Name: 분리 및 신생아 쥐 심근 세포의 냉동 보존 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 5 s
Description: 배우세요 신생아 쥐 심근 세포의 분리 및 냉동 보존 방법을. 효소 소화와 냉동 보존 기술을 활용하여 반복적인 분리 없이 다양한 체외 실험에 활용할 수 있는 효율적인 연구 기법입니다.

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이 연구는 미국심장협회(American Heart Association) 12BGIA12040477, 노스캐롤라이나 주립대학교 총장 교수 우수 프로그램(NC State University Chancellor's Faculty Excellence Program) 및 중국 국립자연과학재단(National Natural Science Foundation of China H020381370216)의 자금 지원을 받았습니다.

다음 프로토콜은 신생아 쥐 새끼 (10-14 새끼)의 한 쓰레기에서 심근 세포의 분리를 위해 설계되었습니다. 쓰레기의 크기가 현저하게 다른 경우, 절차는 보상을 확장 할 필요가있다. 새끼는 약 48 ± 6 시간 이전이어야한다. 모든 절차가 여기에 노스 캐롤라이나 주립 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다. 1. 세포 격리 준비 참고 : 분리하기 전에 다음 단계 일을 수행합니다. <ol><li> 큰 가위, 작은 가위, 작은 날카로운 집게, 큰 집게 다음을 압력솥. 121 ° C의 최소 30 분의 건조 시간을 60 분 동안 중력 사이클을 사용한다. </li><li> / N을 O를 해동 냉장고에 0.1 % 트립신 용액 40ml를 놓습니다. 냉장 행크의 균형 소금 솔루션 (HBSS) 이미 감기 아니라면. 20 % 소 태아 혈청 (FBS) 스톡 미디어 솔루션을 준비. <ol><li> 단락 전류의 400 mL에비켜의 수정 된 둘 베코의 미디어 (IMDM)는 100 ML의 FBS 5 ML의 L 글루타민 (200 mM)을 2.5 ml의 겐타 마이신 (10 ㎎ ml의 1), 0.9 ml의 2- 머 캅토 에탄올을 추가합니다. 진공 필터를 이용하여 멸균. 저장 최대 3 주 동안 4 ℃에서 미디어와이 작거나 큰 볼륨의 확장이다. 10 % FBS NRCM 미디어를 생산하는 IMDM와 1 : 20 % FBS 스톡 미디어 1을 희석. 만 반복 가열 및 미디어의 냉각을 방지하기 위해 작은 일괄 적으로 확인합니다. </li></ol></li></ol> 2. 세포 분리 1 일 <ol><li> 시료의 오염을 방지하기 위해 배양 후드에서 다음 작업을 수행한다. O / N 배양이 있기 때문에 최적의 타이밍의 경우 오후에이 일을 시작합니다. </li><li> 멸균 문화 후드 내부 작업 공간을 준비합니다. 문화 후드에서 벤치 패드를 놓습니다. 70 % 에탄올로 두 250ml의 비커를 입력하고 그들에 수술 도구를 배치합니다. 후드에서 얼음의 작은 양동이를 놓습니다. 그것은 여러 튜브와 150mm 접시를 개최 할 수있을만큼 충분히 큰지 확인합니다. FO 후드를 살균 UVR 10 분. 얼음에 40 ml의 0.1 % 트립신을 놓습니다. </li><li> 어머니로부터 신생아 쥐 새끼를 검색합니다. 사용할 때까지 따뜻한 동물을 유지하기 위해, 예를 따뜻하게 유지하는 벤치 패드에 싸서 얼음 양동이로 절연 컨테이너에 배치합니다. </li><li> 25 ml의 HBSS와 150mm 배양 접시를 입력하고 얼음에 배치합니다. 포장을 벗긴 2-3 거즈 패드와 작업 영역에 위치. 목에의 뒷면에 피부가 강아지를 잡고 후드에서 70 % 에탄올과 장소를 스프레이. 주 : 최상의 무균 상태를 유지하려면,이 후 후드 청소 강아지를 배치 다른 사람에 의해 수행 될 수있다. </li><li> 목에의 뒷면에 피부가 강아지를 잡으십시오. 그런 다음 잘린 안락사 한 빠르고 강력한 컷, 큰 가위를 사용하여. 거즈와 혈액을 오 점. 주 : IACUC 요건 분산하기 위해서는 에탄올 강아지 청소 더 적절할 수도 그것으로 인해 분무보다는 와이프. 이 단계에 대한 자신의 가이드 라인과 대학 IACUC 확인해야합니다. </li><li> 채널의 전방 측면을 자르고 계속흉곽을 통해 동부 표준시. 마음이 보일 때까지 흉곽을 열 수 있도록 목에 피부를 짜내. 작은 가위를 사용하여 얼음에 HBSS 배양 접시에 심장과 장소를 제거합니다. 다른 새끼에 대해 반복합니다. </li><li> 샘플에서 비 심장 조직을 제거하고 마음을 씻어 부드럽게 HBSS 소용돌이 친다. 신선한 HBSS 포함하는 다른 배양 접시에 심장 조직을 전송하고 더 조직을 씻는다. 조각 1-3mm 3 때까지 더 조직을 절단 한 후 트립신 용액에 전송할 수 있습니다. 4 ° C 냉장고 O / N에서 로커에 트립신 솔루션을 놓습니다. </li></ol> 세포 분리 2 일 주 : 다음 단계로 흡인하면서, 진공 라인보다는 ​​피펫을 사용한다. 조직은 쉽게 이동시키고, 진공 라인은 막힘 또는 세포를 포함하는 조직을 아직 제거 할 것이다. 대신 포부 피펫을 사용하는 것이 가장 좋은 방법입니다. 조직 피펫을 입력하면, 피펫을 제거 철회. <ol><li> t 확인10 % NRCM 미디어하는 hree 분량 : 15 ml를 25 mL를 하나, 둘. 37 ° C의 물을 욕조에 미디어의 한 25 ML 튜브를 놓습니다. 5 가지 15 ML 원뿔 튜브에 4 ml의 HBSS를 추가하고 얼음에 모두 배치합니다. 각 15 ml의 튜브 # 1-5 레이블. </li><li> 50 ML 원뿔 관에 40 ml의 HBSS를 추가합니다. HBSS 10 ml의 일시 중단, 피펫을 콜라에 추가, 50 ml의 1 mg의 ml의 -1 콜라겐 솔루션을 만드는 솔루션을 결합한다. 0.22 μm의 진공 필터를 사용하여 소독하고, 실온에서 보관하십시오. </li><li> 심장 조직 / 트립신 튜브를 검색합니다. 그 확인 트립신 맑아 조직 무성 나타난다. 조직 튜브와 흡인의 코너에 많은 액체 가능한 정착하도록 허용합니다. </li><li> 손으로 튜브와 소용돌이에 25 ml의 따뜻한 10 % FBS NRCM 미디어를 추가합니다. 캡 및 2 분 동안 37 ° C까지 수조에서 회전한다. 다시 대기음 액체. 조직이 단계에서 부유한다; 그렇다면, 튜브의 바닥에서 흡 인물. </li><li> 10 ml의 콜라겐을 추가합니다. 2 분 동안이나 솔루션이 흐린 때까지 물을 욕조에 돌립니다. 숨어ickly 액체를 대기음. 조직을 포함하는 튜브에 10 ml의에게 신선한 콜라게나 제를 추가하고 2 분 동안 물을 욕조에 회전. 피펫, 튜브 # 1에 전송 솔루션을 혼합하고 얼음에 배치합니다. 그것은 모든 액체를 제거하는 것이 가능하지 않을 수있다. 반복하여 다른 세 15 ML 원뿔 튜브에 대한 3.2-3.6 단계를 반복합니다. 튜브 # 5에 남아있는 액체를 전송합니다. </li><li> 원심 분리기 8 분 410 RCF에서 15 ml의 튜브. 원심 분리하는 동안 물을 욕조에 15 ml의 10 % FBS NRCM 미디어 관을 배치합니다. 40 μm의 세포 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 스트레이너 2 ml의 차가운 HBSS 젖은 놓습니다. </li><li> 스핀 다운 세포에서 대기음 뜨는. 각각의 튜브에 resuspend 6 ml의 차가운 HBSS를 추가합니다. 50 ML 원뿔에 스트레이너를 통해 피펫 세포 현탁액은 조직을 제거합니다. 3 ㎖ 차가운 HBSS 각 15 ML 튜브의 측면을 씻어 여과기를 추가 할 수 있습니다. 10 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기 세포. 대기음 뜨는. T-75 플라스크에 10 ml의 10 % FBS NRCM 미디어 및 전송에 재현 탁 세포 펠렛. 5ml의 미디어 원뿔을 씻어 FL에 추가부탁드립니다. </li><li> 37 ° C에서 1 시간, 5 % CO 2 품어. 물을 욕조에 지난 15 ml의 10 % FBS NRCM 미디어 튜브를 놓습니다. T-75 새로운 T-175 플라스크의 내용을 전송, 15 ml의 매체와 T-75을 씻어 T-175에 추가. 1 시간 동안 품어. </li></ol> 4. 냉동 보존 <ol><li> 얼음에 미디어를 동결 놓습니다. T-175-50 ML 원뿔 튜브에서 세포 미디어를 전송하고, 셀 트리 판 블루를 사용하여 계산에 대한 세포 현탁액의 10 μl를 수집합니다. 5 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 원심 동안 세포 계수기를 사용하여 세포를 카운트. </li><li> 1 mL 당 2-4000000 세포의 농도로 미디어를 동결 대기음 배양액과 세포를 재현 탁. 극저온 유리 병에 세포 현탁액 1 ㎖를 꽂은 후, 장소는 -80 ° C 냉동고 O / N의 제어 냉각 컨테이너를 동결 속도, 장소를 유리 병. 1-2일 내에서 액체 질소에 튜브를 전송합니다. </li></ol> 5. 해동 세포 <ol><li> 250 μl를 용해하여 피브로넥틴의 코트 요리60; 9.75 ml의 물 (최종 농도 0.025 mg을 ml의 1)에 피브로넥틴 (재고 농도 1 mg을 ml의 1)의. 