Name: 적혈구 집계 동적 조사를위한 미세 유체 제어 환경 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 학습하세요 적혈구 집계를 미세유체 환경에서 동적으로 정량화하는 방법을. 고속 카메라와 영상 처리 기술을 활용하여 전단율에 따른 적혈구 응집 크기를 분석하고 미세순환의 혈류 역학을 이해할 수 있습니다.

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이 작품은 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구위원회에 의해 지원되었다. 미세는 맥길 대학 맥길 나노 장비 Microfab 시설과 칼턴 대학에서 전자 공학학과의 지원으로 수행되었다.

혈액은 오타와 대학 (H11-13-06)의 윤리위원회의 승인을 건강한 사람들에서 수집됩니다. 1. 마이크로 채널 제작 마이크로 채널은 표준 포토 리소그래피 방법 (18)을 기반으로 제조된다. <ol><li> 컴퓨터 지원 설계 (CAD) 소프트웨어를 사용하여 마이크로 채널 형상을 설계하고 투명 포토 마스크의 구성을 인쇄 할 수 있습니다. 그것들은 제조 공정 동안 광 경로를 지시 때문에 이러한 마스크는 매우 중요하다. 이 경우, 마이크로 사이즈, 깊이 120 ㎛의 두께 60 μm의 길이 7mm이다. </li><li> 클린 룸에서는, 스핀 코팅, 에폭시 계 네거티브 마이크로 원하는 깊이 (60 ㎛ 인)을 획득하기 위해 30 초 동안 2000 rpm으로 실리콘 웨이퍼 상에 포토 레지스트를. </li><li> 웨이퍼와 650 엠제이 / 70 초 CM 2에서 UV 램프에서 포토 마스크를 노출. 단지 투명 영역을 노출 시키도록 보장자외선 빛에 포토 마스크. 투명 영역의 노광의 경화의 결과 사슬 중합 가능 포토 레지스트. 과량의 제거 현상에 실리콘 편을 담그고하는 포토 레지스트. </li><li> 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)의 용액을 만들기 위해 1 : 몰드가 제조되면, (10)의 비율로 실리콘계 엘라스토머와 경화제를 혼합한다. 탈기 진공 챔버에 PDMS 용액을 넣어. 주형에 부어 90 분 마이크로 채널을 생성하는 60 ° C로 가열한다. 90 초 동안 산소 플라즈마를 사용하여 접합 유리 슬라이드에 개별 채널을 결합. 주 : PDMS의 탈기 공정이 혼합 공정에 의해 생기게 기포를 제거하기 위해 수행된다. </li><li> 마이크로 크기가 성공적으로 테스트 할 수 있는지 확인합니다. 이 프로토콜에서, 마이크로 채널은 120 X 60 ㎛의 직사각형의 단면을 갖는다. 이에 비해 평균 RBC 8 ㎛의 직경 2 ㎛의 두께를 갖는다.refore는 마이크로 채널 너비는 적당한 응집을 관찰하고 정확하게 속도 프로파일을 결정하기에 충분하다. </li></ol> 2. 혈액 준비 <ol><li> 윤리위원회의 승인 후, 건강한 자원 봉사 기증자로부터 혈액을 수집합니다. 수집 튜브에 존재하는 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)와 피 (혈액 4 mL를 7.2 밀리그램을 EDTA)을 치료. 주 : EDTA는 혈액 응고를 방지하는 데 사용됩니다. </li><li> 혈액 성분을 분리하기 위해 1400 XG (3000 RPM)에서 혈액 샘플을 10 분 동안 세 번 원심 분리기. 원심 분리의 결과, 세 개의 서로 다른 층들을 관찰한다. 주 : 세 층 (튜브의 하단에 위치) RBC 층 (RBC 층의 상부에 위치 백혈구 및 혈소판 이루어진) 버피 코트하고 플라즈마 층 (전체의 상단에 위치한 성분). <ol><li> 첫 번째 원심 분리 후, 혈액 피펫을 사용하여 혈장을 수집합니다. 어떤 C를 피버피 코트 콘택트에. </li><li> 수집 및 10 % 희석 한 표백제 용기에 버피 코트 폐기하십시오. </li><li> 나머지 적혈구 층 튜브에 각각 PBS 산도 7.4의 3 ㎖를 추가하고 원심 분리기의 적절한 균형을 보장합니다. 조심스럽게 10 분 동안 1,400 XG (3000 RPM)에서 다시 원심 분리 튜브를 혼합한다. 주 :이 세포 부착을 변경할 수 있기 때문에 PBS 용액이 어떤 마그네슘이나 칼슘이 포함되어 있지 않음을 확인합니다. </li><li> 두 번째 원심 분리 한 후 튜브에 PBS를 폐기하고있는 경우 나머지 버피 코트를 제거합니다. 