기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 기계생물학(mechanobiology)에서 기계적 변형(mechanical strain)의 역할을 거의 실시간으로 관찰하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포를 배양하고 신장시킬 수 있는 유연한 막이 포함된 시스템을 구축합니다. 두 번째 단계로, 막을 신장시켜 모터 카운트와 막 변형 간의 상관관계를 보정합니다.

다음으로, 마우스 폐 상피 세포를 신장시키고 핵을 이미지화합니다. 막 변형이 세포로 전달된다는 것을 보여주기 위해, 신장 장치를 AFM에 통합하여 신장 전후의 개별 세포 강성을 나노 인덴테이션으로 측정했습니다. 결과는 가해진 신장으로 인해 세포에 직접적인 손상이 발생했음을 보여줍니다.

또한 형광 이미징을 통해, 신장(stretch)에 따라 활성 산소종의 생성이 증가하는 것이 확인되었습니다. 이 방법은 기계적 환기로 인해 상피 세포가 손상될 수 있는지 여부와 같이 폐 기계 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 본 방법은 폐 세포 및 기계 생물학에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 간이나 성장판 절편과 같은 다른 연조직에도 적용 가능합니다.

일반적으로, 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 원자 힘 현미경(atomic force microscope)과 같이 본 실험에서 사용되는 이례적인 도구들의 조합으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 우선, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 배양에 사용할 수 있도록 수정된 콜라겐 코팅 PDMS 막을 준비하십시오. 다음으로, 멸균된 유연한 콜라겐 코팅 막 위에 마우스 폐 상피 세포를 웰당 2.5 million cells의 밀도로 분주하십시오.

세포가 완전히 confluence 상태에 도달할 때까지 37°C, 5% CO2 조건에서 2일 동안 배양합니다. 그 후, 사전 인장(pretension)이 필요하지 않은 경우, 6개의 클램프 탭 각각의 중심에서 20.5 mm 떨어진 지점에 1.5 mm 바이옵시 펀치를 사용하여 구멍을 두 개씩 뚫습니다. 그리고 세포 배양액을 제거합니다.

기계적 액추에이터가 제로 스트레인(zero strain) 위치에 있는지 확인하고, 펀치 홀이 핀 및 클램프와 일치하도록 스트레처 위에 멤브레인을 배치하십시오. 상단 클램프를 제자리에 놓고, 여러 면을 번갈아 가며 나사를 하나씩 조여줍니다. 장치를 현미경 스테이지 위에 올리기 전, 세포 배양 배지 1 mL를 추가하십시오.

장치를 광로의 중심에 맞춥니다. 다음으로, 장치를 스테이지에 고정합니다. 대상 입력 블록에 있는 현미경 스테이지 컨트롤러를 사용하여 기계적 장치의 수평 및 수직 위치를 조정함으로써 막에 초점을 맞춥니다.

적용하고자 하는 원하는 변형 수준에 해당하는 모터 카운트 값을 입력하십시오. 다음으로, 신장 전후에 동일한 시야를 관찰하기 위해 속도 입력 블록의 값을 10 RPM 이하로 설정하십시오. 신장 중에 시야가 현미경 대물렌즈에 대해 이동할 수 있으므로 신장 과정 중에 현미경 스테이지를 조정해야 할 수도 있습니다. 모든 설정이 완료되면 go를 클릭하십시오.

원자 힘 현미경의 설정을 조정하는 것으로 시작합니다. AFM 헤드의 높이를 Z 방향으로 최대 위치까지 올립니다. 그런 다음 다리에 연장 장치를 부착하여 AFM 캔틸레버가 샘플과 접촉하는 평면을 높입니다.

다음으로, 현미경에서 A FM 스캐너 플레이트와 원하는 대물렌즈를 제거합니다. 대물렌즈에 스페이서를 추가한 다음, 이를 다시 현미경에 장착합니다. 그런 다음 스캐너 플레이트를 A FM에 다시 배치합니다. 스페이서의 높이는 대물렌즈와 구체적인 a FM 설정에 따라 달라지지만, 관찰 평면이 Z 방향으로 이동하므로 광학 이미징을 원할 경우 스페이서를 반드시 사용해야 합니다.

다음으로, AFM 소프트웨어, 광학 현미경 소프트웨어 및 형광 측정용 광원을 포함한 모든 필요한 광원을 켜십시오. AFM에 생세포의 탄성 계수를 측정하기 위해 강성이 200 pN/nm 이하인 캔틸레버 빔이 장착된 칩을 장착하십시오. 그 다음 레이저를 정렬하고 장치에 유리 커버슬립을 장착한 후, 제조사의 권장 사항에 따라 캔틸레버 강성을 보정하십시오. 막을 신축 장치에 장착하기 직전에 벽의 높이를 약 1 mm로 절단하십시오.

이렇게 하면 멤브레인 벽과 로드 셀 사이에서 발생하는 간섭이 줄어듭니다. 그다음 세포 배양액을 제거하고 멤브레인을 기계 장치에 장착하십시오. 소프트웨어를 사용하여 어댑터가 장착된 기계 장치를 스캐너 위에 배치하십시오.

나노 인덴테이션을 수행하기 전, 막을 원하는 인장 변형률 수준까지 늘립니다. 세포의 수분을 유지하기 위해 0.5 milliliters 이하의 배지를 세포 위에 추가하되, FM 스캐너나 현미경에 손상을 줄 수 있는 유출이 발생하지 않도록 주의하십시오. 그 다음 캔틸레버 빔을 막에 접촉시킵니다.

관심 영역을 스캔하려면 해당 AFM 장비의 프로토콜을 따르십시오. 멤브레인에 파종된 세포에 20% 변형(strain)을 가했을 때, 여기에 표시된 바와 같이 세포가 20% 변위되었으며, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 누적 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 센서를 사용하여 기관지 상피 세포에서 활성 산소종(ROS) 생성에 미치는 세포의 영향이 측정되었습니다. 기계적 신축이 없는 경우에는 17%의 단일 신축을 가하고 유지했을 때 60분 동안 ROS 생성이 유의하게 증가하지 않았습니다.

원자 힘 현미경에 기계적 신축 장치를 결합함에 따라 미토콘드리아 ROS의 증가가 이후 60분 동안 지속되었습니다. 10% 인장 변형 전후의 생쥐 폐 상피세포 탄성 계수 맵을 여기에 표시된 영역에서 얻었습니다. 40 by 40 µm 영역에서 300개의 개별 강제 굴곡 곡선을 기록하였으며, 변형 적용 시 고탄성 계수 영역의 국소화가 변화함을 확인하였습니다.

숙달되면 세포 신축(cell stretching)은 15분 이내에 완료할 수 있습니다. 반면 FM 나노 인덴테이션(nano indentation)은 제대로 수행하려면 2시간이 소요될 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 세포를 조심스럽게 다루되 신속하게 처리하는 것이 중요하며, 데이터 보고 전의 교반이나 장시간의 실온 공기 노출은 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. FM을 사용하는 작업은 매우 까다로울 수 있다는 점을 유념하십시오.

본 절차를 수행하는 동안 모든 액체가 스캐너에 닿지 않도록 주의해야 합니다.