마우스 녹내장에 공 촛점 안저 이미징 및 세포 형태 계측 : 신경 퇴행 중 망막 미세 아교 활성화의 생체 역학

다음 실험의 전반적인 목적은 망막의 생체 내 공초점 이미징을 통해 만성 녹내장 마우스 모델에서 미세아교세포의 역동성을 규명하는 것입니다. 이는 비침습적인 월간 공초점 안저검사 또는 CSLO를 통해 망막과 시신경 유두에 있는 형광 표지된 미세아교세포를 관찰함으로써 수행됩니다. 임계값 기반의 세포체(SOMA) 분할 및 morpho를 이용한 실시간 이미지 분석을 통해 미세아교세포의 수와 활성도의 변화를 정량화합니다.

결과는 살아있는 생쥐에서 월간 CSLO 이미징을 통해 만성 신경퇴행의 초기 진행 과정 중 미세아교세포 밀도 분포의 역학 및 형태학적 활성화를 모니터링할 수 있음을 보여줍니다. GFP 양성 미세아교세포 생쥐 뇌의 이광자 공초점 이미징과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 망막의 CSLO 이미징을 통해 온전한 개체 내에서 노화로 인한 신경퇴행성 질환의 진행 전 과정 동안 미세아교세포를 직접 관찰하고 모니터링할 수 있다는 점입니다. 저는 신경퇴행이 감지되기 전 단계의 젊은 DBA/2J 생쥐의 중심 망막 부위에서 미세아교세포의 강한 활성화와 응집이 나타난다는 것을 ex vivo로 입증한 후 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다.

검출 가능한 녹내장 발생 이전에 나타난 이러한 초기 선천성 면역 변화가 신경 퇴행을 유발했는지 확인하기 위해, 미세아교세포의 변화를 추적할 수 있는 생체 내(in vivo) 접근 방식을 수립해야 했습니다. 생체 이미지 획득 절차는 저희 실험실의 기술자인 Caesar Romero가 시연하겠습니다. 작동을 시작하려면 CSLO 시스템을 켜고 세션 정보를 입력하십시오. 다음으로, 안전하게 이미징 준비를 하십시오.

깨끗한 55도 광시야 대물렌즈를 장착합니다. 마취제 투여 2분 후 마우스를 이미징 플랫폼 위에 놓은 다음, 마이드리아졸(mydriatic) 점안액을 사용하여 양쪽 동공을 확장시킵니다. 5분 후, 마우스의 마취 상태를 확인합니다.

다음으로, 최소한의 압력을 가하여 각 눈을 콘택트렌즈로 덮습니다. 오른쪽 눈이 대물렌즈와 마주보고 안와가 렌즈와 평행하도록 마우스의 방향을 조정합니다. 동물은 억제할 필요는 없으나 대물렌즈로부터 일정 거리를 유지해야 합니다.

다음 10~15분 동안 눈의 정렬을 유지하는 동안, 마우스의 안구 운동이 CSLO 라이브 이미징 시스템에 의해 추적되는 동안 마우스는 움직이거나 깜빡이지 않습니다. 내망막의 안저 뷰를 수집하여 이미징 세션을 시작하십시오. 이를 위해.

820 nanometers의 여기 파장에 해당하는 적외선 모드를 선택합니다. 그런 다음 레이저 출력을 100%로, 민감도를 40에서 60% 사이로 조절하십시오. 다음으로, 조이스틱을 빠르게 조작하여 검안경의 방향을 맞추어 눈의 위치를 찾고, 시신경 유두와 망막 혈관의 안저 영상을 수집할 준비를 합니다. 각막과 수정체에 손상이나 혼탁이 있는지 검사하십시오.

영상 획득에 영향을 줄 수 있는 결함이나 부상이 있는 안구는 연구에서 제외하십시오. 이제 대물렌즈를 안구에 더 가까이 가져가 시신경 유두(optic nerve head, ONH)의 표면인 시신경 유두 부위를 찾으십시오. 그런 다음 영상을 ONH 중심에 맞추십시오.

ONH를 정확하게 배치하는 것은 이미지 전체에 걸쳐 균일한 초점과 디미션을 얻는 핵심입니다. 다음 단계는 ONH뿐만 아니라 망막의 내측 평면을 시각화하는 것입니다. 기준 초점 평면으로는 망막의 유리체 표면에 위치한 주요 혈관을 사용하며, 이는 59 및 60 디옵터에 해당하거나, 함몰된 시신경 유두 영역에서는 더 깊은 55 디옵터에 해당합니다.

