Name: 기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: 배우세요 기계적 스트레치 동안 라이브 세포 이미징 방법을 통해 마우스 폐 상피세포의 역학적 반응을 실시간으로 관찰하는 기술입니다. 이 프로토콜은 세포 경직성 변화와 산화 스트레스 반응을 정량화합니다.

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저자는 그들의 지원을 위해 멤피스 대학의 기술 페덱스 연구소 감사 그 싶습니다. 저자는 멤피스 (데이비드 버틀러, 재키 카터, 도미닉 클리블랜드, 야곱 섀퍼) 대학에서 기계 공학 부서의 수석 디자인 프로젝트 그룹의 학생들을 인정하고 싶습니다, 모터 제어를위한 대학 멤피스의 공학 기술 부서의 다니엘 콘 세포 배양에서의 도움, 박사 빈 탱과 양 Charlean Luellen. 이 작품은 K01 HL120912 (ER) 및 R01 HL123540 (CMW)에 의해 지원되었다.

보존 셀의 문화 매체에 대한 음의 벽 (최종 제품에 대한 그림 1D 참조) 멤브레인의 1. 건설 <ol><li> 콜라겐 I로 코팅 된 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 시트를 사용하여, 메스 나 다이를가요 성 멤브레인의 윤곽을 잘랐다. </li><li> 저장을위한 60mm 페트리 접시에 각각의 막 놓습니다. </li><li> 벽의 창조 : <ol><li> B (경화제) 엘라스토머 엘라스토머의 중량비는 1 : 10 PDMS 섞는다. </li><li> 50 ㎖ 튜브에 완전히 혼합 된 PDMS 5 mL를 따르십시오. </li><li> 수평 하이브리드 오븐에서 경화 PDMS 50 ml의 튜브를 놓습니다. </li><li> 경화 시간 동안 8 rpm에서 코팅 튜브의 내벽을 로터 함수를 사용한다. 실온에서, PDMS는 완전히 2 일 내에 완치됩니다. </li><li> 무균 세포 배양 후드에 튜브에서 PDMS를 제거합니다. </li><li> 새로운 면도날을 사용하여, 섹션의 높이에 대한 4mm의 PDMS 실린더 분할. </li><li> 막 WA 될 것입니다 섹션을 배치LLS, 수없이 페트리 접시 용기에 벽이 접혔 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 페트리 접시에 두 가지를 유지하면서 하나의 막에 PDMS의 한 벽을 선택하고 센터. </li><li> 접착제로 사용하는 벽의 바깥 둘레에 : (1 비율 10) 조심스럽게 경화 PDMS를 놓습니다. 이 액체를 유지하기 위해 존재하기 때문에 벽과 막 사이의 간격의 형성을 방지합니다. </li><li> 각 페트리 접시 완성 된 멤브레인을 포함하고 치료하는 24 시간 동안 70 ℃의 오븐에서 덮여를 놓습니다. </li></ol> 교정 용 클램프 변위 또는 레이디 얼 성장 (그림 2)와 모터의 회전 2. 상관 관계 <ol><li> 모터를 제어하는​​ 소프트웨어를 시작합니다. </li><li> 모터 소프트웨어의 수동 설정을 사용하여 장치의 클램프를 변위. </li><li> 거리를 측정하고 클램프의 최소 및 최대 변위 모두에서 클램프를 반대 사이의 모터 카운트 위치를 기록한다. </li><li> D의 변화율을 계산모터 카운트 (~ 0-75k 개수)의 함수로서 클램프 사이 istance. 이 막에 달성의 최대 잠재적 인 변형을 나타냅니다. </li></ol> 마우스 폐 상피 세포주에 스트레치 3. 응용 프로그램 (MLE12) <ol><li> 물론 당 유연한 막에 250 만 세포 (1 단계)에서 종자 MLE12 세포는 이틀 컨 플루 언트합니다. 파종 밀도는 다른 세포 유형에 따라 다를 수 있습니다. </li><li> 기계 액추에이터는 완전히 편안한 위치에 있는지 확인합니다. <ol><li> 세포 배양 용지를 제거합니다. </li><li> 여섯 클램프 각각의 두 펀치 구멍, 1.5 mm에게 생검 펀치를 사용하여 멤브레인의 탭 (도 1d 참조). 구멍의 반경 방향 위치는 멤브레인 경험 초기 사전 장력의 양을 결정한다. 어떠한 미리 장력이 요구되지 않은 경우 멤브레인 탭 20.5 mm의 반경 펀치 구멍. </li><li> 펀치 구멍이 클램프 내에서 핀을 일렬로 들것에 막을 놓습니다.장소에 최고 클램프를 놓습니다. 