Name: 뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: 배우세요 성체 쥐와 인간 척수 뇌실 주위 백질에서 신경 줄기/전구 세포를 분리하는 방법을. 효소적 분해와 불연속 밀도 구배 원심분리를 통해 신경구 형성을 평가할 수 있습니다.

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저자는 Spinal Cord Injury Ontario, Ontario-China Research and Innovation Fund, Toronto General and Western Hospital Foundation 및 Physicians' Services Incorporated Foundation의 지원에 감사드립니다. 저자는 인간 척수 NSPC 배양에 대한 전문적인 조언을 해준 Tasneem Zahir 박사와 쥐 척수 NSPC 분리에 대한 전문적인 조언을 해준 Cindi Morshead 박사와 Iris Kulbatski 박사에게 감사를 표합니다.

모든 동물의 절차는 동물 관리에 캐나다위원회에 의해 제조 된 실험 동물의 관리 및 사용에 대한 가이드에 설립 정책에 따라, 캐나다 동물 관리 대학 건강 네트워크의위원회, 토론토에 의해 승인됩니다. 인간의 척수 조직의 수확 용, 승인 대학 건강 네트워크 연구 윤리위원회에서 온타리오, 캐나다에 장기 기증을 감독 생활 재단의 트릴 - 선물로부터 얻은 것입니다. 해부 버퍼 문화 미디어 1. 준비 <ol><li> 쥐 척수의 분리를 들어, 100 ㎖ 해부 버퍼 (1X PBS + 0.6 % 포도당 + 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신) 냉장을 준비합니다. 인간의 척수를 들어 100 ㎖ 해부 버퍼 (1X HBSS + 0.6 % 포도당 + 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신) 냉장을 준비합니다. </li><li> 37 ° C에서 100 ml의 무 혈청 배지 (SFM)과 따뜻한을 준비합니다. SFM을 준비하기 위해, 2 mM L- 글루타민을 추가, 100 μg의 / m-A로 Neurobasal 배지에 L 페니실린 - 스트렙토 마이신, 2 % B27, 및 10 % 호르몬 믹스. 호르몬 믹스를 준비하려면,은 1 : 0.6 %의 포도당을 함유 한 DMEM / F12 배지를, 3 mM의 NaHCO3를, 5 mM의 HEPES, 25 μg의 / ㎖ 인슐린, 100 μg의 / ㎖ 아포 트랜스페린, 10 μm의 퓨 트레 신 (putrescine), 30 나노 셀레늄, 20 나노 프로게스테론. </li><li> EFH 성장 인자가 풍부한 도금 미디어를 준비 37 ° C에서 따뜻한 SFM (20 NG / ㎖ EGF, 20 NG / ㎖의 bFGF, 2 μg의 / ㎖ 헤파린을 추가 할 수 있습니다). 인간의 EFH 인간 재조합 성장 인자 (재료의 표 참조)이 포함되어 있는지 확인합니다. </li></ol> 2. 수확 및 성인 쥐 뇌실 주위 척수 조직의 해부 <ol><li> 에탄올 해부기구를 소독하고 사전에 멸균 생리 식염수, 또는 오토 클레이브 장비에 헹군다. 쥐 제공 - 하나의 기관에 따라 (6 ~ 8 주 이전) 나트륨 펜 토바 비탈 (65 ㎎ / ㎖에서 1 CC) 또는 마취 (즉, 4 % 이소 플루오 란)의 과다 복용의 독극물 주사는 동물 프로토콜을 승인했다. 디70 % 에탄올로 쥐의 뒷면을 여러개 대형 해부 가위 등의 표면에 피부를 제거합니다. </li><li> 등의 표면에 수직 가위를 잡고 가로 뒷다리 위의 척추를 잘라. 길이 방향으로 가시 돌기를 노출 주동이의 방향으로 척추를 덮는 등의 근육을 잘라 작은 가위를 사용합니다. </li><li> 노출 된 꼬리 끝에서 시작, 척수와 척추 사이의 공간에서 척추관의 측면 측면에 extradurally rongeurs 또는 작은 무딘 뼈 절단 공구를 삽입합니다. 얇은 판에 작은 상처 (왼쪽 뼈 아치와 척추의 양쪽에 가시 돌기의 권리를) 확인하고 조심스럽게 척수 (그림 1A-D)를 노출하는 얇은 판을 벗겨. 