배양 플레이트를 커버하고 적어도 30 분 동안 37 O C에서 배양 할 수있는 충분한 솔루션을 추가합니다. <ol><li> 20 % DMSO 매체를 가산함으로써 다음과 같이 네 15ml의 원뿔형 튜브에, DMSO / 미디어의 혼합물을 만든다. 500 μL DMSO로 (5 %) 9.5 ml의 미디어를 추가합니다. 250 μL DMSO로 (2.5 %) 9.75 ml의 미디어를 추가합니다. 10 ml의 미디어를 (이 두을)를 추가합니다. </li></ol></li><li> 37 ° C 물욕 상기 미디어의 혼합물을 가열한다. 액체 질소에서 세포를 제거하고 드라이 아이스에 배치합니다. 미디어 혼합물 따뜻한 때 바로 해동 될 때까지, 37 ° C의 물을 욕조에 세포를 해동. 이 세포에 손상을 줄 수 있으므로 너무 오래 물을 욕조에 세포를 보관하지 마십시오. </li><li> 5 % DMSO / 미디어 관에 극저온 유리 병의 내용을 전송합니다. 8 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 세포 펠렛을 떠나 대기음 뜨는. 2.5 % DMSO / 미디어 관의 내용은 펠릿 및 R 셀에 추가esuspend. 8 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 세포 펠렛을 떠나 대기음 뜨는. </li><li> 펠릿에 resuspend 셀 하나의 0 % DMSO / 미디어 튜브의 내용을 추가합니다. 8 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 세포 펠렛을 떠나 대기음 뜨는. </li><li> 세포 펠렛 및 재현 탁에 두 번째 0 %의 DMSO / 미디어의 내용을 추가합니다. 셀 카운팅을위한 작은 샘플을 가져 가라. 8 분 동안 410 RCF에서 원심 분리기. 혈구에서 원심 분리 카운트 세포는 트리 판 블루를 사용하는 동안 죽은 세포 레이블을. 기록 셀 량뿐만 아니라 생존. </li><li> 세포 펠렛을 떠나 대기음 뜨는. 10 % NRCM 매체에 재현 탁 (옵션 : 100 μM의 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의) 추가) 피브로넥틴 코팅 요리와 플레이트 세포를. </li></ol> 6. 세포 배양 <ol><li> cm 2 당 약 10 만개 세포에서 플레이트 세포. 문화의 사용 목적에 따라 도금 밀도를 조정합니다. 1:10 비율로 IMDM 20 % 미디어를 희석하여 2 % NRCM 미디어를 준비합니다. 다음은 일반적인 배양의 개요이다. &lt;/ 리&gt; <li> 1 일에, 멀리 따뜻한 IMDM와 죽은 세포를 씻어 10 % NRCM (옵션 100 μM의 BrdU)를 추가합니다. 2 일에, 멀리 따뜻한 IMDM와 죽은 세포를 씻어 10 % NRCM를 추가합니다. 3 일 - 추가 2 % NRCM을. 4 일에 2 % NRCM를 추가합니다. 5 일에 세포가 합류하고 구타되어 있는지 확인하십시오. 약 일주일 동안 문화의 세포를 유지한다. 그 시점에서 섬유 아세포는 크게 NRCMs을 빨리 성장하기 시작할 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Louch, W. E., Sheehan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+in+cardiomyocyte+isolation%2C+culture%2C+and+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+and+Cellular+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 51 (3), 288-298 (2011).</li>
<li>Miragoli, M., Salvarani, N., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myofibroblasts+Induce+Ectopic+Activity+in+Cardiac+Tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myofibroblasts Induce Ectopic Activity in Cardiac Tissue.</a> Circulation Research. 101, 755-758 (2007).</li>
<li>Simpson, P., Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+rat+myocytes+in+single+cell+cultures+with+and+without+proliferating+nonmyocardial+cells.+Cross-striations%2C+ultrastructure%2C+and+chronotropic+response+to+isoproterenol%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of rat myocytes in single cell cultures with and without proliferating nonmyocardial cells. Cross-striations, ultrastructure, and chronotropic response to isoproterenol.</a> Circulation Research. 50 (1), 101-116 (1982).</li>
<li>Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocyte+hypertrophy+in+neonatal+rat+heart+cultures+and+its+regulation+by+serum+and+by+catecholamines%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines.</a> Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).</li>
<li>Rohr, S., Flückiger-Labrada, R., Kucera, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photolithographically+defined+deposition+of+attachment+factors+as+a+versatile+method+for+patterning+the+growth+of+different+cell+types+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Archive+%3A+European+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Photolithographically defined deposition of attachment factors as a versatile method for patterning the growth of different cell types in culture.</a> Pflügers Archive : European Journal of Physiology. 446 (1), 125-132 (2003).</li>
<li>Zhang, B., Green, J. V., Murthy, S. K., Radisic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+enrichment+of+functional+cardiomyocytes+using+microfluidic+deterministic+lateral+flow+displacement%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Label-free enrichment of functional cardiomyocytes using microfluidic deterministic lateral flow displacement.</a> PloS One. 7 (5), e37619(2012).</li>
<li>Boateng, S. Y., Hartman, T. J., Ahluwalia, N., Vidula, H., Desai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+fibroblast+proliferation+in+cardiac+myocyte+cultures+by+surface+microtopography%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Inhibition of fibroblast proliferation in cardiac myocyte cultures by surface microtopography.</a> American Journal of Physiology. Cell Physiology. 285 (1), C171-C182 (2003).</li>
