적혈구 집계 동적 조사를위한 미세 유체 제어 환경

본 실험 과정의 전반적인 목표는 제어된 일정 전단율 하에서 미세혈관 내의 적혈구 응집체를 동적으로 직접 정량화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 적혈구 현탁액과 인산염 완충 식염수를 이중 Y자형 미세채널에 주입하여 혈액층에 일정한 전단력을 형성시킵니다. 다음 단계로 고속 카메라를 사용하여 흐름을 시각화하고 기록합니다.

다음으로, 이미지 처리 기술을 사용하여 녹화된 영상을 처리하고 마이크로채널 내의 평균 응집체 크기와 응집체 크기 분포를 구합니다. 마지막 단계는 두 연속 프레임 사이에서 마이크로채널에 주입된 형광 입자의 변위를 추적하여 혈류 속도를 결정하는 것입니다. 최종적으로, 혈류 속도와 혈액층 두께를 기반으로 마이크로채널 내의 전단율을 계산하여 응집체 크기와 그에 해당하는 국소 전단율 사이의 관계를 도출합니다.

광투과법과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 다른 기술들처럼 통계적으로 분석하는 것이 아니라 미세 전단 흐름 내에서 적혈구 응집체를 동적으로 분석한다는 점입니다. 이 방법은 적혈구 응집체 형성 조건의 이해 및 미세 순환에서의 혈류학적 거동 규명과 같이 혈액학적 방사선 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 표준 포토리소그래피 공정에 따라 너비 120 microns, 높이 60 microns, 길이 7 mm의 미세 채널을 제작하십시오.

다음으로, 건강한 자원봉사 기증자로부터 혈액 세포를 수집하고 동봉된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 헤마토크릿 수치가 5%, 10%, 15%인 적혈구 현탁액을 준비한 후, 각 적혈구 현탁액 1 mL에 형광 추적 입자가 포함된 1% 용액 60 µL를 혼합하십시오. 튜브를 가볍게 흔들어 용액을 섞어줍니다. 또한, pH 7.4의 PBS 1 mL에 동일한 부피의 추적 입자를 혼합하십시오.

적혈구가 포함된 추적자 용액을 25 µL 유리 주사기에 채우고, 100 µL 유리 주사기도 준비합니다. PBS 내의 추적자 용액을 사용하여 시스템에 기포가 없는지 확인합니다. 다음으로, 초당 18프레임 이상의 기록이 가능한 고속 카메라 및 마이크로 입자 이미지 속도 측정(microparticle image velocimetry) 시스템이 연결된 도립 현미경 스테이지 위에 마이크로채널을 배치합니다.

각 주사기를 튜브를 통해 미세유체 채널의 입구 포트 중 하나에 연결한 다음, 동일한 주사기 펌프의 홀더에 장착합니다. 주사기 펌프를 설정하여 25 µL 주사기가 시간당 2 µL의 속도로 분사되도록 프로그래밍합니다. 이 경우, 주사기 크기 차이로 인해 100 µL 주사기는 그 4배의 속도로 분사됩니다.

다양한 전단 속도를 테스트하기 위해 실험 사이에 유량을 변경하십시오. 고속 카메라를 보정하려면 20배 렌즈를 장착한 상태에서 보정용 자(calibration ridicule)를 사용하십시오. 그런 다음 펌프를 작동시켜 두 용액을 마이크로채널에 분주하기 시작하십시오.

응집체의 선명한 이미징을 위한 최적의 카메라 노출 시간을 결정하십시오. 측정을 시작하기 전 유동이 정상 상태(steady state)에 도달할 때까지 기다리는 것이 중요합니다.

이제 3~5분 이내에 정상 상태(steady state)에 도달합니다. 시린지를 다시 채워 혼합물을 조절하고 적혈구가 부유 상태를 유지하도록 합니다. 정상 상태의 흐름에 도달하면, 적혈구의 이동을 기록하기 시작합니다.

흐름을 7초 동안 기록하십시오. 이미지 처리 기능이 있는 프로그램을 사용하여, 히스토그램 평활화(histogram equalizer) 방법을 통해 획득한 각 그레이스케일 이미지의 대비를 향상시킵니다. 그다음, 그레이스케일 이미지를 이진 이미지로 변환하십시오.

여러 값을 테스트하여 모든 응집체가 적절하게 검출되는 값을 선택함으로써 임계값을 신중하게 설정하십시오. 필요한 경우, 하나의 응집체 내에 존재하는 간격에 해당하는 구멍을 채우십시오. 그 다음, 이진 이미지에서 인접한 흰색 픽셀을 판별하여 인접한 세포들이 응집체로 계산되도록 세포를 검출하십시오.