반복 세 번째 원심 분리 청소 적혈구를 생성하는 2.2.3와 2.2.4 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 해당 (5 % RBC-현탁액을 얻기 위해 10 % 내지 15 %를 1 ㎖의 튜브에서 플라즈마 (0.95, 0.9 및 0.85 mL)로 세정 적혈구의 요구량 (0.05, 0.1 및 0.15 ml)에 섞어 ) 헤마토크릿. 마이크로 원심과 적혈구 용적률을 확인합니다. </li></ol> 3. 유체 준비 <ol><li> 형광 추적 입자 용액 60 μl를 추가 (1 % 고체, D 입자 = 0. 86 μm의는, λ는 = 542 nm의 복근 은 1 ml의 RBC 서스펜션 튜브에 λ 방출 = 612 ㎚). 주 : (내부적 폴리스티렌 입자를 염색) 형광 트레이서 입자 내의 미세 유동의 속도를 측정하는데 사용된다. 레이저 빔 (λ = 542 ㎚)의 대응하는 파장에 노출 될 때 이들 입자는 형광. </li><li> pH 7.4의 PBS 용액을 준비하고 PBS 용액 1 ㎖에 동일한 형광 트레이서 입자 용액 60 μL를 추가한다. </li></ol> 4. 골재 크기 측정 <ol><li> 마이크로 채널에서의 유체 (RBC-현탁액과 PBS)를 삽입하려면, 25 μL, 100 μL의 두 유리 주사기를 사용합니다. 이 의지시스템의 컴플라이언스를 줄이는 것을 돕는다. 튜브 및 항목 구멍을 맞는 커넥터를 통해 주사기에 마이크로 연결합니다. 유체 용기와 주사기 사이에 존재하는 압력 차이를 이용하여 유리 주사기를 채우기. 기포가 시스템에 존재하지 확인. 대안적인 방법으로서, 마이크로 유체 모두를 구동하기 위해 압력 제어 시스템을 사용한다. </li><li> 고속 카메라와 μPIV 시스템에 연결 거꾸로 현미경 무대에서 마이크로 놓습니다. 프로그램 (PBS에 대한 Q = 8 μL / hr의 유량을 야기되었다 피를 예를 들어, Q는 = 2 μL / 시간) 원하는 유량에 주사기 펌프. 주 : 하나의 주사기 펌프를 사용한다. 두 개의 다른 내부 직경이 서로 다른 두 개의 유리 주사기를 사용하면, Y-마이크로 각 분기 유입 유량에 따라 달라질 수있다. </li><li> 도시 된 바와 같이 다른 항목과 다른 지점에서 유량에서 이중 Y-마이크로 유체 모두를 각각 삽입 <strong&gt;도 1. 펌프 유량을, 다른 전단 속도 변경을 테스트하기 위해. 이는 (도 2 및 3) ​​두 지점 (19) 사이 (여기서는 4) 같은 적절한 비율을 유지한다. 측정 값을 취득하기 전에, 정상 상태에 도달하는 흐름 기다리 : 육안 원활한 흐름을 위해 고속 카메라 이미지를 검사한다. 주 : 비 혈액 층 내에 선형 속도 프로파일을 얻는 데 중요하다. </li><li> 고속 카메라를 사용하여 적혈구를 시각화. 유체 흐름의 이미지를 제어, 기록 및 저장 카메라를 컴퓨터에 연결합니다. 두 유체 흐름이 정상 상태에 도달하면, 기록을 시작. <ol><li> 더 나은 처리 결과에 대한 여러 이미지를 획득. 골재의 명확한 이미지에 대한 최적의 카메라 노출 시간을 결정합니다. 참고 :이 경우 카메라의 노출 시간은 0.5 밀리 초였다. 각 프레임 사이의 시간 간격의 선택은 카메라 프레임 레이트 및 t의 유량에 기초그는 마이크로. 이 절차에서 처리 된 각 프레임 사이의 시간은 60 밀리 초이다. 따라서 초 당 18 프레임을 기록 할 수있는 카메라가 충분하다. 참고 : 잘못된 측정으로 이어질 수있는 튜브와 주사기, 혈액 정착을 피하십시오. </li></ol></li><li> 이미지 프로세싱 기술 (이 경우 MATLAB 프로그램)을 사용하여 다음과 같이 (도 4에 도시 된) 픽셀 강도에 기초하여 상기 이미지들의 각각에서 응집체를 검출, 이미지 품질을 개선한다 : <ol><li> 이미지가 각 프레임에 대해 더 나은 이미지 품질을 획득하기 위해 히스토그램 등화 방법을 사용하여 콘트라스트 향상. </li><li> 이진 이미지로 그레이 스케일 이미지를 변환 할 수 있습니다. 이를 위해, 각 화소의 변환을 지시하는 0에서 1까지의 임계 값을 설정. 임계 값보다 큰 값을 갖는 화소가 백 화소로 감지하는 동안 상기 임계 값 이하의 모든 이미지 픽셀은 흑 화소로서 검출한다. </li><li> 작성더 나은 결과를 하나의 집합 내에서의 갭에 해당하는 구멍 (현재 및 필요한 경우). </li><li> 인접 셀이 응집체로서 연관된되도록 이진 영상에 인접 백 화소를 판별하여 세포를 감지. </li><li> 검출 된 다른 집계 레이블과 더 나은 시각화를위한 빨강, 녹색, 파랑 (RGB) 이미지로 바이너리 이미지를 변환 할 수 있습니다. 화상 처리 기술의 효율을 확인하고,도 5에 도시 된 바와 같이, 모든 셀이 고려되는 것을 보장하기 위해 대응하는 처리 된 이미지들의 각각에 오리지널 프레임 수확기. 