블레이드의 각도가 얕은 확인하고 기본 척수가 손상되지 않도록 코드 평행. </li><li> 박람회에 주동이의 방향으로 추궁 절제술 계속흉부와 경부 척수를 전자. </li><li> 조심스럽게 조심스럽게 코드를 해제 뿌리를 절단하는 무딘 조직 집게 및 사용 microscissors와 척추에서 척수를 절제. (1.1 전술) 4 ℃ 무균 쥐 해부 버퍼를 포함하는 페트리 접시에 절제 척수를 놓습니다. 갓 준비 4 ° C의 해부 버퍼에 조직을 씻어 사용하는 가위는 1cm 세그먼트 (그림 1E)에 횡 방향으로 척수를 잘라. </li><li> 조직의 각 세그먼트를 들어, 미세 집게로 조직을 잡고 한 손을 사용합니다. 다른 손으로 조심스럽게 해부 범위의 도움으로 덮는 수막, 백질과 회백질의 대부분을 제거 할 수 microscissors를 사용합니다. 대안 적으로, ependyma과 회백질 (도 1F-H)를 둘러싸는 소량 포함 척수의 뇌실 주위 영역을 남기고 회색 및 백색 물질의 대부분을 벗겨 미세 겸자 (4 듀 #)를 사용한다.</li><li> 차가운 쥐 해부 버퍼를 포함하는 10cm 멸균 페트리 접시에 해부 뇌실 주위 조직을 풀. </li></ol> 3. 수확 및 성인의 뇌실 주위 척수 조직의 해부 참고 : 다른 장기는 장기 이식을 위해 제거 된 후 인간의 척수 조직이 성인 장기 이식 기증자에서 수확 (기증자 나이의 2~60년 시대​​였다). 생활 프로그램의 연령초-선물은 환자의 가족에서 연구 목적으로 조직의 제거를위한 동의를 얻고 우리가 대동맥 크로스 클램핑의 2 시간 이내에 코드를 수확 할 수 있었다 있도록 적시에 우리의 수확 팀을 알립니다. 남성과 여성의 성인 부정적인 혈청과 공여자없이 감염이 허용됩니다. <ol><li> 같은 전방 노출을 사용하여 전방 접근법을 통해 수술실에서 멸균 방식으로 수확 조직은 이미 장기 TRANSP에 의한 장기 제거 해부LANT 수확 팀. </li><li> 큰 리브 살포기와 큰 혈관을 포함한 나머지 조직과 장기의 큰 패들 견인기와 후퇴를 통해 전방 척추를 노출. </li><li> 절제 할 수있는 척추의 원하는 길이의 주동이와 꼬리 끝의 추간판 통해 잘라 긴 칼날이 장착 된 흉골 톱을 사용합니다. 각도 톱은 약 45 ° 내측 척추관 단지 짧은 정지 추체의 측면 부분에서 삼각 골을 잘라. </li><li> 일괄 경질을 통해 절단되지 않도록주의하면서 곡선 osteotomes와 망치의 도움으로 원하는 부분의 추체의 중간 부분을 제거합니다. 부드럽게 톱니 집게로 경질 덮여 척수를 들어 올려 급격히 코드의 주동이와 꼬리 끝을 절개. 좌우 각각의 뿌리를 가로로 쪼개다 긴 가위와 집게를 사용합니다. </li><li> 4 °에서 척수의 절제 세그먼트를 배치; C 살균 버퍼 (1X HBSS + 0.6 % 포도당 + 2 % 페니실린 - 스트렙토 마이신) 조직 배양 방에 수송을위한 대형 시험관에서. </li> <li> 참고 : 일반적으로 3 - 상부 흉추에서 척수의 6 CM 구간 및 / 또는 중간에 낮은 흉부 수준은 가능한 한 빨리 순환의 중단 후 멸균 조건에서 수술실에서 제거하고 차가운 멸균 버퍼에 배치됩니다 . 순환의 중단 및 척수의 제거 사이에 경과 된 시간은 기부 표적 장기를 수확하는 데 필요한 시간에 따라 변화하고 45 분에서 2 시간 범위였다있다. 심장 및 폐도 제거 된 경우, 절개도 하부 경추 코드의 일부분을 수확하기까지 rostrally 취할 수있다. </li><li> 3 시간 이내에 일반적으로, 수확 후 가능한 한 빨리 인간의 척수 조직을 해부하다. 집게로 경질 및 기타 수막을 제거합니다. 갓 만든 4 ° C의 해부 버퍼의 척수 조직을 씻어1cm 세그먼트에 횡 방향으로 절단. </li><li> 해부 범위의 도움으로, 각 조직 세그먼트에 대한 조직 포셉, 미세 집게와 microscissors를 사용하여 회색 물질의 대부분을 덮는 수막, 백질을 절제합니다. 차가운 인간 해부 버퍼를 포함 10cm 무균 페트리 접시에 ependyma 주변 회백질 소량 포함 해부 뇌실 조직을 풀. </li></ol> 4. 분리 및 배양 성인 쥐와 인간의 척수 NSPCs의 <ol><li> 층류 후드에서 무균 적으로 다음 단계를 수행한다. <ol><li> microscissors와 1mm 3 조각으로 해부 쥐 또는 인간의 뇌실 주위 조직을 말하다. </li><li> 효소 물질 / 시약의 표에 나타낸 바와 같이 파파인 해리 키트를 사용하여 단백질 분해 효소 다진 조직을 해리. 