동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

이 절차의 전반적인 목표는 생리학적으로 관련된 3D 환경에서 세포의 이동 특성을 연구하는 것입니다. 이것은 먼저 내부 콜라겐 겔에 세포를 파종한 다음 원하는 매트릭스 특성을 가진 세포가 없는 외부 콜라겐 겔로 둘러싸여서 수행됩니다. 다음으로, 세포가 외부 겔 내부로 침입하고 이동할 수 있으며, 이 동안 세포를 모니터링하고 정량적으로 분석할 수 있습니다.

궁극적으로 이 동심원 겔 분석은 세포 이동 거동이 세포 외 기질의 생물물리학적 특성에 의해 어떻게 영향을 받는지 보여주는 데 사용됩니다. 전달 분석 또는 스크래치 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 세포의 이동이 구조적 및 생물물리학적 특성을 제어하기 매우 쉬운 생리학적으로 관련된 조약 환경에서 발생한다는 것입니다. 이 방법의 시각적 시연은 농축 내부 라우터 겔 시스템의 형성이 매우 섬세하기 때문에 매우 중요합니다.

적절한 겔 인터페이스는 이 실험의 성공에 매우 중요하며, 이는 때때로 달성하기가 약간 어려울 수 있습니다. 80% co fluency로 T 25 플라스크에서 수확할 준비가 된 MD MBA 2 31 세포 배양으로 시작합니다. 첫 번째 트립신은 플라스크당 1밀리리터의 용액을 사용하는 세포입니다.

그런 다음 4분 동안 200Gs의 힘을 사용하여 세포를 펠릿으로 수집하고 스내트를 버리고 세포를 5ml의 배양액으로 재현탁합니다. 미디어. 이제 혈구 분석기를 사용하여 세포 밀도를 측정하고 밀리리터당 1억 개의 세포에 필요한 부피를 측정합니다. 그런 다음 200G에서 4분 동안 셀을 스핀다운합니다.

상층액을 제거하고 펠릿을 필요한 부피의 무혈청 배양 배지에 완전히 재현탁시킵니다. 이 서스펜션은 최종 좌석 농도의 10배입니다. 얼음 양동이에 필요한 원액을 모으기 시작하려면 XPBS milq 물 10개와 수산화나트륨 0.1몰이 포함됩니다.

또한 후드 아래에 있는 여러 개의 마이크로 원심분리기 튜브를 차갑게 식히고, 멸균 기술을 유지하고, 50마이크로리터의 밀리리터당 2.4밀리그램 내부 젤 용액에 대해 원하는 콜라겐 양을 분취합니다. 그런 다음 측정된 콜라겐에 10 XPBS 5마이크로리터를 천천히 첨가합니다. PBS가 추가될 때 튜브를 휘젓되 거품을 만들지 마십시오.

다음으로, 기본 용액을 사용하여 혼합물의 pH를 7.4로 조정하십시오. 일반적으로 5마이크로리터가 작업을 수행합니다. 문제 해결 가이드는 텍스트 프로토콜에 제공됩니다.

마지막으로, 10 x 세포 현탁액을 위한 공간을 남겨두고 무혈청 배양 배지로 부피를 최대 45마이크로리터까지 가져옵니다. 먼저 콜라겐 용액에 5마이크로리터의 10 x 세포 현탁액을 추가하고 기포를 형성하지 않고 용액에 세포를 완전히 재현탁시킵니다. 이제 유리 바닥판을 예열하기 위해 중앙에 20 마이크로 리터의 서스펜션을 추가하십시오.

글쎄, 돔 모양의 물방울을 형성하면 거품이 형성되면 빠르게 파열되거나 엉망이되지 않고 빨아 들입니다. 젤을 올바른 방법으로 주조하는 것은 특히 콜라겐과 같은 점성이 매우 높은 용액의 경우 매우 까다로울 수 있습니다. 가능한 한 거품을 생성하지 않도록 하고 용액이 중합할 준비가 되면 용액을 휘젓지 마십시오., 팽창으로 인해 인공 섬유가 정렬될 수 있기 때문입니다.

이제 접시를 45분 동안 인큐베이터에 다시 넣어 인큐베이션이 끝나기 15분 전에 내부 층이 중합되도록 합니다. 얼음에 200마이크로리터의 외부 콜라겐 젤 용액을 준비합니다. 먼저, 필요한 양의 스톡 콜라겐을 분주합니다.

둘째, 부드럽게 소용돌이치면서 20 XPBS의 10 마이크로리터를 천천히 추가합니다. 그런 다음 이전과 같이 pH를 7.4로 조정하고 Milli Q 물로 용액을 최대 200마이크로리터까지 가져옵니다. 이제 인큐베이터에서 접시를 제거하고 내부 젤 돔 위에 외부 젤 용액 180마이크로리터를 부드럽게 추가합니다.

