Name: EAE와 쥐의 중추 신경계에서 Mononuclear 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-04T04:23:00.000+00:00
Duration: 20 min 51 s
Description: 배우세요 쥐 중추신경계에서 단핵세포를 분리하는 방법을 심장관류와 Percoll 밀도구배법을 사용하여. 혈액 오염을 최소화하고 유세포분석이나 세포배양에 적합한 세포를 얻을 수 있습니다.

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<ol><li> 깊이 쥐가 마취. 70 % 에탄올로 스프레이하고 혈관에서 세포를 (좌심실을 통해 오른쪽 심방과 perfuse를 잘라)를 제거하는 10 분 PBS와 심장 재관류 해. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS를 포함하는 50 ML 튜브의 뇌 및 척수 및 장소를 제거합니다. 얼음처럼 차가운 PBS 10 ML을 포함 10cm 배양 접시에 놓인 70mm 셀 스트레이너의 뇌 및 척수를 자르고. 살균 한 ML 주사기의 플런저의 뒷면을 사용하여 셀 스트레이너를 통해 기관의 각 조각을 누르십시오. 얼음에 50 ML 튜브에 단일 세포 현탁액를 수집합니다. PBS로 세포 스트레이너를 씻고 솔루션은 분명 때까지 튜브에 추가할 수 있습니다. </li><li> G. 390에 80-10 분 원심 분리기 </li><li> PBS + 70 % Percoll 10 ML에 20 ML PBS + 30 % Percoll과 오버레이에있는 세포를 Resuspend. </li><li> 상온 20 분 390g에 원심 분리기. </li><li> 튜브의 상단에있는 지방을 제거합니다. 인터페이스에서 세포를 수집하고 PBS로 두 번 씻는다. 백작. </li></ol>

<ol><li>Beeton, C., Chandy, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+clinical+scoring+of+chronic-relapsing+experimental+autoimmune+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Induction and clinical scoring of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis.</a> Journal of Visualized Experiments. 5, Forthcoming.</li>
</ol>

이 절차는, 살아있는 동물과 관련된 모든 절차로, 귀하의 기관의 동물 사용 및 관리위원회의 승인을 받아야합니다. 우리는 전에와 절차를 수행하는 동안 동물에 주어집니다 마취의 충분한 수준을 보장하기 위해 최초의 심장병 perfusions을 수행할 때 수의사 또는 동물 기술자가 존재하는 것이, 그리고 동물들이 불필요 통증이나 고통을 받아야하지 않는 것이 좋습니다.

<table><tbody><tr><td>PBS, 1x, 멸균</td><td>시약</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>세포 스트레이너, 70 um</td><td>도구</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>시약</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1644</td><td></td></tr></tbody></table>

eae와 쥐의 중추 신경계에서 mononuclear 세포의 분리

Isolation of Mononuclear Cells from the Central Nervous System of Rats with EAE

이러한 실험 면역 encephalomyelitis (EAE, 1), 또는 급성 회백수염, 라임 neuroborreliosis 또는 neurosyphilis로 CNS의 감염에 대한 면역 반응으로 중추 신경계 (CNS)에 감독 면역 질환을 공부하든, 그것은 자주 CNS - 침투 면역 세포를 분리하는 데 필요한. 이 비디오 프로토콜에서 우리는 EAE와 암흑의 CNS에서 mononuclear 세포 (MNCs) 분리하는 방법을 보여줍니다. 이 절차의 첫 단계는 피를 CNS 물을 대는 혈관에 남아하지 않도록 생리 식염수와 설치류의 심장 재관류가 필요합니다. 모든 혈액 오염 인공적으로 명백한 CNS - 침투 MNCs의 수를 증가하고 침투해 면역의 명백한 구성을 변경할 수도 있습니다. 그렇다면 우리는 단일 세포 현탁액을 준비하는 후속 dilaceration에 대한 쥐의 두뇌 및 척수를 제거하는 방법을 보여줍니다. 이 정지는 MNCs을 분리하기 위해 두 계층 Percoll 기울기에 구분합니다. 세척 후,이 세포가 모든 필요한 절차를 거쳐 준비가 된 것입니다. 이 프로 시저를 사용하여 격리 Mononuclear 세포가 가능한하고 전기 생리학, 유동세포계측법 (외과), 또는 생화학 사용할 수 있습니다. 기술은 멸균 조건하에 수행되는 경우 (조직 문화 후드에 살균 장비를 사용) 세포도 조직 문화 매체 재배하실 수 있습니다. 주어진 세포 인구는 더욱 자기 분리 절차 또는 외과 중 하나를 사용하여 정화하실 수 있습니다.

