기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징
2015년 8월 19일
살아있는 세포의 기계적 변형률에 대한 실시간 반응을 측정할 수 있도록 맞춤형 모터 구동 기계식 액추에이터를 사용하여 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 기계생물학과 관련된 이 시스템은 컨포칼 또는 원자력 현미경으로 거의 실시간 이미징을 허용하면서 최대 20%까지 균주를 적용할 수 있습니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 세포 기계생물학에 대한 기계적 변형의 역할을 거의 실시간으로 관찰하는 것입니다. 이것은 먼저 세포가 성장하고 늘어나는 유연한 막이 있는 시스템을 구축함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계로 멤브레인을 늘려 멤브레인 변형률에 따라 모터 수를 보정합니다.
다음으로, 마우스 폐 상피 세포를 늘리고 핵을 이미지화합니다. 막 긴장이 세포로 전달된다는 것을 보여주기 위하여는, 들것은 그 때 뻗기 전후에 개인적인 세포의 뻣뻣함을 측정하기 위하여 nano 압흔을 위한 A FM로 통합했습니다. 결과는 적용된 스트레치로 인한 세포의 직접적인 손상을 보여줍니다.
또한 형광 이미징을 기반으로 활성 산소 종 생성이 늘어남에 따라 증가하는 것으로 나타났습니다. 글쎄요, 이 방법은 상피 세포가 기계적 환기로 손상될 수 있는지 여부와 같은 폐 기계 생물학 분야의 주요 질문에 답할 수 있습니다. 이 방법은 폐 세포, 기계 생물학에 대한 통찰력을 제공할 수 있으며 간 또는 성장판 절편과 같은 다른 연조직에도 적용할 수 있습니다.
일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 원자력 현미경과 같이 이러한 실험에 사용되는 도구의 틀에 얽매이지 않는 조합으로 인해 어려움을 겪을 것입니다. 먼저, 함께 제공되는 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 배양에 사용하기 위해 변형된 콜라겐 코팅된 PDMS 멤브레인을 준비합니다. 다음으로, 웰당 250만 개의 세포로 마우스 폐 상피 세포를 멸균되고 유연한 콜라겐 코팅된 멤브레인에 파종합니다.
세포가 유창성에 도달할 때까지 섭씨 37도 및 5%CO2에서 2일 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 1.5mm 생검 펀치를 사용하여 프리텐션이 필요하지 않은 경우 구조물 중심에서 20.5mm 떨어진 6개의 클램프 탭 각각에 두 개의 구멍을 뚫습니다. 그리고 세포 배양 배지를 제거합니다.
기계식 액추에이터가 변형률이 0인 위치에 있는지 확인하고 펀치 구멍이 핀 및 클램프와 정렬되도록 들것에 멤브레인을 배치합니다. 상단 cl을 배치amps를 제자리에 고정한 다음 나사를 한 번에 하나씩 조이면서 다른 면을 번갈아 가며 조입니다. 장치를 현미경 스테이지에 놓기 전에 1밀리리터 세포 배양 배지를 추가합니다.
장치를 광 경로의 중앙에 놓습니다. 그런 다음 장치를 스테이지에 고정합니다. 대상 입력 블록에 있는 현미경의 스테이지 컨트롤러로 기계 장치의 평면 및 수직 위치를 조정하여 멤브레인에 초점을 맞춥니다.
적용할 원하는 변형률 수준에 해당하는 모터 수 값을 입력합니다. 다음으로, 속도 입력 블록의 값을 10RPM 이하로 설정하여 현미경 대물렌즈에 대해 자기장이 이동할 수 있으므로 스트레치 전후와 동일한 필드를 관찰하고 스트레치 중에 현미경 스테이지를 조정해야 할 수도 있습니다. 모든 것이 설정되면 이동을 클릭합니다.
원자력 현미경을 조정하는 것으로 시작합니다. FM 헤드의 높이를 Z 방향의 최대 위치로 늘립니다. 그런 다음 다리에 익스텐더를 끼워 FM 캔틸레버가 샘플과 접촉하는 평면을 들어 올립니다.
