Name: 세포 외 소포의 분리 및 특성에 대한 종이 기반의 장치 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: 학습하세요 종이 기반 플랫폼을 이용한 세포 외 소포(EV) 분리 방법을 배우세요. 초원심 분리 없이 10μL 혈청 샘플에서 빠르게 EV를 분리하고 전자현미경, ELISA, 전사체 분석으로 특성화할 수 있습니다.

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이 작품은 대만 국립 과학위원회 grants- NSC 99-2320-B-007-005-MY2 (CC) 및 NSC 101-2628-E-007-011-MY3 (CMC) 및 재향 군인의 일반에 의해 부분적으로 지원 병원과 대만의 공동 연구 프로그램의 대학 시스템 (CC).

작업 절차의 일반 다이어그램 그림 1에 제공됩니다. 윤리 실천을 사용하여, 우리는 (정상인의 혈액 샘플을 수집하고, IRB는 프로토콜을 승인 대만에서 타이 재향 군인 병원 (TCVGH), 타이 통해 환자의 방수 샘플을 얻을 IRB TCVGH 번호 CF11213-1). 종이 장치 1. 제작 <ol><li> 96- 웰 마이크로 타이 터 플레이트와 같은 레이아웃을 제공하도록 직경 5mm의 원으로 크로마토 종이 잘라. 등록 관통 구멍, 라미네이트 두 폴리스티렌 시트 이러한 종이 조각을 샌드위치. </li><li> 다음 28 단계에서 설명한 화학적 컨쥬 게이션 방법을 사용하여 용지를 수정 장치. <ol><li> 플라즈마 챔버에서의 산소 플라즈마 (100 mW의 1 % 산소, 30 초)와 함께 종이 취급 장치. 주의 : 3- 머 캅토 프로필 트리 메 톡시 실란 및 N -γ 말레이 미도 숙신이 미드로 작업 할 때 특별한주의를 기울여야합니다에스테르 (GMBS), 그들은 모두 습기에 민감하고 독성이 있기 때문이다. 보호 장갑을 착용하고 흡입을 피하거나 피부 및 눈에 접촉. 밀폐하여 주식 병을 유지하고 결로를 방지하기 위해 열기 전에 RT 평형 수 있습니다. 또한, 질소 충전 장갑 가방이나 상자 안에 주식 병을 엽니 다. 작은 튜브로 나누어지는 주식 병을 자주 개방을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 바로 30 분 동안 에탄올 (200 증명)에 3- 머 캅토 프로필 트리 메 톡시 실란의 4 % (v / v)의 용액에 용지 처리 장치를 배양한다. </li><li> 에탄올로 종이 장치를 씻어 15 분간 에탄올에 0.01 μmol / ㎖ GMBS으로 그들을 품어. </li><li> 에탄올 (200 증명) 헹군 후 4 ℃에서 1 시간 동안 인산염 완충 식염수 (PBS)에 10 ㎍ / ml의 아비딘 용액을 종이 장치를 품어. 4 ° C에서 보관이 필요한 경우, 4 주 이내에 사용한다. </li></ol></li><li> (BSA를 PBS 10 μL가 소 혈청 알부민 (/ V W) 1 %를 함유하는 각 용지 테스트 존 적셔) 3 × 10 분 동안 캡처 분자를 바이오틴 10 μl를 안보 전에 3 × 10 분. 또는 아 넥신 V (1:20 넥신 V 결합 버퍼에 v / v)의 항 CD63 항체를 사용하여 (PBS는 w / v)의 BSA와 0.09 % (/ v)의 아 지드 화 나트륨 w (1 %를 포함하는 20 μg의는 / ㎖) 포획 분자. </li><li> PBS는 각각 3 × 1 분간 완충액 결합 BSA 또는 아 넥신 V (/ V W) 1 %를 함유하는 상응하는 10 μl를 이용하여 결합되지 않은 항 CD63 항체 또는 아 넥신 V 분자를 씻어. </li></ol> 2. 혈청 및 방수 샘플 수집 및 처리 <ol><li> 혈청 수집. <ol><li> 혈청 분리 튜브에 정맥 천자에 의해 말초 혈액 10 ㎖를 수집하고 부드럽게 튜브 다섯 번 반전. 수직으로 튜브를 설정하고 30 분 동안 기다립니다. </li><li> 15 분 동안 1,200 × g에서 원심 분리기. 30 분 동안 3,000 × g에서 다시 깨끗한 튜브 가기 층에서 혈청, 원심 분리기를 전송합니다. </li><li> 0.8 μm의 FIL 통해 뜨는을 전달터. 사용할 때까지 -80 ° C에서 샘플을 보관하십시오. </li></ol></li><li> 수성 유머 컬렉션 : 사용할 때까지 -80 ° C에서 직접 절차 및 샘플을 저장 침략을 통해 안과 의사에 의해 진단 된 환자에서 방수 샘플을 수집합니다. </li></ol> 세포 외 소포 3. 분리 <ol><li> 5 μL / 분의 속도로 각각의 용지 상에 테스트 존 순간 표본. </li><li> BSA 또는 넥신 V 각각 항 CD63 항체 또는 아 넥신 V 분자로 기능화 된 종이 장치의 3 × 1 분간 완충액 바인딩 (/ V는 W) PBS 1 % 함유 대응 10 μL와 언 바운드 전기차 헹구어. 다음과 같은 다운 스트림 분석을 수행합니다. </li></ol> 4. 다운 스트림 분석 예 1 : 스캔 Electromicrographs <ol><li> 10 분 동안 10 μL 0.5 × Karnovsky의 정착을 사용하여 작용 종이 테스트 존에서 캡처 한 전기 자동차를 수정합니다. </li><li> 2 × 5 분 동안 충분한 PBS로 샘플을 씻어. </li><li> 탈수10 분, 2 × 10 분, 50 % 에탄올, 2 × 10 분, 70 % 에탄올, 2 × 10 분, 95 % 에탄올, 4 × 10 분 동안 100 % 에탄올 이후 35 % 에탄올로 샘플. </li><li> 건조 및 코트에게 긴급 팔라듐 / 금으로 샘플을 스퍼터링하고, 저 전자 가속 전압에서 작동 사형 전자 현미경을 사용하여 검사 (~ 5 kV로). </li></ol> 5. 다운 스트림 분석 예 2 : 종이 기반의 ELISA <ol><li> 1 항 CD9 차 항체를 함유하는 5 μL 솔루션을 추가 : 1000 희석 PBS에서 캡처 전기 자동차를 포함하는 각 시험 영역에. 1 분을 기다립니다. </li><li> PBS가 30 초 동안 100 rpm으로 진탕 ml의 30 샘플을 씻어. </li><li> 5 μL 솔루션을 포함하는 고추 냉이 과산화 효소 (HRP)를 1 차 항체를 -linked 추가 PBS 1,000 희석하고 1 분을 기다립니다. </li><li> PBS가 30 초 동안 100 rpm으로 진탕 ml의 30 샘플을 씻어. </li><li> 과산화수소의 부피비 1 : 1를 함유하는 5 μL 비색 기질 추가D의 3,3 &#39;, 5,5&#39;- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB)와 데스크탑 스캐너를 사용하여 스캔. </li></ol> 6. 다운 스트림 분석의 예 3 : RNA 분리 <ol><li> 캡처 된 전기 자동차를 용해하는 버퍼를 바인딩 / 폴리 비닐 피 롤리 돈 기반 RNA 분리 원조의 35 μL와 용해의 265 μL에 샘플을 담가. 소용돌이 적극적으로. </li><li> 해물에 격리 키트에 30 μL 균질를 추가합니다. 소용돌이는 적극적으로 10 분 동안 얼음에 넣어. </li><li> 다음 단계에 설명 된 산 페놀 - 클로로포름 분리를 사용하여 RNA를 추출합니다. <ol><li> 병의 바닥 층에서 페놀 - 클로로포름 330 μl를 타고 균질 / 해물을 추가 할 수 있습니다. 소용돌이 적극적으로. </li><li> 5 분 동안 10,000 XG에 원심 분리기. 깨끗한 튜브로 수성 (위)의 위상을 전송하고 제거 볼륨을 확인합니다. </li></ol></li><li> 이전 단계에서 제거 및 CO 성상의 1.25 배 부피 100 부피 % 에탄올 총 RNA를 침전95 ° C로 예열 용출 용액에서 RNA를 llect. </li><li> 농축시키고, 상기의 제조 프로토콜에 따라 RNA 정리 키트를 사용하여 RNA를 정제. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 금융 이익이 없다는 것을 선언합니다.