참고 : 시약 구성 요소 4 튜브를 포함한다; 유리 병 1 : 얼의 균형 소금 솔루션 (EBSS), 유리 병 2 : 파파인 containing L의 시스테인 및 EDTA, 바이알 3 : 데 옥시 리보 뉴 클레아 제 I (DNase의), 비알 4 : 소 혈청 알부민 (BSA)과 Ovomucoid 프로테아제 억제제. 참고 : 참고 : 파파인은 단백질 기질에 대한 폭 넓은 특이성을 가지고 설 프히 드릴 프로테아제이다. 파파인은 여기 카 리카 파파야 공장에서 라텍스에서 파생 된 대부분의 단백질 기질 더욱 광범위보다 췌장 단백질 분해 효소를 저하된다. 해리 과정에서 점성을 증가시키고 피펫 어려운 것 해리 배지로 방출 될 일부 세포 손상 유발 DNA가있다. 따라서, 그대로는 DNase의 세포에 손상을주지 않고 DNA를 소화하는 세포 분리 방법에 포함된다. Ovomucoids는 분리 단계 이후 파파인 활성을 억제하는 데 사용되는 프로테아제 억제제 당단백된다. </li></ol></li><li> 처음 사용시, EBSS (유리 병 1) 32 mL로 알부민 ovomucoid 억제제 혼합물 (유리 병 4)를 재구성 한 후 4 ℃에서 저장하고 이후의 절연 부에 사용.참고 :이 ovomucoid 억제제의 10 mg을하고 mL의 알부민 10 ㎎의 유효 농도에서 솔루션을 얻을 수 있습니다. </li><li> 0.5 mM의 EDTA 1 MM의 L 시스테인에서 파파인 / ㎖의 20 대에서 해결책을 산출, 파파인 유리 병 (유리 병 2)에 EBSS (유리 병 1) 5 mL를 추가합니다. 파파인이 완전히 효소의 전체 활동을 보장하기 위해 용해 될 때까지 다른 십분의 37 ° C의 물을 욕조에 병을 배치, 완전히 용해 할 때 파파인 솔루션은 분명 나타나는지 확인합니다. </li><li> (3 병) DNase의 약병에 EBSS (유리 병 1)의 500 μl를 추가하고 DNase의가 변성 전단에 민감한으로 가볍게 섞는다. 약 20 단위 / ml의 파파인 및 0.005 %의 DNase의 최종 농도 결과, 파파인 함유 바이알 DNase의 용액 250 μL를 추가한다. 나중에 사용하기 위해 DNase의 유리 병의 균형을 저장합니다. </li><li> 위의 단계 4.4에서 제조 된 파파인 솔루션에 다진 쥐 또는 인간의 조직을 놓습니다. 인간의 조직 분리를 들어, 둘 사이에 동등하게 다진 조직을 분할파파인 바이알 (약 0.2 g / 병). </li><li> 파파인 활성화 용액 중에 조직을 해리 로커 플랫폼에서 일정한 교반하에 37 ℃에서 인큐베이션. 각각 0.4 g - 약 0.2 다진 조직의 크기에 따라 1 내지 2 시간 동안 45 분에 1 시간, 및 인체 조직에 대한 쥐 조직을 인큐베이션. </li><li> 흐린 세포 현탁액을 수득 나머지 조직편을 해리 10 ㎖ 피펫 혼합물 씹다. 실온에서 5 분 동안 300 XG에 멸균 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 세포 현탁액을 (해리되지 않은 조직의 조각을 포함하지 않는다) 전송합니다. </li><li> 매체에 함유 ovomucoid 파파인​​ 억제제 펠렛 세포를 재현 탁. <ol><li> 15 ML 원뿔 튜브에 재구성 알부민 ovomucoid 방지 액 (유리 병 4) 300 μL와 2.7 ml의 EBSS (유리 병 1)을 혼합하여 ovomucoid 솔루션을 준비합니다. 위의 단계 4.4에서 저장 (3 병)의 DNase 솔루션 150 μl를 추가합니다. </li><li> 에서 상층 액을 버린다세포 펠렛은 즉시 희석 DNase의 알부민 억제제 혼합물에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li></ol></li><li> 단일 단계 불연속 밀도 기울기를 통해 원심 분리하여 세포 점막에서 별도의 손상 세포. <ol><li> 위에 부드럽게 15ml의 튜브 (4 바이​​알) 알부민 억제제 용액 5 mL를 첨가하고, 5 ㎖ 피펫을 사용하여 불연속 밀도 구배를 준비 서서히 세포 현탁액 레이어 (단계 4.8에서 상술 한 바와 같이 제조) 알부민 억제제 솔루션입니다. </li><li> 실온에서 6 분 70 XG에 원심 분리기. </li><li> 주 :이 경계에서 최소의 혼합이 결과에 영향을주지 않지만 구배의 두 층 사이의 인터페이스는, 명확하게 볼 수 있어야한다. 