<li>Fu, J. -D., Li, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+the+sarcoplasmic+reticulum+in+the+developmental+regulation+of+Ca2%2B+transients+and+contraction+in+cardiomyocytes+derived+from+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Crucial role of the sarcoplasmic reticulum in the developmental regulation of Ca2+ transients and contraction in cardiomyocytes derived from embryonic stem cells.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 20 (1), 181-183 (2006).</li>
<li>Liu, J., Fu, J. D., Siu, C. W., Li, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+Functional+sarcoplasmic+reticulum+for+calcium+handling+of+human+embryonic+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+insights+for+driven+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">a Functional sarcoplasmic reticulum for calcium handling of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes: insights for driven maturation.</a> Stem Cells. 25 (12), 3038-3044 (2007).</li>
<li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+boutique+science+or+valuable+arrhythmia+model%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model.</a> Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).</li>
<li>Uchida, T., Nagayama, M., Taira, T., Shimizu, K., Sakai, M., Gohara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+temperature+range+for+low-temperature+preservation+of+dissociated+neonatal+rat+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Optimal temperature range for low-temperature preservation of dissociated neonatal rat cardiomyocytes.</a> Cryobiology. 63 (3), 279-284 (2011).</li>
<li>Miyamura, K., Nagayama, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+viability+of+cryopreserved+rat+cardiac+myocytes+and+effects+of+dimethyl+sulfoxide+concentration+on+cryopreservation%5BTitle%5D)+AND+%22Cryobiology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of viability of cryopreserved rat cardiac myocytes and effects of dimethyl sulfoxide concentration on cryopreservation.</a> Cryobiology. 59 (3), 375(2010).</li>
<li>Rana, P., Anson, B., Engle, S., Will, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+human-induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes%3A+bioenergetics+and+utilization+in+safety+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicological+Sciences%3A+An+Official+Journal+of+the+Society+of+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Characterization of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: bioenergetics and utilization in safety screening.</a> Toxicological Sciences: An Official Journal of the Society of Toxicology. 130 (1), 117-131 (2012).</li>
<li>Yokomuro, H., Mickle, D. aG., Weisel, R. D., Li, R. -K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimal+conditions+for+heart+cell+cryopreservation+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimal conditions for heart cell cryopreservation for transplantation.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 242 (1-2), 109-114 (2003).</li>
<li>Simpson, P., McGrath, a, Savion, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myocyte+hypertrophy+in+neonatal+rat+heart+cultures+and+its+regulation+by+serum+and+by+catecholamines%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Myocyte hypertrophy in neonatal rat heart cultures and its regulation by serum and by catecholamines.</a> Circulation Research. 51 (6), 787-801 (1982).</li>
<li>Evans, H. J., Western Goodwin, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((array+analysis+of+cell+cycle+protein+changes+during+the+hyperplastic+to+hypertrophic+transition+in+heart+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">array analysis of cell cycle protein changes during the hyperplastic to hypertrophic transition in heart development.</a> Molecular and Cellular Biochemistry. 303 (1-2), 189-199 (2007).</li>
<li>Golden, H. B., Gollapudi, D., et al. Methods in Molecular Biology. , 205-214 (2012).</li>
<li>Zlochiver, S., Muñoz, V., Vikstrom, K. L., Taffet, S. M., Berenfeld, O., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrotonic+myofibroblast-to-myocyte+coupling+increases+propensity+to+reentrant+arrhythmias+in+two-dimensional+cardiac+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Electrotonic myofibroblast-to-myocyte coupling increases propensity to reentrant arrhythmias in two-dimensional cardiac monolayers.</a> Biophysical Journal. 95 (9), 4469-4480 (2008).</li>
<li>Chang, M. G., Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiral+waves+and+reentry+dynamics+in+an+in+vitro+model+of+the+healed+infarct+border+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Spiral waves and reentry dynamics in an in vitro model of the healed infarct border zone.</a> Circulation Research. 105 (11), 1062-1071 (2009).</li>
</ol>

