Name: 동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 43 s
Description: 학습하세요 동심 젤 시스템을 이용한 3D 환경에서 세포 이동 특성 연구 방법입니다. 콜라겐 겔 내부에 세포를 배양하여 외부 기질의 생물물리학적 특성이 세포 이동에 미치는 영향을 정량 분석할 수 있습니다.

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저자는 중요한 토론 W. 일 및 K. 젠슨 감사, 싱가포르 국립 대학의 나노 역학 연구소의 지원을 인정합니다. NAK는 마리 퀴리 IIF 원정대에 의해 지원을 인정합니다.

1. 세포 수확 <ol><li> 37 ° C, 5 % CO 2 배양기에서 MD-MBA-231 세포를 얻습니다. 0.5 % 트립신 - EDTA 용액을 이용하여 조직 배양 접시에서 세포를 분리합니다. T25 플라스크에서 배양 세포 트립신 EDTA 용액 1 ㎖를 사용합니다. </li><li> 4 분의 200 × g에서 원심 분리하여 15ml의 원뿔형 튜브 펠렛의 세포 상등액을 흡인하고, 세포를 재현 탁 배양액 5ml에. </li><li> 혈구를 사용하여, ρ, 셀 밀도를 계산. 주 : 셀 시드 내측 겔을 제조하기 위해, 세포 현탁액을 이후 10 × 최종 세포 파종 밀도에 도달하기 위해 희석된다. 따라서, 10 × 세포 현탁액 농축이 요구된다. </li><li> 10 × 세포 농도를 달성하는 데 필요한 유체의 체적을 계산한다 : <img alt="식 (1)" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq1.jpg" width="175" /> 참고 : 마지막 셀 시드 밀도를 최종 C, 약 2의(15); 10 6 세포 / ㎖의 MD-MBA-231 세포에 권장되며,이 프로토콜에 사용된다. 기타 파종 밀도는 다른 세포 유형에 대해 탐구 할 수있다. </li><li> 펠렛의 세포 하나 더 4 분 동안 200 × g에서 원심 분리하여 15 ML 원뿔 튜브 시간, 뜨는을 대기음. </li><li> 세포 응집을 최소화하기 위해 충분히 세포의 무 혈청 배지 (단계 1.3에서 계산 V 배지)에 필요한 양의 세포를 재현 탁. 주 : 페놀 레드가 자동 형광, 형광 / 반사 영상을 방해 할 수 있습니다. 페놀 레드없는 배지의 사용은 최상의 이미지 품질을 달성하기 위해 고려 될 수있다. </li></ol> 콜라겐 솔루션 2. 준비 <ol><li> 주식 콜라겐 솔루션, 10 × PBS 버퍼, 밀리-Q의 H 2 O, 0.1 M의 NaOH, 여러 마이크로 원심 튜브를 얻습니다. 조기 콜라겐 중합을 방지하기 위해 얼음을 모두 유지하고 무균 상태를 유지한다. </li><li> 멸균 유리 - 평형을37 ° C 배양기에서 사전 온난화로 바닥 접시. 참고 :이 프로토콜의 모든 볼륨이 잘 12mm 유리 바닥 접시에 최적화되었습니다. 다른 접시 형이 사용되는 경우, 대응하여 볼륨을 조절한다. </li><li> 콜라겐 스톡 농도에 기초하여 상기 내측 겔 (용액 I) 2.4 ㎎ / ㎖의 콜라겐 용액 50 μL를 준비하기 위해 필요한 요구되는 부피를 계산한다. 주 : 겔 내측 기타 콜라겐 농도도 사용될 수있다. </li><li> 멸균 환경 (일반적으로 바이오 안전성 후드)에서, 천천히 부드러운 소용돌이와 (단계 2.3에서 계산) 콜라겐 원액 필요한 양의 10 × PBS 버퍼의 5 μl를 추가합니다. 공기 방울 형성​​을 방지하기 위해주의하십시오. </li><li> 교정의 pH 미터를 사용하여 0.1 M의 NaOH를 이용하여 7.4로 혼합물의 pH를 조정한다. 대략적인 기준으로, (양이 주식 농도와 산도에 따라 달라집니다) 7.4에 가까운 pH를 가지고 약 5 μl를 사용합니다. 참고 : 볼륨이에 관여합니다단계는 표준 pH 미터를 사용하기에는 너무 작다. 다음 트릭 중 하나를 사용하여 <ol><li> 여러 샘플 콜라겐 솔루션을 준비합니다. 표준 pH 측정기를 사용하여 대량으로 pH를 조정하고 샘플에 걸쳐 콜라겐 솔루션을 배포 할 수 있습니다. </li><li> 대안 적으로, 더 많은 양의 콜라겐 용액의 pH를 조정 (Ⅰ. 