EAE와 쥐의 중추 신경계에서 Mononuclear 세포의 분리

안녕하세요, 저는 Christine Beaton입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스의 생리학 및 생물물리학과 George Chen 교수 연구실의 보조 연구원입니다. 오늘은 쥐의 중추 신경계에서 단핵구를 분리하는 방법을 보여드리겠습니다.

본 절차에서는 중추신경계에 잔류 혈액이 남지 않도록 쥐를 깊게 마취시킨 후 심장 관류를 수행합니다. 이후 뇌와 척수를 적출하고 셀 스트레이너(cell strainer)를 사용하여 단일 세포 현탁액을 만든 다음, 퍼콜(percoll) 이중 층 밀도 구배 원심분리를 통해 단핵구를 분리합니다. 그럼 시작해 보겠습니다.

이제 심장 관류를 시작할 준비가 되었으므로, 이에 필요한 모든 재료를 보여드리겠습니다. 우선 벨 자(Bell jar)가 필요하며, 바닥에는 휘발성 마취제가 적셔진 종이 타월을 놓았습니다. 할레인(halothane)이나 이소플루레인(isoflurane)을 사용할 수 있습니다.

다음으로 필요한 것은 쥐를 고정할 장치와 혈액을 수집할 도구입니다. 여기 쥐를 관류하기 위한 임시 설치 장치가 준비되어 있습니다. 21 gauge 바늘을 사용하며, IV 관류 시스템을 통해 중력으로 공급되는 식염수를 관류할 것입니다.

해당 시스템을 사용할 수 없는 경우에는 여러 개의 시린지에 식염수를 채워 수동으로 관류할 수도 있습니다. 하지만 이 방법이 훨씬 더 간편합니다. 또한 Kim wipes를 넣은 10 mL 시린지 배럴이 필요합니다.

그리고 절차 동안 쥐가 깊은 마취 상태를 유지할 수 있도록 코에 바를 마취제를 약간 넣겠습니다. 그리고 당연히 기구들이 필요합니다. 오늘은 세포를 배양할 것이 아니기 때문에 무균 절차로 진행하지 않겠습니다.

제가 현재 사용하고 있는 모든 기구들은 멸균 상태가 아닙니다. 하지만 당연히 세포를 배양하려는 경우에는 멸균된 기구를 사용해야 합니다. 본 영상의 목적을 위해, 저는 이미 죽은 쥐를 사용하겠습니다.

따라서 여러분께 단계별로 보여드리기 위해 절차를 천천히 진행하겠습니다. 물론 실제 시술에서는 쥐가 죽지 않으면서도 깊게 마취된 상태여야 합니다. 심장이 계속 뛰고 있어야 합니다.

이제 이 쥐를 가지고 시작해 보겠습니다. 쥐의 등이 저를 향하지 않도록 눕혀 놓고, 코 위에 적신 티무(team) 와이프를 올렸습니다. 그런 다음 가장 먼저 쥐가 깊게 마취되었는지 확인하겠습니다.

따라서 각 절차를 수행하기 전에 이 과정을 거쳐야 합니다. 핀셋으로 쥐를 집어 보았을 때 아무런 반응이 없어야 합니다. 만약 반응이 있다면, 쥐를 다시 벨저(belger)에 넣어 깊게 마취되었는지 확인해야 합니다.

그런 다음 70% ethanol을 사용하여 쥐의 상반신을 담급니다. 그리고 흉강을 개방하겠습니다. 우선 피부를 절개하여 옆으로 젖혀 열겠습니다.

그런 다음 공동 자체를 절개하겠습니다. 여기 있는 이 덩어리가 심장입니다. 여기에서 우심방을 확인하실 수 있습니다.

혈액이 흘러나올 수 있도록 이 부분을 절개하겠습니다. 그다음 전신에 관류시키기 위해 좌심실에 바늘을 삽입해야 합니다. 따라서 바로 이 위치에 바늘을 삽입하겠습니다.

바늘을 삽입한 후, IV 튜브를 열어 식염수가 흐르게 하고 5~10분 동안 그대로 둡니다. 관류가 잘 이루어지면 붉은 맥박과 코, 그리고 당연히 쥐의 눈 색깔이 변하는 것을 볼 수 있으며, 이는 혈액이 쥐의 몸에서 빠져나가고 있음을 나타냅니다. 따라서 이는 관류가 양호하게 진행되고 있음을 의미합니다.

심장 관류 후의 쥐의 모습입니다. 보시는 바와 같이 이 쥐의 코, 귀, 눈이 더 이상 분홍색이나 붉은색이 아닙니다. 완전히 하얗게 변했는데, 이는 관류가 잘 이루어졌음을 보여줍니다.