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NRCMs이, 고립 냉동 보관 및 해동 될 때까지이 프로토콜은 할 수 있습니다. 세포를 해동하여 절차의 중요한 부분이다. DMSO 희석액 시리즈 서서히 세포를 DMSO (14)로부터 제거하기 위해 사용된다. 그것은 DMSO의 추출 해동 세포 사망 직후에 특히 민감 재빨리 수행하는 것이 중요하다. 더 많거나 적은 세포가 해동이 필요한 경우 필요에 따라, DMSO 용액의 볼륨을 확장 할 수 있습니다. NRCM 격리와 문화에 대한 하나의 도전은 섬유 아세포의 급속한 확산이다. 이 프로토콜은 섬유 아세포 (15)의 수를 감소하는 것으로 나타났다 예비 도금을 사용한다. 섬유 아 세포가 심근 세포보다 훨씬 빠른 연결되는 코팅 플라스크를 사용하여 작품을 예비 도금. 미디어 변경 시퀀스는 섬유 아세포 성장을 감소 변경 될 수있다. 섬유 아세포는 10 % NRCM 미디어에서 NRCMs을 빨리 성장하지만, 섬유 아세포 성장은 2 % NRCM 메드 크게 느...

심근 세포의 세포 배양 현대 심장 연구에 중요한 도구입니다. 신생아 쥐의 심근 세포 (NRCMs)는 일반적으로 분리 이후 사용되며 문화는 성인 쥐의 심근 세포 1보다 쉽다. NRCM 방법은 여전히​​ 접시에 오래 격리 절차 및 제한 세포 증식 등 여러 가지 제한 사항이 있습니다. 가장 일반적으로 작업 2-6의 4-48 시간을 필요로와 NRCMs의 분리를위한 다양한 프로토콜이있다. 또한, 세포는 종종 2 일된 래트 새끼 2,4-7를 1에서 분리된다; 출생의 타이밍은 실험실에서 다른 작업과 예측 불가능하고 충돌 할 수 있습니다. 세포의 소량 만이 실험을 위해 필요한 경우 아이솔레이션은 비효율적이며 소모적 일 수있다. 분리 시간을 줄이는 데 초점 흐름을 개선 대부분의 노력은 아직이 새끼의 탄생을 타이밍의 문제를 해결하지 못한다. 대안으로, 많은 실험실 활용배아 줄기 세포 (는 ESC) 또는 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)로부터 유도 된 심근 세포. 그러나, 리 프로그래밍 및 / 또는 분화 과정은 매우 시간 소모 및 비용을 또한 할 수있다. 체외 심근 모델로 이들 세포를 사용하는 경우 다른 문제가있을 수 있습니다. 두 ESC-및 심근 유래 iPSC- 1 차 심근 8-10 전기 생리학에서의 차이를 나타내는 것으로 나타났다. 해리 NRCMs 냉장 11을 사용하여 몇 일 동안 저장 될 수있는, 그러나 이는 장기 저장을 허용 않는다. 액체 질소는 일반적으로 더 큰 시간 동안 세포를 보존하기 위해 사용되지만, 디메틸 설폭 사이드 (DMSO) 등의 동결 방지제 등을 필요로한다. 이전 연구는 동결 미디어의 5 ~ 10 % DMSO 사이의 이상적인 농도가 NRCMs의 냉동 보존을 허용 것을 보여 주었다, 그러나 그렇다하더라도 가능성은 낮은 12로 유지됩니다. DMSO는 무료 동안 세포를 보호하는 데 도움이되지만열정, 그것은 1.5 % 13 위의 농도에서 세포 독성이있을 수 있습니다. 이전 연구 천천히 DMSO를 세포로부터 제거, 세포 생존을 개선시킬 수있다 (14) 것으로 나타났다. 우리는 다음과 같은 격리 cryopreserving NRCM 세포에 의한 세포 - 기반 분석의 효율성을 개선하기 위해 노력했다. 이는 세포가 해동 필요한 절연 부 및 동물의 소비의 주파수를 감소 할 때 사용될 수 있습니다. 이 방법을 사용하여, 우리는를 NRCMs cryopreserve 및 나중에 사용하기 위해 해동시킬 수 있음을 보여준다. 해동 후 세포 수용 가능성을 유지하고 자발적으로 α-sarcomeric 티닌 (α-SA)와 계약에 대한 긍정적 NRCM 문화를 생산하고 있습니다.

