Name: 마우스 나이브 CD4 + T 세포의 분리 및 시험관 T 세포 하위 집합으로 차별화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 학습하세요 마우스의 CD4+ T 세포를 자기적 구슬 분리와 세포 분류로 분리하여 시험관 내에서 T 세포 하위 집합으로 차별화하는 방법을. 이 기술은 면역학 연구와 면역치료 개발에 활용됩니다.

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저자는이 프로토콜의 최적화를 위해 텍사스 MD 앤더슨 암 센터의 대학에서 의학 및 과학의 로잘린 프랭클린 대학의 레이놀즈 랩의 모든 구성원, 그리고 첸 동 연구소에 감사의 말씀을 전합니다. 이 작품은 국립 보건원 (K22AI104941)에서 JMR에 부여에 의해 지원되었다.

모든 실험 절차는 의학 및 과학의 로잘린 프랭클린 대학 환경 보건과 안전의 사무실에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 수행됩니다. 이 프로토콜에 사용 (NCI에서 구입) C57BL / 6 마​​우스는 무균 상태에서 보관하고, 모든 동물 실험은 의학의 로잘린 프랭클린 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 프로토콜을 사용하여 수행 하였다 과학. 악기, 소모품 및 시약 1. 준비 <ol><li> 항 CD3 및 안티 CD28와 코트 48 웰 또는 24 웰 플레이트 (표 1) 멸균 PBS, 커버 및 파라 필름으로 포장 증발과 오염을 방지하고 T 전날 C O를 4에서 O / N을 배양하기 세포 격리. 37 O C.에서 또는 코트 우물 1 시간 로 0.5-1 ml의 1μg / ㎖에서 항 CD3, 항 CD28 모두 코팅함으로써 TH0, TH1,은 Th2 및 iTreg 조건을 수행탈 볼륨 (48 웰 플레이트). Th17를 들어, 우리는 일반적으로 코트 항 CD3 1 ㎍ / ㎖의에서 ml의 항 CD28 2 ㎍ /에서. 참고 : 우리는 더 높은 항 CD3 농도가 Th17 생성을위한 최적의 상태에서 더 낮은 항 CD3 농도가 TH1,은 Th2 및 iTreg 생성을위한 최적의 것으로 나타났습니다. 따라서, 항 CD3, 항 CD28 농도는 적정 개별 실험실 (표 2)에 대해 최적화되어야한다. </li><li> 오토 클레이브 또는 소독제 용액 해부 도구 (가위와 집게) 세트를 소독. 튜브 또는 70 % 에탄올을 포함하는 작은 비커 해부 도구 사이의 빠른 멸균 필요할 것이다. 마지막으로, 70 % 에탄올을 함유하는 스프레이 병 해부 전에 마우스의 표면을 살균 필요할 것이다. </li><li> 알루미늄 호일의 평면 스티로폼 조각 또는 코르크를 포장하여 절개면을 준비합니다. 해부 핀이나 바늘 장소에서 동물을 고정하는 데 사용됩니다. </li><li> TI의 수집을 위해 요리 또는 접시를 준비ssues. 풀링 조직의 경우, 3ml를가 포함 된 별도의 60mm 요리 멸균 PBS + 비장과 림프절 조직에 대한 FBS (PBS +)이 충분 1 %. 개인 마우스의 유지 조직을 분리하는 경우, 우물의 원하는 번호에 PBS +의 24 웰 플레이트 포함하여 1ml를 준비합니다. </li><li> 사용하기 전에 세포 배양 및 사전 따뜻한 대한 완전한 RPMI 미디어를 준비합니다 (표 1). 참고 : 우리는 일상적으로 RPMI를 사용하지만 이러한 IMDM과 DMEM와 같은 다른 미디어가 동일한 효과 또는 실험실과 실험에 따라 우수한 될 수있다. </li><li> 나일론의 사각형 살균 120 μm의 공경 압력솥 메쉬 컷 × 2 cm (표 1). </li><li> 선택 : CD4 + 세포 농축, 프리 러닝 따뜻한 autoMACS으로 선별 시스템 고속 자성 세포를 사용하여 기계의 손상을 방지하기 위해 37 O C 물욕 버퍼를 세정하는 경우. </li><li> 참고 : 농축이 분류 수율을 높이고 시간을 정렬 감소하는 것이 좋습니다. </li><li> 모든제조 단계는 해부 제외한 멸균 조직 배양 후드에서 수행되어야한다. </li></ol> 마우스에서 림프절과 비장 2. 