세포 외 소포의 분리 및 특성에 대한 종이 기반의 장치

이 절차의 전반적인 목표는 종이 기반 플랫폼을 사용하여 세포 외 소포체를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 원형 셀룰로오스가 있는 두 개의 폴리스티렌 시트로 라미네이팅하여 수행되며, 등록된 관통 구멍 배열에 정렬된 종이 컷아웃이 있습니다. 두 번째 단계는 세포 외 소포체를 종이 테스트 영역에 결합하는 분자를 화학적으로 접합하는 것입니다.

다음으로, 생물학적 샘플을 종이 테스트 영역에 직접 피펫으로 주입할 수 있으며, 헹굼 단계 후에 세포외 소포체를 분리할 수 있습니다. 마지막 단계는 전자 현미경, Eliza 또는 전사체 분석을 사용하여 캡처된 세포외 소포체를 특성화하는 것입니다. 궁극적으로, 10마이크로리터 정도의 작은 혈청 샘플에서 추출한 세포외 소포체의 부분 집합을 정제하고 농축할 수 있습니다.

따라서 울트라 교육과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 훨씬 부드럽게 조립되고 수행이 간단하다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 대학원생이 될 것입니다. 폴리스티렌 두 장으로 시작하여 원형 컷아웃 배열을 만듭니다.

각각 수동 홀 펀치 또는 CAD, 자동 커터 플로터를 사용하여 직경이 5mm 미만입니다. 또한 일련의 5mm 직경 크로마토 그래피, 구멍 펀치가있는 종이 디스크를 잘라냅니다. 벤치에 폴리스티렌 시트 하나를 놓고 해당하는 각 관통 구멍 위에 단일 종이 디스크를 오버레이합니다.

폴리스티렌의 두 번째 시트를 등록하고 오버레이하여 종이 디스크를 끼웁니다. 써멀 라미네이터에서 샌드위치를 접착하기 전에 전체 정렬을 확인하십시오. 다음으로, 라미네이트 된 장치를 플라즈마 챔버에 삽입하여 종이 디스크의 화학적 표면 변형을 시작하십시오.

챔버 진공이 해제되면 산소 플라즈마로 종이 표면을 잠시 활성화하고 즉시 종이 장치를 실린 용액에 옮기고 30 분 동안 배양합니다. 실내 온도를 설정합니다. 5ml의 200프루프 에탄올로 장치를 헹궈 과도한 cy-lane을 제거합니다.

그런 다음 15분 동안 A-G-M-B-S 링커 솔루션으로 장치를 배양합니다. 실내 온도를 설정합니다. 풍부한 양의 에탄올 헹굼으로 과도한 링커 분자를 제거합니다.

다음으로, 섭씨 4도에서 1시간 동안 아바돈으로 장치를 배양하고 5밀리리터 PBS 세척으로 결합되지 않은 아바돈을 제거합니다. 그런 다음 장치는 항체 결합 단계로 진행하거나 필요한 경우 4주 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다. Aden이 부착된 후 노출된 종이 디스크 영역에 차단 용액 10마이크로리터를 피펫으로 넣고 종이를 10분 동안 배양합니다.

실온에서 10마이크로리터의 차단 용액을 추가하고 10분 실온 배양을 반복합니다. 노출된 종이 기질 피펫의 생체 기능화를 완료하기 위해 10마이크로리터의 비오틴화된 포획 분자를 디스크 상에 두 번 더 배양하고 세포외 소포체의 경우 실온에서 10분 동안 배양합니다. 선택한 포획 분자는 항 CD 63 항체 또는 xin 5일 수 있습니다. 10마이크로리터 피펫팅과 10분 배양 과정을 반복합니다.

두 번 더 분자 부착을 포착한 후. 피펫팅으로 여분의 부분을 씻어냅니다. 각 종이 디스크에 10마이크로리터의 적절한 세척 버퍼를 넣습니다.

실온에서 1분 동안 세척을 배양하고 10마이크로리터 세척 및 1분 배양 단계를 두 번 더 반복합니다. 완전히 기능화된 종이 장치는 이제 혈청 처리를 위해 혈청 또는 수액에서 세포 외 소포를 분리할 준비가 되었습니다. 액츄테이너 튜브에 말초 혈액 10ml를 모으고 튜브를 부드럽게 5회 뒤집습니다.

튜브를 수직으로 놓고 30분 동안 기다립니다. 실내 온도를 설정하고 혈액 샘플을 15분 동안 원심분리합니다. 실내 온도를 설정합니다.

상단 투명 세럼 층을 깨끗한 플라스틱 튜브로 옮기고 하단 반고체상을 버립니다. 30분 동안 더 높은 원심분리 속도로 혈청을 정화합니다. 실내 온도를 설정합니다.

상층액을 새 튜브에 옮기고 0.8마이크로미터 필터에 상등액을 통과시켜 미세 입자를 제거합니다. 이렇게 만들어진 여과된 혈청은 즉시 사용하거나 섭씨 영하 80도에서 보관할 수 있습니다. 체액에서 세포외 소포체를 추출해야 하는 경우, 침습적 절차를 통해 환자로부터 직접 수액을 채취하고 샘플을 섭씨 영하 80도에서 보관합니다.

사용하기 전에는 유리체액 샘플에 대한 여과 또는 정화 단계가 필요하지 않습니다. 혈청 또는 수액으로부터 세포외 소포체를 분리하려면 5마이크로리터의 생물학적 샘플을 각 생체 기능화 종이 기질 디스크에 피펫으로 고정합니다. 실온에서 1분 동안 반점을 배양하고 5마이크로리터 피펫팅과 1분 배양 과정을 반복합니다.