세포 외 소포의 하위 그룹의 성공적인 분리를위한 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 용지 1) 좋은 선택; 종이 섬유의 표면 상에 포획 분자의 2)에 따르면 안정적이고 높은; 3) 시료의 적절한 처리; 4) 일반 실험실 위생 기준. 다공성 물질은 많은 저렴하고 장비가없는 분석에 사용되어왔다. 이들은 가변 공경, 다목적 기능, 저가 및 높은 표면 대 부피 비율 유체의 수동적 위킹을 허용을 가질 수도있다. 우리는 주로 적절한 기공 크기와 낮은 단백질 흡착 크로마토 그래피 셀룰로오스 종이 1 등급을 선택했다. 다른 일반적으로 사용되는 다공성 물질, 니트로 셀룰로오스에 비해, 셀룰로오스 종이 훨씬 낮은 비특이적 단백질 흡착 (34)를 갖는다. 우리는 또한이 연구에서 전기 자동차의 작은 비특이적 캡처를 찾을 수 있습니다. 또한, 그 입자 보유 수준으로 11㎛가 특정 캡쳐를 허용 전기차 (35)의 크기보다 큰전기 자동차의 물리적 트래핑에 대비. 여...

세포외 소포체(EV)는 크기가 40nm에서 5,000nm인 이질적인 막질 입자이며 다양한 생물 발생 경로1-9를 통해 많은 세포 유형에 의해 활발하게 방출됩니다. 그들은 DNA, RNA, 단백질 및 부모 세포의 표면 마커의 독특하고 선택된 부분 집합을 포함합니다. 세포간 통신(intercellular communication)10, 면역조절(immunity modulation)11, 혈관신생(angiogenesis)12, 전이(metastasis)12, 화학저항력(chemoresistance)13, 안과 질환(Eye diseases)9의 발병과 같은 다양한 세포 과정에 대한 그들의 관여는 점점 더 인식되고 있으며, 진단, 예후, 치료 및 기초 생물학 응용에서의 유용성에 대한 큰 관심을 불러일으키고 있다.
EV는 생물 발생 또는 세포 기원에 따라 엑소좀, 미세소포체, 세포자멸사, 종양소체, 엑토솜, 미립자, 텔레로솜, 프로스타토솜, 카디오솜, 벡소좀 등으로 고전적으로 분류할 수 있습니다. 예를 들어, 엑소좀은 다소포체(multivesicular body)에서 형성되는 반면, 미세소포(microvesicle)는 원형질막(plasma membrane)에서 직접 발아하여 생성되며, 자가사멸 소포(apoptotic vesicle)는 자가사멸 세포(apoptotic cell) 또는 괴사세포(necrotic cell)에서 생성됩니다. 그러나 명명법은 여전히 정제되지 않았는데, 부분적으로는 EV에 대한 철저한 이해와 특성화가 부족하기 때문입니다. EV를 정제하기 위해 초원심분리(ultracentrifugation) 14, 한외여과(ultrafiltration) 15, 마그네틱 비드(magnetic beads)16, 고분자 침전(polymeric precipitation 17-19), 미세유체 기술(microfluidic techniques) 20-22 등 여러 가지 방법이 개발되었습니다. EV를 정제하는 가장 일반적인 절차에는 큰 파편 및 기타 세포 오염 물질을 제거하기 위한 일련의 원심분리 및/또는 여과가 포함되며, 비용이 많이 들고 지루하며 비특이적인 프로세스인 최종 고속 초원심분리가 포함됩니다14,23,24. 불행히도 만족스러운 순도와 효율성을 갖춘 EV의 빠르고 신뢰할 수 있는 절연에 대한 기술적 요구는 아직 충족되지 않았습니다. 
우리는 EV22의 하위 그룹을 분리하고 특성화하는 간단하고 시간과 비용을 절약하면서도 효율적인 방법을 제공하는 종이 기반 면역친화성 장치를 개발했습니다. 정의된 모양으로 절단된 셀룰로오스 종이는 관통 구멍이 등록된 두 개의 플라스틱 시트를 사용하여 배열하고 적층할 수 있습니다. 소수성 왁스 또는 폴리머25-27을 인쇄하여 종이 기반 장치에서 유체 경계를 정의하는 일반적인 전략과 달리, 이러한 적층 종이 패턴은 에탄올을 포함한 많은 유기 액체에 내성이 있습니다. 종이 테스트 영역은 EV 하위 그룹의 특정 표면 마커에 대한 친화력이 높은 포획 분자(예: 표적 특이적 항체)의 안정적이고 조밀한 적용 범위를 제공하기 위해 화학적으로 변형됩니다. 생물학적 샘플은 종이 테스트 영역에 직접 피펫으로 주입할 수 있으며, 정제된 EV는 헹굼 단계 후에도 유지됩니다. 분리된 EV의 특성화는 SEM, ELISA 및 전사체 분석을 통해 수행할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>크로마토그래피 논문</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>3001-861</td><td>Whatman&reg; 1등급 셀룰로오스</td></tr>지<tr><td>(3-메르캅토프로필) 트리메톡시실란</td><td>시그마 알드리치</td><td>175617</td><td>이 화학 물질은 물 및 수분과 반응하므로 질소가 채워진 장갑 주머니에 넣어야 합니다. 