마우스 나이브 CD4 ⁺ T 세포의 분리 및 시험관 T 세포 하위 집합으로 차별화

다음 절차의 전반적인 목표는 마우스 림프절과 비장에서 분리된 4개의 양성 T 세포인 naive CD를 별개의 T helper subset으로 분극화하는 것입니다. 시험관내(In vitro)에서는 성체 야생형 마우스에서 채취한 비장과 림프절을 먼저 처리하여 이를 수행합니다. 두 번째 단계에서는 CD 4개의 양성 세포 집단을 magnetic bead 분리에 의해 농축한 다음 naive T cell marker 발현에 의해 추가로 분류합니다.

마지막 단계에서 세포는 T 세포 수용체 활성화 인자와 편광 사이토카인으로 처리되어 다양한 T 도우미 계통으로의 분화를 유도합니다. 궁극적으로 유세포 분석. Elis A 및 Real-time PCR은 T helper cell 분화의 효율성을 평가하는 데 사용됩니다.

이 방법은 특정 분자의 발현 또는 특정 약물을 사용한 치료가 T 세포 반응의 특성에 어떤 영향을 미치는지와 같은 T 보조 세포 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 5주에서 10주 된 C 57 black six 쥐의 팔다리를 해부판에 고정하는 것으로 시작한 다음 항문에서 턱까지 피부를 세로로 자르고 아래에 있는 복막 조직에 구멍을 뚫지 않도록 주의합니다. 다음으로, 피부를 고정하여 열고 한 쌍의 집게를 사용하여 림프절을 잡고 다른 한 쌍을 사용하여 이미지에 표시된 각 위치에서 조직을 분리합니다.

각 림프절을 채취하면 1% FBS 또는 PBS plus가 보충된 PBS가 들어 있는 채취 접시에 넣은 다음 조심스럽게 복막을 열고 비장을 제거합니다. 비장도 채취 접시에 넣고 접시를 얼음 양동이에 옮겨 CD 4개의 양성 세포를 농축합니다. 비장의 림프절을 멸균 겸자를 사용하여 3ml의 PBS와 각각 멸균 집게를 사용하여 60mm 접시 2개로 나눕니다.

다음으로, 비장 위에 멸균 나일론 메쉬 사각형을 놓고 주사기 플런저의 엄지 손가락 쪽을 사용하여 거의 모든 조직이 현탁액이 될 때까지 메쉬에 부드럽게 부수십시오. 서스펜션을 위아래로 몇 번 파이프를 연결하여 남아 있는 용해성 덩어리를 분해한 다음 15ml 원추형 튜브의 입구에 새 나일론 메쉬 조각을 놓습니다. 서스펜션을 튜브에 여과하여 남아 있는 이물질을 제거합니다.

이제 림프절에 대한 기계적 해리를 반복하고 여과된 세포의 두 튜브를 PBS plus로 채웁니다. 그런 다음 튜브를 몇 번 뒤집고 세포를 회전시킵니다. 림프절 펠릿을 PBS 2밀리리터에 다시 현탁시킵니다.

비장 세포 펠릿에 쥐당 CK 용액인 얼음 냉기 1ml를 추가합니다. 1분 후, PBS 플러스 10ml로 적혈구 용해를 멈춥니다. 튜브를 뒤집고 세포를 다시 스핀다운합니다.

그런 다음 비장 펠릿을 PBS 플러스 10밀리리터에 다시 현탁시키고 림프절 세포를 추가한 다음 풀링된 세포 현탁액을 스핀다운합니다. 이번에는 펠릿을 15마이크로리터의 CD에 넣고 마우스당 85마이크로리터의 PBS plus에 희석한 4개의 마그네틱 비드를 섭씨 4도에서 15-30분 동안 재현탁시킵니다. 그런 다음 PBS plus 10ml에 세포를 희석합니다.

나일론 스트레이너를 통해 현탁액을 새 15ml 튜브로 여과하고 셀을 스핀 다운합니다. 다시 말하지만, 마우스당 100마이크로리터의 PBS 플러스에서 펠릿을 다시 회전시키고 제조업체의 지침에 따라 마그네틱 비드 선택으로 CD에 대해 4개의 양성 셀을 긍정적으로 선택합니다. CD 4 양성 양성 세포 분획을 얻은 후, 10 밀리리터의 PBS plus로 세포를 세척하여 CD 4 양성 T 세포 분획을 분류합니다.

다음으로, 세척 후 어두운 곳에서 섭씨 4도에서 15-30분 동안 적절한 형광 항체로 세포에 라벨을 붙입니다. 라벨이 부착된 세포를 여과하여 파편을 제거하고 얼음 위의 팩스 튜브로 옮기고 빛으로부터 보호하고, CD 4개의 양성, CD 25 음성, CD 62 L, 양극 CD 44 음성 모집단을 완전한 RPMI 배지로 분류합니다. 모든 세포가 수집되었을 때.

미성숙한 T 세포를 신선하고 완전한 배지로 세척합니다. 그런 다음 펠릿을 재현탁하고 RPMI를 완료하고, naive T 세포를 계수하고, 농도를 10의 곱하기 10으로 조절하여 밀리리터당 6개의 세포로 조절하여 in vitro T helper subset 분화를 유도합니다. 다음으로, 멸균 FBS free PBS 및 플레이트 1밀리리터로 anti CD 3 및 anti CD 28로 미리 코팅된 세포 배양 플레이트의 각 웰을 세척합니다.

세포는 최종적으로 표에 요약된 바와 같이 적절한 사이토카인과 차단 항체로 배양 배지를 보충하고 배양 4-5일 후 4-5일 동안 섭씨 37도에서 5%의 이산화탄소로 세포를 배양합니다. 시험관내에서 분화된 TH 1, TH 2개 유도성 treg 및 TH 17 배양물로부터 4개의 양성 T 세포를 CD의 세포 내 사이토카인 염색을 수행할 수 있다. 각 T 세포 하위 집합이 예상되는 사이토카인 프로파일을 나타내는지 확인합니다.

실제로, anti CD 3 EISs로 24시간 재회복 후, A는 subset이 세포 내에서 발현된 cytokine 단백질의 해당 세포 외 생산도 나타낸다는 것을 보여줍니다. 계통 특이적 전사 인자에 대한 Real-Time PCR은 in vitro differentiated CD 4개의 positive T cell subset의 적절한 transcription factor 프로파일을 추가로 검증합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 미러링 림프절과 비장 세포를 분리하고 처리하여 naive CD 4개의 양성 T 도우미 세포를 얻는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

또한 이러한 T 세포를 TH 1, TH 2 TH 17 또는 ireg 세포로 분화할 수 있습니다.