분리 <ol><li> 제도적 승인 기술을 사용하여 동물의 필요 매수를 안락사. 때문에 남성에 비해 나이브 T 세포와 하체 지방의 높은 비율에 이상 마우스에 C57BL / 6 암컷 마우스, 연령 5-10 WKS을 사용합니다. 주 : 수컷 마우스 유래의 세포를 시험관 내에서 유사하게 수행하고, 상기 프로토콜 단계는 동일하게 유지. 5-10 주령 된 암컷 마우스는, 일반적으로 마우스 당 3-6 × 106 나이브 CD4 + T 세포를 수득한다. 그러나 마우스 사용하여 다른 균주 수율 및 성능에 영향을 미칠 수 있습니다. 예컨대, C57BL / 6 마​​우스의 세포 Balb.c 생쥐에서 세포의 Th2 세포를 생성하기위한 더 좋은 반면 Th1 세포를 생성하기위한 더 낫다. </li><li> 사지 동물의 확산 및도 1에 도시 된 바와 같이 장소에 고정. 오랫동안 피부를 잘라조심 itudinally 턱 항문에서 동안하지 깊은 조직에 구멍을합니다. </li><li> 확산은 집게로 피부를 열고도 1에 도시 된 바와 같이 림프절에 쉽게 접근 할 수있게하는 장소에서 피부를 고정. </li><li> 도 1에 도시 된 위치에서 액세스 림프절 수확. 포셉 쌍 림프절 잡는 포셉 다른 쌍의 조직을 분리하여 쉽게 제거 할 수있다. 컬렉션 접시에 조직을 배치합니다. </li><li> 도 1에 도시 된 위치에서 비장을 수확.이 경우, 복막 조심 절삭 비장에 액세스하는데 필요하다. 컬렉션 접시에 조직을 배치합니다. </li><li> 더 많은 조직이 수확 될 경우 절차를 반복합니다. 그렇지 않으면 다음 단계로 진행합니다. 이 시점에서, 정렬 후 T 세포의 도금 할 때까지 얼음 상에 남아있는 모든 단계를 수행한다. </li></ol> 3. 조직 처리 및 CD4 + 심화<ol><li> 작은 백혈구 사망을 초래할 수있다 적혈구 용해를 필요로하지 않는 림프절 세포 제제 등의 수율을 높이기 위해 다른 요리의 림프절과 비장을 처리합니다. 따라서, 다음 단계가 별도로 정렬 라벨링 전에 조합 하였다 비장 및 림프절 개체군 처리 방법을 설명한다. </li><li> PBS + 3 ㎖를 포함하는 새로운 60mm 접시에 수집 요리와 장소에서 조직 (비장 또는 풀링 림프절)를 제거합니다. 멸균 집게를 사용하여 조직을 통해 메쉬 멸균 나일론의 사각형을 배치합니다. </li><li> 주사기 플런저의 엄지 손가락 쪽 (3-10 ml)에 타고 부드럽게 메시에 대한 조직을 분쇄. 거의 조직의 모든 현탁액에 가야한다. 또한, 두 개의 멸균 된 프로스트 슬라이드 사이에 조직을 배치하고 현탁액에 고요. </li><li> 서스펜션 최대 피펫 몇 번 아래로 남아있는 수용성 덩어리를 분쇄 할 수 있습니다. 의 입구에 나일론 메쉬의 새로운 사각형 조각을 배치15ml의 원뿔형 튜브 및 잔여 파편을 제거하기 통해 현탁액을 필터. </li><li> 반복하여 림프절과 비장 조직에 대해 2-4 단계를 반복합니다. </li><li> 현탁액을 15 ㎖ 튜브로 여과 한 후 PBS +와 튜브의 나머지를 채우고 몇 번 반전. C. O 4에서 5 분 동안 475 XG에 세포를 원심 분리기 </li><li> 비장 세포의 경우, 다음의 원심 분리 상층 액을 흡인 및 적혈구를 용해시키기 위해 1 분 동안 비장 당 빙냉 1X ACK 용액 1 ㎖에서 세포 펠렛을 재현 탁. 그 다음, ACK의 상부에 PBS + 10를 가하여 튜브를 반전 및 원심 XG 475 4 O C.에서 5 분간 </li><li> 림프절 세포, PBS + 2 ㎖에 재현 탁하고 상등액을 흡인. 원하는 경우 이들 ACK들은 용해 및 세척 단계 이후에 비장 세포와 결합 될 수있다. </li><li> PBS +의 또 다른 10ml에 비장 세포의 원심 분리에 resuspend 후에 뜨는을 대기음. 