눈과 피부에 닿지 않도록 하십시오. 연기를 흡입하거나 증기를 흡입하지 마십시오.</td></tr><tr><td>에탄올</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>BP2818</td><td>Absolute, 200 Proof, 분자 생물학 등급</td></tr><tr><td>소 혈청 알부민(BSA)</td><td>BioShop Canada Inc.</td><td>ALB001</td><td>종종 Cohn fraction V라고 합니다.</td></tr><tr><td>N-&#947;-maleimidobutyryloxy succinimide ester (GMBS)</td><td>Pierce Biotechnology</td><td>22309</td><td>GMBS는 아민-설프히드릴 교차결합제입니다. GMBS는 습기에 민감합니다.</td></tr><tr><td>Avidin</td><td>Pierce Biotechnology</td><td>31000</td><td>NeutrAvidin은 비오틴에 대한 4개의 결합 부위를 가지고 있으며 pI 값은 6.3으로 네이티브 아비딘보다 더 중립</td></tr>적입니다. <tr><td>Biotinylated mouse anti-human anti-CD63</td><td>Ancell</td><td>215-030</td><td>clone AHN16.1/46-4-5</td></tr><tr><td>biotinylated annexin V</td><td>BD Biosciences</td><td>556418</td><td>Annxin V는 포스파티딜세린(PS)에 대한 친화력이 높습니다</td></tr>.<tr><td> 항체</td><td>System Biosciences</td><td>EXOAB-CD9A-1</td><td>2차 항체는 horseradish peroxidise-conjugated</td></tr><tr><td>Serum separation tubes</td>, <td>BD Biosciences</td><td>367991</td><td>Clot activator and gel, and gel for serum separation</td></tr><tr><td>Annexin V binding buffer</td>, <td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td>10x; 사용하기 전에 1x로 희석합니다.</td></tr><tr><td>TMB 기질 시약 세트</td><td>BD Biosciences</td><td>555214</td><td>세트에는 과산화수소와 3,3',5,5'-테트라메틸벤지딘(TMB)</td></tr><tr><td colspan="4">[헤더]</td></tr><tr><td>RNA 분리 키트</td><td>Life Technologies</td><td>AM1560</td><td>MirVana RNA 분리 키트</td></tr><tr><td>폴리비닐피롤리돈 기반 RNA 분리 보조제</td><td>Life Technologies</td><td>AM9690</td><td>식물 RNA 분리 보조제에는 다당류에 결합하는 폴리비닐피롤리돈(PVP)이 포함되어 있습니다.</td></tr><tr><td>RNA 정리 키트</td><td>, Qiagen, Inc.</td><td>74004</td><td>MinElute RNA 청소 키트는 최대 45&nbsp; &뮤; g RNA입니다.</td></tr><tr><td>플라즈마 챔버</td><td>March Instruments</td><td>PX-250</td><td></td></tr><tr><td>주사 전자 현미경</td><td>Hitachi Ltd.</td><td>S-4300</td><td></td></tr><tr><td>데스크탑 스캐너</td><td>Hewlett-Packard Company</td><td>Photosmart B110</td><td>8비트 컬러 이미지를 캡처했습니다. 카메라와 스마트폰도 사용할 수 있습니다.</td></tr><tr><td>이미지 기록 시스템</td><td>J& H Technology Co</td><td>GeneSys G:BOX Chemi-XX8</td><td>16비트 형광 이미지를 캡처했습니다. 형광 현미경도 사용할 수 있습니다.</td></tr></tbody></table>