예., 표준 pH 미터의 사용을 허용 양). 최종 pH로 pH를 가져 필요한 양의 NaOH를 참고. 볼륨을 확장하고 실험에 NaOH를 적절한 양을 사용합니다. 리트머스 종이를 사용하여 pH 값을 확인합니다. </li><li> 그렇지 않으면, 더 정확하게 소량의 pH를 조정하기 위해 마이크로 pH 전극을 사용한다. </li></ol></li><li> O. H 2 μL를 사용하여 45의 부피로 용액을 가져와 조기 콜라겐 중합을 방지하기 위해 얼음의 모든 단계를 수행합니다. </li></ol> 동심 젤 문화 3. 형성 <ol><li> 예열 된 유리 바닥 접시를 타고 일부터 (단계 2.2 참조)전자 인큐베이터. </li><li> I. 용액에 재현 탁하고 (단계 1.5에서 제조) 10 × 농축 된 세포 현탁액의 5 μL를 추가 철저. 공기 방울 형성​​을 방지하기 위해주의하십시오. 혼합물을 50 μL의 현재 볼륨 및 (최종 = 2 × 106 세포 / ㎖ c) 최종 농도 콜라겐 (2.4 ㎎ / ㎖), 셀 밀도를 포함한다. </li><li> 이 돔 형상의 액적 (도 1a)을 형성하도록 I는 웰의 중심으로 서서히 세포 - 함유 용액 20 μL를 추가한다. 이 단계에서 거품 형성을 방지하기 위해주의하십시오. 거품 형태의 경우, 신중하지만 빨리 시도 중 하나를 파열되거나 피펫 팁을 사용하여 빨아. 조심스럽게 내부 겔을 45 분 동안 중합 수 있도록 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li><li> (외부, 무 세포 콜라겐 젤) 솔루션 O이 배양 단계가 끝나기 전에 약 15 분을 준비합니다. 참고 : 외부 젤 상태는 콜라겐 농도와 중합의 pH 조건에 변경 될 수 있습니다다른 마이크로 (10)과 네트워크를 구하십시오. 7.4의 pH에​​서 중합 4.0 ㎎ / ㎖ 콜라겐 젤 -이 프로토콜에서 1.5에 초점을 맞 춥니 다. <ol><li> 콜라겐 스톡 농도에 기초하여, 최종 농도 콜라겐 용액 O 200 μL를 준비하는 데 필요한 요구 체적을 계산한다. </li></ol></li><li> 10 × PBS의 20 μL는 부드러운 소용돌이와 (3.4 단계에서 계산) 콜라겐 원액의 필요한 양을 천천히 버퍼에 추가합니다. 교정의 pH 미터를 이용하여, 0.1 M의 NaOH를 사용하여 최종 pH로 혼합물의 pH를 조정한다. pH 조정에 대한 2.5 단계로주의를 참조하십시오. </li><li> O. H 2를 사용하여 200 μL의 최종 부피로 용액을 가져와 조기 콜라겐 중합을 방지하기 위해 얼음의 모든 단계를 수행합니다. </li><li> 내부 겔의 45 분의 중합 후 인큐베이터에서 접시를 타고 (단계 3.3 참조). 이 솔루션은 완전히 내부를 덮도록 조심스럽게, 내부 젤 위에 솔루션 O 180 μl를 추가젤과 잘 (그림 1B)를 채 웁니다. <ol><li> 외부 젤 비 균일 한 섬유 방향으로 이어질 수있는 솔루션을 교반하지 않고 신중하게이 단계를 수행합니다. 피펫 팁과 내부 젤에 손이 닿지 않도록주의하고, 기포 나 공기 주머니의 형성을 방지하기 위해. 거품 형태의 경우, 신중하지만 빨리 시도 중 하나를 파열되거나 피펫 팁을 사용하여 빨아. 부드럽게 외부 겔 중합을 수 있도록 인큐베이터에서 접시를 다시 배치합니다. </li></ol></li><li> 중합 45 분 후 인큐베이터에서 접시를 가져 가라. 거칠게 취급하면 여전히 바닥면으로부터 분리 할 수​​ 있지만, 이미 상당히 겔,​​이 시점에서 고화한다. <ol><li> 부드럽게 접시 (도 1C)로 가온 세포 배양 배지 2 ㎖를 붓는다. 젤이 완전히 매체에 빠져들되어 있는지 확인합니다. 문화의 기간에 걸쳐 3 일 - 매 2 매체를 새로 고칩니다. </li></ol></li></ol> 4. 라이브 셀 이미징 <ol><li> 장기 라이브 세포 이미징 기능을 갖춘 반전 공 초점 현미경을 사용하여 이미지를 수행합니다. 포함 내장 된 온도 (37 ° C) 및 CO 2 (5 %) 제어와 배양 챔버. 현미경에 전환하고 실험을 시작하기 전에 단계를 적어도 1 시간을 따뜻하게. 