이 시점에서 림프절 정지가 될 수 있습니다비장 현탁액 위에 dded 티슈 풀링 정렬에 필요한 경우. C. O 4에서 5 분 동안 475 XG 다시 튜브를 원심 </li><li> 세포 펠렛은 이제 CD4 농축을 위해 준비 될 수있다. 이 단계를 수행하지 않을 경우, 정렬 준비 단계로 진행합니다. </li><li> 고속 자기 세포 선별 시스템을 사용하여 CD4를 들어 농축, CD4 구슬 세포 펠렛을 재현 탁. 일반적으로 PBS + 85 μL에 희석 구슬의 15 μl를 1 마우스에서 조직에 라벨을 사용한다. 필요에 따라, 비드 혼합물의 부피 진입로 펠렛을 재현 탁하고, 4 ℃에서 15 내지 30 O 분간 부화 </li><li> , PBS + 10 mL로 세포를 씻어 O 4 ℃에서 5 분 동안 475 XG 다시 파편, 및 원심 분리기를 제거하기 위해 15 ㎖의 새로운 튜브에 나일론 통해 현탁액 합격 </li><li> 마우스 당 PBS의 + 100 ㎕의 펠렛을 재현 탁하고 고속 자기 세포 분류 시스템에 긍정적 인 선택으로 진행합니다. 수동 분리 시스템, F를 사용하면농축 제조업체의 지침을 ollow. 대안 적으로, FACS 완충액에서 재현 탁 샘플 : PBS를 1mM EDTA (PH = 8), 1 % BSA, 멸균 여과로. </li><li> 긍정적 인 부분을 제거하고 PBS + 10ml의 다시 씻는다. 풍부한 CD4 + 분율은 지금 정렬에 표시 할 준비가되어 있습니다. </li></ol> 4. 정렬 나이브 CD4 + T 세포 <ol><li> PBS는 CD62L, CD44, CD25, CD4 및 대항 함유 형광 항체 +를 세포 펠렛 레이블. 표 1에 열거 된 항체를 사용하는 경우, 각각의 희석 물이 제공된다. 염색의 경우, 항체 칵테일 100 ㎕의 부피는 한 마우스에서 조직 당 사용된다. </li><li> 항체 칵테일 펠렛을 재현 탁하고 어두운 4 O C에서 15 ~ 30 분 동안 품어. </li><li> 4 O ℃에서 PBS + 10ml의 원심 분리기 475 XG 5 분으로 세포를 씻으 </li><li> 다시 다른 나일론 필터 또는 셀 스트레이너 캡을 통해 혼합물 전달남은 파편을 이동합니다. 셀 소터에 대한 호환되는 튜브로 표지 된 세포를 피펫. 얼음에 세포를 유지하고 정렬 될 때까지 빛으로부터 보호. </li><li> 셀 소터에 수집 호환 튜브의 하단에 전체 RPMI 미디어 또는 FBS의 1-2ml을 피펫 팅에 의해 수집 튜브를 준비합니다. </li><li> 정렬 CD4 + CD25과 순진한 CD4 + T 세포 - CD62L + CD44 - 인구 (그림 2). 전체 RPMI 매체와 수집 된 세포를 씻으 전술 한 바와 같이 원심 분리기. </li><li> 완전 RPMI에서 펠렛을 재현 탁 순진한 세포를 계산하고, 1 × 10 6 세포 / ml로 농도를 조절합니다. </li></ol> 5. 체외 분화 설정 <ol><li> 항 CD3 및 안티 CD28 코팅 된 플레이트의 우물을 기음과 멸균 PBS (NO FBS) 1ml를 잘 각을 씻는다. 48- 웰 플레이트, RP 0.5 × 106 세포 / 웰에서 0.5 ml의 판형MI. 24 웰 플레이트, 문화 1 × 10 6 세포 RPMI의 / 웰에 1.0 ml의하십시오. </li><li> 이러한 약물로서 인자의 영향을 테스트하기 전에 중 어느 적절한 웰에 물질을 추가하거나, 실험에 따라 분화 처리 후의 경우. 다음에, 따라서 사이토 카인 및 차단 항체로 배양 배지를 보충. TH0 : 30 U / ㎖ 된 hIL-2. TH1 : 15 NG / ㎖ rmIL-12, 30 U / ㎖ 된 hIL-2, 5000 및 NG / ㎖ 11B11.Th2 : 10 NG / ㎖ rmIL-4, 30 U / ㎖ 된 hIL-2, 2000 NG 37.51 수용성 ㎖ /, 5000 NG / ㎖ XMG1.2. iTreg : 15 NG / ㎖ hTGFβ, 30 U / ㎖ 된 hIL-2, 5000 NG / ㎖ XMG1.2, 5000 NG / ㎖ 11B11. Th17 : 20 NG / ㎖ rmIL-6, 3 NG / ㎖ hTGFβ, 5000 NG / ㎖ XMG1.2, 5000 NG / ㎖ 11B11. 