세포 외 소포의 분리 및 특성에 대한 종이 기반의 장치

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

세포 외 소포 (전기 자동차), 각종 세포에서 방출 막의 입자는, 임상 적용을위한 할 수있는 잠재력을 가지고 있습니다. 그들은 핵산과 단백질화물을 포함 점점 진핵​​ 생물과 원핵 세포 모두에 의해 사용되는 세포 간 의사 소통의 수단으로 인식하고 있습니다. 그러나, 작은 크기로, 전기 자동차의 분리를위한 현재의 프로토콜은 종종 시간이 소요, 복잡하고, 이러한 초 원심 분리기와 같은 큰 샘플 볼륨과 고가의 장비를 필요로합니다. 이러한 한계를 해결하기 위해, 우리는 쉽게 효율적이고, 10 μL로 낮은 샘플 볼륨을 필요 전기차의 서브 그룹들을 분리하기위한 종이 기반 면역 플랫폼을 개발했다. 생물학적 시료는 화학적으로 특정한 EV 표면 마커에 높은 친 화성을 가지고 포획 분자로 변성 된 종이 테스트 존에 직접 피펫 팅 될 수있다. 우리는 주사 전자 현미경 (SEM)을 사용하여 분석의 유효성을 확인, 종이 기반 효소 결합 immunosorbent 분석 (P-ELISA)과 전 사체 분석. 이 종이 기반의 디바이스는 건강과 질병에 EV 기능에 대한 우리의 이해를 발전하기 위해 병원과 연구 환경에서 전기 자동차의 연구를 가능하게 할 것이다.