수행 단계 4.5.1, 4.5.2, 4.5.3 캡처 한 모든 프레임에 대해, 4.5.4과 4.5.5. </li><li> 검출 된 픽셀의 수에 기초하여 상기 프레임 내에서 검출 된 각각의 집합체의 면적을 계산한다. 사용되는 렌즈의 배율에 기초하여, 교정 레티클을 사용하여 변환 계수를 계산하고, 2 ㎛의 결과를 변환한다. 각 검출 골재 크기를 평균다음은 프레임 - RBC 현탁액 각각의 기록에 대한 평균 응집체 크기를 얻기 위해 모든 프레임들에 대한 결과를 평균. </li><li> 각 감지 집계 내에서 적혈구의 대표 추정 수를 결정하는 하나의 RBC의 면적을 계산합니다. 도 6에 도시 된 바와 같이, 이러한 결과를 이용하여, (각 집합 내의 셀들의 예상 숫자로 표시됨) 골재 크기의 함수로서 각 집합 내의 적혈구의 비율의 분포를 계산한다. 주 : RBC 응집체를 측정하기는 ImageJ에 소프트웨어는 각각의 프레임에서 동일한 작업을 수행하기 위해 (MATLAB 대신으로) 사용될 수있다. </li></ol></li></ol> 5. 유체 속도와 전단 속도 측정 유속 및 μPIV 시스템을 사용하여, 따라서 전단 속도를 결정한다. <ol><li> 데이터는 고속 카메라를 사용하여 획득되면, μPIV 시스템에 사용 더블 펄스 카메라로 전환. 화상 AC 용 영상 소프트웨어를 사용하여속도 필드 검지 흐름 및 화상 처리 quisition. </li><li> 레이저를 켜기 전에, 레이저의 종류에 따라, 모든 예방 조치가 필요 가져 가라. 그런 다음 시스템, 카메라와 레이저를 켭니다. </li><li> 사용되는 렌즈의 배율에 기초하여 카메라의 교정. 이를 위해, 현미경으로 10 ㎛의 정밀도 마이크로을 사용하여 이미지에 1 화소의 사이즈를 설정한다. </li><li> 레이저를 시작하고 두 유체의 입자를 시각화. 흐름에서 가장 빠른 입자에 초점을 맞춤으로써 마이크로의 중간 평면을 찾기 (즉, 가장 빠른 입자는 밝은해야한다). </li><li> 입자의 적절한 변위를 보장하기 위해 DT (두 개의 연속적인 프레임 사이의 시간 간격)을 설정한다. 가장 빠른 입자는 두 이미지 사이에 약 5 ~ 10 픽셀을 이동해야합니다. </li><li> 흐름을 기록 시작합니다. 이미지 백쌍, 떨어져 5 밀리 초를 취득 할 수있는 소프트웨어를 설정합니다. 모든 DIF에 대한 단계 5.4, 5.5 및 5.6를 수행ferent RBC-현탁액과 다른 전단 속도에 대한. 참고 : 방법의 자세한 내용은 피츠와 페 네치 (20)의 연구에 제시되어있다. </li><li> 이미징 소프트웨어와 상호 상관 방법을 사용하여 획득 된 기록을 처리. 주 :이 소정 크기의 작은 윈도우로 이미지 쌍 이산화 이루어져라는 상관 윈도우 및 각 윈도우에서 입자의 변위를 따르고 (유체의 흐름 및 사용자에 의해 선택된 시간 간격에 기초하여). <ol><li> 취득한 화상 데이터는 더 프로세싱 (배경 차감 &quot;베이스 - 클리핑&quot;21 또는 이미지 22,23 중첩 포함) 프리 - 프로세싱을 필요로하는 경우, 최초로 결정한다. </li><li> 이어서, 상관 윈도우 사이즈 및 형상뿐 아니라 이미지의 중첩의 퍼센티지를 선택한다. 상세한 연구 피츠 등에 의해 실시 하였다. (24)를 혈액에 대한 최적의 파라미터 및 영상 전처리 기술을 결정하는데상이한 채널 구성으로 흐른다. 100 이미지 쌍과 속도의 제곱 평균 (RMS) 오류에서 계산 된 평균 속도 필드와 결과를 표현한다. </li></ol></li><li> 도 7에 도시 된 바와 같이. 처리 된 데이터로부터, 상기 채널의 출구 속도 프로파일을 추출 나은 프로파일, 공간 속도 장 평균. 주 : 속도 프로파일을 구성하는 바는, 채널 폭에 대하여 선택된 상관 윈도우 사이즈에 대응한다. 속도의 RMS 에러는 또한 실험 속도 추정에 오류를 나타내는,도 7에 도시된다. </li><li> 모든 측정 및 처리가 수행되면 레이저를 끄고 ,. 소프트웨어, 카메라, 이동 무대, 컴퓨터와 레이저 : 모든 시스템의 구성 요소를 종료합니다. </li><li> 전단 속도를 계산하기 위해, 먼저 검출하고 고속 카메라 촬영에 기초한 마이크로 채널에서 혈액 두께를 추정한다. 이를 위해, 모든 평균특정 녹화 비디오 프레임의 배경 이미지를 얻었다. (5 %, 10 % 및 15 % 적혈구 용적률에서 정지 할 때 10 μL / 시간 흐르는 RBC-현탁액도 8에 도시 된 바와 같이) 피 층을 구분합니다. 대응 혈액 층 두께에 대한 속도 값을 구하여 혈액 층 두께에 의해 속도 값을 나누어 전단 속도를 계산한다. </li></ol>