나사 한 번 교류 측면에서 하나를 조입니다. </li><li> 1 ml의 세포 배양 배지를 추가합니다. </li></ol></li><li> 빛의 경로와 멤브레인의 중앙을 중심으로 현미경의 무대 장치를 놓습니다. </li><li> 무대에 장치를 고정하는 테이프 또는 자석 (가능한 경우)를 사용합니다. 일단 고정, 현미경의 스테이지 제어기와 기계 장치의 면내 (막으로 평행 한 방향) 및 수직 (Z 방향)을 제어한다. </li><li> 수동 회전 모터 (20)의 위치 및 속도를 제어함으로써, 제조사에 의해 제공된 소프트웨어를 사용하여 연신을 적용한다. </li></ol> 미토콘드리아 활성 산소 종의 4. 측정 (ROS) <ol><li> 세포가 컨 플루 언트되면, 직접 세포에 미토콘드리아 초과 산화물 표시 등 (5 μm의 최종 농도)와 RT DMEM의 1-2 ml를 추가합니다. </li><li> 37 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> 워시 세포는 부드럽게 버퍼와 세 번에 물을 욕조에 따뜻하게37 ° C. </li><li> 즉시 똑바로 공 초점 현미경으로 이미 자리에 들것 (단계 2.2)에 유연한 막 놓습니다. </li><li> 페놀 레드 무료 매체 HEPES 25 mm의 DMEM의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 580분의 510 nm의 여기 / 방출 필터를 설정합니다. </li><li> 이미지 여러 필드는 매 15 분 미토콘드리아 슈퍼 옥사이드 생산의 원하는 시간 코스를 만들 수 있습니다. </li><li> 캡처 된 이미지에서, 기록 형광 강도는 형광 강도를 정량화 가능한 소프트웨어를 사용하여 각 시간 간격 히스토그램. </li></ol> 스트레칭과 원자 힘 현미경 (5) 응용 프로그램 (AFM) 참고 :이 단계는 특정 원자 현미경과 광학 현미경 조합 (그림 4 및 재료 목록) 제공됩니다. <ol><li> 실험을위한 AFM을 준비합니다. <ol><li> Z 방향의 최대 위치로 AFM 헤드의 높이를 증가시킨다. </li><li> AFM의 다리에 익스텐더를 넣어비행기를 해제하는 AFM은 캔틸레버 연락처 샘플을에서. 시험편 AFM 헤드는 기계 장치의 높이를 수용하도록 해제 될 필요가있다. </li></ol></li><li> (사용 가능한 경우) 광학 현미경을 준비합니다. <ol><li> AFM 스캐너 플레이트를 제거합니다. 원하는 목표를 제거합니다. </li><li> 목적에 스페이서를 추가합니다. 스페이서의 높이는 대물과 특정 AFM 셋업에 달려 있지만, 관측 평면 들것 및 어댑터의 높이 (도 동일한 양만큼 z- 방향으로 이동되기 때문에 광학 이미징이 요구되는 경우에 필요하다 5A). AFM은 일반적으로 상기 장치 광로 저배율 이미징을 제공합니다. </li><li> 그 위치에서 원하는 목표를 다시 마운트합니다. AFM에 다시 스캐너를 설치. </li><li> AFM 소프트웨어를 시작합니다. 형광 측정을위한 광원을 포함한 모든 필요한 광원을 시작합니다. </li><li> 캔틸레버 빔 칩을 탑재하는원하는 측정에 적합합니다. 생균의 탄성률을 측정 할 때 200 PN / nm 이하의 강성이 바람직하다. </li><li> 레이저를 맞추고 장치에 장착 된 유리 커버 슬립에 제조업체의 제안에 따라 캔틸레버의 강성을 보정. </li></ol></li><li> 단계 1에서와 같이 막을 제조되지만 다음과 변형. <ol><li> 즉시 스트레칭 장치에 막을 설치하기 전에, 높이 약 1mm로 벽을 잘라. 이는 멤브레인 벽과로드 셀 간의 간섭 발생을 방지한다. </li><li> 3.2.1-3.2.3 설명 된대로 기계 장치에 막을 마운트합니다. </li><li> 유출시 AFM 스캐너의 손상을 방지하기 위하여 세포 배양 배지를 제거한다. </li><li> 커플 어댑터 (도 5a)와 장치. 스캐너의 어댑터와 기계 장치를 놓습니다. </li><li> 원하는 인장 변형 레벨 막을 스트레칭. </li></ol></li><li&gt; 신장 세포의 나노 압입. <ol><li> 때문에 유출에 AFM 스캐너 또는 현미경 손상을 방지하기 위해 세포에서 미디어의 제한 (&lt;0.5 ml)에 볼륨을 추가합니다. </li><li> 멤브레인 외팔보를 작동. </li><li> 관심 분야를 스캔하고 특정 AFM 장치의 프로토콜을 따르십시오. </li></ol></li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