이 비디오에서는 실험자가 면역 질환 encephalomyelitis와 쥐의 중추 신경계에서 mononuclear 세포를 분리하는 방법을 보여줍니다.

EAE와 쥐의 중추 신경계에서 Mononuclear 세포의 분리

실험적 자가면역성 뇌척수염(EAE, 1)과 같이 중추신경계(CNS)를 대상으로 하는 자가면역 질환을 연구하든, 또는 ...

안녕하세요, 저는 Christine Beaton입니다. 저는 캘리포니아 대학교 어바인 캠퍼스의 생리학 및 생물물리학과 George Chen 교수 연구실의 보조 연구원입니다. 오늘은 쥐의 중추 신경계에서 단핵구를 분리하는 방법을 보여드리겠습니다.본 절차에서는 중추신경계에 잔류 혈액이 남지 않도록 쥐를 깊게 마취시킨 후 심장 관류를 수행합니다. 이후 뇌와 척수를 적출하고 셀 스트레이너(cell strainer)를 사용하여 단일 세포 현탁액을 만든 다음, 퍼콜(percoll) 이중 층 밀도 구배 원심분리를 통해 단핵구를 분리합니다. 그럼 시작해 보겠습니다.이제 심장 관류를 시작할 준비가 되었으므로, 이에 필요한 모든 재료를 보여드리겠습니다. 우선 벨 자(Bell jar)가 필요하며, 바닥에는 휘발성 마취제가 적셔진 종이 타월을 놓았습니다. 할레인(halothane)이나 이소플루레인(isoflurane)을 사용할 수 있습니다.다음으로 필요한 것은 쥐를 고정할 장치와 혈액을 수집할 도구입니다. 여기 쥐를 관류하기 위한 임시 설치 장치가 준비되어 있습니다. 21 gauge 바늘을 사용하며, IV 관류 시스템을 통해 중력으로 공급되는 식염수를 관류할 것입니다.해당 시스템을 사용할 수 없는 경우에는 여러 개의 시린지에 식염수를 채워 수동으로 관류할 수도 있습니다. 하지만 이 방법이 훨씬 더 간편합니다. 또한 Kim wipes를 넣은 10 mL 시린지 배럴이 필요합니다.그리고 절차 동안 쥐가 깊은 마취 상태를 유지할 수 있도록 코에 바를 마취제를 약간 넣겠습니다. 그리고 당연히 기구들이 필요합니다. 오늘은 세포를 배양할 것이 아니기 때문에 무균 절차로 진행하지 않겠습니다.제가 현재 사용하고 있는 모든 기구들은 멸균 상태가 아닙니다. 하지만 당연히 세포를 배양하려는 경우에는 멸균된 기구를 사용해야 합니다. 본 영상의 목적을 위해, 저는 이미 죽은 쥐를 사용하겠습니다.따라서 여러분께 단계별로 보여드리기 위해 절차를 천천히 진행하겠습니다. 물론 실제 시술에서는 쥐가 죽지 않으면서도 깊게 마취된 상태여야 합니다. 심장이 계속 뛰고 있어야 합니다.이제 이 쥐를 가지고 시작해 보겠습니다. 쥐의 등이 저를 향하지 않도록 눕혀 놓고, 코 위에 적신 티무(team) 와이프를 올렸습니다. 그런 다음 가장 먼저 쥐가 깊게 마취되었는지 확인하겠습니다.따라서 각 절차를 수행하기 전에 이 과정을 거쳐야 합니다. 핀셋으로 쥐를 집어 보았을 때 아무런 반응이 없어야 합니다. 