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<li>Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+and+counting+of+red+blood+cells+in+blood+cell+images+using+hough+transform%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Comput.+Appl%22%5BJournal%5D)">Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform.</a> Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).</li>
<li>Jambhekar, N. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+blood+cells+classification+using+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Res.+Repot%22%5BJournal%5D)">Red blood cells classification using image processing.</a> Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).</li>
<li>Otsu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+threshold+selection+method+from+gray-level+histograms%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE+Trans.+Syst.+Man.+Cybern%22%5BJournal%5D)">A threshold selection method from gray-level histograms.</a> IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).</li>
</ol>

저자가 공개하는 게 없다.

본 방법을 이용하여, 정량적으로 분석 할 수있다 정량적 RBC 다른 유동 조건 하에서 헤마토크릿 집계. 성공적인 시험 및 골재 검출 들어, 마이크로 엔트리에서 두 유체 사이에 적절한 속도 비를 결정하는 데 중요하다. 이 비율은 속도 프로파일 19 준 선형 최적 혈중 층 두께를 얻기 위해 매우 중요하다. 성공적인 테스트를위한 또 다른 중요한 요소는 좋은 이미지 품질입니다. 상기 방법은 화상 처리에 기초하기 때문에 사실, 그것은 이미지 배경 (채널 내부의 유체)과 검출 대상 입자 사이의 콘트라스트가 매우 중요하다. 도 2 및도 3에 도시 된 바와 같이, 여기서, 입자 집합체 검출에 도움이 배경보다 어둡게 보인다. 화상 처리 기술을 위해 고려해야 할 가장 중요한 매개 변수는 t이며hreshold 값. 따라서, 콘트라스트에 기초하여 그것을도 5에 도시 된 바와 같이 모든 응집체가 고려 될 최적의 임계 값...

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

An erratum was issued for <a href="http://www.jove.com/video/52719">Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation</a>. The introduction section was updated.