기계적 스트레칭 동안 라이브 세포 이미징의 고유 장치가 개발되었다; 그리고이 장치는 폐 상피 세포 제어 공학을 연구 프로토콜에서 사용되었다. 예비 연구에서, 단일 개최 스트레칭 기관지 상피 세포에서 미토콘드리아 초과 산화물의 생산을 자극 한 것으로 나타났습니다. 또한, 기계적인 변형의 수준 증가는 폐포 상피 세포 단층의 무결성에 대한 직접적인 손상을 야기하는 것이 입증되었다. 이러한 예비 실험을 수행하기 위해, 장치는 먼저 교정하고,이어서,이를 막 균주 세포 (도 2-3)에 송신 한 것으로 나타났다. 도 3e에 도시 된 (막 마크에 의해 측정) 및 변형 막 (핵 사이의 거리에 의해 측정) 세포주 사이의 상관 관계에 의해 나타낸 바와 같이, 전체 장치는 잘 수행. 그러나, STRA 사이에 관찰 약간의 차이가 있었다도 2D에 도시 된 바와 같이, 접근 중 세포막과 마커 복귀 곡선상에서 측정...

세포는 여러 조직에서의 기계적 하중을 실시하고,이 기계적 자극 유전자 발현, 성장 인자, 사이토 카인, 또는 세포 외 기질의 재 형성의 방출 패턴의 변화를 촉진하고 세포 골격 1-4 밝혀졌다. 기계적 자극에서 형질 세포 내 신호는 mechanotransduction 5-7의 과정을 통해 발생한다. 호흡계에서, mechanotransduction의 일 결과는, 반응성 산소 종 (ROS) 환상 인장 변형의 존재 폐 상피 세포에서 8,9 및 전 염증성 사이토 카인 (10)의 증가이다. 강력한 증거는 과도한 인장력이 11-14 세포의 생화학 적 반응에 더하여, 폐포 상피 부상을 직접 유도 것을 시사한다. 포커스 여기서 기계적 변형에 폐 세포의 반응에 주로이지만 mechanotransduction 의해 유도 경로는 BAS에 중요한 역할혈관 음 (15)의 조정 · 성장판 (16)의 개발을 포함하여 인체의 여러 조직의 IC 기능. mechanotransduction에 대한 관심이 증가 배양 세포 및 조직 생리 학적으로 중요한 기계적 하중의인가에 대한 여러 장치의 발전을 가져왔다. 특히, 조직 경험 기계적 하중의 일반적인 형태 인 인장 변형을, 적용 장치 11,17-19 인기 있습니다. 그러나, 사용 가능한 장치의 대부분은 어느 조직 공학 응용 프로그램을위한 생물 반응기로 설계 또는 스트레칭 실시간 영상에 도움이 아니다. 이와 같이, mechanotransduction의 경로의 조사를 용이하게하기 위해 장력 세포와 조직을 시각화 도구와 방법의 개발이 요구된다. 