 주의를 기울여야 합니다. 셋째, 배양 기간 동안 유대감을 유지하는 것은 어려울 수 있습니다.

인간의 식도 상피 세포를 분리하려면 적출된 식도 편평 점막 조직을 멸균된 페트리 접시에 넣고 에탄올 살균 메스를 사용하여 조직을 0.5cm 스트립으로 자릅니다. 그런 다음 섭씨 37도에서 덮인 0.1% tryin에서 조직을 배양하고 5ml의 FCS로 1시간 후에 소화를 중지합니다. 다음으로, 겸자로 스트립을 잡고 메스 블레이드로 상피 표면을 스트립당 1-2분 동안 부드럽게 긁어 상피 세포를 주변 배지로 제거한 후 모든 스트립을 긁어낸 후 분리된 상피 세포를 포함하는 배지를 15ml 원심분리 튜브로 옮깁니다.

세포를 회전시킨 후 센나를 버리고 펠릿을 12ml의 상피 배지에 재현탁시킵니다. 그런 다음 페터 세포 배양에서 배지를 버리고 멸균 피펫을 사용하여 피더 세포의 상피 세포를 플레이트링하여 인간 식도 섬유아세포를 분리합니다. 긁어낸 조직 스트립을 멸균 페트리 접시에 옮기고 마지막으로 메스로 조직을 다집니다.

10ml의 0.5% 콜라겐 분해효소(섭씨 37도에서 덮인 용액)와 5% 이산화탄소를 밤새 가습된 분위기로 소화합니다. 다음 날, 분해물을 50ml 원심분리 튜브에 옮기고 세포를 스핀다운합니다. 섬유아세포 배양 배지 10밀리리터에서 입천장을 현탁시키는 Resus.

세포 배양 인큐베이터의 T 75 플라스크 내 배양. 탈세포화된 돼지 식도 골격을 준비하려면 먼저 가위와 핀셋을 사용하여 돼지 식도를 세로로 절단합니다. 다음으로, 100ml의 멸균 PBS가 들어 있는 180ml 멸균 냄비에 식도를 10분 동안 부드럽게 흔들어 조직을 헹구는 동안 이물질을 제거합니다.

코르크 마개가 식도에서 건조되면 코르크 해부 보드에 70% 에탄올을 점막 면이 위로 향하게 하여 보드에 뿌립니다. 이제 멸균 핀셋을 사용하여 식도의 한쪽 끝에 있는 점막 표면을 잡고 보드에서 조직을 당겨 점막과 점막하를 분리합니다. 그런 다음 멸균 메스 칼날을 사용하여 lanar propria를 따라 식도를 세로로 절개하고 박리가 진행됨에 따라 핀을 제거하여 점막을 들어 올릴 수 있습니다.

밑에 있는 점막하를 버리고 메스를 사용하여 남은 점막을 5cm 정사각형 조각으로 자릅니다. 방금 시연한 것처럼 부드러운 교반으로 150ml의 멸균 PBS로 조각을 씻습니다. 5분 후, 150ml의 염화몰 용액 1개가 들어 있는 180ml 냄비에 조직을 옮깁니다.

37도에서 항생제를 보충합니다. 72시간 후, 조직을 150ml의 멸균 PBS로 옮기면 상피가 기본 조직에서 눈에 띄게 분리되기 시작합니다. 멸균 겸자와 메스 날을 사용하여 분리되는 상피를 제거하고 남은 조직을 150ml의 멸균 PBS가 담긴 새 냄비에 넣고 부드러운 교반으로 5분 동안 3회 세척한 후 조직을 최소 4개월 동안 글리세롤에 보관해야 합니다.

골격을 완전히 살균하려면 최소 4개월 동안 글리세롤로 멸균된 돼지 골격 조각을 재수화하여 식도 점막 모델을 준비하십시오. 100 밀리리터의 멸균 PBS에서 5, 10 분 동안 교반합니다. 세척할 때마다 supinate를 새 PBS로 교체합니다.

다섯 번째 교반 테스트 후 섭씨 37도에서 100밀리리터의 DMEM에서 하룻밤 동안 배양하여 비계 무균 상태를 수행했습니다. 다음날 아침, 골격을 점막하 면이 위로 향하는 6개의 웰 플레이트 개별 웰로 옮깁니다. 그런 다음 멸균 의료용 스테인리스 스틸 링을 각 골격의 중앙에 놓고 멸균 집게를 사용하여 링을 부드럽게 눌러 조직이 5번 적절하게 밀봉되도록 합니다.

