2015년 6월 4일
프로토콜은 화상 처리 기술에 기초하여 상세를 제어하고 일정한 전단 속도 하에서 적혈구 (RBC) 응집체 정량화 실험 방법을 설명했다. 이 프로토콜의 목적은 제어 된 미세 환경에서 대응하는 전단 속도로 RBC 집합체 크기를 관련시키는 것이다.
이 절차의 전반적인 목표는 미세순환에서 적혈구 응집체를 동적으로 제어되고 일정한 전단 속도에서 직접 정량화하는 것입니다. 이것은 첫 번째 훈련, 적혈구 현탁액 및 인산염 완충 식염수가 있는 이중 y 마이크로 채널을 통해 달성되어 혈액층에 지속적인 환호성을 생성합니다. 두 번째 단계는 고속 카메라로 흐름을 시각화하고 기록
하는 것입니다.다음으로, 이미지 처리 기술을 사용하여 기록을 처리하고 마이크로채널에서 평균 응집체 크기와 응집체 크기 분포를 얻습니다. 마지막 단계는 두 개의 연속된 프레임 사이의 마이크로 채널에 주입된 형광 입자의 변위를 따라 혈액 속도를 결정하는 것입니다. 궁극적으로, 마이크로 채널의 전단 속도는 혈액 속도와 혈액층 두께를 기반으로 계산되어 응집체 크기를 해당 국소 전단 속도와 관련시킵니다.
광 투과 방법과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 적혈구 응집체가 다른 기술을 사용하여 통계적으로 분석되는 것과 달리 미시적 공유 흐름에서 동적으로 분석된다는 것입니다. 이 방법은 적혈구 응집체 형성 조건을 이해하고 미세 순환에서 혈액 방사선 거동을 찾는 것과 같은 혈액 방사선 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 표준 포토리소그래피 방법에 따라 너비 120미크론, 높이 60미크론, 길이 7mm의 마이크로 채널을 제작합니다.
다음으로, 건강한 자발적 기증자로부터 혈액 세포를 수집하고 동반 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 5, 10 및 15% 헤마토크릿 수치의 적혈구 현탁액을 준비하고, 각 적혈구 현탁액 1밀리리터를 형광 추적 입자를 포함하는 1% 용액 60마이크로리터와 결합합니다. 튜브를 부드럽게 흔들어 용액을 혼합합니다. 또한 pH 7.4에서 1ml의 PBS에 동일한 부피의 추적 입자를 결합하십시오.
25마이크로리터 유리 주사기에 적혈구가 포함된 추적 용액과 100마이크로리터 유리 주사기를 로드합니다. PBS의 추적 프로그램 솔루션을 사용하여 시스템에 기포가 없는지 확인합니다. 다음으로, 초당 18프레임 이상을 기록할 수 있는 고속 카메라와 미립자 이미지 속도 측정 시스템에 연결된 도립 현미경 스테이지에 마이크로 채널을 배치합니다.
튜브를 통해 각 주사기를 미세유체 채널의 입구 포트 중 하나에 연결한 다음 동일한 주사기 펌프의 홀더에 넣습니다. 시간당 2마이크로리터의 속도로 25마이크로리터 주사기를 분배하도록 주사기 펌프를 프로그래밍합니다. 이것은 또한 크기 차이로 인해 100 마이크로 리터 주사기를 그 속도의 4 배로 분배합니다.
서로 다른 전단 속도를 테스트하기 위해 실험 사이의 유량을 변경합니다. 20 x 렌즈를 제자리에 놓고 보정 조롱을 사용하여 고속 카메라를 보정하십시오. 그런 다음 펌프를 시작하여 두 용액을 마이크로 채널로 분배하기 시작합니다.
최적의 카메라 노출을 결정합니다. 응집체의 선명한 이미징을 위한 시간입니다. 측정값을 획득하기 전에 흐름이 정상 상태에 도달할 때까지 기다리는 것이 중요합니다.
이제 정상 상태인 경우 3-5분 이내에 도달합니다. 주사기를 다시 채워 혼합물을 교육하고 적혈구를 현탁액으로 유지하십시오. 정상 상태 흐름에 도달하면 적혈구의 움직임을 기록하기 시작합니다.
7초 동안 흐름을 기록합니다. 이미지 처리가 가능한 프로그램을 사용하여 히스토그램 이퀄라이저 방법을 사용하여 촬영한 각 그레이 스케일 이미지의 대비를 향상시킵니다. 다음으로, 회색 음영 이미지를 이진 이미지로 변환합니다.
여러 값을 테스트하고 모든 집계가 제대로 감지되는 값을 선택하여 임계값을 신중하게 설정합니다. 필요한 경우 하나의 골재 내의 간격에 해당하는 구멍을 채웁니다. 그런 다음 이진 이미지에서 인접한 흰색 픽셀을 결정하여 세포를 검출하여 인접한 세포가 응집체로 간주되도록 합니다.
검출된 다양한 적혈구 응집체에 레이블을 지정한 다음 이진 이미지를 더 나은 시각화를 위해 빨간색, 녹색, 파란색 이미지로 변환합니다. 마지막으로 빨간색, 녹색, 파란색 이미지를 원본 이미지에 오버레이합니다. 이미지 처리의 효율성을 확인하려면 감지된 픽셀 수를 기준으로 프레임에서 감지된 각 집합체의 면적을 계산합니다.