이것은 내부 용액을 완전히 덮고 우물을 채워야 합니다. 용액을 젓지 말고 내부 젤 용액을 만지지 마십시오. 외부 용액을 배출하는 동안 기포가 형성되면 신속하게 파열하거나 피펫으로 다시 빨아들입니다.

또 다른 중요한 단계는 적절한 겔 계면을 확보하는 것입니다. 이 단계의 핵심은 외부 젤 용액을 추가하는 것입니다. 내부 젤이 아직 인증되지 않은 경우.

겔화 역학은 중합 조건에 따라 달라질 수 있으며, 외부 겔 중합을 위해 이 조건을 미리 최적화하는 것이 중요합니다., 접시를 45분 동안 인큐베이터로 되돌려 놓으십시오. 45분 후 젤은 상당히 단단해야 하지만 여전히 조심스럽게 제거할 수 있습니다.2ml의 따뜻한 매체를 추가하여 젤을 완전히 잠길 수 있습니다. 이것은 2-3일마다 신선한 배지로 제공되는 동심원 겔 배양을 완료합니다.

며칠 안에 세포는 외부 기질로 이동하기 시작하여 이동을 관찰하고 형광 추적기로 세포를 염색합니다. 배지 2 밀리리터를 염료 5 마이크로 리터를 함유 한 새로운 배지로 교체하고 배양 기간 후 30 분 동안 배양하고 세척 당 2-3 분 동안 1 밀리리터의 PB S3를 사용하여 배양액을 세척합니다. 세척 후 접시에 일반 매체를 다시 채우십시오.

그런 다음 환경 제어 현미경에 접시를 설정합니다. 이제 사용량 설정을 사용하여 젤 인터페이스 옆에 있는 외부 젤 영역을 스캔합니다. 일반적으로 ZS 스택에서 5미크론 간격을 사용하여 두께가 100미크론인 647미크론 정사각형 뷰에서 스캔합니다.

그런 다음 중간 영역을 스캔하고 마지막으로 젤의 주변을 스캔합니다. 가장자리 효과로 고통받을 수 있는 세포를 피하기 위해 바닥, 상단 또는 측면 표면에서 50미크론 이내의 영역을 제외합니다. 수집된 데이터에서 세포의 움직임을 분석하려면 먼저 imas와 같은 데이터 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 엽니다.

먼저 명령 초과를 선택한 다음 명령 화면을 선택합니다. 이렇게 하면 표면을 추적하는 옵션이 표시됩니다. 시간이 지남에 따라 데이터 세트 내에서 관심 영역, 즉 데카르트 좌표와 기간을 선택합니다.

다음으로, 관심 영역에서 배경을 뺍니다. 배경 제거로 인해 셀이 손실되지 않도록 하려면 개체에 맞는 가장 큰 구를 선택합니다. 이제 시드 포인트 직경을 선택하여 연결된 개체를 분할하고 모든 시드 포인트 분류를 진행합니다.

다음 단계는 Surface Now를 수동으로 분류하는 것입니다. 동일한 개체를 가리키는 그룹 시드 점. 관심 영역의 모든 시점 간에 이 작업을 수행합니다.

마지막으로 추적이 완료되면 개체를 추적하고 개체 추적을 분류한 다음 스프레드시트를 사용하여 분석할 정량적 데이터 세트를 출력합니다. 며칠 간의 동심원 겔 배양 후, 세포는 내부 외부 겔 계면을 뚫고 외부 겔로 침입하기 시작했습니다. 세포 집단은 주로 방사형 방향으로 바깥쪽으로 퍼졌습니다.

다양한 콜라겐 밀도의 외부 젤에서 세포의 움직임을 비교했습니다. 이미징은 8시간 동안 수행되었으며 각 샘플에서 약 200개의 세포 궤적이 계산되었습니다. 가장 얇은 매트릭스의 셀은 가장 적은 거리를 이동했습니다.

이 계산은 방사상으로 바깥쪽으로 이동하는 세포뿐만 아니라 모든 세포를 고려했습니다. 모든 경우에 커버된 총 거리는 순 변위보다 컸습니다. 예상대로 지속성은 변위와 거리 사이의 비율로 계산되었습니다.

지속성 값이 0.4라는 것은 이러한 세포가 본질적으로 약한 방향성 이동을 가졌음을 시사합니다. 평균 속도 계산은 콜라겐 밀도가 세포 속도에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 반비례 관계에 있는 기질 공극 크기와 콜라겐 밀도는 이동 속도에 반대 효과를 일으켜 서로를 상쇄할 수 있습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 동심원 겔 시스템을 구축하는 방법과 3D 환경에서 이러한 세포 이동을 연구하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차에 따라 세포 추출, 마이크로어레이 분석과 같은 다른 많은 작업을 수행할 수 있으며, 여기서 마이그레이션의 다른 시점 동안 특정 단백질이 얼마나 많이 발현되는지와 같은 추가 질문에 답할 수 있습니다.