혈액의 전부 또는 대부분이 쥐의 몸에서 빠져나갔습니다. 이제 쥐의 심장 관류가 완료되었으므로, 머리를 절단해야 합니다. 쥐를 안락사시키기 위해 참수하겠습니다.

이를 위해 일반적인 실험 장비를 사용하겠습니다. 이제 쥐의 뇌를 적출하겠습니다. 털이 사방에 날리는 것을 방지하기 위해 70% ethanol로 털을 충분히 적셔주겠습니다.

그 다음 먼저 피부를 제거하겠습니다. 뇌를 조직학적 분석에 사용할 계획이 아니며 작은 조각으로 자를 예정이므로, 깨끗하게 꺼내는 것에 크게 주의를 기울이지는 않겠습니다. 한 번에, 뇌가 척수와 연결되는 바로 여기 두개골 기저부에 가위를 넣겠습니다.

양쪽 뼈를 절개한 다음 상단을 제거하겠습니다. 이 과정을 반복해서 수행합니다. 이제 뇌가 완전히 노출되었습니다.

보시는 바와 같이, 뇌가 완전히 투명하므로 관류가 잘 이루어졌음을 알 수 있습니다. 관류가 되지 않은 동물의 경우, 뇌의 최상층이 붉은 혈관, 즉 붉은 혈액 모세혈관으로 완전히 덮여 있는 것을 볼 수 있는데, 지금은 전혀 보이지 않으므로 관류가 성공적으로 진행된 것입니다. 이제 후각구(olfactory bulb)가 남지 않도록 주의하며 뇌를 걷어내어, 차가운 PBS가 들어 있는 튜브에 넣겠습니다.

이제 뇌의 형태를 온전하게 유지하는 것에 너무 신경 쓰지 않고, 뇌를 PBS가 든 튜브에 넣은 다음 시신경을 절단하겠습니다. 그다음 스패출러를 사용하면 뇌가 매우 쉽게 빠져나옵니다. 이제 동일한 쥐에서 척수를 제거하겠습니다. 이 경우에도 척수를 작은 조각으로 자를 예정이므로, 전체를 모두 추출할 수만 있다면 매우 깨끗하게 꺼내는 것에 너무 주의를 기울이지 않겠습니다.

먼저 척추를 따라 피부를 절개하며, 여기서 척추가 보입니다. 그런 다음 척추가 전체적으로 노출되도록 주변의 근육 조직을 제거하겠습니다. 바로 이곳에서 척수를 확인할 수 있습니다.

마우스의 경우, 양 끝을 절개하고 주사기로 PBS를 주입하면 척수가 거의 한 덩어리로 밀려 나옵니다. 하지만 쥐(rat)는 그렇게 간단하지 않습니다. 절개하여 척수를 직접 걷어내야 합니다.

이제 양측을 절개하고, 뇌에서 했던 것과 마찬가지로 뼈를 절개하여 제거함으로써 척수를 노출시킵니다. 뇌와 마찬가지로 척수가 완전히 하얗게 보이는데, 이는 심장 관류가 잘 이루어졌음을 나타냅니다. 척추 전체를 따라 이 과정을 수행하겠습니다.

그런 다음 오른쪽 고관절 높이인 이 지점까지 내려갑니다. 이제 핀셋을 사용하여 — 보기에 좋지는 않겠지만 — 척수를 뽑아내어 뇌가 들어 있는 튜브에 함께 넣겠습니다. 이제 튜브에 쥐의 뇌와 척수가 모두 들어갔으므로, 단일 세포 현탁액을 준비할 준비가 되었습니다.

이제 중추신경계로부터 단일 세포 현탁액을 준비하겠습니다. 이를 위해 10 centimeter 페트리 접시와 그 안에 배치할 70 micron 세포 스트레이너가 필요합니다. 또한 1 mL 주사기의 플런저를 사용할 것이며, 핀셋과 가위가 필요합니다.

이제 샘플을 세포 스트레이너(cell strainer)에 넣고 튜브에 남은 것이 없는지 확인하겠습니다. 그다음 뇌와 척수를 함께 섞어 작은 조각으로 자릅니다. 모든 조직이 충분히 다져지면, 오닐 시린지(oneill syringe)의 플런저를 사용하여 이를 밀어 넣겠습니다.

단일 세포들이 통과함에 따라 세포 트레이너 외부의 PBS가 점차 탁해지는 것을 확인하실 수 있습니다. 물론 세포 현탁액을 섞어야 한다면, 당연히 조직 배양 후드 내에서 작업을 수행하고 손가락을 넣지 않을 것입니다. 이제 PBS가 탁해졌으므로, 이를 처음으로 수집하여 50 mil 튜브에 넣겠습니다.