참고 : 긴 작동 거리와 사용 대물 렌즈는 3D 젤 세포의 관찰 및 현지화를 최적화 할 수 있습니다. </li><li> 3 차원 시스템에서 세포의 정확한 위치 파악을 할 수 있도록 30 분 동안 형광 세포 추적기 염료 5 μl를 함유하는 배지에서 배양 한 겔. 그 후, 1 × PBS로 세척하여 세 번 결합되지 않은 염료를 제거합니다. 그 후, 접시에 세포 배양 배지를 추가한다. </li><li> 인큐베이터에서 접시를 타고 현미경 스테이지 (그림 1D)에 놓습니다. 참고 : 라이브 세포 이미징 바로 외부 겔의 중합 후 원칙적으로 시작할 수 있습니다. 그러나이 시점에서, 세포를 전n은 내부 젤은 아직 확산되지 않았다. 외측 겔, 라이브 셀 이미징 배양 개시 후 (셀 타입에 따라) 24 시간을 시작할 수 침범 제 세포의 이주를 조사. 대략적인 기준으로, 약 12​​ - 문화의 14 일이 외부 젤을 입력 내부 겔에 세포의 대부분이 필요하다. </li><li> 내부 젤을 둘러싼 외부 젤 지역에서보기 (VOV의)의 볼륨을 선택. 24 시간의 배양이 세포 집단 확산 것이다 후 내부와 외부 사이의 계면 겔을 교차하고, 외측 겔 침투하기 시작했다. <ol><li> 보브의 경우, 바로 옆에있는 외부 젤 (7)의 외곽에 가까운 겔 인터페이스, 중간 지역, 지역에 젤 영역을 포함한다. 가능한 에지 효과를 피하기 위하여, 겔의 상단에서뿐만 아니라, 가까운 아래쪽 및 측면 표면으로부터 50㎛의 영역보다 제외. 각 보브는 일반적으로 X에서 (647 × 647 × 100 μm의 3을 측정Z의 -stack 5 μm의 간격이 각각, Y, Z 방향). </li></ol></li><li> 확인 촬상 모드, 채널 / 필터, 노출 시간, 이미지 해상도가 올바르게 선택된다. 콜라겐 네트워크의 라벨없는 이미징의 경우, 시간 경과 라이브 셀 이미징 동안 동시에 반사율 공 촛점 현미경을 사용한다. </li><li> 샘플 이미지를 가지고 강도 막대 그래프를 플롯과 충분한 신호를 관찰하고 히스토그램이 제로 최대 강도 사이에 위치하도록함으로써 포화를 방지하기 위해 이득 및 오프셋을 조정합니다. 실험 기간에 걸쳐 더 이상 이러한 설정을 변경하지 마십시오. </li><li> 8 시간 (또는 필요 이상) 10 분, 시간 간격, Δ의 t으로, 선택한 보브 년대의 시간 경과 이미지를 가져 가라. </li></ol> 5. 셀 추적 및 데이터 분석 <ol><li> appropria를 사용하여 Z -stack 이미지에서 정량적 이미지 포스트 - 프로세싱을 수행<html> 테 이미지 처리 소프트웨어. <ol><li> 세그먼트 시간 경과 이미지는 자동으로 값 (x, y, z, t)의 3D 셀 위치를 선택합니다. </li><li> 모든 프레임의 경우, 수동으로 현지화 정확성을 확인하고 세포 착각되었을 수 세포 파편 및 세포 돌기 때문에 오탐 (false positive)를 제거합니다. 다른 오브젝트로 분석 및 분할 겹치거나 연결된 세포의 증식 세포를 제거합니다. </li></ol></li><li> 시계열로 각 셀의 위치를 연결하여 이전 단계에서 얻어진 셀 좌표 (x, y, z, t)로부터 3D 경과 셀 트랙을 생성한다. </li><li> 임계 트랙 길이 (보통 20 분)보다 짧은 트랙을 제거하여 임의의 시스템 노이즈를 제거합니다. </li><li> 필요한 경우, 트랙에 의한 전체적인 순 변위를 감산함으로써 샘플 드리프트 보정. </li><li> 셀의 변위를 계산세틸 / ftp_upload / 52735 / 52735eq2.jpg &quot;폭 =&quot;80 &quot;/&gt;, 및 세포 이동 거리, <img alt="식 (3)" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52735/52735eq3.jpg" width="100" /> 관찰 된 셀 궤적으로부터, 여기서시 셀의 3 차원 위치를 나타내는 벡터이고, 시점의 총 수이다. <ol><li> Δ (t)가 프레임 간의 시간 간격, S = D / (n 개 •의 Δ의 t)와 같은 세포 속도를 계산한다. P = Δd 및 / D를 사용하여 세포 이동의 방향성 (또는 지속성)을 계산합니다. 지속성이 간단한 측정은 P = 0 순 변위가 0이고 P = 1 궤적이 직선 방향 라인이 있음을 의미한다. </li></ol></li></ol>