Erratum: Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

적혈구 세포 (적혈구)는 혈액의 유동 학적 거동을 결정하는데 중요한 역할을한다. 그들은 거의 유일하게 생체 외 및 생체 내에서 혈액의 특정 속성에 대한 책임이 있습니다. 생리 학적 조건 하에서, 적혈구는 혈액 부피의 40 % 내지 45 %를 차지한다. 미세에서는 적혈구에만 의한 작은 혈관의 직경과 효과 1 감추고 플라즈마 혈액 부피의 20 %까지 차지한다. 미세 플라즈마 감소의 이러한 현상은 Fåhræus 효과로 알려져있다. 저 전단 속도에서, 적혈구, 따라서 혈액의 비 뉴톤 거동에 기여 함께 메우고 &quot;연전 현상&quot;또는 응집체라는 차원 1 인 또는 3 차원 구조를 형성 할 수있다. 그러나, 적혈구 응집 메커니즘은 완전히 이해되지 않습니다. 두 이론은 적혈구의 응집을 모델링 존재 : 세포 이론 브리징 인해 거대 분자 (2)의 가교 및 힘에 attrac기 이론 인해 삼투압 구배 3 분자의 고갈에 의해 발생. 일반적으로, 인간의 피를, 단위는 1에서 10 초 -1에 이르기까지 매우 낮은 전단 속도 4에 형성한다. 이 범위보다, 적혈구는 해리하는과 용기 내에서 개별적으로 흘러 경향이있다. 골재 형성의 조건을 이해하면 혈액의 유동 학적 거동을 정의의 관점에서 혈액 류 분야에 매우 중요하다. 이 집계는 종종 macrocirculation 레벨 (&gt; 300 μm의 직경) (5)에서 볼 수 있습니다. 이 규모에서, 혈액은 뉴턴 유체 및 균일 한 혼합물로 간주됩니다. 그러나, 이러한 응집체는 거의 모세관 레벨 (4-10 μm의 직경)에 보지되고 일반적으로 당뇨병 및 비만과 같은 6 병리 적 상태의 표시이다. 적혈구 응집 염증 또는 감염 조건을 포함 변경할 수있는 다른 병적 인 조건,고혈압이나 동맥 경화, 유전 질환 및 만성 질환 (7)과 같은 심혈관 질환. 따라서, RBC의 응집 메카니즘을 이해하고 (이들 골재와 유동 조건의 크기 간의 관계를 정의함으로써) 이러한 엔티티를 분석하는 혈액 microrheological 동작의 이해로 이어질 수 있으며, 이에 따라 임상 적 적용에 관한 것이다. RBC 응집체는 이러한 헤마토크릿 (혈액 내의 적혈구 용적), 전단 속도, 혈관 직경, RBC 막 강성과 현탁 매질 조성물 8-10와 같은 여러 요인들에 의해 변경 될 수있다. 따라서, 제어 된 조건을 효과적으로 RBC 응집체를 분석하기 위해 요구된다. 몇몇 방법들은 혈액 동작에 대한 관련 정보를 제공하는 정전기 응집 측량 (응집 지수)를 제공함으로써 골재 형성을 분석 할 수있다. 이들 방법은, 특히 적혈구 침강 속도를 포함방법 (11), 광 전송 방식 (12), 광 반사 방법 (13) 및 저 전단 점도 제 14. 몇몇 연구는 적혈구 응집을 연구하고 제어 흐름 조건 15-17에서 집계 된 정도를 확인하려고했습니다. 그러나, 이들 연구는 간접적 응집의 정도뿐만 아니라 로컬 점도에 대한 정보를 제공하는 미세한 혈액 화상에 기초하여 측정 전단 시스템에서 차지하는 공간의 비율을 결정함으로써 RBC에게 골재 크기를 조사. 따라서 우리는 직접 적혈구가 통제되고 일정한 전단 속도에 따라, 동적, 미세에 집계 정량화 할 수있는 새로운 방법을 제시한다. 인산 완충 식염수 (PBS) 용액이 때문에 혈액 층 전단 유동을 생성하여, (도 1에 도시 된 바와 같이) RBC 현탁액-Y-마이크로 이중에서 비말 동반된다. 이 혈액 내에서 일정한 시어 레이어R 율을 얻을 수있다. RBC-현탁액은 다른 헤마토크릿 (H) 레벨 (5 %, 10 % 및 15 %)에서와 상이한 전단 속도 (초 -1 2-11)에 따라 시험한다. 혈액의 속도와 전단 속도는 흐름이 고속 카메라를 사용하여 시각 동안 마이크로 입자 화상 유속계 (μPIV) 시스템을 사용하여 결정된다. 얻어진 결과는 다음 적혈구를 검출 골재 크기를 결정하기 위해 이미지 강도에 기초 MATLAB 코드로 처리된다.