5개의 인간 식도 섬유아세포를 0.2밀리리터의 섬유아세포가 각 고리의 중앙으로 중앙에 위치시킵니다. 그런 다음 고리 바깥쪽 영역을 최소 2밀리리터의 섬유아세포 배지로 가득 채우고 세포 배양 인큐베이터에서 골격을 배양합니다. 24시간 후, 고리를 제거하고 각 웰의 배지를 최소 5ml의 새로운 섬유아세포로 교체합니다.

중간, 비계가 완전히 잠기도록 주의하십시오. 일주일 후, 매체를 버리고 집게를 사용하여 골격 점막 표면이 위로 향하게 뒤집습니다. 고리를 골격에 다시 놓은 다음 0.2 밀리리터의 복합 배지에 6 개의 상피 세포의 한 시간 중심을 각 고리의 중심에 하나씩 추가합니다.

링 외부 영역을 약 2ml의 복합 매체 1로 막고 구조물을 인큐베이터에 다시 넣습니다. 24 시간 후, 고리를 제거하고 각 웰의 매체를 최소 5 밀리리터의 새로운 복합 매체로 교체하여 골격이 완전히 잠겼는지 확인합니다. 다시 24시간 후에 매체를 최소 5ml의 복합 배지로 교체하십시오. 2.

넷째 날에는 멸균 의료용 스테인리스 스틸 메쉬 그리드를 새로운 6개의 웰 플레이트의 우물에 배치하고 구조물을 그리드 점막 쪽이 위로 향하게 하여 옮깁니다. 마지막으로, 표면을 공기에 노출된 상태로 유지하면서 복합재의 아래쪽에 도달할 수 있는 충분한 복합 매체 3개를 추가하여 샘플이 공기 액체 계면에서 유지되도록 합니다. 절차에서 가장 까다로운 부분은 공기 액체 인터페이스를 설정하는 것입니다.

그리드가 액체 상태인지 여부가 명확하지 않은 경우 파이프가 물에 잠겨 있는지 더 쉽게 확인할 수 있으므로 파이프 팁에 대한 멸균 장치와 접촉합니다. 또는 플레이트가 움직일 때 액체를 더 쉽게 볼 수 있으므로 플레이트를 부드럽게 흔들어 보고 그리드에 액체가 있고 샘플을 덮고 있지 않은지 확인할 수 있습니다. 이것은, 상피에 대한 논리적 평가는 성숙한 다층화된 층화된 편평 상피를 나타내며, 정상적인 인간 식도에서 관찰되는 것과 유사하지만 더 얇으며, 세포는 표면을 향해 이동함에 따라 점진적으로 평평해지고 궁극적으로 핵이 됩니다.

증식 및 분화의 주요 마커에 대한 면역조직화학적 특성화는 모델 상피의 미세해부학적 구조가 정상적인 인간 식도 상피의 미세해부학적 구조와 유사함을 보여줍니다. 예를 들어, 유사한 사이토케라틴 14 발현은 천연 식도와 모델 상피 모두에서 관찰되며, 염색은 기저층의 세포로 제한됩니다. 이 모델은 일차 상피 세포를 암종 세포로 대체하여 종양 세포를 통합하도록 성공적으로 수정되어 모델의 유연성을 입증했습니다.

예를 들어, 편평 암종 세포는 상피 내에 큰 균열이 있는 정의된 노란색 영역으로 구성물에서 볼 수 있는 상피를 생성하며, 이는 모델 내의 식도 선암 세포를 포함한 기능 장애 셀리아 분자의 존재를 반영하는 것으로 보이며, 그 결과 골격이 얇아짐으로 눈에 보이는 많은 양의 골격 저하가 발생합니다. 공기 액체 계면에서 2주간의 성장 후 h 및 e 분석에서 세포 아래 영역의 골격 두께가 명백하게 감소하는 것으로 확인된 후 이 절차에 따라 북부 또는 서부 블로팅과 같은 다른 유전자 발현 방법을 동일한 조직에 적용하여 다음과 같은 질문에 답할 수 있습니다. 상피는 환경 스트레스에 어떻게 반응합니까? 따라서 이것은 개발 후 더 많은 질문을 더 깊이 살펴볼 수 있는 정말 귀중한 리소스를 제공합니다.

이 기술은 Barrett's Metaplasia에 관심이 있는 연구자들이 정상적인 인간 식도의 유전자 발현에 대한 특정 역류 성분 노출의 영향을 연구할 수 있는 길을 열었습니다.