전기차의 하위 그룹을 분리하는 종이 장치의 기능을 효율적으로 EV 표면 마커의 민감하고 특이 인식에 의존한다. 포획 분자와 종이 섬유의 안정한 다른 변형 28-30 바와 같이 아비딘 - 비오틴 화학 제를 사용함으로써 달성된다. 물리적 흡착 방법의 화학적 결합의 효과와 그 형광 기반의 판독을 사용하여 평가한다. 종이 시험 영역은 단계 1.3에서 20 ㎍ / ml의 형광 단의 R 피코 에리 트린 - 복합 비타민 B 복합체 분자 (PE-비오틴)로 대체 캡처 분자를 제외하고 프로토콜 1 단계)에 따라 제조된다. 종이 시험 영역은 다음 언 바운드 PE-비오틴 분자를 제거하는 PBS로 세척한다. 대조적으로, PBS를 1 % 함유하는 10 ㎕를 20 ㎍ / ml의 PE 비오틴 (w / v)의 BSA 및 0.09 % (w / v)의 아 지드 화 나트륨을 직접 PBS이어서, 3 × 10 분간 종이 테스트 존에서 목격되고 PE 비오틴 염료 분자의 물리적 흡착을 수행하기위한 린스. 화학적수정 된 종이 장치 ( &quot;종이 ...

이 프로토콜은 적게 10 μL의 혈청 샘플에서 세포 외 소체 (전기 자동차), 셀로부터 방출 멤브레인 작은 입자를 분리하는 방법을 자세히 설명. 이 접근법은, 초 원심 분리의 필요성을 회피 분석 시간의 몇 분을 필요로하고, 제한된 양의 시료로부터 전기차의 분리를 가능하게한다.