<table><tbody><tr><td>IMDM (+25 mM HEPES +L-글루타민)</td><td>Gibco</td><td>12440-046</td><td>25 mM HEPES 및 L-글루타</td></tr>민 <tr><td>L-글루타민</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-064</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Gibco</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (+Ca +Mg)</td><td>Corning</td><td>21-020-CV</td><td>칼슘 및 마그네슘 첨가, pH 7.1-7.4</td></tr><tr><td>트립신 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25300-056</td><td></td></tr><tr><td>트립신 0.05%</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Cryostor CS5</td><td>BioLife 솔루션</td><td>205102</td> 냉동 <td>매체</td></tr><tr><td>극저온 바이알</td><td>코닝</td><td>430659</td><td></td></tr><tr><td>콜라겐분해</td>효소 <td>시그마</td><td>C1889-50MG</td><td></td></tr><tr><td>40 &뮤; m 세포 여과기</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542040</td><td></td></tr><tr><td>살균 진공 필터 (0.22&mu; m)</td><td>Corning</td><td>431118</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔</td>형 <td>Corning</td><td>430828</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 원뿔</td>형 <td>Corning</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>trypan blue</td><td>Cellgro</td><td>25-900-CI</td><td></td></tr><tr><td>Mr Frosty 냉동 용기</td><td>ThermoScientific</td><td>5100-0001</td><td></td></tr><tr><td>Millicell EZ&nbsp; 슬라이드</td><td>Millipore</td><td>PEZGS0416</td><td></td></tr><tr><td>&alpha;-sarcomeric actinin 항체</td><td>Sigma</td><td>A7811</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Corning</td><td>356008</td><td></td></tr><tr><td>Bromodeoxyuridine</td><td>BD Biosciences</td><td>51-7581KZ</td><td></td></tr></tbody></table>