주의 : 위에서 제시된 조건은 분화 실험 (대표 결과 부)의 끝에서 측정 한 사이토 카인 생성을 최대화하기위한 최적 인 것으로 밝혀졌다. 그러나 각 개개의 실험실 조건 (표 2에 최적화되어야 </stroNG&gt;). 또한, 판 - 결합 된 항 - CD28 이외에 수용성 항 CD28의 첨가가 우리 실험실에서의 Th2 사이토 카인의 생산을 강화하는 것으로하지만, 다른 T 세포의 서브 세트들에 영향을주지되었습니다 </li><li> 종래 유전자 발현 및 사이토 카인 생성의 분석 4-5 d 내지 5 % CO 2와 37 ℃로 플레이트를 인큐베이션. 대안 적으로, 확산 및 최종 수율을 향상시키기 위해 신선한 매체와 함께 1 × 106 세포 / ml로 조정 한 후 2 일 TCR 자극으로부터 세포를 제거하고, 새로운 웰 (비 코팅)에 접시. 이 경우, 편광 신선한 시토 킨 및 항체가 필요하지 않지만이 IL-10 U / ㎖의 TH0, TH1,은 Th2 및 iTreg 새로운 배양 배지에 첨가되어야한다. </li></ol> 분화 6. 분석 <ol><li> 유동 세포 계측법에 의한 사이토 카인 분석을 위해, / ㎖ 또는 1 μg의 이오 노마 이신 (예로서 brefeldin 골지체 억제제의 존재 하에서 4-6 시간 동안 항 CD3 / ㎖ 표 ng를 10ng / ㎖ PMA 및 1000으로 각 웰을 restimulate1). 세포 내 사이토 카인 염색법 실험에 따라 (그림 3)을 수행합니다. 주 : 얼룩 비 혈통 특정 사이토킨 또는 (도시되지 않음) IL-4 및 IFNγ와 같은 전사 인자, 음성 대조군으로서 분화 효율의 지표로서 각 조건 Th17 배양 용 (도 3). 또한, Tregs의 상호 개발과 같은 Th17 문화에 대한 얼룩은 Foxp3는 TGFβ의 추가로 발생할 수 있습니다. </li><li> 단백질 정량, 사이토 카인 특정 ELISA (그림 3)에 의해 각 웰과 분석의 상층 액을 수집합니다. 테스트되는 요인 대조 시료에 비해 증식 영향을 미쳤다 우려가있는 경우, 세포는, 세정 수, 정규화 계산하고 ELISA 분석을 위해 상등액을 수집하기 전에 24 시간 동안 항 CD3 1 ㎍ / ㎖로 재 자극. L 될 수 있다는 조건 IL-4, 세탁 restimulating 필요한은 Th2로부터는 IL-4를 제거하는 경우 시금초기 분화 문화 eftover. </li><li> 실시간 PCR에 의한 유전자 발현 분석을 위해 수확 세포는 잠복기 후에, 세척 정상화 및 항 CD3 1 ㎍ / ml의 수확의 mRNA에 앞서 (도 3)으로 2-6 시간 동안 다시 자극한다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

비장은 순진한 목 세포를 포함하는 동안, 림프절이 인구의 비율이 훨씬 높다. 제대로이 프로토콜에 림프절을 식별하고 제거하지 않으면 순진한 세포의 수율이 열악 발생합니다. 이것은 더 많은 지방 조직이 나이가 마우스 또는 수컷 마우스에서 특히 어려울 수 있습니다. 동물의 사지와 피부의 그림 1, 적절한 고정 및 피닝 (pinning)에 나타낸 바와 같이 접근 외부 림프절 쉽게 시각화 수 있습니다. 림프절 및 비장이 처리되면, 셀 정렬은 고순도 나이브 CD4 + T 세포 집단을 수득하는 바람직한 방법이다. 순도는 나이브 세포 분화 과정에 영향을 미치는 세포로부터 또는 토륨 nTregs 이펙터와 메모리를 방지하는 것이 중요하다. 나이브 T 세포의 높은 수율을 얻는데 어려움 통상 분리 단계 동안 비효율적 조직 수집 및 프로세싱 또는 세포의 손실에 의해 야기된다. 항복 메이크들 늘리려면URE 얼음에 감기 인큐베이션 완충제를 사용하여 셀을 처리한다. 또한, 미리 추천 시약 및 분리 프로토콜...