멤브레인 단편 계면에 남아 해리 세포 튜브의 하단에 펠렛. </li></ol></li><li> 쥐 세포의 경우, 상층 액을 제거하고 래트 EFH 배지 1 ㎖에서 세포 펠렛을 재현 탁 (37 ° C에서 미리는 예열).혈구와 라이브 세포 밀도를 계산하고 EFH에 / μL (10) 세포의 밀도로 T25 문화 플라스크에 넣고 세포를 접시. 랫트 조직에서 세포의 전형적인 수율은 / μL 미만 10 세포의 밀도로 요구되는 약 80 % viability.If 클론 배양 종자 세포는 약 2 × 106 세포이다. 5 % CO 2, 37 ℃에서 플라스크를 품어 1 주 분야의 응집을 방지하는 문화가 방해받지 않고 성장할 수 있습니다. </li><li> 인체 세포의 경우, 상층 액을 제거하고, 인간 EFH 배지 10ml에 세포 펠렛을 재현 탁 (37 ° C에서 미리는 예열). 도 40㎛ 나일론 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액을 필터 미엘린 및 세포막 파편을 제거하기 위해 EFH 30 ㎖로 하였다. 5 분 동안 300 XG 원심 분리기 및 EFH 배지 1 ㎖로 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 혈구와 살아있는 세포 밀도를 계산하고 총 부피 / 웰 105 세포의 밀도로 6 웰 배양 플레이트에 인간 세포 판형5 ㎖의 EFH / 웰. 인체 조직에서 세포의 전형적인 수율은 약 70 %의 생존과 약 1 × 10 6 세포입니다. 같은 마트 리겔로 부착 기판과 사전 코트 우물 (아래 참고 참조). 1 ml의 SFM : 40 μL 마트 리겔의 비율로 희석. </li><li> 주 : 대안 적으로, 폴리 D 라이신 / 라미닌, 피브로넥틴, 콜라겐과 같은 다른 부착 기질을 사용할 수있다. </li><li> 5 % CO 2에서 37 ° C에서 접시를 품어과 문화 1 주일 동안 방해받지 않고 성장할 수 있습니다. </li></ol> 성인 쥐와 인간의 척수 NSPCs 5.과 Passaging <ol><li> 쥐 NSPCs 작은 neurosphere를 초기 파종 1 주일 이내에 직경 약 70 μm의를 형성 할 것이다; 상기 세포 현탁액을 수집하고 5 분 동안 300 XG에서 원심 분리하고, 기계적으로 해리를 neurosphere를 세포 펠렛을 분쇄하여 주간에 의해 통로 쥐 NSPCs. </li><li> 신선한 쥐 EFH 매체를 함유하는 T25 플라스크에 세포를 해리 시드. 또한,계대 50 % 조건 쥐 매체를 사용합니다. 계대에서 쥐 NSPCs의 전형적인 수율은 통로 수를 기하 급수적으로 증가 약 5 × 10 6 세포입니다. </li><li> 인간의 문화를 들어 일주일 초기 도금 후, 세포를 기판에 부착 할 수 있도록 회 매주 신선한 EFH와 배양액의 절반을 교체한다. 일반적 1~2주 이상 세포가 기판에 부착되면 신선한 EFH로 일주일에 두 번 배양액의 전체 부피를 대체. </li><li> 4-8주 사이의 합류에 도달하기 전에 배양 세포. <ol><li> 또한 37 ° C에서 약 10 분간 인큐베이션 당 효소 기질로부터 세포를 분리하여 배양 세포를 효소의 2 ㎖로 (자재 표 참조). 5 분 동안 300 XG에 세포 현탁액을 원심 분리 수집하고 부드럽게 갓 EFH 배지 1 ㎖로 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 혈구와 살아있는 세포를 계산하고 6 웰 배양 접시에 세포를 플레이트 (사전 공동위와 같은 단계 4.12)에서 105 세포의 밀도 / 웰 / 웰 EFH 5 ㎖의 전체 부피에 ated. 계대에서 인간 NSPCs의 전형적인 수율은 약 2 × 10 6 세포이며, 일반적으로는 통로에 두 배로. 계대 사이에 주 3 회 - 일반적으로 50 % 조건 EFH 매체 (2) 문화를 유지한다. </li></ol></li></ol>