분리 및 신생아 쥐 심근 세포의 냉동 보존

Isolation and Cryopreservation of Neonatal Rat Cardiomyocytes

세포 배양은 심장 연구에서 점점 더 중요해지고 있지만, 심근세포의 증식이 제한되어 있기 때문에 심근세포를 배양하는 것은 어렵고 시간이 많이 걸립니다. 가장 일반적으로 사용되는 세포는 신생아 쥐 심근세포(NRCM)로, 세포가 필요할 때마다 격리가 필요합니다. 쥐의 탄생은 예측할 수 없습니다. 필요할 때까지 세포를 보관할 수 있도록 하기 위해 동결 보존이 제안되었지만, 원발성 심근세포에 대한 동결/해동 방법은 세포의 민감성으로 인해 까다롭습니다. 적절한 동결 방지제인 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 사용하여 동결 보존이 이루어졌습니다. 세포를 해동하면서 DMSO를 천천히 추출하여 생존 가능한 NRCM으로 배양물을 얻었습니다. NRCM 표현형은 α-sarcomeric actininin에 대한 면역세포화학 염색을 사용하여 검증되었습니다. 또한, 세포는 배양에서 며칠 후에 자발적인 수축을 보이기도 했습니다. 해동 후 세포 생존율은 40-60%로 허용 가능했습니다. 그럼에도 불구하고 설명된 방법을 통해 NRCM을 쉽게 동결 보존하고 해동할 수 있습니다. 이를 통해 연구자들은 실험을 계획하는 데 더 큰 유연성을 가질 수 있을 뿐만 아니라 동물 사용을 줄일 수 있습니다.