여기서, 면내 기계적 연신 장치를 설계하고, 프로토콜은 m을 적용하기 위해 개발되었다ultiple 조직에 변형의 형태와 세포를 실시간으로 (그림 1A-D)의 생화학 적 및 기계적 응답의 영상을 허용하면서. 장치는가요 성 멤브레인을 잡고 약 20 % (도 1b)에 면내 방사형 팽창 위로 적용 원주 등 간격 배치 여섯 클램프를 사용한다. 모터 (도 1C)는 인큐베이터의 외측에 배치 된 모터 공급자 독점 소프트웨어에 의해 제어되는 동안 구동 장치는 장기간 세포 배양 용 인큐베이터에 배치 될 수있다. 모터는 긴장과 이완 균일 여섯 들것 클램프 구동, 내부 캠을 회전 선형 드라이버에 접속된다. 기계적인 장치 이외에, 맞춤형가요 성 멤브레인은 기계 시스템에 사용되는 시판되는 세포 배양 준비 막으로부터 만들어졌다. 약의 직경 그리고 원형 벽 (28mm)를 만들어 세포 만 잘 설명 변형 프로파일이 지역에서 배양 할 수 있도록 유연한 막에 부착 하였다. 구동 장치 내에서 이러한 막의 배치는가요 성 멤브레인의 중앙에 균일하고 등방 변형을 제공 할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, 유한 요소 분석은 시판되는 소프트웨어 (도 1E-F)를 수행 하였다. 플렉서블 멤브레인은 대칭 경계 조건으로 메시에 대한 모든 사변형 요소를 이용하여 모델링되었다. 그림 1 층에 표시된 최대 주 변형률의 윤곽 플롯에서 볼 동심 링은 변형의 등방성 분포를 나타냅니다. 막에 의해 경험 한 스트레인은 하중 (도 2)를 통해 표시의 화상을 기록하여 측정 하였다.도 2d는 반경 방향 및 축 방향으로 측정 된 평균 막 응력은 대략 선형임을 나타낸다적용된 모터에 대하여 20 %의 최대 선형 변형까지 카운트한다. 다시 정지 위치로 후퇴 동안 측정과 비교 팽창 동안 측정 균주 수준 사이에는 유의 한 차이가 없었다. 다음으로,가요 ​​성 멤브레인에 정의 배양 인간 기관지 상피 세포 (16HBE) 및 그 핵의 변위를 측정 하였다. 전 세포 변위 디지털 현미경 기록 위상차 이미지를 측정 하였다 반면 16HBE 세포의 형광 표지 (DAPI) 핵은, 공 초점 현미경으로 20 배의 대물 렌즈를 사용하여 영상화되었다. 도 3에서 보듯이, 핵의 변위에 의해 측정 된 변형은 최대 ~ 20 %의 선형 변형에 막 마크의 변위에 의해 측정 된 것과 유사 하였다. 이는 멤브레인에 적용 균주 부착 세포에 전달되었음을 확인한다. 전통적인 현미경에 정의 디바이스의 사용을 기술하는 프로토콜 및 원자 힘 microscopE는 다음과 같이 제공된다.