만약 반응이 있다면, 쥐를 다시 벨저(belger)에 넣어 깊게 마취되었는지 확인해야 합니다.그런 다음 70% ethanol을 사용하여 쥐의 상반신을 담급니다. 그리고 흉강을 개방하겠습니다. 우선 피부를 절개하여 옆으로 젖혀 열겠습니다.그런 다음 공동 자체를 절개하겠습니다. 여기 있는 이 덩어리가 심장입니다. 여기에서 우심방을 확인하실 수 있습니다.혈액이 흘러나올 수 있도록 이 부분을 절개하겠습니다. 그다음 전신에 관류시키기 위해 좌심실에 바늘을 삽입해야 합니다. 따라서 바로 이 위치에 바늘을 삽입하겠습니다.바늘을 삽입한 후, IV 튜브를 열어 식염수가 흐르게 하고 5~10분 동안 그대로 둡니다. 관류가 잘 이루어지면 붉은 맥박과 코, 그리고 당연히 쥐의 눈 색깔이 변하는 것을 볼 수 있으며, 이는 혈액이 쥐의 몸에서 빠져나가고 있음을 나타냅니다. 따라서 이는 관류가 양호하게 진행되고 있음을 의미합니다.심장 관류 후의 쥐의 모습입니다. 보시는 바와 같이 이 쥐의 코, 귀, 눈이 더 이상 분홍색이나 붉은색이 아닙니다. 완전히 하얗게 변했는데, 이는 관류가 잘 이루어졌음을 보여줍니다.혈액의 전부 또는 대부분이 쥐의 몸에서 빠져나갔습니다. 이제 쥐의 심장 관류가 완료되었으므로, 머리를 절단해야 합니다. 쥐를 안락사시키기 위해 참수하겠습니다.이를 위해 일반적인 실험 장비를 사용하겠습니다. 이제 쥐의 뇌를 적출하겠습니다. 털이 사방에 날리는 것을 방지하기 위해 70% ethanol로 털을 충분히 적셔주겠습니다.그 다음 먼저 피부를 제거하겠습니다. 뇌를 조직학적 분석에 사용할 계획이 아니며 작은 조각으로 자를 예정이므로, 깨끗하게 꺼내는 것에 크게 주의를 기울이지는 않겠습니다. 한 번에, 뇌가 척수와 연결되는 바로 여기 두개골 기저부에 가위를 넣겠습니다.양쪽 뼈를 절개한 다음 상단을 제거하겠습니다. 이 과정을 반복해서 수행합니다. 이제 뇌가 완전히 노출되었습니다.보시는 바와 같이, 뇌가 완전히 투명하므로 관류가 잘 이루어졌음을 알 수 있습니다. 관류가 되지 않은 동물의 경우, 뇌의 최상층이 붉은 혈관, 즉 붉은 혈액 모세혈관으로 완전히 덮여 있는 것을 볼 수 있는데, 지금은 전혀 보이지 않으므로 관류가 성공적으로 진행된 것입니다. 이제 후각구(olfactory bulb)가 남지 않도록 주의하며 뇌를 걷어내어, 차가운 PBS가 들어 있는 튜브에 넣겠습니다.이제 뇌의 형태를 온전하게 유지하는 것에 너무 신경 쓰지 않고, 뇌를 PBS가 든 튜브에 넣은 다음 시신경을 절단하겠습니다. 그다음 스패출러를 사용하면 뇌가 매우 쉽게 빠져나옵니다. 이제 동일한 쥐에서 척수를 제거하겠습니다. 이 경우에도 척수를 작은 조각으로 자를 예정이므로, 전체를 모두 추출할 수만 있다면 매우 깨끗하게 꺼내는 것에 너무 주의를 기울이지 않겠습니다.먼저 척추를 따라 피부를 절개하며, 여기서 척추가 보입니다. 그런 다음 척추가 전체적으로 노출되도록 주변의 근육 조직을 제거하겠습니다. 