신생아 래트 심근 세포의 분리 후, 세포를 액체 질소로 동결 다운되고, 적어도 몇 달 동안 저장 될 수있다. 일반적 해동시 트립 판 블루 분석에 의해 측정 생존율​​ 40-60 % 사이가 될 것이다. 이 적절한 파종과 문화, 다른 세포 유형보다 낮은이지만 세포는 (그림 1) 증식합니다. 수축력을 검증하기 위해, 세포를 위상차 현미경을 이용하여 묘화 될 수있다. 세포는 자발적으로 3 일 (그림 2) 내에 계약을 시작해야한다. 면역 세포 화학 (ICC) 검정을 위해, 세포를 웰 당 200,000 세포 4 웰 배양 슬라이드에서 배양 하였다. 위해서 배양 세포는 세포가 α-SA로 표지 하였다 NRCMs하고 형광 현미경을 사용하여 영상화하는 것을 보여준다. 문화 NRCMs (그림 4)을 나타내는 다수의 α-SA 양성 세포가있다. 다른 실험은 막힌 포함 수행 된인간 심장 줄기 세포 유래 엑소 좀과 튜링 NRCMs는 엑소 좀 (그림 5...

신생아 쥐 심근세포의 격리는 시간이 많이 걸리고 예측할 수 없는 절차입니다. 이 연구는 세포를 보다 효율적으로 사용할 수 있도록 하는 신생아 쥐 심근세포의 동결 보존 및 해동 방법을 설명합니다. 해동된 NRCM은 매번 분리를 수행할 필요 없이 다양한 실험에 사용할 수 있습니다.

Cell culture has become increasingly important in cardiac research, but due to the limited proliferation of cardiomyocytes, culturing cardiomyocytes is ...

이 절차의 전반적인 목표는 신생 쥐의 심근세포를 동결 보존하고, 이후 인비트로(in vitro) 연구에 사용하기 위해 세포를 해동하는 것입니다. 이는 신생 쥐의 심장을 작은 조각으로 잘게 다져 수행합니다. 그 후 심근세포를 심장 조직으로부터 효소적으로 분리하여 동결 보존하며, 최종적으로 세포 배양을 위해 해동합니다.최종적으로, 해동된 세포는 관심 있는 심장 마커의 면역형광 분석을 포함하여 다양한 인 비트로(in vitro) 분석에 사용될 수 있습니다. 기존 방법과 비교하여 이 기술의 주요 장점은 분석을 위해 세포가 필요할 때마다 매번 완전한 심근세포 분리를 수행할 필요가 없어 시간을 절약할 수 있다는 점입니다. 분리 및 처리 단계에서 샘플의 적절한 크기와 일관성을 파악하는 데 필요한 세부 사항들은 직접적인 시연 없이는 습득하기 어려우므로, 이 방법에 대한 시각적 시연이 매우 중요합니다.신생아 심장을 모두 수집한 후, 샘플에서 심장 이외의 조직을 제거하고 HBSS를 넣어 부드럽게 흔들어 심장을 세척합니다. 두 번째 세척 후 새 플레이트로 옮겨 샘플을 1~3mm³ 크기의 조각으로 자르고, 조직을 40mL의 차가운 tripsin에 옮겨 4°C의 로커(rocker) 위에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, trypsin이 투명한지 확인하고 조직이 솜털처럼 부풀어 올랐는지 확인합니다.조직이 튜브 바닥에 가라앉을 때까지 기다린 후 가능한 한 많은 액체를 흡입하여 제거합니다. 다음으로, 10% FBS가 포함된 따뜻한 NR cm 배지 25 milliliters를 튜브에 넣고 손으로 가볍게 흔들어 섞습니다. 그런 다음 튜브를 37 degrees Celsius의 회전 수조에 2분 동안 넣습니다.조직이 뜨기 시작하면 튜브 바닥에서 상층액을 흡입하여 제거하고, 새로 준비한 collagenase 10 milliliters를 첨가한 뒤 용액이 탁해질 때까지 조직을 워터배스에 2분 더 둡니다. 그 다음 상층액을 빠르게 흡입하여 제거하고, 새로운 collagenase 10 milliliters를 추가하여 다시 회전 배양합니다. 마지막으로 2분이 지나면 조직 슬러리를 몇 번 섞어준 뒤, 상층액을 최대한 많이 흡입하여 얼음 위에 보관된 HBSS 4 milliliters가 담긴 5개의 15 milliliter 튜브 중 첫 번째 튜브로 옮깁니다.각 HBSS 튜브에 샘플 튜브의 상층액이 담길 때까지 소화를 반복한 다음, 모든 튜브를 원심분리합니다

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 쥐 배아에서 hippocampal과 대뇌 피질의 신경 세포를 분리하고 문화에 빠른 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 우리가 거​​의 순수의 연결을 문화가 요구되는 실험을 수행할 수 있습니다.