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</ol>

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이 프로토콜에서 우리는 생체 내에서 발생하는 ECM과 위상학적으로 유사한 매트릭스 환경에서 세포의 3D 이동 거동을 연구하기 위한 시험관 내 분석을 설명합니다. 현재 사용 가능한 다른 방법과 비교하여 이 분석에는 세 가지 주요 강점이 있습니다. 첫째, 이 분석을 통해 집단 수준과 개별 세포 수준 모두에서 세포 이동 메커니즘을 동시에 검사할 수 있습니다. 이것은 집단 세포 이동13을 연구할 수 있는 가능성을 열어주며, 이는 현재까지 주로 2D 분석14으로 제한되어 왔으며, 동시에 집단 내에서 개별 세포의 행동을 관찰합니다. 자연적으로 그룹 또는 클러스터로 이동하지 않는 세포의 경우, 이 분석은 다양한 국소 미세 환경을 가진 다수의 세포로부터 이동 특성을 자세히 분석하는 방법을 제공하며, 이는 이동 효율성 및 방향성 지속성의 생물물리학적 기원에 대한 중요한 통찰력을 제공할 수 있습니다7,15.
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세포의 이주는 배아 발달, 지혈, 면역 응답으로서뿐만 아니라, 혈관 질환, 염증, 암과 같은 병리학 한 공정에서 다양한 생리 학적 반응에서 중요한 역할을한다. 세포 이동의 기초 생화학 및 생물 물리학 적 요인을 해부하여 세포 기능의 기본 원리를 이해뿐만 아니라, 조직 공학, 안티 전이 및 항 염증성 약물 개발 등 다양한 생물 의학 응용 프로그램을 전진뿐만 따라서 근본적으로 중요하다. 생체 관측 기술적 도전이기 때문에, 많은 노력은 세포 이동의 시험관 재현부에 집중되어왔다. 세포의 이동을 연구하는 체외 방법에서 크게 특히, 두 개의 차원 (2D) 표면 분석을위한 스크래치를 설계 또는 분석이 상처 치유되었습니다. 이러한 분석은 간단한 실험 장치를 제공, 쉬운 가축세포 이미징 및 세포 이동의 기초가 다양한 생화학 적 메커니즘에 유용한 통찰력을 제공한다. 그러나 이러한 분석은 생체 마이그레이션에 대한 이해의 중요한 측면이다 세포 외 기질 (ECM) 건축과 리모델링을 고려하지 않습니다. 최근에는 점차 3D 배양 모델은 종종 콜라겐 계 매트릭스 3에서, 더 나은 상황 생체 유사한 플랫폼을 제공하는 것이 이해되었다. 실제로, 세포는 특히 인해 환경 (4)의 다른 차원을 2 차원 표면에 나타나는 것과 구별되는 migrational 동성을 나타낸다. 더욱이, 행렬의 생물 리 학적 및 기계적 특성을 민감하게 종양 세포 침윤 (6)의 컨텍스트에 포함하여, 세포 이동 (5)에 영향을 미친다. 여기서, 우리는 제조 조건에서 쉽게 변할 수 생물 리 학적 특성을 갖는 ECM 차원 셀 마이그레이션 동작을 연구하는 방법을 제시한다. 세포는 아르&quot;내부 젤&quot;의 시드와로 새어 처음에 무 세포 &quot;외부 젤을&quot;침략 수 있습니다. 상기 방법은 세포가 밀접 7 mechanosensing 연결되어 외측 겔에서 무 세포 지역으로 이동하는 세포의 존재를 인식 할 수있는 능력, 및 성향에 의존한다. 이 연구에서 우리는 매우 침습적 유방암 세포, MD-MBA-231에 의해 침략 ECM의 콜라겐 네트워크를 사용합니다. 기계적 특성 모두 내측 및 외측 겔의 미세 조정 8 및 생리 학적으로 관련된 조건을 달성하기 위해 구를 특징으로 할 수있다. 셀 트랙의 재건 및 분석은 인구 수준 및 개별 셀 레벨 모두에서 시공간 마이그레이션 동작의 상세한 정량적 검사를 할 수 있습니다. 중요한 것은, 동심 젤 시스템의 설치, 따라서 중요한 통찰력을 제공하고, 특히 암 세포에 침입, 세포 마이그레이션 직면 한 생체 조직 토폴로지를 모방세포 이동 및 전이의 물리적 메커니즘.