바로 이곳에서 척수를 확인할 수 있습니다.마우스의 경우, 양 끝을 절개하고 주사기로 PBS를 주입하면 척수가 거의 한 덩어리로 밀려 나옵니다. 하지만 쥐(rat)는 그렇게 간단하지 않습니다. 절개하여 척수를 직접 걷어내야 합니다.이제 양측을 절개하고, 뇌에서 했던 것과 마찬가지로 뼈를 절개하여 제거함으로써 척수를 노출시킵니다. 뇌와 마찬가지로 척수가 완전히 하얗게 보이는데, 이는 심장 관류가 잘 이루어졌음을 나타냅니다. 척추 전체를 따라 이 과정을 수행하겠습니다.그런 다음 오른쪽 고관절 높이인 이 지점까지 내려갑니다. 이제 핀셋을 사용하여 — 보기에 좋지는 않겠지만 — 척수를 뽑아내어 뇌가 들어 있는 튜브에 함께 넣겠습니다. 이제 튜브에 쥐의 뇌와 척수가 모두 들어갔으므로, 단일 세포 현탁액을 준비할 준비가 되었습니다.이제 중추신경계로부터 단일 세포 현탁액을 준비하겠습니다. 이를 위해 10 centimeter 페트리 접시와 그 안에 배치할 70 micron 세포 스트레이너가 필요합니다. 또한 1 mL 주사기의 플런저를 사용할 것이며, 핀셋과 가위가 필요합니다.이제 샘플을 세포 스트레이너(cell strainer)에 넣고 튜브에 남은 것이 없는지 확인하겠습니다. 그다음 뇌와 척수를 함께 섞어 작은 조각으로 자릅니다. 모든 조직이 충분히 다져지면, 오닐 시린지(oneill syringe)의 플런저를 사용하여 이를 밀어 넣겠습니다.단일 세포들이 통과함에 따라 세포 트레이너 외부의 PBS가 점차 탁해지는 것을 확인하실 수 있습니다. 물론 세포 현탁액을 섞어야 한다면, 당연히 조직 배양 후드 내에서 작업을 수행하고 손가락을 넣지 않을 것입니다. 이제 PBS가 탁해졌으므로, 이를 처음으로 수집하여 50 mil 튜브에 넣겠습니다.하지만 계속 주의 깊게 살피면서, 셀 스트레이너(cell trainer)에 PBS를 더 추가하고 계속해서 밀어내겠습니다. 중추신경계(CNS)는 지방 함량이 매우 높기 때문에, 이 기법을 사용하여 세포 현탁액을 준비하기 가장 어려운 장기 중 하나입니다. 따라서 저는 모든 CNS 조직을 셀 스트레이너로 여러 번 통과시켜 단일 세포 현탁액을 모두 수집했습니다.여기 우측 CNS에서 준비한 단일 세포 현탁액을 PBS로 50 mL까지 채운 튜브가 있습니다. 이제 농도 구배 준비를 위해 이 튜브를 원심 분리하겠습니다. 원심 분리가 완료되었습니다. 현재 펠렛이 형성되었으므로, 상층액을 제거하고 30% Percoll/PBS 용액 20 mL에 세포를 다시 현탁하겠습니다.그리고 이를 PBS 내의 70% perkel 10 µL 위에 겹쳐서 migration을 유도하겠습니다. 따라서 SuperNet은 폐기합니다. 셀이 펠릿 형태로 뭉쳐 있지 않고 단일 현탁액 상태가 되도록 펠릿을 풀어줍니다.이제 단일 세포 부유액 상태의 CNS 세포를 준비했습니다. 이 세포들을 PBS에 희석한 30% Percoll 20 mL에 부유시킨 후, 이를 PBS에 희석한 70% Percoll 10 mL 위에 층을 이루어 얹겠습니다. 