다음으로, 터치 패널의 노브를 사용하여 이미지 포화도를 조절하여 시신경 유두 주변의 안저 대부분에 흰색 조명 후광이 나타나도록 합니다. 그런 다음 해당 안구에 최적의 대비를 나타내는 균일한 후광이 형성되는 더 낮은 포화도를 선택하십시오. 어두운 영역이 계속 남아 있는 경우 카메라를 다시 정렬해야 할 수도 있습니다.

이제 신호 대 잡음비를 높이기 위해 실시간으로 촬영한 30개 프레임을 평균하여 중심 망막의 고해상도 안저 영상을 수집합니다. 이는 초당 4.7프레임에 해당하며, GFP 양성 세포의 형광 영상을 수집하기 위해 준비된 동일한 위치에서 즉시 정규화됩니다. 터치스크린 패널에서 형광 이미지 모드로 전환하여 488 nanometer 레이저 여기와 460 to 490 nanometer 배리어 필터 세트가 포함된 청색 레이저를 선택하고, 획득 설정을 100% 레이저 출력 및 100 to 125% 감도로 설정합니다.

이제 100회의 스캔을 평균하여 ONH의 단일 XY 포인트 2차원 형광 이미지를 수집하십시오. 다음으로, 제어 패널에서 composite를 선택하여 ONH 주변 망막의 다중 포인트 이미지를 캡처하고, 검안경을 이용해 비측-측두축(nasal temporal axis)을 따라 팬 이동하십시오. 소프트웨어가 새로 스캔된 영역을 자동으로 평균화하여 실시간으로 스티칭합니다.

망막 영역의 이미지 품질이 평균화하기에 불충분한 경우, 스캔 중인 영역을 식별하는 녹색 원이 빨간색으로 변합니다. 결과로 생성된 합성 이미지는 최대 1.7 by 4mm의 영역을 커버합니다. 합성 이미지 획득 과정에서 주의가 필요합니다.

스캔 평균화 및 이미지 스티칭이 완료되기 전에 대물렌즈를 너무 빠르게 이동하면 고해상도 이미지가 손실될 수 있습니다. 마취 기운이 사라지기 시작하면 마우스의 호흡이 가빠져 이미징이 불가능해지므로 이미징 세션을 종료해야 합니다. 혈관과 시신경 유두를 랜드마크로 사용하여 시계열 분석을 위한 안저 이미지를 순차적으로 정렬하는 것부터 시작하십시오.

일반적인 이미지 편집 소프트웨어를 사용하여 모든 이미지의 O hs가 겹칠 때까지 정렬하십시오. 이미지를 드래그하는 동안 상단 이미지는 반투명하게 표시됩니다. 그런 다음, 각 이미지의 주요 혈관이 이전 이미지의 혈관계와 겹칠 때까지 순차적으로 회전시킨 후, 향후 참조를 위해 해당 배치를 저장하십시오.

각 이미지에 대해 보정된 각도를 기록하고, 이를 해당하는 단일 XY 지점 형광 이미지에 적용합니다. 이제 Fluor render에서 정렬된 TIFF 파일을 열어 중심 망막에 위치한 개별 GFP 양성 미세아교세포를 식별할 수 있습니다. 모든 세포를 시각화하려면 이미지를 화면에 꽉 차게 맞추고 렌더 뷰(render view)를 composite orthogonal 및 interpolated로 설정하십시오.

그다음 속성을 0.58 gamma, 255 saturation point, 255 luminance, 195 alpha, 1.00 shading으로 정의합니다. RG 채널을 모두 가시 상태로 선택하여 선택 과정을 마칩니다. 개별 세포를 분할하기 위해 워크스페이스 프레임에서 B 채널을 더블 클릭하여 숨깁니다.

높은 임계값(high threshold)은 일정하게 유지하면서, 최소한의 중첩으로 대부분의 세포가 마스킹되고 세포 돌기가 제외될 때까지 낮은 임계값(low threshold)을 높여 레드 채널을 선택하고 임계값 처리하십시오. 마지막으로 capture 명령을 사용하여 마스킹된 세포가 포함된 파일을 저장하십시오. 해당 래스터 그래픽 편집기에서 마스킹된 세포 이미지를 엽니다.

직접 관찰을 위해 그레이스케일을 반전시키고 해상도를 300 DPI 이상으로 조정합니다. RGB 이미지는 TIF 파일로 저장합니다. 라이브 이미지 분석의 다음 단계는 마이크로그리아 분석으로, 면적 정량을 위해 SATA를 식별하는 세그멘테이션 및 모포(morpho) 과정을 수행합니다.