두 번 더 친화성 결합 후, 먼저 적절한 세척 완충액 10마이크로리터를 피펫팅하여 결합되지 않은 소포를 헹굽니다. 실온에서 1분 동안 완충액을 배양하고 10마이크로리터 세척 후 후속 배양을 반복합니다. 두 번 더 단계를 밟습니다.

포획된 세포외 소포체는 이제 포획된 소포를 기능화된 종이 지지 피펫 10마이크로리터에 고정하기 위해 다음 다운스트림 분석을 수행할 준비가 되었습니다. 가교 반응을 실온에서 10분 동안 진행하고 5분 동안 다량의 PBS가 있는 모든 디스크를 헹굽니다. 다음으로, 다음 세척을 순서대로 적용하여 종이 기판을 탈수합니다.

35% 에탄올 배양 1회, 50% 에탄올 배양 2회, 70% 에탄올 배양 2회, 95% 에탄올 배양 2회, 100% 에탄올 배양 4회. 개별 세척마다 에탄올 용액을 실온에서 10분 동안 종이 디스크 위에 배양합니다. 종이 장치가 뼈가 마르면 스퍼터링하고 금속 스퍼터에 18나노미터의 팔라듐 금 층으로 샘플을 코팅합니다.

샘플을 주사 전자 현미경에 삽입하고 5kV에서 현미경 검사를 수행하여 생물학적 샘플의 과도한 충전을 방지하고 면역 분석을 통해 포획된 소포를 검출합니다. 먼저 각 종이 디스크에 5마이크로리터의 anti-CD 9차 항체를 추가하고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 기계적 교반을 통해 종이 장치를 30ml의 실온 PBS로 세척하여 결합되지 않은 모든 항체를 제거합니다.

다음으로, 5마이크로리터의 무 과산화효소(horse radish peroxidase) 피펫을 사용하여 2차 항체를 각 종이에 접합시켰습니다. 디스크를 만들고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 결합되지 않은 2차 항체를 제거하기 위해 기계적 교반을 통해 30ml의 PBS로 장치를 세척합니다.

마지막으로, 5마이크로리터의 색상 및 미터법 기판 혼합물을 각 종이에 추가합니다.디스크. 실온에서 20-30분 동안 반응을 배양하고 데스크탑 스캐너를 사용하여 그에 따른 별색 강도의 변화를 스캔합니다. 시작하려면 가위나 면도날을 사용하여 과도한 폴리스티렌 라미네이트 영역을 잘라내어 벌크 장치에서 개별 종이 디스크를 분리합니다.

각 종이 디스크를 깨끗한 1.5ml 마이크로 원심 분리기에 넣습니다. 2개는 265마이크로리터의 용해 완충액을 추가하여 포획된 소포를 lys합니다. 그리고 35 마이크로 리터의 PVP 기반 다당류 제거 캐리어를 각 튜브 소용돌이에 격렬하게 연결합니다.

완전한 소포, 용해 및 유리된 RNA 분자의 제거를 보장하기 위해 용해물 와류에 30마이크로리터의 균질화 용액을 첨가하여 튜브를 혼합하고 10분 동안 얼음 위에서 배양합니다. 다음으로, 330마이크로리터의 산성 페놀 클로로포름 혼합물을 용해물에 첨가하여 튜브당 최소 15초 동안 단백질과 DNA 와류에서 RNA의 적절한 위상 특이적 분리를 보장합니다. 튜브를 5분 동안 최고 속도로 원심분리합니다.

실온에서 상부 수성상이 포함된 RNA를 새로운 1.5ml 튜브로 옮기고 하부 유기상은 버립니다. RNA에 100% 에탄올 1.25 수성 부피를 추가하고 잠시 소용돌이쳐 섞습니다. 그런 다음 혼합물을 상업용 RNA 고체 추출 컬럼에 적용합니다.

실온에서 15초 동안 튜브를 원심분리하고 플로우 스루 분획을 버립니다. 700마이크로리터의 작업 용액을 추가하여 컬럼을 세척합니다. 첫 번째, 튜브를 5-10초 동안 원심분리하고 흐름을 버립니다.

다음으로, 500마이크로리터의 작업 용액으로 컬럼을 세척합니다. 두 번째, 튜브를 5초에서 10초 동안 원심분리합니다. 흐름을 버리고 세척을 한 번 더 반복합니다.

실온에서 마지막 1분 동안 탈수하여 잔류 에탄올을 제거하고 건조된 추출 컬럼을 새로운 1.5ml 튜브로 옮깁니다. 예열된 R RNA 자유수 100마이크로리터를 추가합니다. 튜브를 5-10초 동안 최고 속도로 원심분리하고 필요하다고 판단되는 경우 상단 추출 컬럼을 폐기합니다.

형광 표지된 비오틴을 사용하는 상용 RNA 세척 키트를 사용하여 RNA EIT를 농축하고 추가로 정제합니다. surface Im mobilization의 기자로서. 종이 기능화 프로토콜의 효능과 특이성은 가교제 개질 표면에서 발생하는 높은 형광을 비기능성 종이 표면과 비교하여 확인할 수 있습니다.

또한, 리포터 분자가 비오틴화된 항 CD 63 항체로 대체될 때, 적절하게 기능화된 종이 기질은 음성 대조군 종이 기질보다 더 높은 세포외 소포 포획 속도를 촉진할 것입니다. 서로 다른 포획 분자가 종이 기판에 고정될 때, 세포 외 소포의 다른 하위 그룹은 종이 장치를 사용하여 다른 크기 분포를 나타내는 것으로 보입니다. 또한 방광 내 RNA 함량과 소포 특이적 표면 단백질의 풍부함을 모두 분석할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 종이 기반 장치를 사용하여 세포 외 레에서 상승을 분리하고 수용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.