<table><tbody><tr><td>세포 배양 인큐베이터</td><td>Fisher Scientific Pte Ltd</td><td>모델: 371, S/No 318854-6055</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Nikon A1R</td><td></td><td>인큐베이터 챔버가 장착된 도립 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경</td></tr><tr><td>Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle's Medium)</td><td>Life Technologies</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청(FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>형광 CellTracker 염료 CMTMR</td><td>Life Technologies</td><td>C2927</td><td></td></tr><tr><td>유리 바닥 접시</td><td>IWAKI Cell Biology</td><td>3931-035</td><td>직경 12mm 직경의 유리 바닥 웰이 있는 35mm 직경 접시</td></tr><tr><td>혈구계</td><td>iN CYTO</td><td>DHC-N01 (Neubauer 개선)</td><td></td></tr><tr><td>마이크로프로세서 pH 측정기</td><td>Hanna Instruments</td><td>pH 211</td><td></td></tr><tr><td>뉴트라겐 Collagen</td><td>Advanced BioMatrix</td><td>#5010-D</td><td>산 가용화 소 콜라겐 유형 I(재고 pH ~ 2)</td></tr><tr><td>대물 렌즈</td><td>Nikon</td><td></td><td>CFI Super Plan Fluor ELWD ADM 20XC, W.D. 8.2-6.9mm, NA 0.45.</td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pH 측정기</td><td>Sartorius</td><td>S/No 29153352</td><td>기본 pH 측정기 PB-11</td></tr><tr><td>트립신-EDTA</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>15400-054</td><td></td></tr></tbody></table>

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

Concentric Gel System to Study the Biophysical Role of Matrix Microenvironment on 3D Cell Migration

이동하는 세포의 능력은 암 및 암전이에에서 배아 발생 및 상처 치유 수명에 걸쳐 세포 기능의 다양한 중요하다. 강렬한 연구 노력에도 불구하고, 세포 이동의 기본 생화학 및 생물 물리학 적 원리는 아직도 완전히 특히 생리 관련 3 차원 (3D) 미세 환경에서 이해되지 않습니다. 여기서는 3D 세포 이동 동작의 정량적 검사가 가능하도록 설계 시험 관내 분석을 기술한다. 이 방법은 이전에 빈 세포 외 기질 (ECM)로 마이그레이션하는 세포의 mechanosensing 능력과 성향을 이용한다. 우리 모델 시스템으로서 콜라겐 겔에서 고도로 침윤성 유방암 세포의 침윤, MDA-MB-231을 사용한다. 주 동안 배양 세포 집단의 확산 및 개별 세포의 이주 역학 라이브 세포 이미징을 사용하여 모니터링 및 시공간 - 분해 된 데이터를 추출하기 위해 분석 될 수있다. 게다가상기 방법에 따라서 세포 이동에 생물 물리학 적 미세 인자의 역할을 조사하기 간단하지만 강력한 방법을 제공하고, 다양한 세포 외 기질을위한 용이하게 적응할 수있다.

여기에 제시된 동심 겔 분석 고도로 침윤성 유방암 세포를 사용하여 수행하고, MDA-MB-231, 2.4 ㎎ / ml의 내측 콜라겐 젤, 예로서 = 2 × 106 세포 / ml의 세포 시딩 밀도와. 도 2에 도시 된 바와 같이, 통상적으로 배양 몇 일 후, 세포 내외 겔 인터페이스를 위반하고 외측 겔 침투하기 시작했다. 셀 인구는 반경 방향 바깥쪽으로 주로 확산. 외측 겔 중합 조건은 세포 이동 특성에 관한 행렬의 밀도 및 기계적 성질의 역할을 연구하기 위해 수정 될 수있다. (3) 1.5 mg을 외측 겔 각 셀의 움직임을 도시한다 / ㎖, 2.4 ㎎ / ㎖, 및 4.0 ㎎ / ㎖의 콜라겐은, pH가 7.4에서 중합. 공 촛점 시간 경과 화상이 8 시간에 대한 내측 및 외측 겔 사이의 경계에서 획득 한 세 가지 콜라겐 concen에서 세포의 변위 된trations 흰...

기계적 특성 및 세포 외 매트릭스의 미세 강하게 세포의 3 차원 이동에 영향을 미칩니다. 시험 관내 방법은 개별 세포 집단 수준에서 모두 biophysically 변수 환경에서 시공간 세포 이동 동작을 연구하기 위해, 설명한다.

The ability of cells to migrate is crucial in a wide variety of cell functions throughout life&#160;from embryonic development and wound healing&#160;to ...

