뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

이 절차의 전반적인 목표는 성체 쥐 또는 인간 척수의 뇌실 주위 영역에서 신경 줄기 세포를 분리하는 것입니다. 이것은 먼저 후판 절제술을 통해 척수를 적출함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 척수를 가로로 1cm 분절로 절단하고 척수의 각 분절에서 뇌실 주위 부위를 절개하는 것입니다.

다음으로, 다진 조직을 1mm 조각으로 절단한 다음 효소로 해리합니다. 마지막 단계는 불연속적인 밀도 구배를 통한 원심분리로 온전한 세포를 분리하고 세포 현탁액을 플레이트에 주입하는 것입니다. 궁극적으로 신경 구체 형성과 신경 줄기 세포의 성장은 면역형광 현미경을 사용하여 평가할 수 있습니다.

오늘 저는 성인 쥐 척수의 뇌실 주위 영역에서 신경 줄기 세포를 분리하는 방법을 시연할 것입니다. 그런 다음 이러한 세포는 어떤 외인성 요인이 계통 제한을 촉진하는지 또는 이러한 세포가 다양한 자극이나 스트레스에 어떻게 반응하는지와 같은 신경 줄기 세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 시작하려면 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 배양, 배지 및 해부 버퍼를 준비합니다.

다음으로, 마취제를 과다 투여한 후 쥐의 피부를 소독하고 큰 해부 가위를 사용하여 등쪽 표면을 제거하여 척추를 노출시킵니다. 해부 가위를 등쪽 표면에 수직으로 가로로 잡습니다. 뒷다리 위의 척추를 자릅니다.

그런 다음 더 작은 가위를 사용하여 척추 위에 있는 등쪽 근육을 세로로 자르고 등뼈 위쪽에 있는 등쪽 근육을 로스트 방향으로 잘라 노출된 새끼 끝에서 시작하는 가시 돌기를 노출시킵니다. 작고 뭉툭한 뼈 절단 기구를 척수와 척추 사이의 공간에서 척추관의 측면 측면에 특별히 삽입합니다. 날을 얕고 코드와 평행하게 놓습니다.

그런 다음 얇은 판을 작게 자르고 얇은 판을 조심스럽게 벗겨내어 척수를 노출시킵니다. 이 각도는 아래에 있는 척수의 손상을 방지합니다. 로스트 방향으로 얇은 판을 계속 제거합니다.

뭉툭한 조직 집게를 사용하여 흉추 및 경추 척수를 노출시키려면 척추에서 척수를 부드럽게 들어 올리고 마이크로 가위로 뿌리를 절단합니다.탯줄을 분리하려면 절제된 척수를 얼음처럼 차갑고 멸균된 쥐 해부 완충액이 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다. 얼음처럼 차가운 해부 완충액으로 조직을 헹구고 가위를 사용하여 척수를 가로로 1cm 분절로 자릅니다. 조직의 각 부분에 대해 가는 집게를 사용하여 한 손으로 조직을 잡고 다른 손으로는 마이크로 가위를 사용하여 대부분의 회백질과 함께 백질을 조심스럽게 제거하고 척수의 뇌실 주위 영역만 남깁니다.

절개된 뇌실 주위 조직을 얼음처럼 차가운 쥐 해부 완충액이 들어 있는 10cm 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 쥐 신경 줄기 세포의 분리를 시작하려면 마이크로 가위를 사용하여 심실 당 절개 된 조직을 1 입방 밀리미터 조각으로 다집니다. 다음으로, 먼저 파파인 해리 키트의 파파인 바이알에 Earl's balanced salt 용액 5ml를 추가하여 효소 해리 완충액을 준비합니다.

바이알을 섭씨 37도에서 10분 동안 놓아 파파인이 완전히 용해되고 용액이 투명하게 보이도록 합니다. 다음으로, 500마이크로리터의 Earl's Balanced Salt 용액을 해리 키트의 DNA 바이알에 추가합니다. 그리고 파파인이 들어있는 바이알에 DNA 용액 250마이크로리터를 넣고 부드럽게 섞습니다.

다음으로, 다진 조직을 약 0.2g의 바이알에 넣고 바이알을 섭씨 37도의 로커 플랫폼에 45분에서 1시간 동안 놓습니다. 배양 후 10ml 피펫으로 혼합물을 트라이 레이트하여 남아 있는 조직 조각을 해리하여 탁한 세포 현탁액을 생성합니다. 세포 현탁액을 멸균 15ml 원뿔형 튜브에 넣고 300Gs에서 5분 동안 원심분리합니다.

원심분리 중 실온에서 2.7ml의 Earl's balance salt 용액과 300μl의 재구성된 알부민 OVO MOID 억제제 용액을 혼합하여 OVO moid 용액을 준비합니다. 15 밀리리터 원뿔형 튜브에 이전에 제조된 DNA 용액 150 마이크로리터를 타원형 모이드 용액에 첨가하고 튜브를 반전시켜 혼합하고, 펠릿화된 세포에서 상등액을 버리고, 즉시 희석된 DNA 알부민 억제제 혼합물에 세포 펠렛을 현탁시킵니다. 다음으로, 15ml 튜브에 5ml의 알부민 억제제 용액을 첨가하고 5mL 피펫을 사용하여 알부민 억제제 용액 위에 세포 현탁액을 부드럽고 천천히 층을 이뤄 불연속 밀도 구배를 준비합니다.

실온에서 70gs에서 6분 동안 샘플을 원심분리합니다. 완료되면, 상등액을 버리고 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 준비된 1ml의 예열 랫드 EFH 배지에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 혈류 세포분석기로 살아있는 세포 밀도를 계수하고 EFH 마이크로리터당 10개 세포의 밀도로 T 25 배양 플라스크에 세포를 플레이트

플라스크를 섭씨 37도에서 5% 이산화탄소로 배양하고 구체의 응집을 피하기 위해 일주일 동안 배양물이 방해받지 않고 자라도록 합니다. 여기에 표시된 것은 쥐 척수의 가로 부분으로, luxal fast blue와 hematin 및 eoin으로 염색되어 백질과 회백질의 경계를 보여줍니다. 점선 윤곽선은 이 프로토콜에서 이 영역에서 분리된 절개된 남아 있는 뇌실 주위 조직을 나타냅니다.

여기에 보이는 것과 같은 신경구는 고배율로 현탁 배양에서 자유롭게 떠다니며 자랄 것입니다. 마이크로 스파이크는 신경구체에서 돌출된 것을 볼 수 있으며, 신경구체가 해리되고 마트리겔로 코팅된 우물에서 도금된 KI 67 양성 염색에서 볼 수 있듯이 신경구체가 증식합니다. 또한, 그들은 주로 신경 전구 세포에 대한 마커인 둥지를 발현합니다.

이 절차에 따라, 분화를 촉진하기 위해 배양된 세포에 외인성 인자를 첨가할 수 있습니다. 성체 신경 줄기세포 또는 그 자손은 재생 복구 능력을 평가하기 위해 다양한 동물 모델에 이식할 수도 있습니다. 이 비디오가 유용하기를 바라며 실험에 행운을 빕니다.