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쥐의 척수 조직 관리의 해부 동안 추궁 절제술을 수행하는 동안 척수 손상되지 않도록주의해야한다. 이것은 척수 세그먼트 그대로 때 뇌실 조직을 분리하기 쉽다. 조직 세그먼트 완전히 해부 완충액에 침지되어야하고 덮는 수막과 백질은 microscissors와 스트립 길이로 절단 할 수있다. 또한, 미세 조직 집게 멀리 백질을 벗겨하는 데 사용할 수 있습니다. NSPCs위한 분리 과정을 위해, 우리는 쥐와 인간 척수 조직을 해리 기계적 분쇄 결합-EDTA 파파인 해리 방법을 사용 하였다. 이전에 출생 쥐의 대뇌 피질의 뉴런 (11)의 해리와 같이 다른 단백질 분해 효소에 비해, 파파인은, 덜 손상하지만 효과적이다. 우리는 종종 태아 조직에서 사용 만 기계적 분쇄와 그 해리는, 성인의 조직과 같은 효과가 없습니다 발견했다. 일 후전자 효소 분해, 기계적 분쇄 나머지 조직의 조각을 해체하는 것이 중요하다. 흐린 세포 현탁액의 결과에는 그대로 남아 조직편 없다 있도록 ...

NSPCs 자기 갱신과 쉽게 체외에서 확장 할 수 있습니다 신경 혈통하기 위해 최선을 다하고 다 능성 세포이다. 그들은 자기 갱신 다 능성 줄기 세포보다 제한 조상의 속성을 표시하기 때문에 우리는 신경 줄기 / 전구 세포의 혼합 인구로이 세포를 참조하십시오. NSPCs은 태아와 성인 뇌와 척수 1, 2 모두에서 발견된다. 성인에서, NSPCs는 일반적으로 대기하고 측면 심실 2-4 안감 뇌실 영역 및 척수 5,6의 중심 운하를 둘러싼 뇌실 주위 백질 영역을 포함하는 특정 틈새 시장 내에 위치. 일반적으로, NSPCs는 EGF와 bFGF를 보충 무 혈청 배지에서 자유 부동 neurosphere를 또는 부착 단일 층, 줄기 / 전구 세포 집단에 대한 선택 분열 촉진으로 배양. 원래 레이놀즈와 바이스 (2)에 의해 개발 된 neurosphere 분석은 가장 일반적으로 문화에 사용되며,신경 줄기 세포를 확장합니다. 그들이 성장 인자 배지 포함 혈청에 도금 할 때 NSPCs는 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포로 분화, 능성을 보여줍니다. 배양 된 조직이 중앙 운하 6,7의 영역을 포함하는 경우 다 능성, 자기 갱신 NSPCs은 성인 쥐에서 척수를 분리하고 배양 할 수있다. 다른 영역으로부터 세포를 생성 반대로 성인 척수에서 생성 NSPCs 사용에 잠재적 이점이 조직 - 특이 적 세포가 가장 근접 부상이나 질병 다음 분실되거나 손상된 척수 세포 유사 있다는 것이다. 이전의 연구는 인간 성인 척수로부터 유래 neurosphere를 장기 또는 세포를 전파 8,9 충분한 수를 생성하기 위해 계대 수 없다는 것을 보여 주었다. 그러나, 배양 조건의 수정을, 우리는 시연, 성인의 척수 유래 NSPCs의 확장과 이식을보고 그 자체 갱신및 다 능성 NSPCs는 장기 이식 공여자 (10)의 성인 인간 척수로부터 분리 될 수있다. 주로, 성장 인자가 풍부한 배지에서 부착 기판에 절개 및 이들 세포를 배양 중에 백질의 대부분의 제거는 인간 성인 척수 NSPCs 증식 선정. 이 프로토콜에서 우리는 성인 쥐에서 인간의 장기 이식 기증자, 뇌실 주위 조직의 절개 및 NSPCs의 분리, 배양 및 확장에서 척수의 수확에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>1x PBS</td><td>Life Technologies</td><td>#10010023</td><td>해부 완충액</td></tr><tr><td>1x HBSS</td><td>Life Technologies</td><td>#14175095</td><td>해부 완충액</td></tr><tr><td>D-포도</td><td>당 시그마</td><td># G-6152</td><td>해부 완충액 및 호르몬 혼합물을 위한 30% 포도당 원액 준비</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Life Technologies</td><td>#15140-148</td><td>해부 완충액 및 배양 배지</td></tr><tr><td>뉴로베이스-A&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>#10888-022</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>L-글루타민, 200 mM</td><td>Life Technologies</td><td>#25030-081</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life Technologies</td><td>#12587010</td><td>배양 배지</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>#11885084</td><td>호르몬 믹스</td></tr><tr><td>F12</td><td>Life Technologies</td><td>#21700-075</td><td>호르몬 믹스</td></tr><tr><td>NaHCO 3</td><td>Sigma</td> <td># S-5761</td><td>호르몬 믹스를위한 7.5 % NaHCO3 원료 용액 준비</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>시그마</td> <td>#H9136</td><td>호르몬 믹스</td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma</td><td>#I-5500</td><td>호르몬 믹스</td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma</td><td>#T-2252</td><td>호르몬 믹스</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td># P7505</td><td>호르몬 믹스</td></tr><tr><td>셀레늄</td><td>시그마</td><td>#S-9133</td><td>호르몬 믹스</td></tr><tr><td>프로게스테론</td><td>시그마</td><td>#P-6149</td><td>호르몬 믹스</td></tr><tr><td>EGF, 마우스</td><td>시그마</td><td>#E4127</td><td>준비 100 &mu; B27 및 분취량의 g/ml 재고; EFH 배지</td></tr><tr><td>EGF, 인간 재조합</td><td>시그마</td><td>#E9644</td><td>100 &mu; B27 및 분취량의 g/ml 재고; EFH 배지</td></tr><tr><td>bFGF, 인간 재조합</td><td>시그마</td><td>#F0291</td><td>100 &mu를 준비합니다. B27 및 분취량의 g/ml 재고; EFH 미디엄&nbsp;</td></tr><tr><td>헤파린, 10,000 U</td><td>시그마</td><td>#H3149</td><td>호르몬 믹스 및 분취액에 27.3 mg/ml 스톡을 준비합니다. EFH 매체</td></tr><tr><td>Papain 해리 키트</td><td>Worthington Biochemicals</td><td>#LK003150</td><td>EBSS, papain, DNase, BSA Sodium Pentobarbital Bimeda &ndash와 함께 ovomucoid 프로테아제 억제제를 포함</td></tr><tr><td></td><td>; MTC Animal Health Inc</td><td>DIN 00141704</td><td></td></tr><tr><td>조직 집게: Addisons</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11006-12&nbsp;</td><td>톱니 모양의 표준 팁, 마이크로 팁도 사용 가능</td></tr><tr><td>가는 집게: Dumont #4</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>#15024-10</td><td>Round-handle Vannas</td></tr><tr><td>Rongeurs</td><td>Bausch & Lomb</td><td>N1430</td><td></td></tr><tr><td>10mm 페트리 접시&nbsp;</td><td>Nunc</td><td>1501</td><td></td></tr><tr><td>T25 배양 플라스크</td><td>Nunc</td><td>156367</td><td></td></tr><tr><td>40 &mu; m 나일론 셀 스트레이너</td><td>VWR</td><td>CA21008-949</td><td></td></tr><tr><td>6 웰 플레이트</td><td>Nunc</td><td>CA73520-906</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel, 성장 인자 감소 (100x)</td> <td>Corning</td><td>354230</td><td>지시에 따라 해동 및 동결 분취량; 40 &mu의 비율로 희석 사용; l Matrigel : 1 ml SFM</td></tr></tbody></table>