본 실험 절차의 전반적인 목표는 생리학적으로 유의미한 3D 환경에서 세포의 이동 특성을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포를 내부 콜라겐 겔에 파종한 다음, 원하는 매트릭스 특성을 가진 세포가 없는 외부 콜라겐 겔로 이를 둘러쌉니다. 이후 세포가 외부 겔로 침습 및 이동하도록 유도하며, 이 과정 동안 세포를 모니터링하고 정량적으로 분석할 수 있습니다.궁극적으로, 이 동심원 겔 분석법은 세포 이동 행동이 세포외 기질의 생물물리학적 특성에 의해 어떻게 영향을 받는지 보여주는 데 사용됩니다. 전이 분석법(transfer assay)이나 스크래치 분석법(scratch assay)과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 구조적 및 생물물리학적 특성을 매우 쉽게 조절할 수 있는 생리학적으로 유의미한 처리 환경에서 세포 이동이 일어난다는 점입니다. 동심원 내부 라우터 겔 시스템의 형성이 매우 정교하기 때문에, 이 방법의 시각적 시연이 매우 필수적입니다.적절한 겔 계면을 형성하는 것은 본 실험의 성공을 위해 매우 중요하며, 때로는 이를 달성하는 것이 다소 까다로울 수 있습니다. 80% 밀도로 증식하여 수확 준비가 된 T 25 플라스크의 MDA-MB-231 세포 배양물로 시작하십시오. 먼저 플라스크당 1 mL의 용액을 사용하여 세포를 트립신 처리합니다.그다음 200 G의 원심력으로 4분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛 형태로 수집하고, 상층액을 제거한 뒤 5 mL의 배양 배지에 세포를 재현탁합니다. 이제 혈구계수기를 사용하여 세포 밀도를 측정하고, mL당 1억 개의 세포를 얻는 데 필요한 부피를 결정합니다. 그다음 세포를 200 G에서 4분 동안 원심분리하여 가라앉힙니다.상층액을 제거하고 펠렛을 필요한 부피의 무혈청 배양 배지에 완전히 재현탁합니다. 이 현탁액은 최종 도말 농도의 10배 농도입니다. 시작하기 위해 10 XPBS, 초순수 및 0.1 M 수산화나트륨을 포함한 필요한 스톡 용액들을 얼음 버킷에 준비합니다.또한 후드 내에서 멸균 상태를 유지하며 여러 개의 마이크로 원심분리 튜브를 냉각시키고, 2.4 mg/mL 농도의 내부 겔 용액 50 µL에 필요한 양의 콜라겐을 분주합니다. 그다음 계량된 콜라겐에 10 XPBS 5 µL를 천천히 첨가합니다. PBS를 첨가하면서 튜브를 부드럽게 돌려 섞되, 기포가 생기지 않도록 주의하십시오.다음으로, 염기 용액을 사용하여 혼합물의 pH를 7.4로 조정합니다. 일반적으로 5 µL 정도면 충분합니다. 문제 해결 가이드는 텍스트 프로토콜에 제공되어 있습니다.마지막으로, 10 x 세포 현탁액을 넣을 공간을 남겨두고 무혈청 배지를 사용하여 부피를 45 µL로 맞춥니다. 우선, 콜라겐 용액에 10 x 세포 현탁액 5 µL를 첨가하고, 기포가 생기지 않도록 용액 내에서 세포를 충분히 재현탁합니다. 이제 예열된 유리 바닥 플레이트 중앙에 현탁액 20 µL를 첨가합니다.돔 모양의 액적을 형성하십시오. 기포가 빠르게 형성되면 주변을 더럽히지 않게 즉시 터뜨리거나 빨아들이십시오. 겔을 올바르게 캐스팅하는 것은 매우 까다로울 수 있으며, 특히 콜라겐과 같이 점도가 매우 높은 용액의 경우 더욱 그렇습니다. 기포 발생을 최대한 피하고, 중합 준비가 된 용액을 소용돌이치게 하지 마십시오. 소용돌이가 발생하면 인위적인 섬유 정렬이 나타날 수 있기 때문입니다.이제 디쉬를 인큐베이터에 넣고 45분 동안 보관하여, 배양 종료 15분 전까지 내부 층이 중합되도록 합니다. 얼음 위에서 200 µL의 외부 콜라겐 겔 용액을 준비합니다. 먼저, 필요한 양의 스톡 콜라겐을 분주합니다.둘째, 부드럽게 소용돌이치듯 섞으면서 10 XPBS 20 µL를 천천히 첨가합니다. 그 다음, 이전과 동일하게 pH를 7.4로 조정하고, Milli Q water를 사용하여 용액의 최종 부피를 200 µL로 맞춥니다. 이제 배양기에서 디쉬를 꺼내고 내부 겔 돔 위에 외부 겔 용액 180 µL를 조심스럽게 첨가합니다.이 단계에서는 내부 용액이 완전히 덮이고 웰(well)이 채워져야 합니다. 용액을 젓지 말고 내부 겔 용액을 건드리지 않도록 주의하십시오. 