그 다음 원심분리하겠습니다.이제 20 mL의 CNS 현탁액을 취하여, 작업의 편의를 위해 70% Percoll 층 위에 천천히 층을 형성하겠습니다. 또한 층 중 하나에 페놀 레드(phenol red)와 같은 염료를 추가할 수도 있지만, 이것이 세포에 어떤 영향을 미치는지 확실하지 않으므로 저는 가급적 사용하지 않으려 합니다.두 층이 섞이지 않도록 충분히 천천히 주입해야 하므로, 하단 층에 큰 와류가 발생하지 않도록 주의하십시오. 상단 층이 두꺼워질수록 주입 속도를 높일 수 있습니다. 이제 농도 구배에 세포를 첨가하였습니다.여기 아래쪽의 투명한 층은 70% Percoll 층이며, 위쪽의 뿌연 층은 단일 세포 현탁액이 포함된 30% Percoll 층입니다. 이제 이 튜브를 원심분리기에 넣고 20분 동안 회전시키면, 실험이 잘 되었을 경우 단핵구 세포 층을 확인할 수 있습니다. 이제 밀도 구배 원심분리를 마쳤습니다.따라서 항상 그렇듯이, 농도 구배를 형성하기 위해 원심분리하며, 이때 브레이크를 꺼서 너무 빠르게 감속되어 구배가 흐트러지지 않도록 매우 주의하십시오. 이제 층이 형성되었습니다. 구배 상단에는 지방층이 있는데, 세포 현탁액의 오염을 방지하기 위해 이 층을 제거하겠습니다.그리고 Perkel 30%와 70%의 두 층 사이의 계면을 보면, 계면이 뚜렷하지 않고 모호한 것을 볼 수 있는데 바로 그곳에 세포들이 있습니다. 세포를 제거하고 나면 계면이 훨씬 더 뚜렷해질 것입니다. 따라서 상층부의 지방 대부분을 제거하여 폐기통에 버리겠습니다.전부 제거할 필요는 없지만, 단핵세포를 채취하기 위해 내려갔을 때 피펫이 완전히 코팅되지 않을 정도로만 충분히 제거하고자 합니다. 이제 다른 전송 피펫을 사용하여 인터페이스 높이까지 내려가 세포를 수확하겠습니다. 이제 인터페이스에서 수 밀리리터(mL)를 수집했습니다.따라서 얻을 수 있는 모든 세포를 확보한 것으로 보입니다. 해당 CNS 내의 단핵 세포 수는 매우 적었습니다. 이제 튜브에 단핵 세포들이 준비되었습니다.튜브에 PBS를 50 mL까지 채운 후, 세포를 원심 분리하여 펠렛(pellet)으로 만들면 펄(perle)이 씻겨 나갑니다. 모든 펄을 완전히 제거하기 위해 PBS를 튜브 가득 채워 최소 두 번 이상 세척하는 것을 권장합니다. 그러면 세포는 이후 수행하고자 하는 모든 실험 절차에 사용할 준비가 됩니다.오늘 저는 쥐의 중추신경계에서 단핵구를 분리하는 방법을 보여드렸습니다. 물론, 이러한 단핵구를 확보한 후에는 추가 정제 과정을 통해 해당 세포군에서 예를 들어 T 림프구를 분리할 수 있습니다. 저는 이 세포들을 사용하여 유세포 분석법을 수행함으로써 제 뇌에 존재했던 세포군을 검출할 예정입니다.세포 분리 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