<table><tbody><tr><td>SU8-50 에폭시 기반 네거티브 포토레지</td>스트 <td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU8-50 개발자</td><td>MicroChem Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>폴리(디메틸실록산) (PDMS) Sylgard-184</td><td>Dow-Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>PE-50 시리즈 플라즈마 시스템&nbsp;</td>K2-EDTA(에틸렌디아민테트라아세트산)가 있는 <td>플라즈마 에칭</td><td>PE-50 시리즈</td><td></td></tr><tr><td>채혈 튜브</td><td>FisherSci</td><td>B367861</td><td></td></tr><tr><td>원심분리기, i.e. Thermo Scientific CL2</td><td>Thermo Scientific</td><td>004260F</td><td></td></tr><tr><td>포시페이트 완충 식염수(PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5368-10PAK</td><td></td></tr><tr><td>트레이서 형광 입자 용액 (15 ml)</td><td>FisherSci</td><td>R800</td><td></td></tr><tr><td>응집계</td><td>RheoMeditech</td><td>Rheo Scan AnD300</td><td></td></tr><tr><td>유리 주사기 (50 &micro; l)</td> <td>Hamilton</td><td>80965</td><td></td></tr><tr><td>튜빙 (Tygon)</td><td>FisherSci</td><td>AAA00001</td><td></td></tr><tr><td>고속 카메라 (Basler)</td><td>Graftek Imaging Inc.</td><td>basler acA2000-340km</td><td>초당 18프레임을 레코딩할 수 있는 카메라를 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>더블 펄스 카메라&nbsp;</td><td>LaVision</td><td>Imager Intense</td><td></td></tr><tr><td>Microscope MITAS</td><td>LaVision</td><td>MITAS</td><td></td></tr><tr><td>Nd:YAG 레이저</td><td>New Wave Research</td><td>Solo-II</td><td></td></tr><tr><td>주사기 펌프(Nexus3000 및 PicoPlus)</td><td>Chemyx Inc. 및 Harvard Apparatus</td><td>Nexus3000 및 PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>DaVis 소프트웨어</td><td>LaVision</td><td>Davis</td><td></td></tr></tbody></table>

적혈구 집계 동적 조사를위한 미세 유체 제어 환경

Controlled Microfluidic Environment for Dynamic Investigation of Red Blood Cell Aggregation

혈액은 비 뉴톤 biofluid로서, 혈액 류 분야에서 많은 연구의 초점을 나타낸다. 혈액 성분은 적혈구, 혈장에 현탁 백혈구 및 혈소판을 포함한다. 인해 적혈구 풍부 (혈액량의 40 % 내지 45 %)로, 그들의 동작은 특히 미세 혈액의 유동 학적 거동을 지시한다. 매우 낮은 전단 속도로, 적혈구는 조립 볼 수 있습니다 및 양식 개체는 혈액의 비 뉴턴 동작이 발생하는 집계를했다. 그것은 미세에서 혈액 유 동학을 이해하는 골재 형성의 조건을 이해하는 것이 중요하다. 여기에 설명 된 프로토콜은 화상 처리에 기초하여, 일정한 전단 속도하에 정량적 미세에서 RBC 응집체를 결정하기 위해 실험적인 방법에 대해 설명. 이를 위해, RBC-현탁액 시험 120 X 60 ㎛의 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 마이크로 분석. RBC-현탁액은 천만에 있습니다혈액 층 내의 선형 속도 프로파일을 구함으로써 일정한 전단 속도의 넓은 범위를 달성하기 위해 제 2 유체를 이용한 비가. RBC 응집체가 고속 카메라를 사용하여 시각화하는 동안 전단 속도는 마이크로 입자 화상 유속계 (μPIV) 시스템을 사용하여 결정된다. RBC 집합체 캡쳐 영상은 이미지 강도에 기초하여 상기 골재 크기를 결정하기 위해 화상 처리 기술을 이용하여 분석한다.

이중 Y-마이크로 채널에서 2 유체 흐름의 예는, 5 %, 10 % 및 15 % 적혈구 용적률에서 현탁하고, 10 μL / 시간 흐르는 인간 적혈구에 대한도 2에 도시되어있다.도 3으로 골재 크기 때의 차이를 나타내고 채널의 유동은 10 % 적혈구 용적률 5 μL / hr로 10 μL / 시간으로 감소된다. 헤마토크릿 및 전단 속도를 변화 할 때 응집체의 크기의 질적 개념을 제공한다. 세 개의 연속적인 프레임들에 대해, (5)는 네 개의 인간 RBC 응집체의 변위를 다음 도표 카메라 프레임 레이트 요구 및 질적 개념의 정량적 측정 값을 제공하는 각 프레임 내의 분포를 집계합니다. 중간 집계 각각 녹색과 빨간색으로 표시되며, 큰 골재 (이상 30 적혈구 추정) (9-30까지가 적혈구를 추정) 동안 그림 5에서, (8 이하 추정 적혈구와) 작은 집계는 파란색으로 표시됩니다. <p cl엉덩이 = &quot...

프로토콜은 화상 처리 기술에 기초하여 상세를 제어하고 일정한 전단 속도 하에서 적혈구 (RBC) 응집체 정량화 실험 방법을 설명했다. 이 프로토콜의 목적은 제어 된 미세 환경에서 대응하는 전단 속도로 RBC 집합체 크기를 관련시키는 것이다.

Blood, as a non-Newtonian biofluid, represents the focus of numerous studies in the hemorheology field. Blood constituents include red blood cells, white ...