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

이 절차의 전체적인 목표는 종이 기반 플랫폼을 사용하여 세포 외 소포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 정렬된 관통 구멍 배열 위에 원형 셀룰로오스 종이 컷아웃을 배치하여 두 개의 폴리스티렌 시트로 라미네이팅함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 세포 외 소포가 종이 테스트 구역에 결합할 수 있도록 분자를 화학적으로 접합하는 것입니다.다음으로, 생물학적 시료를 종이 테스트 구역에 직접 피펫팅하며, 세척 단계 후에 extracellular vesicles를 분리합니다. 마지막 단계는 전자 현미경, Eliza 또는 전사체 분석을 사용하여 포획된 extracellular vesicles의 특성을 분석하는 것입니다. 결과적으로, 10 µL만큼 적은 양의 혈청 시료로부터 extracellular vesicles의 하위 집합을 정제하고 농축할 수 있습니다.따라서 초음파 처리와 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 훨씬 더 완만하게 조립이 가능하며 수행 방법이 간단하다는 점입니다. 대학원생이 해당 절차를 시연하겠습니다. 우선 두 장의 폴리스티렌 시트로 원형 컷아웃 배열을 만듭니다.수동 펀치나 CAD 자동 커터 플로터를 사용하여 지름 5 mm 미만의 구멍을 각각 뚫습니다. 또한, 펀치를 사용하여 지름 5 mm의 크로마토그래피 종이 디스크를 여러 장 잘라냅니다. 폴리스티렌 시트 한 장을 벤치 위에 놓고, 각 관통 구멍 위에 종이 디스크를 하나씩 덮어 놓습니다.두 번째 폴리스티렌 시트를 맞추어 덮어 종이 디스크를 샌드위치 구조로 만듭니다. 열 라미네이트기로 접합하기 전에 전체적인 정렬 상태를 확인하십시오. 다음으로, 라미네이트된 장치를 플라스마 챔버에 넣어 종이 디스크의 화학적 표면 개질을 시작합니다.챔버의 진공을 해제한 즉시 산소 플라즈마로 종이 표면을 짧게 활성화한 후, 종이 소자를 cylin 용액에 옮겨 30분 동안 배양합니다. 온도는 실온으로 설정합니다. 5 mL의 200 proof 에탄올로 소자를 헹구어 과잉의 cy lanes를 제거합니다.그런 다음 장치를 A-G-M-B-S 링커 용액과 함께 15분 동안 배양합니다. 온도는 실온으로 설정하십시오. 충분한 양의 에탄올로 헹구어 과잉 링커 분자를 제거합니다.다음으로, 장치를 avadon과 함께 4°C에서 1시간 동안 배양하고 5 mL의 PBS 세척액으로 결합되지 않은 avadon을 제거합니다. 이후 장치를 항체 결합 단계로 진행하거나, 필요한 경우 4°C에서 4주 동안 보관할 수 있습니다. Aden 부착 후, 노출된 종이 디스크 영역에 블로킹 솔루션 10 µL를 피펫으로 분주하고 종이를 10분 동안 배양합니다.실온에서 블로킹 용액 10 µL 첨가와 10분간의 실온 배양 과정을 반복합니다. 노출된 종이 기판의 바이오 기능화를 완료하기 위해 이 과정을 두 번 더 수행합니다. 디스크 위에 비오틴화된 포획 분자 10 µL를 피펫팅하고 실온에서 10분 동안 배양합니다. 세포 외 소낭(extracellular vesicles)의 경우, 포획 분자로 anti-CD63 항체 또는 Annexin V를 선택할 수 있습니다. 10 µL 피펫팅과 10분 배양 과정을 반복합니다.포획 분자 부착 후 두 번 더 반복합니다. 각 종이 디스크에 적절한 세척 버퍼 10 µL를 피펫팅하여 과잉 성분을 씻어냅니다.상온에서 1분 동안 세척액을 반응시킨 후, 10 µL 세척과 1분 반응 단계를 두 번 더 반복합니다. 이제 기능화가 완료된 종이 소자를 사용하여 혈청 또는 방수에서 세포외 소포를 분리할 준비가 되었습니다. 혈청 처리의 경우, vacutainer 튜브에 10 mL의 말초 혈액을 채취하고 튜브를 부드럽게 5회 뒤집어 섞어줍니다.튜브를 수직으로 세워 30분 동안 기다립니다. 실온으로 설정하고 혈액 샘플을 15분 동안 원심분리합니다. 실온으로 설정하십시오.상층의 투명한 혈청 층을 깨끗한 플라스틱 튜브로 옮기고 하층의 반고체 상은 폐기합니다. 더 높은 원심분리 속도로 30분 동안 혈청을 투명화합니다. 온도는 실온으로 설정합니다.상층액을 새 튜브로 옮기고, 상층액을 0.8 µm 필터에 통과시켜 미세 입자를 제거합니다. 이렇게 여과된 혈청은 즉시 사용하거나 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 체액에서 세포외 소포를 추출하려는 경우, 침습적 절차를 통해 환자로부터 방수를 직접 수집하고 시료를 -80 °C에서 보관하십시오.사용 전까지 유리체액 샘플에는 여과 또는 청징 단계가 필요하지 않습니다. 혈청 또는 방수에서 세포외 소포를 분리하려면, 생체 기능화된 종이 기질 디스크 각각에 생물학적 샘플 5 µL를 스폿팅하십시오. 해당 스폿을 상온에서 1분 동안 배양하고, 5 µL 피펫팅과 1분 배양 과정을 반복하십시오.친화성 결합 후, 적절한 세척 버퍼 10 µL를 먼저 피펫팅하여 결합되지 않은 소포를 씻어냅니다. 상온에서 버퍼를 1분 동안 반응시키고, 10 µL 세척과 이어지는 반응 단계를 반복합니다. 