별개의 계통 ​​또는 CD4 + T 도우미의 부분 집합의 개념 (목) 세포는 20 세기 한 후반 이후 주변왔다. 세포 증식 및 세포 목 이펙터로 최종 분화의 여러 라운드에서 공동 자극 신호 결과의 존재 동족 항원의 인식. 이 과정에서 생성되는 토륨 셀의 유형이 활성화 중에 본 사이토킨 환경에 의존한다. 우선, 토륨 나이브 T 세포는 세포 수용체 (TCR) 활성화, 보조 자극 CD28 결찰 및 사이토 카인이 다음과 같은 별개의 신호 계통에 편광 생각되었다. 1 형 헬퍼 세포 (TH1)는 사이토킨 IFNγ 그들의 이펙터 생산뿐만 아니라 분화 과정 중에 3,4- IL-12 시그널링 그들의 요건을 특징으로한다. 결국 차별화 된 Th1 세포가 가장 특유 B를 특징으로하는 유전 적 프로파일이 발견되었다Y TH1 유전 적 프로그램 (5)의 마스터 조절기 간주되는 T 상자 가족의 전사 인자의 발현, Tbx21 (T-내기). 또한, IL-12뿐만 아니라 IFNγ로는 T-내기 식 6, 7을 홍보 할 수 있습니다. 면역 응답하여, Th1 세포는 세포 내 병원체뿐만 아니라자가 면역 염증 강한 프로모터 대 숙주 방어에 중요하다. 대조적으로, 2 형 헬퍼 세포 (은 Th2)은 그 개발 IL-4 및 IL-4, IL-5 포함한 효과기 사이토킨, 및 IL-13을 요구, B 세포 반응을 구동하기위한 중요하고 알레르기 8 병원성, 9. Th1 세포와 마찬가지로,은 Th2 세포가 자신의 마스터의 전사 조절을 표현하는 것으로하고, GATA-3 10,11 불린다. 흥미롭게도, 편광 사이토 카인의 존재 및 특정 목 혈통의 생성은 특정 토륨 서브셋 동안 재 면역 우성 될 수 있음을 시사 2,12 등의 개발 반목sponse. TH1 Th2에 계통의 식별 이후, 추가 작업은 최근 모낭 도우미 (TFH), (TH9) IL-9-생산 및 IL-22 생산 (Th22) (포함 T 헬퍼 세포의 더욱 부분 집합을 보여 주었다 ) 13에서 검토. 체외 분화 실험의 목적을 위해,이 프로토콜은 조절 T 세포 (TREG) 및 IL-17을 생산하는 CD4 + T 세포 (Th17)를 지칭 단에 두 개의 추가 서브 세트들을 토륨 초점을 맞출 것이다. CD25 + T 조절 세포는 흉선에서 자연적 (nTreg)가 발생할 수있다; 순진 목 세포는 (14, 15에서 검토) 주변의 규제가 될 (iTreg)을 유도 할 수있다. Tregs 두 가지 유형의 특성 전사 인자가, 용해성 항염 매개체 생산, IL-2 소모 및 셀 접촉 의존적 메커니즘 (14,15)을 포함하는 그들의 이펙터 억제 메카니즘에 중요 forkhead 상자 P3 (Foxp3를)를라고 표현한다. Foxp의 부족심각한, 다기관자가 면역 질환에서 3 식 결과는 면역 조절 장애, polyendocrinopathy, 장 질환이라, 염증을 해결하고 자기에 주변 내성을 조절하는이 목 부분 집합의 중요한 역할을 보여주는 X-연결 증후군 (IPEX)는 16 항원. 시험 관내에서, 순진한 CD4 + T 헬퍼 세포는 Foxp3의를 상향 조절하고 IL-2와 14, 15을 TGF-β가 함께 자극에 TREG 프로그램에 최선을 다하고된다. (17, 18에서 검토) 만 사이토 카인 생성을 고려할 때, 특히 CD4 + T 세포 계통 상당한 가소성 중등도가있을 수있다. 그러나, 체외 분화 프로토콜의 목적을 위해, 우리는 고유 혈통 각 서브셋을 논의한다. 최근, IL-17 사이토 카인을 생산 Th17 세포의 서브 세트는자가 면역 염증 19-21 중 특히 병원성 염증성 기능 고유 혈통로 확인되었다. Th17 세포 고유의 전사 인자를 발현, 유전자 Th17 프로그램 (22)을 좌표로 불리는 관련 레티노이드 고아 수용체 감마 t (RORγt). TGFβ는 RORγt의 유도를 통해 Th17 계보의 생성에 중요합니다. 그러나, TGFβ 신호의 효과는 (12에서 검토) IL-6와 Th17 synergizing에 약속을 유도하는 것으로 여겨진다. 또한 연구는 다른 긍정적 인 IL-1β를 포함, Th17 약속을 조절할 수있는 신호 증가 나트륨 및 TLR의 다양한 23 ~ 26 신호 것으로 나타났습니다. 다른보고는 생체 내에서 병원성 Th17 세포가 실제로 TGFβ 신호 우회 것들 대신 분화 27 IL-1, IL-6, IL-23의 조합에 의존한다고 제안했다. 따라서, Th17 세포 신호 전달 경로의 다양한로부터 유도 될 수있다; Th17 계통에 대한 약속이 프로토콜의 목적을 위해, 일반적으로 사용되는 (TGFβ 및 IL-6) 통로표시됩니다. 모든 이펙터 계통에 대한 설명 분화 프로토콜은 실험의 전 과정에 걸쳐 TCR와 CD28에 대한 자극으로 고정 된 항체에 의존한다. 