외부 용액을 분사하는 동안 기포가 형성되면 빠르게 터뜨리거나 피펫으로 다시 빨아들이십시오.또 다른 중요한 단계는 적절한 겔 인터페이스가 형성되었는지 확인하는 것입니다. 이 단계의 핵심은 내부 겔이 아직 굳기 전에 외부 겔 용액을 첨가하는 것입니다.겔화 속도는 중합 조건에 따라 달라질 수 있으므로, 사전에 이 조건을 최적화하는 것이 필수적입니다. 외부 겔을 중합시키려면 디쉬를 인큐베이터에 넣고 45분 동안 둡니다. 45분 후 겔은 상당히 단단해지지만 여전히 밀려날 수 있으므로, 따뜻한 배지 2 mL를 조심스럽게 추가하여 겔을 완전히 잠기게 합니다. 이로써 동심원 겔 배양이 완료되며, 2~3일마다 신선한 배지를 공급해 줍니다.며칠 이내에 세포가 외부 매트릭스로 이동하기 시작합니다. 세포의 이동을 관찰하려면 형광 추적기로 세포를 염색하십시오. 배지 2 mL를 5 µL의 염료가 포함된 신선한 배지로 교체하고 30분 동안 배양하십시오. 배양 기간이 끝나면, PBS 1 mL를 사용하여 3회 세척하며, 회당 2~3분씩 세척하십시오. 세척 후, 디쉬에 일반 배지를 다시 채우십시오.그런 다음 디쉬를 환경 제어 현미경 위에 설치합니다. 이제 설정된 볼륨을 사용하여 겔 인터페이스 옆의 외부 겔 영역을 스캔하십시오. 일반적으로 ZS 스택에서 5 µm 간격으로 100 µm 두께의 647 µm 정사각형 뷰로 스캔합니다.그 다음 중간 영역을 스캔하고 마지막으로 겔의 외곽 지역을 스캔합니다. 가장자리 효과(edge effect)의 영향을 받을 수 있는 세포를 배제하기 위해 바닥, 상단 또는 측면 표면에서 50 microns 이내의 영역은 제외하십시오. 수집된 데이터로부터 세포의 이동을 분석하려면 먼저 imas와 같은 데이터 분석 소프트웨어에서 이미지 파일을 엽니다.먼저 surpass 명령을 선택한 다음 surface 명령을 선택하십시오. 그러면 표면을 추적하는 옵션이 나타납니다. 이어서 데이터 세트 내에서 관심 영역, 즉 데카르트 좌표와 시간 범위를 선택하십시오.다음으로, 관심 영역에서 배경을 감산합니다. 배경 제거 과정에서 세포가 소실되는 것을 방지하기 위해, 객체 내에 들어가는 가장 큰 구를 선택하십시오. 이제 시드 포인트 직경을 선택하여 연결된 객체들을 분리하고, 모든 시드 포인트를 분류하십시오.다음 단계는 표면을 수동으로 분류하는 것입니다. 동일한 객체를 가리키는 시드 포인트들을 그룹화하십시오. 관심 영역 내의 모든 시점(time points)에 대해 이 작업을 수행하십시오.마지막으로, 추적이 완료되면 객체를 추적하고 객체 궤적을 분류한 다음, 스프레드시트를 사용하여 분석할 정량적 데이터 세트를 출력합니다. 며칠 동안 동심원 젤 배양을 진행한 후, 세포가 내측 젤과 외측 젤의 경계면을 뚫고 외측 젤로 침투하기 시작했습니다. 세포 집단은 주로 방사형 방향으로 외부로 퍼져 나갔습니다.다양한 콜라겐 밀도를 가진 외부 겔 내 세포의 이동을 비교하였습니다. 8시간 동안 이미징을 수행하였으며, 각 샘플에서 약 200개의 세포 궤적을 계산하였습니다. 가장 얇은 매트릭스 내의 세포가 가장 짧은 거리를 이동하였습니다.이 계산에는 방사형으로 외부로 이동하는 세포뿐만 아니라 모든 세포가 고려되었습니다. 모든 경우에서 총 이동 거리가 순 변위보다 더 길었습니다. 예상한 바와 같이, 지속성은 변위와 거리 사이의 비율로 계산되었습니다.0.4의 지속성 값은 이 세포들이 본질적으로 약한 방향성 이동을 보였음을 시사합니다. 평균 속도 계산 결과, 콜라겐 밀도가 세포 속도에 영향을 미치지 않는 것으로 나타났습니다. 역관계에 있는 매트릭스 기공 크기와 콜라겐 밀도가 이동 속도에 서로 반대되는 영향을 미쳐 결과적으로 상쇄되었을 가능성이 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 동심원 겔 시스템을 구축하는 방법과 3D 환경에서 세포의 이동을 연구하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 따라 세포 추출이나 마이크로어레이 분석과 같은 다양한 추가 실험을 수행할 수 있으며, 이를 통해 이동 과정 중 서로 다른 시점에서 특정 단백질이 얼마나 발현되는지와 같은 추가적인 질문에 대한 답을 찾을 수 있습니다.I.