검출된 서로 다른 적혈구 응집체에 라벨을 지정한 다음, 더 나은 시각화를 위해 이진 이미지를 RGB 이미지로 변환합니다. 마지막으로, RGB 이미지를 원본 이미지 위에 오버레이합니다. 이미지 처리 효율을 검증하기 위해, 검출된 픽셀 수를 기반으로 프레임 내에서 검출된 각 응집체의 면적을 계산합니다.

모든 프레임을 동일한 방식으로 처리하십시오. 다음으로, 각 프레임에서 검출된 응집체 크기의 평균을 구한 뒤, 모든 프레임의 결과값을 평균하십시오. 적혈구 현탁액 엔진의 각 기록에 대한 평균 응집체 크기를 얻으려면, 리디큘 이미지를 사용하여 결과값을 제곱 마이크로미터(µm²)로 변환하십시오.

그런 다음 적혈구 한 개의 면적을 계산하여 대표값을 결정합니다. 데이터가 획득되면 검출된 각 응집체 내의 적혈구 수를 추정합니다. 고속 카메라를 사용하여 미세입자 이미지 유속계(microparticle image velocimetry) 시스템에 사용되는 이중 펄스 카메라로 전환합니다.

유동의 이미지 획득 및 속도장 결정을 위한 이미지 프로세싱을 위해 여기에 표시된 것과 같은 이미징 소프트웨어를 사용하십시오. 반드시 보호 안경을 착용한 후 레이저 시스템과 카메라의 전원을 켜십시오. 현미경 아래에 마이크로미터를 배치하고, 생성된 이미지를 사용하여 시스템을 보정하십시오.

그런 다음 유체 흐름을 시작하고 두 유체 내의 입자들을 시각화합니다. 흐름 내에서 가장 빠르고 밝은 입자들에 초점을 맞추어 마이크로채널의 중간 평면을 찾습니다. 다음으로, 가장 빠른 입자들이 두 이미지 사이에서 5~10 픽셀 정도 이동하도록 프레임 간 시간 간격을 약 2밀리초로 설정하고 유동 O의 기록을 시작합니다. 소프트웨어가 모든 서로 다른 적혈구 현탁액과 서로 다른 전단율에 대해 100쌍의 이미지를 획득하도록 설정하십시오.

이미지 전처리를 수행합니다. 상관관계 윈도우의 크기와 모양, 그리고 이미지 중첩 백분율을 선택하십시오. 결과는 100쌍의 이미지로부터 계산된 평균 속도장과 속도의 제곱평균제곱근 오차(root mean square error)로 나타냅니다.

레이저 카메라와 컴퓨터의 전원을 끕니다. 모든 측정과 이미지 프로세싱이 완료되면, 먼저 고속 카메라 녹화 영상을 기반으로 마이크로 채널 내 혈액 두께를 검출 및 추정하여 전단율(shear rate)을 계산합니다. 이를 위해 해당 녹화 영상의 모든 프레임을 평균하여 비디오의 배경 이미지를 얻습니다.

마지막으로, 모든 프레임의 평균 이미지를 시각적으로 검사하여 혈액층의 경계를 수동으로 검출함으로써 혈액층의 두께를 정합니다. 그런 다음 추출된 속도 프로파일에서 해당 혈액층 두께에 해당하는 속도 값을 수동으로 얻고, 이 속도 값을 혈액층 두께로 나누어 전단율을 계산합니다. 여기에 표시된 두께는 3개의 연속된 프레임에서 검출된 4개 적혈구 응집체의 순 이동 거리입니다.

30개 이상의 세포로 구성된 대형 응집체는 빨간색으로 표시되어 있습니다. 9개에서 30개 사이의 세포로 구성된 중간 크기 응집체는 초록색으로 표시되며, 9개 미만의 세포로 구성된 소형 응집체는 파란색으로 표시됩니다. 응집체의 속도는 표시된 미세유체 채널 내의 위치에 따라 달라집니다.

다음은 유량 10 microliters per hour에서 헤마토크릿(hematocrit) 5%, 10%, 15%로 부유된 적혈구의 속도 프로파일입니다. 예상대로 양쪽 가장자리에서 속도가 0을 향하는 것을 확인할 수 있으며, 전체 전단율(shear rate)이 증가함에 따라 각 헤마토크릿 수준에서 응집체의 크기가 감소하므로 두 유동 스트림 사이의 변곡점은 헤마토크릿 수준에 따라 약간씩 달라집니다. 이는 마이크로채널 내의 전단력이 응집력보다 커져 적혈구가 해리되기 때문입니다.

이 절차를 수행할 때, 마이크로 채널 내 흐름의 이미지 품질을 확보하고 흐르는 적혈구와 이미지 배경 사이의 대비를 분명하게 하는 것이 중요합니다. 이 영상을 시청하고 나면, 제어된 흐름 조건 하에서 적혈구 응집체를 정성적 및 정량적으로 분석하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.