이 과정을 두 번 더 수행합니다.포집된 엑소좀(extracellular vesicles)은 이제 다음의 다운스트림 분석을 수행할 준비가 되었습니다. 포집된 소포체를 기능화된 종이 지지체에 고정하기 위해, 각 종이 디스크에 0.5 x karnofsky 고정액 10 µL를 피펫으로 분주합니다. 실온에서 10분 동안 가교 반응이 진행되도록 둔 후, 모든 디스크를 충분한 양의 PBS로 5분 동안 헹굽니다. 다음으로, 아래의 세척 과정을 순서대로 적용하여 종이 기질을 탈수합니다.35% ethanol 배양 1회, 50% ethanol 배양 2회, 70% ethanol 배양 2회, 95% ethanol 배양 2회, 그리고 100% ethanol 배양 4회를 수행합니다. 각 개별 세척 단계마다 ethanol 용액을 종이 디스크 위에 떨어뜨리고 상온에서 10분 동안 배양합니다. 종이 소자가 완전히 건조되면 금속 스퍼터 장비를 사용하여 시료에 18 nanometer 두께의 palladium gold 층을 스퍼터 코팅합니다.시료를 주사 전자 현미경에 넣고, 면역 분석을 통해 포획된 소포체를 검출하기 위해 생물학적 시료의 과도한 충전을 방지하도록 5 kV에서 현미경 관찰을 수행합니다. 먼저 각 종이 디스크에 5 µL의 anti CD9 1차 항체를 첨가하고 상온에서 1분 동안 배양합니다. 기계적 교반을 통해 30 mL의 상온 PBS로 종이 장치를 세척하여 결합되지 않은 모든 항체를 제거합니다.다음으로 각 페이퍼 디스크에 말고추냉이 퍼옥시다아제(horse radish peroxidase)가 접합된 2차 항체 5 µL를 피펫으로 분주하고 실온에서 1분 동안 배양합니다. 기계적 교반을 통해 PBS 30 mL로 장치를 세척하여 결합되지 않은 2차 항체를 제거합니다.마지막으로, 각 종이 디스크(paper disc) 위에 발색 및 측정 기질 혼합물 5 µL를 첨가합니다. 상온에서 20~30분 동안 반응시키고, 데스크톱 스캐너를 사용하여 결과물인 스폿 색상 강도의 변화를 스캔합니다. 시작하려면, 가위나 면도날을 사용하여 과잉의 폴리스티렌 라미네이트 영역을 잘라내어 벌크 장치로부터 개별 종이 디스크를 분리하십시오.각 종이 디스크를 깨끗한 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 265 microliters의 용해 버퍼를 첨가하여 포획된 소포를 용해합니다. 그리고 각 튜브에 35 microliters의 PVP 기반 다당류 제거 캐리어를 넣고 격렬하게 볼텍싱합니다.소포의 완전한 용해와 방출된 RNA 분자의 분리를 보장하기 위해, 균질액 30 µL를 용해물에 넣고 볼텍싱하여 혼합한 후 튜브를 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 단백질 및 DNA로부터 RNA가 상별로 적절히 분리될 수 있도록 산성 페놀 클로로포름 혼합물 330 µL를 용해물에 첨가하고, 튜브당 최소 15초 동안 격렬하게 볼텍싱합니다. 튜브를 최대 속도로 5분 동안 원심분리합니다.실온에서 RNA가 포함된 상층 수성층을 새 1.5 milliliter 튜브로 옮기고 하층 유기층은 버립니다. RNA에 수성층 부피의 1.25배에 해당하는 100%ethanol을 첨가하고 짧게 vortex 하여 혼합합니다. 그런 다음 이 혼합물을 상용 RNA 고체 추출 컬럼에 적용합니다.상온에서 튜브를 15초 동안 원심분리하고 통과액을 제거합니다. 워킹 솔루션 700 µL를 첨가하여 컬럼을 세척합니다. 튜브를 5~10초 동안 원심분리한 후 통과액을 제거합니다.다음으로, 500 µL의 워킹 솔루션으로 컬럼을 세척합니다. 두 번째로, 튜브를 5~10초 동안 원심분리합니다. 통과액을 버리고 세척 과정을 한 번 더 반복합니다.실온에서 1분간 최종 스핀 다운을 수행하여 잔여 에탄올을 제거하고, 건조된 추출 컬럼을 새로운 1.5 milliliter 튜브로 옮깁니다. 미리 가열한 RNase-free water 100 µL를 첨가합니다. 튜브를 최대 속도로 5~10초 동안 원심 분리하고, 필요하다고 판단되면 상단의 추출 컬럼을 제거합니다.형광 표지된 비오틴을 사용하여 상용 RNA 정제 키트로 RNA EIT를 농축하고 추가로 정제합니다. 이는 표면 고정화를 위한 리포터로 사용됩니다. 가교제로 수정된 표면에서 발생하는 높은 형광을 기능화되지 않은 종이 표면과 비교함으로써 종이 기능화 프로토콜의 효능과 특이성을 확인할 수 있습니다.또한, 리포터 분자를 비오틴화된 anti CD 63 항체로 대체하면, 적절하게 기능화된 종이 기질은 음성 대조군 종이 기질보다 더 높은 엑소좀 포획률을 촉진합니다. 서로 다른 포획 분자를 종이 기질에 고정화했을 때, 종이 장치를 사용하면 엑소좀의 서로 다른 하위 그룹들이 서로 다른 크기 분포를 나타내는 것으로 보입니다. 또한, 소낭 내부의 RNA 함량과 소낭 특이적 표면 단백질의 풍부도를 모두 분석할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 종이 기반 장치를 사용하여 세포 외액에서 리소좀을 분리하고 준비하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