concentric-gel-system-to-study-biophysical-role-matrix

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이러한 세포 마이 그 레이션으로 세포 프로세스 전통적으로 2 차원, 딱딱한 플라스틱 표면에 연구하고 있습니다. 이 보고서는 직접 단백질 지방화를 시각화하고보다 생리학 관련, 3 차원 매트릭스에서 마이 그 레이션 세포의 단백질 역학을 분석하는 기술을 설명합니다.

3 차원 매트릭스에서 찬란 태그가 추가된 단백질을 표현 마이 그 레이션 전지의 라이브 세포 이미징

라이브 셀 마이그레이션 연구에 대한 현미경 챔버의 접착제 및 가용성 그라디언트의 조립 방법이 설명되어 있습니다. 엔지니어링 환경 솔루션 기울기와 antifouling 표면과 접착제 트랙을 결합하기 때문에 하나가지도 단서의 상대적 중요성을 확인할 수 있습니다.

형광 현미경과 영상 셀 마이그레이션을위한 접착제 및 가용성식이 그라디언트를 만들기

이 문서는 찬란 추가 수정 및 3D 세포 배양의 라이브 영상 모두에 사용할 수 있습니다 콜라겐 레이블을하는 방법을 제시한다. 우리는 또한 3D 환경에서 배양 세포의 내생 세포 골격 단백질을 시각화하기 위해 최적화 된 프로토콜을 제공합니다.

3D로 침윤성 암 세포의 세포 골격 조직을 공개

일차원 국한 미세 환경에서 세포의 자발적인 이동을 연구하는 정량적 방법이 설명된다. 이 방법은 미세 채널을 활용하고 번의 실험에서 서로 다른 조건 하에서 세포의 다수의 이동을 연구하기 위해 이용 될 수있다.

미세 채널에서 세포의 이동에 관한 연구

세포 이동은 암과 같은 상처 치료 및 면역 반응 및 병태 생리 학적 과정으로, 생리의 과다에 관여하는 생물학적 현상이다. 3D-콜라겐 매트릭스 마이그레이션 분석은 3 차원 형상의 생리적 환경 내에서 다른 세포 유형의 이동성 특성을 분석하는 다용도 공구이다.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

세포 이동은 인간의 발달과 생활에서 중요한 부분을 차지합니다. 세포 이동을 변경할 수 있는 메커니즘을 이해하기 위해 3D 콜라겐 매트릭스에서 화학주성을 조사할 수 있는 평면 구배 확산 시스템을 제시하여 기존 분석법의 최신 확산 챔버 한계를 극복할 수 있습니다.

평면 그라데이션 확산 시스템은 3D 콜라겐 매트릭스에 화성을 조사하기 위해

다음 프로토콜은 2차원(2D)과 3차원(3D) 세포 환경 사이의 중간 단계로 사용할 샌드위치와 같은 배양을 조립하는 절차를 설명합니다. 엔지니어링된 시스템은 현미경 검사, 생체 역학, 생화학 및 세포 생물학 분석에 적용할 수 있습니다.

샌드위치 같은 미세 환경은 셀 / 재료의 상호 작용을 활용하는

콜라겐은 ECM의 핵심 구성 요소이며, 이전의 분화와 증식에 이르기까지 여러 세포 과정에 대한 중요한 단서를 제공한다. 3D 콜라겐 히드로 겔 내에 세포를 포함하는 프로토콜 및 PDMS 마이크로 채널을 사용하여 무작위 또는 정렬 된 콜라겐 매트릭스를 생성하는 더 진보 된 기술이 여기에 제공된다.

3D 상호 작용의 연구에 대한 3D 콜라겐 젤과 마이크로 채널 준비<em&gt; 생체</em

이 프로토콜의 목표 3 차원 섬유 소 매트릭스 내에서 셀 마이그레이션에 프로 및 안티 migratory 요인의 효과 평가 하는 것입니다.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

과립 하이드로겔 내부 및 계면으로의 3D 세포 이동에 대한 정량적 평가를 위한 프로토콜이 여기에 제시되어 있습니다.

Quantifying three-dimensional cell migration within and into granulular hydrogel biomaterials(과립 하이드로겔 생체 물질로의 3차원 세포 이동 정량화)

학습하세요 동심 젤 시스템을 이용한 3D 환경에서 세포 이동 특성 연구 방법입니다. 콜라겐 겔 내부에 세포를 배양하여 외부 기질의 생물물리학적 특성이 세포 이동에 미치는 영향을 정량 분석할 수 있습니다.

동심 젤 시스템은 3 차원 세포의 이동에 매트릭스 미세 환경의 생물 물리학 역할을 연구하는

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