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

성인 쥐 및 성장 인자가 풍부한 배지에서 배양 인간 척수 신경 줄기 / 선조 세포 (NSPCs)는 자기 갱신, 및 확장 신경 줄기 세포의 분화능 증식을 허용한다. 혈청 조건에서 이러한 능성 NSPCs는 신경 세포, 성상 세포 및 희소 돌기 아교 세포를 생성, 차별화됩니다. 수확 된 조직의 bFGF (효소 파파인-EDTA 용액 중에서 해리 한 후 기계적으로 표피 성장 인자 (EGF)가 보충 된 배지로 Neurobasal 배지, 염기성 섬유 아세포 성장 인자에 도금 단일 세포 현탁액을 수득 해리 불연속 밀도 구배를 통해 분리되고 ) 및 헤파린. 성인 쥐 척수 NSPCs은 자기편 문화로 성장 자유 부동 neurosphere를 성인 인간의 척수 NSPCs으로 배양. 이러한 조건 하에서, 성인 척수 NSPCs은 전구 세포의 마커 익스프레스, 증식, 연속적 통로에 확장 될 수있다. 이러한 세포 수 bE는 다양한 자극에 반응하여 시험관 내에서 연구 및 외인성 인자는 신경 줄기 세포의 분화를 검사 혈통 제한을 촉진하기 위해 사용될 수있다. 능성 NSPCs 또는 그들의 자손 또한 회생 수리를 평가하기 위해 다양한 동물 모델에 이식 할 수있다.

EFH 매체에 현탁 배양에서 자란 성인 쥐 척수 세포는 초기 도금의 일주일 내 작은 neurosphere를 (미분화 세포의 콜로니)을 형성한다. 차 배양에서 도금 셀의 대부분은 죽게되고 성장 인자 응답 줄기 세포가 증식되고 EFH 매체에 대해 선택된다. 통로 (3)에 의해, 다수의 자유 부동 neurosphere를 약 100 μm의 직경 (그림 2A)에있을 것입니다. neurosphere를 라운드 및 위상 밝은이며, 고배율, 섬모 형상 microspikes은 세포 파편 (도 2B)의 덩어리 달리 neurosphere를 특유한 분야의 외측에 돌출 된 세포로부터 보인다. 랫트 조직에서 세포의 전형적인 수율은 약 80 %의 생존과 약 2 × 106 세포이다. neurosphere를 셀 클러스터의 응집을 피하기 위해 너무 높은 밀도로 시딩되지 않아야한다. 또한, 큰 neurosphere를는 해리가 어려워 질 및 세포해질 것이다구의 중심에 괴사. 문화가 계...

다 자란 포유류의 척수에는 배양에서 분리 및 확장될 수 있는 신경줄기세포/전구세포(NSPC)가 포함되어 있습니다. 이 프로토콜은 쥐와 인간 장기 이식 기증자로부터 성인 척수의 뇌실 주위 영역에서 생성된 NSPC의 수확, 분리, 배양 및 전달을 설명합니다.