쥐 배아 신경 세포의 분리 및 문화 : 빠른 프로토콜

기본 마우스 심근 문화는 근원 섬유 조직과 기능의 조사를 위해 중요한 도구 중 하나입니다. 다음 프로토콜은 신생아 마우스 마음에서 차 심근의 격리와 문화를 설명합니다. 얻어진 심근 배양 이후 역학적, 생화학 및 세포 생물학의 다양한 분석을 위해 사용될 수있다.

분리 및 문화 신생아 마우스 심근

이 프로토콜은 컨포칼 회전 디스크 현미경을 사용하여 렌티바이러스 및 아데노바이러스 형질도입 후 1차 쥐 신생아 심근세포를 사용하여 살아있는 세포를 이미징하는 방법을 설명합니다. 이를 통해 살아있는 심근세포의 세포 과정을 자세히 관찰할 수 있습니다.

차 쥐 신생아 심근 라이브 셀 이미징은 아데노 바이러스 다음과 렌티 바이러스 형질 도입은 공 초점 현미경 디스크를 회전시키는 사용

쥐 심장에서 다른 심장 세포 유형의 분리를 위해 몇 가지 프로토콜이 개발 및 기술되었습니다. 여기에는 실험 준비 비용을 줄이기 위해 단일 준비에서 고품질 주요 심장 세포 유형 (cardiomyocytes, endothelial cell, fibroblast)을 분리 할 수있는 최적화 된 프로토콜이 설명되어 있습니다.

성인 쥐 심장에서 고품질 Cardiomyocytes, 내피 세포 및 섬유 아세포의 동시 격리

여기, 우리는 분리와 성인 쥐 심 실 cardiomyocytes (ARVC)의 재배에 대 한 프로토콜을 제시. 단기 및 장기 재배에 대 한 고립 된 ARVC는 사용할 수 있습니다. 분리와 ARVC의 재배는 심장 질환에 대 한 새로운 치료 regimens 개발에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.

절연 및 성인 쥐 Cardiomyocytes의 재배

여기서, 우리는 성인 마우스와 쥐 심근세포의 격리, 형질 전환 및 장기 문화에 대한 프로토콜을 제시합니다.

성인 마우스및 쥐 심근세포의 격리, 트랜스페션 및 장기 문화

세포 및 분자 기능 실험을 위한 심장학의 황금 표준은 심근 세포입니다. 이 기사에서는 마우스 심근 세포를 분리하기 위한 비 Langendorff 기술에 대한 적응에 대해 설명합니다.

마우스 심근 세포를 일관되게 분리하는 간단하고 효과적인 방법

이 방법은 세포 현탁액에 의해 야기된 세포 주입 도중 어떤 중요한 침습도 삭제한다.

침습을 최소화하는 새로운 세포 주입 방법

다 자란 포유류의 척수에는 배양에서 분리 및 확장될 수 있는 신경줄기세포/전구세포(NSPC)가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 쥐와 인간 장기 이식 기증자로부터 성인 척수의 뇌실 주위 영역에서 생성된 NSPC의 수확, 분리, 배양 및 전달을 설명합니다.

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

이 프로토콜은 9 주 된 쥐의 branchiomeric 머리 근육에서 위성 세포의 분리에 대해 설명합니다. 근육은 다른 아가미 아치에서 시작. 이어서, 위성 세포 분화를 연구하기 mm 크기의 스폿 코팅에 배양했다. 이 접근 방법은 위성 세포의 팽창 및 계대를 피한다.

쥐 머리 Branchiomeric 근육에서 분리 및 위성 세포의 특성

배우세요 신생아 쥐 심근 세포의 분리 및 냉동 보존 방법을. 효소 소화와 냉동 보존 기술을 활용하여 반복적인 분리 없이 다양한 체외 실험에 활용할 수 있는 효율적인 연구 기법입니다.

분리 및 신생아 쥐 심근 세포의 냉동 보존

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