그러나, 다른 보여준 그 항원 제시 세포가 28 또는 가교 항 CD3 및 햄스터 항체와 항 CD28 항체 이일 29은 다양한 토륨 서브 세트의 생성을 유도하는 매우 효과적인 수단과 TCR 활성화. 여기에 제시된 프로토콜은 Th17 세포 31 차 림프 기관 (30)로부터 쥐의 CD4 + T 세포를 분리하고 생성 이전에보고 된 방법에 작성합니다. 하나의 주요 차이점은이 프로토콜은 림프 조직으로부터 나이브 CD4 + T 세포를 분리하는 셀 소터의 사용에 의존한다는 것이다. 그러나 많은 기업들이 이제 요구 사항 F를 우회 할 수있다, 순진한 CD4 + T 세포에 대한 풍요롭게 빠른 분리 키트를 제공또는 정렬 실험에 따라. 방법과이 프로토콜에서 제시 시약은 우리가 일상적으로 사용하고 가장 효과가 무엇을 발견한다. 그러나, 대체 시약 및 방법은 아래에 제시된 많은 단계를 위해 존재한다는 것을 명심하고 자신의 목적을 위해 최선을 작동합니다 어떤 결정하기 위해 개별 실험실에 달려있다.

<table><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td>사용 전 37 oC 수조에서 RPMI</td></tr><tr><td>1640 Media</td><td>Life Technologies</td><td>11875119</td><td></td></tr><tr><td>10% FBS</td><td>Life Technologies</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>1000X 2-머캅토에탄올</td><td>Life Technologies</td><td>21985023</td><td></td></tr><tr><td>100X Pen/Strep</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>100X L-글루타민</td><td>Life Technologies</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>120 미크론 나일론 메쉬</td><td>Amazon</td><td>CMN-0120-10YD</td><td>2cm2 사각형 및 오토클레이브로 절단</td></tr><tr><td>대안: 100미크론 셀 스트레이너</td><td>Fisher</td><td>08-771-19</td><td>나일론 메쉬</td></tr><tr><td>autoMACS 러닝 버퍼</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-221</td> <td>절단의 대안사용 전 37 oC 수조에서 따뜻하게</td></tr><tr><td>AutoMACS 헹굼 용액</td><td>Miltenyi</td><td>130-091-222</td><td>사용 전 37 oC 수조에서 따뜻하게</td></tr> 하기 <tr><td>CD4 비드</td><td>Miltenyi</td><td>130-049-201</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 완충액</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01</td><td></td></tr><tr><td>사이토카인:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>인간 (h) IL-2</td><td>Peprotech</td><td>200-02</td><td></td></tr><tr><td>재조합 마우스(rm) IL-4</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-6</td><td>R & D 시스템</td><td>406-ML-025</td><td></td></tr><tr><td>rmIL-12</td><td>Peprotech</td><td>210-12</td><td></td></tr><tr><td>hTGFb</td><td>R & D Systems</td><td>240-B-010</td><td></td></tr><tr><td>항체:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2C11 (anti-CD3)</td><td>BioXcell</td><td>BE0001-1</td><td></td></tr><tr><td>37.51 (anti-CD28)</td><td>BioXcell</td><td>BE0015-1</td><td></td></tr><tr><td>11B11 (anti-IL-4)</td><td>BioXcell</td><td>BE0045</td><td></td></tr><tr><td>XMG1.2 (anti-IFNg)</td><td>BioXcell</td><td>BE0055</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD62L-FITC</td><td>BioLegend</td><td>104406</td><td>1:100에서 사용</td></tr><tr><td>anti-CD25-PE</td><td>BioLegend</td><td>102008</td><td>1:400에서 사용</td></tr><tr><td>anti-CD4-PerCP</td><td>BioLegend</td><td>100434</td><td>1:1000에서</td></tr><tr><td>사용 anti-CD44-APC</td><td>BioLegend</td><td>103012</td><td>1:500에서 사용</td></tr><tr><td>Phorbol&nbsp; 12-myristate 13 acetate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8139</td><td>DMSO에서 0.1 mg/ml로 주식을 준비하고 -20 o에서 부분 표본을 동결합니다.C</td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0634</td><td>DMSO에서 0.5mg/ml로 스톡을 준비하고 -20에서 분취량을 동결oC</td></tr><tr><td>Brefeldin A</td><td>eBioscience</td><td>00-4506-51</td><td>1:1000에 사용</td></tr></tbody></table>

마우스 나이브 cd4<sup&gt; +</sup&gt; t 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; t 세포 하위 집합으로 차별화

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

항원 미숙(순진) CD4+ T 세포는 MHC class II에 제시된 동족 항원의 T 세포 수용체(TCR) 인식 시 효과기 하위 집합으로 확장 및 분화를 겪습니다. TCR 활성화 시 환경에 존재하는 사이토카인 신호는 미성숙한 CD4+ T 세포의 effector 운명을 결정하는 주요 요인입니다. naive T cell 활성화 중 cytokine 환경은 복잡하고 in vivo에서 중복 및 반대 신호를 모두 포함할 수 있지만, in vitro에서 naive CD4+ T cell 활성화 중 다양한 cytokine 조합을 추가하면 특징적인 cytokine 및 transcription factor 발현을 가진 effector T helper 계통의 확립을 쉽게 촉진할 수 있습니다. 이러한 분화 실험은 특정 CD4+ T helper subset의 발달을 촉진하거나 억제하는 것으로 여겨지는 표적의 평가를 위한 첫 번째 단계로 일반적으로 사용됩니다. 분화 과정 중에 신호 작용제, 길항제 또는 기타 사이토카인과 같은 매개체를 추가하는 것도 T 세포 분화에 대한 특정 표적의 영향을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서는 마우스에서 naive T cell을 분리하기 위한 기본 프로토콜과 in vitro에서 naive cell을 다양한 T helper effector 계통으로 분극화하는 데 필요한 후속 단계를 설명합니다.

토륨 조건에 따라 달라질 수 분화 분석 시점은 T 세포 수용체 활성화의 강도뿐만 아니라 테스트되는. 분화 2-3 일 후, 세포를 T 세포 증식의 범위를 결정하기 위해 광학 현미경에 의해 시각화 될 수있다. 세포의 광범위한 확산과 응집을 전시 웰스 가장 가능성이 가능성이 문화 4 일 후에 미디어를 배출합니다, 외인성 IL-2, 같은 TH1과은 Th2 등의 추가에 의존하는 일 4. 분화 조건에서 분석을위한 준비가 될 것입니다. 사이토 카인 생산을 극대화하기 위해, 지친 미디어와 같은 우물 신선한 RPMI는 IL-2를 포함하는 보충 또는 계산 및 IL-2는 또 다른 하루 이틀의 차별화를 확장 포함 신선한 RPMI 잘 당 1 × 10 6 세포에 다시는 도금 될 수있다 이 방법을 사용. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52739/52739fig1.jpg" /><b...

순진한 CD4+ T cell은 활성화 시점의 환경에 따라 다양한 subset으로 분극화합니다. naive CD4+ T cell을 다양한 effector subset으로 분화하는 것은 T cell receptor stimuli 및 specific cytokine signal의 추가를 통해 in vitro에서 달성할 수 있습니다.