본 실험 과정의 전반적인 목표는 제어된 일정 전단율 하에서 미세혈관 내의 적혈구 응집체를 동적으로 직접 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 적혈구 현탁액과 인산염 완충 식염수를 이중 Y자형 미세채널에 주입하여 혈액층에 일정한 전단력을 형성시킵니다. 다음 단계로 고속 카메라를 사용하여 흐름을 시각화하고 기록합니다.다음으로, 이미지 처리 기술을 사용하여 녹화된 영상을 처리하고 마이크로채널 내의 평균 응집체 크기와 응집체 크기 분포를 구합니다. 마지막 단계는 두 연속 프레임 사이에서 마이크로채널에 주입된 형광 입자의 변위를 추적하여 혈류 속도를 결정하는 것입니다. 최종적으로, 혈류 속도와 혈액층 두께를 기반으로 마이크로채널 내의 전단율을 계산하여 응집체 크기와 그에 해당하는 국소 전단율 사이의 관계를 도출합니다.광투과법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 다른 기술들처럼 통계적으로 분석하는 것이 아니라 미세 전단 흐름 내에서 적혈구 응집체를 동적으로 분석한다는 점입니다. 이 방법은 적혈구 응집체 형성 조건의 이해 및 미세 순환에서의 혈류학적 거동 규명과 같이 혈액학적 방사선 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 표준 포토리소그래피 공정에 따라 너비 120 microns, 높이 60 microns, 길이 7 mm의 미세 채널을 제작하십시오.다음으로, 건강한 자원봉사 기증자로부터 혈액 세포를 수집하고 동봉된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 헤마토크릿 수치가 5%, 10%, 15%인 적혈구 현탁액을 준비한 후, 각 적혈구 현탁액 1 mL에 형광 추적 입자가 포함된 1% 용액 60 µL를 혼합하십시오. 튜브를 가볍게 흔들어 용액을 섞어줍니다. 또한, pH 7.4의 PBS 1 mL에 동일한 부피의 추적 입자를 혼합하십시오.적혈구가 포함된 추적자 용액을 25 µL 유리 주사기에 채우고, 100 µL 유리 주사기도 준비합니다. PBS 내의 추적자 용액을 사용하여 시스템에 기포가 없는지 확인합니다. 다음으로, 초당 18프레임 이상의 기록이 가능한 고속 카메라 및 마이크로 입자 이미지 속도 측정(microparticle image velocimetry) 시스템이 연결된 도립 현미경 스테이지 위에 마이크로채널을 배치합니다.각 주사기를 튜브를 통해 미세유체 채널의 입구 포트 중 하나에 연결한 다음, 동일한 주사기 펌프의 홀더에 장착합니다. 주사기 펌프를 설정하여 25 µL 주사기가 시간당 2 µL의 속도로 분사되도록 프로그래밍합니다. 이 경우, 주사기 크기 차이로 인해 100 µL 주사기는 그 4배의 속도로 분사됩니다.다양한 전단 속도를 테스트하기 위해 실험 사이에 유량을 변경하십시오. 고속 카메라를 보정하려면 20배 렌즈를 장착한 상태에서 보정용 자(calibration ridicule)를 사용하십시오. 그런 다음 펌프를 작동시켜 두 용액을 마이크로채널에 분주하기 시작하십시오.응집체의 선명한 이미징을 위한 최적의 카메라 노출 시간을 결정하십시오. 측정을 시작하기 전 유동이 정상 상태(steady state)에 도달할 때까지 기다리는 것이 중요합니다.이제 3~5분 이내에 정상 상태(steady state)에 도달합니다. 시린지를 다시 채워 혼합물을 조절하고 적혈구가 부유 상태를 유지하도록 합니다. 정상 상태의 흐름에 도달하면, 적혈구의 이동을 기록하기 시작합니다.흐름을 7초 동안 기록하십시오. 이미지 처리 기능이 있는 프로그램을 사용하여, 히스토그램 평활화(histogram equalizer) 방법을 통해 획득한 각 그레이스케일 이미지의 대비를 향상시킵니다. 그다음, 그레이스케일 이미지를 이진 이미지로 변환하십시오.여러 값을 테스트하여 모든 응집체가 적절하게 검출되는 값을 선택함으로써 임계값을 신중하게 설정하십시오. 필요한 경우, 하나의 응집체 내에 존재하는 간격에 해당하는 구멍을 채우십시오. 그 다음, 이진 이미지에서 인접한 흰색 픽셀을 판별하여 인접한 세포들이 응집체로 계산되도록 세포를 검출하십시오.