<table><tbody><tr><td>SmartMotor NEMA 34: 3400 시리즈</td><td>MOOG Animatics</td><td>SM3416D</td><td>통합 모터, 컨트롤러, 증폭기, 인코더 및 통신 버스</td></tr><tr><td>Flexcell Membrane (Collagen I 코팅)</td><td>Flexcell International Corp</td><td>SM2-1010C</td><td>3.5"&nbsp; 엑스&nbsp; 5.25인치&nbsp; 엑스&nbsp; 0.020"</td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>10:1</td></tr><tr><td>Hoechst 33342&nbsp;</td><td>시그마-알드리치</td><td>H1399</td><td>DAPI 염색</td></tr><tr><td>MitoSOX</td><td>시그마-알드리치</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>티론</td><td>시그마-알드리치</td><td>D7389&nbsp;</td><td>미토콘드리아 과산화물 라벨</td></tr><tr><td>DMEM</td><td></td><td></td><td>과산화물 억제제</td></tr><tr><td>FBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>50ml 튜브</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-443-19</td><td>모든 원심 튜브를 사용하여 이미징 영역을 만들 수 있습니다.</td></tr><tr><td>하이브리드화 오븐</td><td>Bellco Glass</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MLE12 셀</td><td>ATCC</td><td>CRL-2110</td><td>마우스 폐 상피 세포&nbsp;</td></tr><tr><td>16HBE 세포</td><td>ATCC</td><td>CRL-2741</td><td>인간 기관지 상피 세포</td></tr><tr><td colspan="4">AFM Indentation Experiments</td></tr><tr><td>Cantilever Beams for Nano-indentation</td><td>Budget Sensors</td><td>Si-Ni30</td><td></td></tr><tr><td>AFM&nbsp;</td><td>Asylum Research</td><td>MFP3D</td><td></td></tr><tr><td>Olympus 현미경</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td>20X 및 40X 대물렌즈가 있는 도립 현미경.</td></tr><tr><td>AFM 다리 연장기</td><td>망명 연구</td><td>사용할 수 없음</td><td>AFM microscope</td></tr><tr><td colspan="4">Finite Element Analyses</td></tr><tr><td>ABAQUS</td><td>Simulia</td><td>6.12</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microscopes</td></tr><tr><td>Digital microscope</td><td>Life Technologies</td><td>EVOS XL Core</td><td>처음에는 자립형 회사였으나 현재는 Life Technologies가 소유하고 있습니다.</td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710</td><td>2광자 정립 현미경</td></tr></tbody></table>

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

현재 세포와 조직이 기계적 자극에 어떻게 반응하는지 이해하는 데 상당한 관심이 있지만, 현재의 접근 방식은 살아있는 세포나 생존 가능한 조직에서 실시간으로 반응을 측정하는 능력에 한계가 있습니다. 세포 액추에이터를 사용하여 공초점 및 원자력 현미경(AFM)으로 이미징하는 동안 탄성 기질에서 성장한 살아있는 세포 또는 탄성 기판에 부착된 조직을 팽창시키는 프로토콜이 개발되었습니다. 예비 연구에 따르면 인간 기관지 상피 세포의 긴장성 스트레칭이 미토콘드리아 과산화물 생성을 크게 증가시켰습니다. 또한, 이 프로토콜을 사용하여 폐포 상피 세포를 늘리고 이미지화하여 체외에서 한 가지 형태의 폐 손상을 시뮬레이션하여 상피 세포에 직접적인 손상을 보여주었습니다. 늘어난 세포에서 AFM 나노 인덴테이션을 수행하는 프로토콜도 제공됩니다.

활성 산소 종 및 변형 이전의 연구는 환상 스트레칭 21에 응답기도 및 폐포 상피 세포에서 반응성 산소 종 (ROS)의 증가를 보여 주었다. 활성 산소는 분자와 지질, 단백질, 다당류, 핵산 22-24 높은 반응성 산소 분자에서 파생 된 활성 산소를 포함한다. ROS는 일반적인 세포 내 이온 채널의 기능을 조절하는 신호 단백질 키나제 / 포스파타제 활성 및 유전자 발현의 역할을하지만, 과도하거나 비 조절 생산 아폽토시스 및 괴사 세포 사망, 신경 변성, 동맥 경화증, 당뇨병, 암 (24, 25)에 기여할 수있다. 전자가 전자 전달 사슬로부터 누출 때 과산화물, ROS 다른 형태의 프리 커서는 미토콘드리아 호흡의 부산물로서 생성 될 수있다. 이전의 연구는 환상 기계적 스트레칭 슈퍼의 생산을 자극하는 것이 제안NADPH 산화 효소 시스템 (니코틴 아미드 아데닌 디 뉴클레오티드 인산 옥시 다제)과 미토콘드리...

살아있는 세포의 기계적 변형률에 대한 실시간 반응을 측정할 수 있도록 맞춤형 모터 구동 기계식 액추에이터를 사용하여 새로운 이미징 프로토콜이 개발되었습니다. 기계생물학과 관련된 이 시스템은 컨포칼 또는 원자력 현미경으로 거의 실시간 이미징을 허용하면서 최대 20%까지 균주를 적용할 수 있습니다.