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

본 절차의 전반적인 목표는 성체 쥐 또는 인간 척수의 뇌실주변 영역에서 신경줄기세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 층판절제술을 통해 척수를 채취함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 척수를 1cm 간격으로 횡단 절단하고, 각 척수 분절에서 뇌실주변 영역을 박리하는 것입니다.다음으로, 잘게 다진 조직을 1 mm 크기로 자른 후 효소적으로 분해합니다. 마지막 단계는 불연속 밀도 구배 원심분리를 통해 온전한 세포를 분리하고 세포 현탁액을 플레이팅하는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 현미경을 사용하여 신경구 형성 및 신경 줄기세포의 성장을 평가할 수 있습니다.오늘은 성체 쥐 척수 척수뇌실 주변 영역에서 신경줄기세포를 분리하는 방법을 시연하겠습니다. 이렇게 분리한 세포는 어떤 외인성 인자가 계통 제한을 촉진하는지, 또는 이러한 세포가 다양한 자극이나 스트레스에 어떻게 반응하는지와 같이 신경줄기세포 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 활용될 수 있습니다. 먼저, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 배양액, 배지와 해부 버퍼를 준비하십시오.다음으로, 마취제를 과량 투여한 후 쥐의 피부를 소독하고 큰 해부 가위를 사용하여 등 쪽 표면을 제거하여 척주를 노출시킵니다. 해부 가위를 등 쪽 표면에 수직이 되도록 가로 방향으로 잡습니다. 뒷다리 위쪽의 척주를 절단합니다.그 다음, 작은 가위를 사용하여 노출된 꼬리 끝부분부터 시작하여 척추를 덮고 있는 등쪽 근육을 주둥이 방향으로 세로로 절개하여 극돌기를 노출시킵니다. 작은 뭉툭한 골절단 도구를 구강 외측에서 척수와 척추 사이의 공간인 척수강 외측면으로 삽입합니다. 날을 척수와 평행하게 얕게 위치시킵니다.그런 다음 층판(lamina)에 작은 절개를 넣고 층판을 조심스럽게 벗겨내어 척수를 노출시킵니다. 이러한 각도는 하부의 척수 손상을 방지합니다. 층판을 머리쪽(rostral direction) 방향으로 계속 제거하십시오.둔단 조직 포셉(blunt tissue forceps)을 사용하여 흉수와 경수 spinal cord를 노출시키려면, vertebral column에서 spinal cord를 조심스럽게 들어 올린 후 마이크로 가위로 신경근을 절단합니다. spinal cord를 분리하기 위해 절제한 spinal cord를 얼음처럼 차가운 멸균 rat dissection buffer가 담긴 Petri dish에 넣습니다. 조직을 차가운 dissecting buffer로 헹구고 가위를 사용하여 spinal cord를 1 cm 간격의 세그먼트로 가로 방향으로 절단합니다. 각 조직 세그먼트에 대해 한 손으로는 미세 포셉으로 조직을 잡고, 다른 한 손으로는 마이크로 가위를 사용하여 회백질의 대부분과 함께 백질을 조심스럽게 제거하여 spinal cord의 periventricular region만 남깁니다.적출한 뇌실 주변 조직을 얼음처럼 차가운 쥐 해부 완충액이 담긴 10 centimeter 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 쥐 신경 줄기세포 분리를 시작하기 위해, 미세 가위를 사용하여 적출한 뇌실 주변 조직을 1 cubic millimeter 크기로 잘게 다집니다. 다음으로, 파파인 분해 키트의 파파인 바이알에 Earl's balanced salt solution 5 milliliters를 첨가하여 효소 해리 완충액을 준비합니다.파파인이 완전히 용해되어 용액이 투명해질 때까지 바이알을 37 °C에서 10분 동안 둡니다. 다음으로, 해리 키트에서 추출한 DNA 바이알에 Earl's balanced salt solution 500 µL를 첨가합니다. 가볍게 혼합한 후, DNA 용액 250 µL를 파파인이 들어 있는 바이알에 넣고 가볍게 혼합합니다.다음으로, 잘게 다진 조직 약 0.2 g을 바이알에 넣고, 바이알을 37 °C의 로커 플랫폼(rocker platform)에 올려 45분에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 10 mL 피펫으로 혼합물을 트리테이션(triturate)하여 남아 있는 조직 조각들을 해리시켜 탁한 세포 현탁액을 얻습니다. 세포 현탁액을 멸균된 15 mL 원추형 튜브(conical tube)로 옮기고 300 Gs에서 5분 동안 원심 분리합니다.원심분리 중 실온에서, 2.7 mL의 Earl's balance salt solution과 300 µL의 재구성된 albumin OVO MOID 억제제 용액을 혼합하여 OVO moid 용액을 준비합니다. 15 mL 원추형 튜브에 앞서 준비한 DNA 용액 150 µL를 oval moid 용액에 첨가하고 튜브를 뒤집어 혼합한 다음, 펠렛화된 세포의 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 희석된 DNA albumin 억제제 혼합액에 즉시 재부유시킵니다. 다음으로, 15 mL 튜브에 albumin 억제제 용액 5 mL를 넣어 불연속 밀도 구배를 준비하고, 5 mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 albumin 억제제 용액 위에 천천히 부드럽게 층을 이뤄 쌓습니다.실온에서 70 ×g로 6분 동안 샘플을 원심분리합니다. 완료되면 상층액을 제거하고, 동반된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 준비하여 미리 데워둔 rat EFH 배지 1 mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 혈구계수기를 사용하여 살아있는 세포의 밀도를 측정하고, EFH 배지 내에서 µL당 10 cells의 밀도로 세포를 T 25 배양 플라스크에 분주합니다.플라스크를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 배양하고, 구체(sphere)의 응집을 방지하기 위해 일주일 동안 배양물을 건드리지 않고 성장시킵니다. 여기에는 luxal fast blue로 염색하고, 백질과 회백질의 경계를 나타내기 위해 hematin과 eoin을 사용한 쥐 척수의 횡단면이 표시되어 있습니다. 점선으로 된 외곽선은 본 프로토콜에서 해당 영역으로부터 분리한 절제된 잔여 뇌실 주변 조직을 나타냅니다.여기에 표시된 것과 같은 신경구(Neurospheres)는 고배율에서 부유 배양 시 자유롭게 떠다니며 성장합니다. 신경구에서 돌출된 미세 돌기(Micro spikes)를 관찰할 수 있으며, 신경구를 해리하여 매트리젤(matrigel)이 코팅된 웰에 도말했을 때 KI 67 양성 염색 결과에서 보이듯이 신경구가 증식함을 알 수 있습니다. 또한, 이들은 주로 신경 전구 세포의 마커인 nestin을 발현합니다.이 절차를 마친 후, 분화를 촉진하기 위해 배양된 세포에 외인성 인자를 추가할 수 있습니다. 성체 신경 줄기세포 또는 그 자손 세포를 다양한 동물 모델에 이식하여 재생 복구 능력을 평가할 수도 있습니다. 이 영상이 유용하기를 바라며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 비디오는 성체 쥐의 척수 뇌실 주위 조직에서 신경 줄기/전구 세포를 분리하는 방법을 제시합니다. 이 기술에는 단백질 분해 효소가 포함된 용액에서 조직 조각을 배양하여 세포 외 기질을 파괴하고 세포를 방출하는 것이 포함됩니다. 그 후, 방출된 세포는 신경 줄기/전구 증식을 강화하고 3차원 신경구로의 응집을 촉진하는 특정 성장 인자를 포함하는 배지에 도금됩니다.