그런 다음 현미경에서 A FM 스캐너 플레이트와 원하는 대물렌즈를 제거합니다. 대물렌즈에 스페이서를 추가한 다음 현미경에 다시 장착합니다. 그런 다음 스캐너 플레이트를 A FM에 다시 놓습니다. 스페이서의 높이는 목표와 특정 FM 설정에 따라 달라지지만 관측 계획이 Z 방향으로 이동하기 때문에 광학 이미징이 필요한 경우 스페이서를 사용해야 합니다.
그런 다음 A FM 소프트웨어, 광학 현미경 소프트웨어 및 형광 측정을 위한 광원을 포함하여 필요한 모든 광원을 시작합니다. A FM에서 살아있는 세포의 탄성 계수를 측정하기 위해 나노미터당 200피코 뉴턴 이하의 강성을 가진 캔틸레버 빔이 있는 칩을 장착합니다. 그런 다음 레이저를 정렬하고 유리 커버 슬립을 장치에 장착하고 이를 사용하여 제조업체의 제안에 따라 캔틸레버 강성을 보정합니다. 스트레칭 장치에 멤브레인을 장착하기 직전에 벽을 약 1mm 높이로 자릅니다.
이것은 멤브레인 벽과 로드 셀 사이에서 발생하는 간섭을 줄입니다. 그런 다음 세포 배양 매체를 제거하고 기계 장치에 멤브레인을 장착합니다. 소프트웨어를 사용하여 어댑터가 있는 기계 장치를 스캐너에 놓습니다.
나노 압흔 전에 멤브레인을 원하는 인장 변형률 수준으로 늘립니다. 세포에 0.5ml 이하의 매체를 추가하여 수분을 유지하되 FM 스캐너나 현미경을 손상시킬 수 있는 유출을 피하도록 주의하십시오. 그런 다음 캔틸레버 빔을 멤브레인과 맞물립니다.
특정 A FM 장치의 프로토콜에 따라 관심 영역을 스캔합니다. 세포막에 파종된 세포에 20%의 균주를 적용했을 때, 세포는 20%를 변위시켰습니다.여기에 나타난 바와 같이, 반응성 산소 종의 생산에 대한 세포의 영향은 동반된 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 누적 미토콘드리아 과산화물 센서를 사용하여 기관지 상피 세포에서 측정되었습니다. 기계적 스트레치가 없는 경우, 단일 17% 스트레치가 적용되고 유지되었을 때 ROS 생산은 60분 동안 크게 증가하지 않았습니다.
미토콘드리아 ROS의 증가는 기계식 들것을 원자력 현미경에 통합한 후 60분 동안 더 지속되었습니다. 탄성 계수, 10% 인장 변형 전후의 마우스 폐 상피 세포 지도는 여기에 설명된 영역에서 얻어졌습니다. 40 x 40 마이크로미터 영역에 걸쳐 300개의 개별 강제 편향 곡선이 기록되었으며, 이는 변형률 적용에 따른 고탄성 영역의 국소화 변화를 보여줍니다.
일단 숙달되면 세포 스트레칭은 15분 안에 완료할 수 있습니다. FM 나노 인덴테이션은 제대로 수행하는 데 2시간이 소요될 수 있지만 이 절차를 시도하는 동안 데이터가 보고되기 전에 교반 및 장기간 실내 공기 노출로 인해 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있으므로 세포를 신중하면서도 신속하게 처리하는 것을 기억하는 것이 중요합니다. FM으로 작업하는 것은 매우 어려울 수 있다는 것을 잊지 마십시오.
이 절차를 수행하는 동안 스캐너에서 모든 액체를 멀리 유지하는 것과 같은 예방 조치를 취해야 합니다.
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개요
본 연구는 생체 내 세포의 기계적 변형 반응을 실시간으로 관찰할 수 있는 새로운 이미징 프로토콜을 제시합니다. 사용자 정의 모터 구동 기계식 액추에이터를 활용하여, 본 시스템은 최대 20%의 변형을 적용하면서 공초점 또는 원자력 현미경을 이용한 거의 실시간 이미징을 가능하게 합니다.