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

다음 실험의 전반적인 목표는 세포 기계생물학(mechanobiology)에서 기계적 변형(mechanical strain)의 역할을 거의 실시간으로 관찰하는 것입니다. 이를 위해 먼저 세포를 배양하고 신장시킬 수 있는 유연한 막이 포함된 시스템을 구축합니다. 두 번째 단계로, 막을 신장시켜 모터 카운트와 막 변형 간의 상관관계를 보정합니다.다음으로, 마우스 폐 상피 세포를 신장시키고 핵을 이미지화합니다. 막 변형이 세포로 전달된다는 것을 보여주기 위해, 신장 장치를 AFM에 통합하여 신장 전후의 개별 세포 강성을 나노 인덴테이션으로 측정했습니다. 결과는 가해진 신장으로 인해 세포에 직접적인 손상이 발생했음을 보여줍니다.또한 형광 이미징을 통해, 신장(stretch)에 따라 활성 산소종의 생성이 증가하는 것이 확인되었습니다. 이 방법은 기계적 환기로 인해 상피 세포가 손상될 수 있는지 여부와 같이 폐 기계 생물학 분야의 핵심적인 질문들에 대한 답을 제시할 수 있습니다. 본 방법은 폐 세포 및 기계 생물학에 대한 통찰을 제공할 수 있으며, 간이나 성장판 절편과 같은 다른 연조직에도 적용 가능합니다.일반적으로, 이 방법에 익숙하지 않은 연구자들은 원자 힘 현미경(atomic force microscope)과 같이 본 실험에서 사용되는 이례적인 도구들의 조합으로 인해 어려움을 겪을 수 있습니다. 우선, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 세포 배양에 사용할 수 있도록 수정된 콜라겐 코팅 PDMS 막을 준비하십시오. 다음으로, 멸균된 유연한 콜라겐 코팅 막 위에 마우스 폐 상피 세포를 웰당 2.5 million cells의 밀도로 분주하십시오.세포가 완전히 confluence 상태에 도달할 때까지 37°C, 5% CO2 조건에서 2일 동안 배양합니다. 그 후, 사전 인장(pretension)이 필요하지 않은 경우, 6개의 클램프 탭 각각의 중심에서 20.5 mm 떨어진 지점에 1.5 mm 바이옵시 펀치를 사용하여 구멍을 두 개씩 뚫습니다. 그리고 세포 배양액을 제거합니다.기계적 액추에이터가 제로 스트레인(zero strain) 위치에 있는지 확인하고, 펀치 홀이 핀 및 클램프와 일치하도록 스트레처 위에 멤브레인을 배치하십시오. 상단 클램프를 제자리에 놓고, 여러 면을 번갈아 가며 나사를 하나씩 조여줍니다. 장치를 현미경 스테이지 위에 올리기 전, 세포 배양 배지 1 mL를 추가하십시오.장치를 광로의 중심에 맞춥니다. 다음으로, 장치를 스테이지에 고정합니다. 대상 입력 블록에 있는 현미경 스테이지 컨트롤러를 사용하여 기계적 장치의 수평 및 수직 위치를 조정함으로써 막에 초점을 맞춥니다.적용하고자 하는 원하는 변형 수준에 해당하는 모터 카운트 값을 입력하십시오. 다음으로, 신장 전후에 동일한 시야를 관찰하기 위해 속도 입력 블록의 값을 10 RPM 이하로 설정하십시오. 신장 중에 시야가 현미경 대물렌즈에 대해 이동할 수 있으므로 신장 과정 중에 현미경 스테이지를 조정해야 할 수도 있습니다. 모든 설정이 완료되면 go를 클릭하십시오.원자 힘 현미경의 설정을 조정하는 것으로 시작합니다. AFM 헤드의 높이를 Z 방향으로 최대 위치까지 올립니다. 