임계값(threshold) 기반의 강도 측정 및 객체 계수가 가능한 소프트웨어를 사용하십시오. 분할된 세포가 포함된 TIFF 파일을 열고, 최대 해상도를 위해 스플라인 리스케일링(spline rescaling)을 선택하며, 더 나은 시각화를 위해 적색 채널을 흑백으로 설정하십시오. 다음으로, 개별 세포를 분할하기 위해 연령에 따라 이미지의 수평 직경을 1.4에서 1.7 millimeters로 정의하여 보정하십시오.

다음으로 ImageJ에서 레드 채널에 강도 임계값 설정을 적용합니다. Object Count 및 Account Update 명령 내의 임계 강도 함수를 엽니다. 이 함수를 사용하여 개체를 나타내는 관심 영역의 각 임계값에 대한 2차원 파라미터를 추적하십시오.

다음으로, 강도 히스토그램에서 강도 임계값을 정의합니다. 255단계 중 하위 50~60%를 선택하고 개별 세포의 최종 임계값을 세밀하게 조정합니다. 바이너리 툴바 컨트롤이나 객체 카탈로그를 사용하여 파란색으로 표시된 임계값 컬러 마스크와 회색으로 표시된 세포체 주변부 사이의 겹침 정도를 시각적으로 평가합니다.

여러 개의 세포가 포함된 세포체 관심 영역을 수동으로 식별합니다. 관심 영역을 분리하여 이러한 요소들을 구분하십시오. 이 과정에서 토글을 사용하여 영역 제한 기능을 통해 현재 세포들을 직접 시각화하십시오.

미세아교세포의 세포체 면적이 50~60 µm²보다 크면 활성화된 것으로 분류합니다. 세포체 면적이 이보다 작으면 비활성화된 미세아교세포로 분류합니다.

마지막으로, 대조도를 50% 높인 상태에서 소마 마스크(somal mask)와 단일 XY 포인트 이미지를 중첩시켜 프로세스를 검증하고 활성화된 각 미세아교세포의 분지 복잡성을 확인합니다. 설명된 프로토콜은 중앙 망막의 넓은 영역에 걸쳐 미세아교세포를 시각화하는 데 사용되었습니다. CX3CR1 GFP를 이형 발현하는 어린 DBA/2J 마우스의 경우, 생체 이미지와 임계값 설정 및 형태학적 분석이 결합된 고해상도 세포 분석을 통해 개별 GFP 양성 세포의 자동 분할이 가능했으며, 이에 따라 면적을 기반으로 세포를 구분하였습니다. DBA/2J 마우스는 만성 녹내장 모델이며, 개별 안구마다 신경 퇴행의 진행 정도가 다양하다는 점에 맞추어, 감지 가능한 신경 퇴행이 일어나기 전 연령부터 국소 미세아교세포증(microgliosis) 및 미세아교세포 활성화를 모니터링하기 위해 매달 촬영하였습니다. 이 분석을 통해 시간이 경과함에 따라 망막 미세아교세포 활성화와 미세아교세포증의 변화가 나타났음을 확인하였습니다.

분석 결과 개별 망막 내의 전체 및 활성화된 미세아교세포(microglia) 밀도의 역동적인 변화 또한 검출되었습니다. 미세아교세포 집단 밀도는 다른 결과들과 마찬가지로 GFP 발현 세포 밀도의 변화와는 연관되지 않았습니다. 따라서 CSLO 분석은 초기 질병 진행의 지표로 활용될 수 있습니다.

이 절차를 수행할 때, 내망막에 위치한 GFP 양성 미세아교세포의 형광 이미지 포화 수준을 주의 깊게 최적화하는 것이 중요합니다. 중심 망막의 CSLO 이미지 재현성과 중심 망막 전반에서 검출되는 일관된 세포 세부 사항은 개발 후 이 단계에 결정적으로 의존합니다. 이 생체 내 이미징 프로토콜은 저희 실험실에서 DBA/2J 및 기타 만성 망막 퇴행 모델에서 망막 및 시신경 유두 미세아교세포의 초기 변화와 이후의 녹내장 진행 사이의 잠재적 연관성을 조사하는 데 적용되고 있습니다. 또한, 이 생체 내 이미징 전략은 다발성 경화증, 알츠하이머병 및 파킨슨병과 같이 망막과 시신경의 퇴행을 유발하는 다른 만성 질환의 조기 발견을 가능하게 할 수 있습니다.