주요 연구 구성요소
과학 영역
- 기계생물학
- 세포 이미징
- 생체 세포 역학
배경
- 세포에 미치는 기계적 변형의 영향을 이해하는 것은 기계생물학에 매우 중요합니다.
- 실시간 이미징 기술은 세포 반응 연구를 향상시킵니다.
- 기계적 변형은 세포 행동 및 성분에 영향을 미칠 수 있습니다.
- 이전 방법은 실시간 반응을 효과적으로 측정할 수 있는 능력이 부족했습니다.
연구 목적
- 생체 내 세포 기계생물학에 미치는 기계적 변형의 역할을 실시간으로 관찰하는 것.
- 세포에 적용되는 변형을 보정할 수 있는 시스템을 개발하는 것.
- 기계적 변형 전후의 세포 강성을 측정하는 것.
사용된 방법
- 세포 성장 및 변형을 위한 유연한 막이 있는 시스템 구성.
- 모터 카운트와 막 변형의 보정.
- 생쥐 폐 상피 세포의 변형 및 핵 이미징.
- 원자력 현미경에 나노 압입을 위한 스트레처 통합.
주요 결과
- 적용된 기계적 변형으로 인한 세포 직접 손상이 관찰되었습니다.
- 실시간 이미징은 변형에 대한 세포 반응에 대한 통찰을 제공했습니다.
- 개발된 시스템은 효과적으로 세포에 막 변형을 전달했습니다.
- 강성 측정은 변형 후 세포 성질의 변화를 나타냈습니다.
결론
- 새로운 이미징 프로토콜은 기계생물학적 반응에 대한 상세한 연구를 가능하게 합니다.
- 실시간 관찰은 변형 하의 세포 역학에 대한 이해를 향상시킵니다.
- 이 접근 방식은 다양한 맥락에서 세포 반응을 더 깊이 연구하는 데 적용될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Real-time live cell imaging during mechanical stretch enables direct observation of mechanobiological responses, supporting predictive confidence in early discovery and target validation. This approach provides actionable insights into cellular injury mechanisms relevant to respiratory and soft tissue disease models, informing risk-adjusted portfolio decisions. Integration of confocal and atomic force microscopy (AFM) with mechanical actuation advances the precision and reproducibility of mechanistic de-risking in preclinical research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of cellular responses to mechanical strain, clarifying mechanistic pathways.
- Supports functional target validation by quantifying changes in cell stiffness and reactive oxygen species (ROS) production.
- Facilitates predictive confidence in selecting disease-relevant targets for further development.
Screening & Assay Development
- Prepares validated live cell systems for downstream screening of mechanobiology-modulating compounds.
- Standardizes quantitative outputs such as elastic modulus and ROS levels for reproducible assay development.
- Enables reliable evaluation of compound effects under physiologically relevant mechanical conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanical injury models with disease-relevant endpoints for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct measurement of injury phenotypes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions by quantifying cellular damage and stress responses.
Pipeline & Workflow Integration
This method bridges early discovery, lead identification, and preclinical mechanistic studies by enabling real-time, quantitative assessment of cellular responses to mechanical stimuli.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on mechanotransduction and injury pathways in live cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for assay standardization and compound triage.
- Analytics: Provides high-content measurements of cell stiffness and ROS production for comparative analysis.
- Translational Research: Connects in vitro findings to disease-relevant injury mechanisms in lung and other soft tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to multiple tissue types and mechanobiology research questions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of mechanobiology assays.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by providing early mechanistic insights.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of mechanistically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in live cell imaging, AFM operation, and mechanical actuation systems.
- Demands specialized instrumentation including confocal microscopy and AFM with compatible actuators.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible strain calibration and data acquisition.
- Adaptable to various cell and tissue models with protocol modifications for substrate and actuator compatibility.
- Careful handling and rapid execution are critical to minimize artifacts from cell agitation or environmental exposure.