그런 다음 다리에 연장 장치를 부착하여 AFM 캔틸레버가 샘플과 접촉하는 평면을 높입니다.다음으로, 현미경에서 A FM 스캐너 플레이트와 원하는 대물렌즈를 제거합니다. 대물렌즈에 스페이서를 추가한 다음, 이를 다시 현미경에 장착합니다. 그런 다음 스캐너 플레이트를 A FM에 다시 배치합니다. 스페이서의 높이는 대물렌즈와 구체적인 a FM 설정에 따라 달라지지만, 관찰 평면이 Z 방향으로 이동하므로 광학 이미징을 원할 경우 스페이서를 반드시 사용해야 합니다.다음으로, AFM 소프트웨어, 광학 현미경 소프트웨어 및 형광 측정용 광원을 포함한 모든 필요한 광원을 켜십시오. AFM에 생세포의 탄성 계수를 측정하기 위해 강성이 200 pN/nm 이하인 캔틸레버 빔이 장착된 칩을 장착하십시오. 그 다음 레이저를 정렬하고 장치에 유리 커버슬립을 장착한 후, 제조사의 권장 사항에 따라 캔틸레버 강성을 보정하십시오. 막을 신축 장치에 장착하기 직전에 벽의 높이를 약 1 mm로 절단하십시오.이렇게 하면 멤브레인 벽과 로드 셀 사이에서 발생하는 간섭이 줄어듭니다. 그다음 세포 배양액을 제거하고 멤브레인을 기계 장치에 장착하십시오. 소프트웨어를 사용하여 어댑터가 장착된 기계 장치를 스캐너 위에 배치하십시오.나노 인덴테이션을 수행하기 전, 막을 원하는 인장 변형률 수준까지 늘립니다. 세포의 수분을 유지하기 위해 0.5 milliliters 이하의 배지를 세포 위에 추가하되, FM 스캐너나 현미경에 손상을 줄 수 있는 유출이 발생하지 않도록 주의하십시오. 그 다음 캔틸레버 빔을 막에 접촉시킵니다.관심 영역을 스캔하려면 해당 AFM 장비의 프로토콜을 따르십시오. 멤브레인에 파종된 세포에 20% 변형(strain)을 가했을 때, 여기에 표시된 바와 같이 세포가 20% 변위되었으며, 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 누적 미토콘드리아 슈퍼옥사이드 센서를 사용하여 기관지 상피 세포에서 활성 산소종(ROS) 생성에 미치는 세포의 영향이 측정되었습니다. 기계적 신축이 없는 경우에는 17%의 단일 신축을 가하고 유지했을 때 60분 동안 ROS 생성이 유의하게 증가하지 않았습니다.원자 힘 현미경에 기계적 신축 장치를 결합함에 따라 미토콘드리아 ROS의 증가가 이후 60분 동안 지속되었습니다. 10% 인장 변형 전후의 생쥐 폐 상피세포 탄성 계수 맵을 여기에 표시된 영역에서 얻었습니다. 40 by 40 µm 영역에서 300개의 개별 강제 굴곡 곡선을 기록하였으며, 변형 적용 시 고탄성 계수 영역의 국소화가 변화함을 확인하였습니다.숙달되면 세포 신축(cell stretching)은 15분 이내에 완료할 수 있습니다. 반면 FM 나노 인덴테이션(nano indentation)은 제대로 수행하려면 2시간이 소요될 수 있습니다. 이 절차를 수행할 때는 세포를 조심스럽게 다루되 신속하게 처리하는 것이 중요하며, 데이터 보고 전의 교반이나 장시간의 실온 공기 노출은 결과에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다. FM을 사용하는 작업은 매우 까다로울 수 있다는 점을 유념하십시오.본 절차를 수행하는 동안 모든 액체가 스캐너에 닿지 않도록 주의해야 합니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