검출된 서로 다른 적혈구 응집체에 라벨을 지정한 다음, 더 나은 시각화를 위해 이진 이미지를 RGB 이미지로 변환합니다. 마지막으로, RGB 이미지를 원본 이미지 위에 오버레이합니다. 이미지 처리 효율을 검증하기 위해, 검출된 픽셀 수를 기반으로 프레임 내에서 검출된 각 응집체의 면적을 계산합니다.모든 프레임을 동일한 방식으로 처리하십시오. 다음으로, 각 프레임에서 검출된 응집체 크기의 평균을 구한 뒤, 모든 프레임의 결과값을 평균하십시오. 적혈구 현탁액 엔진의 각 기록에 대한 평균 응집체 크기를 얻으려면, 리디큘 이미지를 사용하여 결과값을 제곱 마이크로미터(µm²)로 변환하십시오.그런 다음 적혈구 한 개의 면적을 계산하여 대표값을 결정합니다. 데이터가 획득되면 검출된 각 응집체 내의 적혈구 수를 추정합니다. 고속 카메라를 사용하여 미세입자 이미지 유속계(microparticle image velocimetry) 시스템에 사용되는 이중 펄스 카메라로 전환합니다.유동의 이미지 획득 및 속도장 결정을 위한 이미지 프로세싱을 위해 여기에 표시된 것과 같은 이미징 소프트웨어를 사용하십시오. 반드시 보호 안경을 착용한 후 레이저 시스템과 카메라의 전원을 켜십시오. 현미경 아래에 마이크로미터를 배치하고, 생성된 이미지를 사용하여 시스템을 보정하십시오.그런 다음 유체 흐름을 시작하고 두 유체 내의 입자들을 시각화합니다. 흐름 내에서 가장 빠르고 밝은 입자들에 초점을 맞추어 마이크로채널의 중간 평면을 찾습니다. 다음으로, 가장 빠른 입자들이 두 이미지 사이에서 5~10 픽셀 정도 이동하도록 프레임 간 시간 간격을 약 2밀리초로 설정하고 유동 O의 기록을 시작합니다. 소프트웨어가 모든 서로 다른 적혈구 현탁액과 서로 다른 전단율에 대해 100쌍의 이미지를 획득하도록 설정하십시오.이미지 전처리를 수행합니다. 상관관계 윈도우의 크기와 모양, 그리고 이미지 중첩 백분율을 선택하십시오. 결과는 100쌍의 이미지로부터 계산된 평균 속도장과 속도의 제곱평균제곱근 오차(root mean square error)로 나타냅니다.레이저 카메라와 컴퓨터의 전원을 끕니다. 모든 측정과 이미지 프로세싱이 완료되면, 먼저 고속 카메라 녹화 영상을 기반으로 마이크로 채널 내 혈액 두께를 검출 및 추정하여 전단율(shear rate)을 계산합니다. 이를 위해 해당 녹화 영상의 모든 프레임을 평균하여 비디오의 배경 이미지를 얻습니다.마지막으로, 모든 프레임의 평균 이미지를 시각적으로 검사하여 혈액층의 경계를 수동으로 검출함으로써 혈액층의 두께를 정합니다. 그런 다음 추출된 속도 프로파일에서 해당 혈액층 두께에 해당하는 속도 값을 수동으로 얻고, 이 속도 값을 혈액층 두께로 나누어 전단율을 계산합니다. 여기에 표시된 두께는 3개의 연속된 프레임에서 검출된 4개 적혈구 응집체의 순 이동 거리입니다.30개 이상의 세포로 구성된 대형 응집체는 빨간색으로 표시되어 있습니다. 9개에서 30개 사이의 세포로 구성된 중간 크기 응집체는 초록색으로 표시되며, 9개 미만의 세포로 구성된 소형 응집체는 파란색으로 표시됩니다. 응집체의 속도는 표시된 미세유체 채널 내의 위치에 따라 달라집니다.다음은 유량 10 microliters per hour에서 헤마토크릿(hematocrit) 5%, 10%, 15%로 부유된 적혈구의 속도 프로파일입니다. 예상대로 양쪽 가장자리에서 속도가 0을 향하는 것을 확인할 수 있으며, 전체 전단율(shear rate)이 증가함에 따라 각 헤마토크릿 수준에서 응집체의 크기가 감소하므로 두 유동 스트림 사이의 변곡점은 헤마토크릿 수준에 따라 약간씩 달라집니다. 이는 마이크로채널 내의 전단력이 응집력보다 커져 적혈구가 해리되기 때문입니다.이 절차를 수행할 때, 마이크로 채널 내 흐름의 이미지 품질을 확보하고 흐르는 적혈구와 이미지 배경 사이의 대비를 분명하게 하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 제어된 흐름 조건 하에서 적혈구 응집체를 정성적 및 정량적으로 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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