모든 프레임을 동일한 방식으로 처리합니다. 다음으로, 각 프레임에서 감지된 집계 크기를 평균한 다음 모든 프레임의 결과를 평균화합니다. 적혈구 현탁액 엔진의 각 기록에 대한 평균 응집체 크기를 얻으려면 조롱 이미지를 사용하여 결과를 제곱 마이크로미터로 변환하십시오.
그런 다음 한 적혈구의 면적을 계산하여 대표자를 결정합니다. 검출된 각 세포 내의 예상 적혈구 수는 데이터가 수집되면 집계됩니다. 고속 카메라를 사용하여 미세 입자 이미지 속도 측정 시스템에 사용되는 이중 펄스 카메라로 전환합니다.
여기에 표시된 것과 같은 이미징 소프트웨어를 사용하여 흐름의 이미지를 획득하고 속도장 결정을 위한 이미지 처리를 수행합니다. 반드시 보호 안경을 착용한 다음 레이저 시스템과 카메라를 켜십시오. 현미경 아래에 마이크로미터를 놓고 결과 이미지를 사용하여 시스템을 보정합니다.
그런 다음 유체 흐름을 시작하고 두 유체의 입자를 시각화합니다. 흐름에서 가장 빠르고 밝은 입자에 초점을 맞춰 마이크로 채널의 중간 평면을 찾습니다. 다음으로, 가장 빠른 입자가 두 이미지 사이에서 5-10 픽셀을 이동하고 흐름을 기록하기 시작하도록 프레임 사이의 시간 간격을 약 2 밀리 초로 설정하십시오 O.모든 다른 적혈구 현탁액과 다른 전단 속도에 대한 100 쌍의 이미지를 획득하도록 소프트웨어를 설정하십시오.
다음 이미지는 사전 처리됩니다. 상관 관계 창의 크기와 모양, 겹치는 이미지의 비율을 선택합니다. 결과를 100개의 이미지 쌍에서 계산된 평균 속도 필드와 속도의 평균 제곱근 오차로 표현합니다.
레이저 카메라와 컴퓨터를 끕니다. 모든 측정 및 이미지 처리가 수행되면 먼저 고속 카메라 녹화를 기반으로 마이크로 채널의 혈액 두께를 감지하고 추정하여 순전한 속도를 계산합니다. 이를 위해 특정 녹화의 모든 프레임을 평균화하여 비디오의 배경 이미지를 얻습니다.
마지막으로, 모든 프레임의 평균 이미지를 육안으로 검사하여 혈액층을 delit하고 혈액층의 가장자리를 수동으로 감지합니다. 그런 다음 추출된 속도 프로파일에서 해당 혈액층 두께에 대한 속도 값을 수동으로 구하고 속도 값을 혈액층으로 나누어 전단 속도를 계산합니다. 여기에 표시된 두께는 3개의 연속적인 프레임에서 감지된 4개의 적혈구 응집체의 순 움직임입니다.
30개 이상의 셀로 구성된 큰 응집체는 빨간색으로 표시됩니다. 9개에서 30개 사이의 중간 응집체는 녹색으로 표시되고, 9개 미만의 세포로 구성된 작은 응집체는 파란색으로 표시됩니다. 골재의 속도는 표시된 마이크로 채널에서의 위치에 따라 달라집니다.
다음은 시간당 10마이크로리터의 유속으로 5% 헤마토크릿, 10% 헤마토크릿 및 15% 헤마토크릿에 현탁된 적혈구의 속도 프로파일입니다. 예상대로 양쪽 가장자리에서 속도가 0을 향하는 것을 볼 수 있으며, 전체 전단 속도가 각 헤마토크릿 수치 저하에서 응집체의 크기를 증가시키기 때문에 두 흐름 흐름 사이의 변곡점은 헤마토크릿 수준 간에 약간 다릅니다. 이것은 적혈구를 분해하는 응집력을 초과하는 마이크로 채널의 순전한 힘 때문입니다.
이 절차를 수행하는 동안 마이크로 채널에서 흐름의 우수한 이미지 품질을 보장하고 흐르는 적혈구와 이미지 배경 간의 대비를 보장하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 동영상을 시청한 후에는 흐름이 제어된 조건에서 적혈구 응집체를 정성적 및 정량적으로 분석하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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이 프로토콜은 제어된 전단율에서 이미지 처리 기술을 사용하여 적혈구(RBC) 집합체를 정량화하는 방법을 설명합니다. 이 연구는 미세유체 환경에서 RBC 집합체 크기와 전단율을 상관 지어 보는 것을 목표로 합니다.
Understanding red blood cell aggregation dynamics under controlled shear rates provides critical insights into blood rheology relevant to microcirculation and vascular health. This microfluidic approach enables quantitative assessment of aggregate formation and disaggregation, supporting mechanistic studies in hematology and hemorheology. The method aids in de-risking target validation by linking biophysical parameters to functional outcomes in blood flow behavior.
This method integrates into the discovery continuum from target validation through lead identification by providing shear-dependent phenotypic readouts that inform mechanistic understanding of blood flow modifiers.