그것은 널리 본문에 기계적 세력 세포 분화와 증식에 영향을 미칠 수 있음을 이해합니다. 여기 유연한 micropatterned 기판에 교양 세포를 막기 위해 uniaxial 순환 인장 응력을 제공하는 맞춤식 생물 반응기의 사용을 보여주는 비디오 프로토콜을 제시한다.

순환 Uniaxial 스트레인을 사용하여 줄기 세포의 기계적 자극

본 논문은 문화에 살고있는 세포의 기계적 자극에 대한 통합 원자의 운영 독자 강제 광학 이미징 현미경을 지시하는 것을 목표로하고있다. 단계별 프로토콜이 제공됩니다. 기계적 자극에 살고 세포 응답을 보여주는 대표적인 데이터 집합이 제공됩니다.

기계 자극에 라이브 세포 응답 통합 광학과 원자 힘 현미경에 의해 연구

기계 군은 폐 개발 및 폐 부상에서 핵심적인 역할을한다. 여기서는 쥐 태아의 폐 유형 II 상피 세포 및 섬유아 세포를 분리하고 사용하여 기계적인 자극에 노출하는 방법을...

태아의 폐 세포에 Mechanotransduction을 공부하는 실험적 시스템

이 원고는 단방향 스트레칭을 사용하여 부착 세포 나 조직에 힘을 적용하거나 해제하는 방법을 제시한다.

PDMS 막에 마이크로 패턴 세포를 스트레칭

우리는이 문서에서 복잡한 이방성 축 기계적 변형에 하나의 세포 반응을 조사하고 생체 조직의 기계적 특성을 정량화하는 데 사용할 수있는 새로운 스트레칭 플랫폼을 제시한다.

세포와 조직 Mechanobiology의 응용 프로그램에 대한 새로운 스트레칭 플랫폼

이전에 설계 된 장치를 사용 하 여 부착 세포에 기계적 변형을 적용 하는이 백서는 새롭게 디자인 된 하 층 구조와 100 배 오일 침 지 대물 렌즈를 사용 하 여 변형 된 셀의 고해상도 단일 셀 이미징을 위한 맞춤형 장치를 설명 합니다.

일축 인장 스트레인 하에서 살아있는 세포의 핵 역학에 대 한 고해상도 이미징

기계적 힘은 세포 이동을 제어하는 데 중요합니다. 이 프로토콜은 유리 마이크로파이펫 및 마이크로매니퓰레이터를 사용하여 변형될 수 있는 탄성 하이드로겔의 사용을 입증하여 세포 구조 및 이동의 변화를 유도하기 위해 국소 강성 구배를 가진 세포를 자극한다.

세포 운동 및 관련 신호 이벤트의 기계적 제어를 평가하기위한 단일 세포 Durotaxis 분석

제시된 방법은 실리콘 고무에 내장된 3D 소프트 하이드로겔의 단종 스트레칭을 포함하면서 살아있는 공초점 현미경 검사를 허용합니다. 섬유 정렬뿐만 아니라 외부 및 내부 하이드로겔 균주의 특성화가 입증된다. 개발된 장치 및 프로토콜은 다양한 변형 정권에 대한 세포의 반응을 평가할 수 있다.

라이브 현미경 이미징 에서 3D 하이드로겔의 제어 변형

우리는 인간 복재 정맥 내피 세포(hSVEC)를 분리하고 배양하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 또한 hSVEC의 기계적 응력을 연구하기 위해 전단 응력과 스트레치를 생성하는 자세한 방법을 제공합니다.

인간 복재 정맥 내피 세포 분리 및 제어된 수준의 전단 응력 및 스트레칭에 대한 노출

여기에서는 공압식으로 작동되고 고해상도 현미경 검사와 호환되는 다목적 등축 스트레칭 장치를 제시합니다.

고배율 Live-Cell Confocal Fluorescence Microscopy를 위한 Equibiaxial Stretching Device

여기서는 등방성 및 단축 변형 파형을 세포에 적용하면서 조절 가능한 강성과 맞춤형 단백질 매트릭스를 가진 기질에서 배양을 지원하는 새로운 장치를 소개합니다. 이 간단하고 경제적인 플랫폼 덕분에 연구자들은 기초 연구와 질병 관련 맥락에서 기계적 단서가 세포 기능을 어떻게 조절하는지 조사할 수 있습니다.

시험 관 내 세포 신장 및 영상 촬영을 위한 새로운 플랫폼

배우세요 기계적 스트레치 동안 라이브 세포 이미징 방법을 통해 마우스 폐 상피세포의 역학적 반응을 실시간으로 관찰하는 기술입니다. 이 프로토콜은 세포 경직성 변화와 산화 스트레스 반응을 정량화합니다.

기계 스트레치 동안 라이브 세포 이미징

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