현재 문서는 효율적으로 효과적으로 흐름 cytometric 분석을 위해 활용할 수 뇌 및 척수 조직에서 mononuclear 세포를 분리하기 위해 빠른 프로토콜을 설명합니다.

Percoll 그라디언트를 사용하여 두뇌와 척수 Mononuclear 세포의 분리

이 비디오에서는 밀도 구배 원심분리를 사용하여 마우스의 뇌에서 단핵 세포를 분리하는 작업을 수행합니다. 분리된 단핵 세포 현탁액은 추가 다운스트림 분석에 사용할 수 있습니다.

마우스 뇌에서 단핵 세포 분리: 뇌 상주 단핵 세포를 분리하기 위한 밀도 구배 원심분리 기술

이 원고는 다양한 질병 단계에서 각각 유세포 분석 및 정량적 PCR을 사용하여 림프절, 비장, 혈액 및 척수의 면역 세포 분포 및 mRNA 사이토카인 수치를 평가하는 방법과 함께 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델의 유도 및 채점 방법을 설명합니다.

다양한 조직에서 면역 세포의 질병에 의존하는 유통의 마우스 및 평가에 실험자가 면역 뇌척수염의 유도

세부 사항에 microglial 함수를 이해 하는 노력 microglia 성숙한 vivo에서 속성 정리 microglial 문화 모델의 부족에 의해 방해 되어 있다. 이 프로토콜 정의 매체 조건 하에서 높은 없는 성숙한 쥐 microglia의 강력한 생존을 유지 하기 위해 설계 된 절연과 문화 접근을 설명 합니다.

절연 및 동적 홍보 설치류 Microglia의 문화 Ramified 혈 청 자유로운 매체에 있는 외관

이 프로토콜의 목표는 lissencephalic 및 gyrencephalic 척추동물의 중추 신경계의 여러 영역에서 미세 혈관을 분리하는 것입니다.

5개의 척추동물 단에 걸쳐 중추 신경계 마이크로혈관의 믿을 수 있는 격리

우리는 성인 마우스 뇌 반구의 다른 해부 된 영역에서 microglia의 격리를위한 프로토콜을 제공하고, 전체 길이 전사체의 깊은 단일 세포 RNA 시퀀싱을위한 반자동 라이브러리 준비를 제공합니다. 이 방법은 건강과 질병에서 microglia의 기능적 이질성을 해명하는 데 도움이됩니다.

깊은 단세포 RNA 염기서열 분석에 대한 하나의 성인 마우스 뇌 반구에서 영역 별 Microglia의 격리

이 원고는 마우스에서 활성 실험자가 면역 뇌척수염(EAE)을 유도하는 프로토콜을 제시한다. 중추신경계(CNS)에서 침투된 림프구의 분리 및 특성화 방법도 림프구가 CNS 자가면역 질환의 발병에 어떻게 관여하는지 보여주기 위해 제시된다.

실험적인 자가면역 뇌척수염 중 중추신경계에서 림프구 침투의 흐름 세포 분석

이 논문은 뇌, 척수 및 수막을 포함한 중추 신경계 내에서 상주 및 말초 유래 면역 세포를 검사하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜을 제시합니다. 이러한 각 프로토콜은 정상 상태 및 염증 조건에서 이러한 구획을 차지하는 세포의 기능과 구성을 확인하는 데 도움이 됩니다.

면역 세포의 다운스트림 분석을 위한 중추신경계 조직 및 관련 수막 분리

살아있는 쥐의 뇌에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하는 방법이 여기에 실험적으로 자세히 제시되어 있습니다. 그것은 그들의 웰빙을 손상시키지 않고 동일한 동물로부터 이러한 세포를 여러 번 수집할 수 있습니다.

살아있는 쥐에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하기 위한 "뇌 착유" 방법

이 연구는 쥐의 골수에서 풍부한 호중구 세포외 트랩(NET)을 분리하는 두 가지 기술을 간략하게 설명합니다. 한 가지 방법은 상용 호중구 분리 키트와 밀도 구배 원심분리를 결합하는 반면, 다른 방법은 밀도 구배 원심분리만 사용합니다. 두 접근법 모두 말초 혈액 호중구의 NET을 능가하는 기능적 NET을 산출합니다.

비슷한 용량의 쥐 골수 호중구를 분리하기 위한 독특한 접근법

현재까지 동일한 마우스에서 모든 주요 중추 신경계 상주 세포 유형을 동시에 분리하기 위한 프로토콜은 충족되지 않은 수요입니다. 이 프로토콜은 신경 염증 중에 복잡한 세포 네트워크를 조사하고 동시에 필요한 마우스 수를 줄이기 위해 순진하고 실험적인 자가면역 뇌척수염 마우스에 적용할 수 있는 절차를 보여줍니다.

성인 자가면역 뇌척수염 마우스에서 주요 중추 신경계 상주 세포 유형의 동시 분리

배우세요 쥐 중추신경계에서 단핵세포를 분리하는 방법을 심장관류와 Percoll 밀도구배법을 사용하여. 혈액 오염을 최소화하고 유세포분석이나 세포배양에 적합한 세포를 얻을 수 있습니다.

EAE와 쥐의 중추 신경계에서 Mononuclear 세포의 분리

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