뇌실 주위 백질 성인 쥐의 지역 및 인간의 척수에서 신경 줄기 / 전구 세포의 분리

본 절차의 전반적인 목표는 성체 쥐 또는 인간 척수의 뇌실주변 영역에서 신경줄기세포를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 층판절제술을 통해 척수를 채취함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 척수를 1cm 간격으로 횡단 절단하고, 각 척수 분절에서 뇌실주변 영역을 박리하는 것입니다.

다음으로, 잘게 다진 조직을 1 mm 크기로 자른 후 효소적으로 분해합니다. 마지막 단계는 불연속 밀도 구배 원심분리를 통해 온전한 세포를 분리하고 세포 현탁액을 플레이팅하는 것입니다. 최종적으로, 면역형광 현미경을 사용하여 신경구 형성 및 신경 줄기세포의 성장을 평가할 수 있습니다.

오늘은 성체 쥐 척수 척수뇌실 주변 영역에서 신경줄기세포를 분리하는 방법을 시연하겠습니다. 이렇게 분리한 세포는 어떤 외인성 인자가 계통 제한을 촉진하는지, 또는 이러한 세포가 다양한 자극이나 스트레스에 어떻게 반응하는지와 같이 신경줄기세포 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 활용될 수 있습니다. 먼저, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 배양액, 배지와 해부 버퍼를 준비하십시오.

다음으로, 마취제를 과량 투여한 후 쥐의 피부를 소독하고 큰 해부 가위를 사용하여 등 쪽 표면을 제거하여 척주를 노출시킵니다. 해부 가위를 등 쪽 표면에 수직이 되도록 가로 방향으로 잡습니다. 뒷다리 위쪽의 척주를 절단합니다.

그 다음, 작은 가위를 사용하여 노출된 꼬리 끝부분부터 시작하여 척추를 덮고 있는 등쪽 근육을 주둥이 방향으로 세로로 절개하여 극돌기를 노출시킵니다. 작은 뭉툭한 골절단 도구를 구강 외측에서 척수와 척추 사이의 공간인 척수강 외측면으로 삽입합니다. 날을 척수와 평행하게 얕게 위치시킵니다.

그런 다음 층판(lamina)에 작은 절개를 넣고 층판을 조심스럽게 벗겨내어 척수를 노출시킵니다. 이러한 각도는 하부의 척수 손상을 방지합니다. 층판을 머리쪽(rostral direction) 방향으로 계속 제거하십시오.

둔단 조직 포셉(blunt tissue forceps)을 사용하여 흉수와 경수 spinal cord를 노출시키려면, vertebral column에서 spinal cord를 조심스럽게 들어 올린 후 마이크로 가위로 신경근을 절단합니다. spinal cord를 분리하기 위해 절제한 spinal cord를 얼음처럼 차가운 멸균 rat dissection buffer가 담긴 Petri dish에 넣습니다. 조직을 차가운 dissecting buffer로 헹구고 가위를 사용하여 spinal cord를 1 cm 간격의 세그먼트로 가로 방향으로 절단합니다. 각 조직 세그먼트에 대해 한 손으로는 미세 포셉으로 조직을 잡고, 다른 한 손으로는 마이크로 가위를 사용하여 회백질의 대부분과 함께 백질을 조심스럽게 제거하여 spinal cord의 periventricular region만 남깁니다.

적출한 뇌실 주변 조직을 얼음처럼 차가운 쥐 해부 완충액이 담긴 10 centimeter 멸균 페트리 접시에 넣습니다. 쥐 신경 줄기세포 분리를 시작하기 위해, 미세 가위를 사용하여 적출한 뇌실 주변 조직을 1 cubic millimeter 크기로 잘게 다집니다. 다음으로, 파파인 분해 키트의 파파인 바이알에 Earl's balanced salt solution 5 milliliters를 첨가하여 효소 해리 완충액을 준비합니다.

파파인이 완전히 용해되어 용액이 투명해질 때까지 바이알을 37 °C에서 10분 동안 둡니다. 다음으로, 해리 키트에서 추출한 DNA 바이알에 Earl's balanced salt solution 500 µL를 첨가합니다. 가볍게 혼합한 후, DNA 용액 250 µL를 파파인이 들어 있는 바이알에 넣고 가볍게 혼합합니다.

다음으로, 잘게 다진 조직 약 0.2 g을 바이알에 넣고, 바이알을 37 °C의 로커 플랫폼(rocker platform)에 올려 45분에서 1시간 동안 배양합니다. 배양 후, 10 mL 피펫으로 혼합물을 트리테이션(triturate)하여 남아 있는 조직 조각들을 해리시켜 탁한 세포 현탁액을 얻습니다. 세포 현탁액을 멸균된 15 mL 원추형 튜브(conical tube)로 옮기고 300 Gs에서 5분 동안 원심 분리합니다.

원심분리 중 실온에서, 2.7 mL의 Earl's balance salt solution과 300 µL의 재구성된 albumin OVO MOID 억제제 용액을 혼합하여 OVO moid 용액을 준비합니다. 15 mL 원추형 튜브에 앞서 준비한 DNA 용액 150 µL를 oval moid 용액에 첨가하고 튜브를 뒤집어 혼합한 다음, 펠렛화된 세포의 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 희석된 DNA albumin 억제제 혼합액에 즉시 재부유시킵니다. 다음으로, 15 mL 튜브에 albumin 억제제 용액 5 mL를 넣어 불연속 밀도 구배를 준비하고, 5 mL 피펫을 사용하여 세포 현탁액을 albumin 억제제 용액 위에 천천히 부드럽게 층을 이뤄 쌓습니다.

실온에서 70 ×g로 6분 동안 샘플을 원심분리합니다. 완료되면 상층액을 제거하고, 동반된 텍스트 프로토콜에 기술된 대로 준비하여 미리 데워둔 rat EFH 배지 1 mL에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 혈구계수기를 사용하여 살아있는 세포의 밀도를 측정하고, EFH 배지 내에서 µL당 10 cells의 밀도로 세포를 T 25 배양 플라스크에 분주합니다.

플라스크를 37 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 배양하고, 구체(sphere)의 응집을 방지하기 위해 일주일 동안 배양물을 건드리지 않고 성장시킵니다. 여기에는 luxal fast blue로 염색하고, 백질과 회백질의 경계를 나타내기 위해 hematin과 eoin을 사용한 쥐 척수의 횡단면이 표시되어 있습니다. 점선으로 된 외곽선은 본 프로토콜에서 해당 영역으로부터 분리한 절제된 잔여 뇌실 주변 조직을 나타냅니다.

여기에 표시된 것과 같은 신경구(Neurospheres)는 고배율에서 부유 배양 시 자유롭게 떠다니며 성장합니다. 신경구에서 돌출된 미세 돌기(Micro spikes)를 관찰할 수 있으며, 신경구를 해리하여 매트리젤(matrigel)이 코팅된 웰에 도말했을 때 KI 67 양성 염색 결과에서 보이듯이 신경구가 증식함을 알 수 있습니다. 또한, 이들은 주로 신경 전구 세포의 마커인 nestin을 발현합니다.

이 절차를 마친 후, 분화를 촉진하기 위해 배양된 세포에 외인성 인자를 추가할 수 있습니다. 성체 신경 줄기세포 또는 그 자손 세포를 다양한 동물 모델에 이식하여 재생 복구 능력을 평가할 수도 있습니다. 이 영상이 유용하기를 바라며, 실험에 좋은 결과가 있기를 바랍니다.