출처: Watson, DC, et al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 박테리아 배양 여과액에서 박테리아 세포외 소포(EV)를 분리하기 위해 다공성 수지 비드를 사용한 크기 배제 크로마토그래피를 사용하는 방법을 보여줍니다. 더 큰 EV는 수지 기공을 우회하여 조기에 용리되는 반면, 더 작은 단백질은 기공으로 들어가 나중에 용리됩니다.

크기배제 크로마토그래피를 이용한 박테리아 세포외 소포의 분리 

혈액에 존재하는 세포외 소포체는 다양한 질병에 대한 새로운 바이오마커로 제안되었습니다. 여기에서는 말초 혈액 샘플에서 대형 원형질막 유래 미세소포를 분리하고 기존 유세포 분석 및 웨스턴 블로팅(Western Blotting)을 통한 후속 분석을 위한 프로토콜을 제시합니다.

말초 혈액에서 마이크로 소포의 분리 및 특성

본 보고서는 마이크로글리아 또는 혈액 대식세포로부터 세포외 소포(EV) 격리에 대한 연대순 요구 사항을 강조합니다. Microglia-파생된 EV는 혈액 대식세포 유래 EV가 시험관내 분석에서 C6 신경교종 세포 침입의 대조군에서 연구된 동안 신경이대 발생의 조절자로 평가되었다. 목표는 특정 미세 환경에서 면역 중재자로서 이러한 EV 기능을 더 잘 이해하는 것입니다.

면역 세포 유래 세포 외 소포의 특성화 및 세포 환경에 대한 기능적 영향 연구

제시된 것은 미생물과 외종의 효과적인 농축 및 격리를 위한 종이 기반 장치를 제조하는 프로토콜이다.

마이크로베식및 엑소좀의 종이 기반 전농도 및 격리

본 프로토콜은 시아노박테리아 배양물로부터의 세포밖 소포의 분리, 농도 및 특성화에 대한 상세한 설명을 제공한다. 서로 다른 규모의 문화에서 소포를 정화하기위한 접근법, 방법론 간의 절충점 및 현장 샘플 작업을위한 고려 사항도 논의됩니다.

시아 노 박테리아 세포 밖 소포의 분리 및 특성 분석

최신 세대의 EV 특성화 도구는 여러 파라미터에 대한 단일 EV 분석이 동시에 가능합니다. 나노유세포분석은 표지 없이 45nm보다 큰 모든 생물학적 입자를 측정하고 다양한 형광 표지 기술로 아집단의 특정 특성을 식별합니다.

나노유세포분석을 통한 단일 세포외 소포 막횡단 단백질 특성 분석

이 프로토콜은 공기 분무 노즐의 크기, 시스 유체 압력, 샘플 흐름 압력, 전압, 이득 및 트리거링 임계값 매개변수를 최적화하여 작은 세포외 소포에 대한 신속하고 크기별 분리 방법을 제공합니다.

small extracellular vesicle의 High-throughput Isolation and Purification (고처리량 분리 및 정제를 위한 유세포 분석 분류 파라미터 최적화)

세포외 소포체는 생물의학 응용 분야에 엄청난 가능성을 가지고 있지만, 현재의 분리 방법은 시간이 많이 걸리고 임상적으로 사용하기에는 비실용적입니다. 이 연구에서는 최소한의 단계로 연속적으로 많은 양의 생체 유체에서 세포외 소포체를 직접 분리할 수 있는 미세유체 장치를 제시합니다.

분기된 A4F 미세유체 장치를 사용한 대용량 시료에서 세포외 소포의 단일 단계 분리

여기에서는 인간 피험자의 눈물 및 타액과 같은 생물학적 액체에서 수집된 세포외 소포체(EV)의 특성화 방법을 보여줍니다. 이 방법에 사용된 스캐너는 샘플의 1μL에서 EV의 표현형, 크기 및 총 입자 수를 감지할 수 있습니다.

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids(생물학적 유체로부터 세포외 소포체 특성화)

이 프로토콜은 효소 소화 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 소변 골격근과 골수에서 작은 세포외 소포를 분리하여 구조적으로 복잡하고 저수율 조직에서 소포 농축 분획을 재현 가능하게 회수하여 하위 분자 분석에 활용할 수 있도록 합니다.

크기 배제 크로마토그래피를 이용한 쥐 골격근 및 골수에서 작은 세포외 소포 분리

학습하세요 종이 기반 플랫폼을 이용한 세포 외 소포(EV) 분리 방법을 배우세요. 초원심 분리 없이 10μL 혈청 샘플에서 빠르게 EV를 분리하고 전자현미경, ELISA, 전사체 분석으로 특성화할 수 있습니다.

세포 외 소포의 분리 및 특성에 대한 종이 기반의 장치

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