하지만 계속 주의 깊게 살피면서, 셀 스트레이너(cell trainer)에 PBS를 더 추가하고 계속해서 밀어내겠습니다. 중추신경계(CNS)는 지방 함량이 매우 높기 때문에, 이 기법을 사용하여 세포 현탁액을 준비하기 가장 어려운 장기 중 하나입니다. 따라서 저는 모든 CNS 조직을 셀 스트레이너로 여러 번 통과시켜 단일 세포 현탁액을 모두 수집했습니다.

여기 우측 CNS에서 준비한 단일 세포 현탁액을 PBS로 50 mL까지 채운 튜브가 있습니다. 이제 농도 구배 준비를 위해 이 튜브를 원심 분리하겠습니다. 원심 분리가 완료되었습니다. 현재 펠렛이 형성되었으므로, 상층액을 제거하고 30% Percoll/PBS 용액 20 mL에 세포를 다시 현탁하겠습니다.

그리고 이를 PBS 내의 70% perkel 10 µL 위에 겹쳐서 migration을 유도하겠습니다. 따라서 SuperNet은 폐기합니다. 셀이 펠릿 형태로 뭉쳐 있지 않고 단일 현탁액 상태가 되도록 펠릿을 풀어줍니다.

이제 단일 세포 부유액 상태의 CNS 세포를 준비했습니다. 이 세포들을 PBS에 희석한 30% Percoll 20 mL에 부유시킨 후, 이를 PBS에 희석한 70% Percoll 10 mL 위에 층을 이루어 얹겠습니다. 그 다음 원심분리하겠습니다.

이제 20 mL의 CNS 현탁액을 취하여, 작업의 편의를 위해 70% Percoll 층 위에 천천히 층을 형성하겠습니다. 또한 층 중 하나에 페놀 레드(phenol red)와 같은 염료를 추가할 수도 있지만, 이것이 세포에 어떤 영향을 미치는지 확실하지 않으므로 저는 가급적 사용하지 않으려 합니다.

두 층이 섞이지 않도록 충분히 천천히 주입해야 하므로, 하단 층에 큰 와류가 발생하지 않도록 주의하십시오. 상단 층이 두꺼워질수록 주입 속도를 높일 수 있습니다. 이제 농도 구배에 세포를 첨가하였습니다.

여기 아래쪽의 투명한 층은 70% Percoll 층이며, 위쪽의 뿌연 층은 단일 세포 현탁액이 포함된 30% Percoll 층입니다. 이제 이 튜브를 원심분리기에 넣고 20분 동안 회전시키면, 실험이 잘 되었을 경우 단핵구 세포 층을 확인할 수 있습니다. 이제 밀도 구배 원심분리를 마쳤습니다.

따라서 항상 그렇듯이, 농도 구배를 형성하기 위해 원심분리하며, 이때 브레이크를 꺼서 너무 빠르게 감속되어 구배가 흐트러지지 않도록 매우 주의하십시오. 이제 층이 형성되었습니다. 구배 상단에는 지방층이 있는데, 세포 현탁액의 오염을 방지하기 위해 이 층을 제거하겠습니다.

그리고 Perkel 30%와 70%의 두 층 사이의 계면을 보면, 계면이 뚜렷하지 않고 모호한 것을 볼 수 있는데 바로 그곳에 세포들이 있습니다. 세포를 제거하고 나면 계면이 훨씬 더 뚜렷해질 것입니다. 따라서 상층부의 지방 대부분을 제거하여 폐기통에 버리겠습니다.

전부 제거할 필요는 없지만, 단핵세포를 채취하기 위해 내려갔을 때 피펫이 완전히 코팅되지 않을 정도로만 충분히 제거하고자 합니다. 이제 다른 전송 피펫을 사용하여 인터페이스 높이까지 내려가 세포를 수확하겠습니다. 이제 인터페이스에서 수 밀리리터(mL)를 수집했습니다.

따라서 얻을 수 있는 모든 세포를 확보한 것으로 보입니다. 해당 CNS 내의 단핵 세포 수는 매우 적었습니다. 이제 튜브에 단핵 세포들이 준비되었습니다.

튜브에 PBS를 50 mL까지 채운 후, 세포를 원심 분리하여 펠렛(pellet)으로 만들면 펄(perle)이 씻겨 나갑니다. 모든 펄을 완전히 제거하기 위해 PBS를 튜브 가득 채워 최소 두 번 이상 세척하는 것을 권장합니다. 그러면 세포는 이후 수행하고자 하는 모든 실험 절차에 사용할 준비가 됩니다.

오늘 저는 쥐의 중추신경계에서 단핵구를 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 물론, 이러한 단핵구를 확보한 후에는 추가 정제 과정을 통해 해당 세포군에서 예를 들어 T 림프구를 분리할 수 있습니다. 저는 이 세포들을 사용하여 유세포 분석법을 수행함으로써 제 뇌에 존재했던 세포군을 검출할 예정입니다.

세포 분리 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.