성체 쥐의 척수 뇌실 주위 영역에서 신경 줄기 전구 세포의 격리

성장 인자를 함유하는 피브린 매트릭스는 완전한 척수 절개 부위로 그라프 신경 줄기 세포를 유지하기 위해 사용되었다. 이식 세포가 완전히 병변 캐비티를 채우고 장거리 호스트 척수로 축삭을 확장 신경 세포를 포함한 여러 신경 세포 유형으로 분화.

중증 척수 손상 후 섬유소 및 성장 인자 칵테일 신경 줄기 세포의 생존 및 분화 촉진

성인의 뇌에서 수확 한 신경 줄기 세포는 신경 시스템 개발의 기초 연구에서 재생 의학의 잠재적 인 임상 응용 프로그램을 탐험에 이르기까지 다양한 애플리케이션에 활용 증가하고있다. 이 실험 결과를 소리를하는 것이 중요합니다 이러한 세포를 성장하는 데 사용되는 분리 및 배양 조건에서 엄격한 통제를한다.

성인 쥐의 뇌의 기존 및 비 인습적 인 지역에서 신경 줄기 세포 성장

이 프로토콜은 단일 세포 현탁액 분해없이 구형 신경 줄기 및 전구 세포 응집체의 확장을 허용 신규 기계적 자르고 방법을 설명한다. 세포 / 세포의 접촉을 유지하는 것은 40 구절에 대한 신속하고 안정적​​인 성장을 할 수 있습니다.

인간의 신경의 집계의 cGMP-해당 확장 방법은 줄기 및 전구 세포는 다 능성 줄기 세포 또는 태아 뇌 조직에서 파생 된

여기서 우리는 subventricular 영역과 개인 성인 쥐의 치아 이랑 (dentate gyrus)에서, 부착 단층 또는 neurosphere를 하나로서, 신경 전구 세포 배양의 동시 발생에 대한 자세한 프로토콜을 설명합니다.

하나의 마우스, 두 문화 : 분리 및 성인 신경의 문화가 개인 마우스의 두 신경 인성 영역에서 줄기 세포

척수 손상은 심각한 이환율과 사망률이 높은 원인 외상 조건이다. 본 연구에서 우리는 구체적으로 신경 줄기 세포를 이식 하였다 마우스 척수 손상의 타박상 모델을 설명한다.

척수 손상의 실험 Contusive 모델에서 신경 줄기 세포 이식

성체 신경 줄기세포(aNSCs) 확장을 위한 배양 시스템을 구축하면 치료를 위한 aNSC를 검사하고 적용할 수 있습니다. 굳은살하영역(subcallosal zone, SCZ)은 최근 성체 마우스에서 새로운 신경아세포 형성 영역으로 인식되고 있습니다. 여기에서는 SCZ-aNSC의 분리, 확장 및 분화 방법에 대해 설명합니다.

마우스 뇌량 밑 영역에서의 분리 및 성인 신경 줄기 세포의 문화

골수 내에서 골수 간질 세포 (MSC)가 존재합니다. 우리의 프로토콜은 hypoxic preconditioning을 통해 세포의 인구를 풍요롭게하고 이후 그들이 성숙한 Schwann 세포가되도록 지시합니다.

성숙한 슈반 세포 생성을위한 골수 유래 선조 세포의 저산소 전처리

여기, 예비 중앙 운하 틈새 주택 내 인 성 신경 줄기 세포 (NSCs) 성인 마우스에서 최소한의 척수 상해 모델의 성능을 보여 줍니다. 우리는 활성화 및 마이그레이션 고 원시적인 NSCs 부상 다음의 척도를 neurosphere 분석 실험을 사용 하는 방법을 보여줍니다.

최소한의 척수 상해의 마우스 모델에서 내 인 성 신경 줄기 세포 활성화 평가 Neurosphere 분석 결과

여기, 전자13 마우스 배아 절 예 하에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 새로운 microsurgical 기술을 소개합니다.

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

살아있는 쥐의 뇌에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하는 방법이 여기에 실험적으로 자세히 제시되어 있습니다. 그것은 그들의 웰빙을 손상시키지 않고 동일한 동물로부터 이러한 세포를 여러 번 수집할 수 있습니다.

살아있는 쥐에서 신경 줄기 세포와 희소돌기아교세포 전구 세포를 분리하기 위한 "뇌 착유" 방법

배우세요 성체 쥐와 인간 척수 뇌실 주위 백질에서 신경 줄기/전구 세포를 분리하는 방법을. 효소적 분해와 불연속 밀도 구배 원심분리를 통해 신경구 형성을 평가할 수 있습니다.

뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

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