마우스 나이브 CD4<sup&gt; +</sup&gt; T 세포의 분리 및<em&gt; 시험관</em&gt; T 세포 하위 집합으로 차별화

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

다음 절차의 전반적인 목표는 마우스 림프절과 비장에서 분리한 naive CD4+ T 세포를 서로 다른 T 헬퍼 하위 집합으로 분화시키는 것입니다. In vitro에서 이는 먼저 성체 야생형 마우스에서 적출한 비장과 림프절을 처리함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 자기 비드 분리법을 통해 CD4+ 세포 집단을 농축한 다음, naive T 세포 마커 발현에 따라 추가로 분류합니다.마지막 단계로, T 세포 수용체 활성화 인자와 분화 유도 사이토카인을 처리하여 세포를 다양한 T 헬퍼 세포 계통으로 분화시킵니다. 최종적으로 유세포 분석, ELISA 및 실시간 PCR을 사용하여 T 헬퍼 세포 분화 효율을 평가합니다.이 방법은 특정 분자의 발현이나 특정 약물 처리가 T 세포 반응의 성격에 어떠한 영향을 미치는지와 같이 T 헬퍼 세포 분야의 핵심적인 질문들에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 먼저 5~10주 된 C 57 black six 마우스의 사지를 해부판에 고정한 다음, 아래의 복막 조직을 뚫지 않도록 주의하며 항문에서 턱까지 피부를 세로로 절개하십시오. 그다음, 피부를 핀으로 고정하여 펼치고, 한 쌍의 핀셋으로 림프절을 잡고 다른 핀셋을 사용하여 이미지에 표시된 각 위치에서 조직을 분리하십시오.림프절을 각각 적출할 때마다 1%FBS가 첨가된 PBS 또는 PBS plus가 담긴 수집 접시에 넣고, 복막을 조심스럽게 열어 비장을 제거합니다. 비장 또한 수집 접시에 넣은 후, CD4 양성 세포를 농축하기 위해 접시를 아이스 버킷으로 옮깁니다. 멸균 핀셋을 사용하여 림프절과 비장을 각각 3mL의 PBS plus가 담긴 두 개의 별도 60mm 접시에 나누어 담습니다.다음으로, 비장 위에 멸균 나일론 메쉬(nylon mesh) 조각을 올리고 시린지 플런저의 엄지 쪽 부분을 사용하여 거의 모든 조직이 부유액 상태가 될 때까지 메쉬 위에서 부드럽게 으깹니다. 부유액을 피펫으로 여러 번 빨아들였다 내뱉어 남아 있는 가용성 덩어리들을 분쇄한 후, 15 milliliter 원추형 튜브 입구에 새 나일론 메쉬 조각을 덮습니다. 부유액을 튜브에 여과하여 남아 있는 잔해물을 제거합니다.이제 림프절에 대해 기계적 해리를 반복하고, 여과된 세포가 담긴 두 튜브를 PBS plus로 채웁니다. 그 다음 튜브를 몇 번 뒤집어 섞은 후 세포를 원심 분리합니다. 림프절 펠릿을 2 mL의 PBS에 다시 현탁합니다.비장 세포 펠릿에 마리당 1 mL의 차가운 ACK 용액을 추가합니다. 1분 후, 10 mL의 PBS+로 적혈구 용혈을 중단시킵니다. 튜브를 뒤집어 세포를 다시 원심 분리합니다.그런 다음 비장 펠렛을 10 mL의 PBS plus에 다시 현탁하고, 림프절 세포를 추가한 후 혼합된 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 이번에는 마우스당 85 µL의 PBS plus에 희석된 15 µL의 CD4 자기 비드를 사용하여 4 °C에서 15~30분 동안 펠렛을 다시 현탁합니다. 그 후 세포를 10 mL의 PBS plus로 희석합니다.현탁액을 나일론 체로 걸러 새로운 15 milliliter 튜브에 옮긴 후 세포를 원심 분리합니다. 다시, 마우스당 100 microliters의 PBS plus로 펠릿을 재원심 분리하고, 제조사의 지침에 따라 자기 비드 선택법으로 CD four 양성 세포를 양성 선택합니다. CD four 양성 세포 분획을 얻은 후, 10 milliliters의 PBS plus로 세포를 세척하여 CD four 양성 T-세포 분획을 분리합니다.다음으로, 세척 후 4°C의 암소에서 15분에서 30분 동안 적절한 형광 항체로 세포를 라벨링합니다. 라벨링된 세포를 필터링하여 잔해를 제거하고, 얼음 위에 둔 FACS 튜브로 옮겨 빛으로부터 보호합니다. CD4 양성, CD25 음성, CD62L 양성, CD44 음성 세포군을 완전 RPMI 배지로 분리 정렬합니다. 모든 세포가 수집되면.신선한 완전 배지로 naive T 세포를 세척합니다. 그 다음 펠렛을 RPMI 완전 배지로 재부유시켜 naive T 세포의 수를 측정하고, 체외 T 헬퍼 서브셋 분화를 유도하기 위해 농도를 1×10⁶ cells/mL로 조정합니다. 이어서, anti-CD3와 anti-CD28이 미리 코팅된 세포 배양 플레이트의 각 웰을 1 mL의 멸균된 FBS-free PBS로 세척한 후 세포를 분주합니다.마지막으로 표에 명시된 대로 적절한 사이토카인과 차단 항체를 배양액에 첨가하고, 세포를 37 °C, 5% CO2 조건에서 4~5일 동안 배양합니다. 4~5일의 배양 후, 인비트로(in vitro) 분화된 TH1, TH2, 유도성 treg 및 TH17 배양액 내의 CD4 양성 T 세포에 대해 세포 내 사이토카인 염색을 수행하여, 각 T 세포 하위 집합이 예상되는 사이토카인 프로파일을 나타내는지 확인합니다.실제로 anti CD3로 24시간 동안 재자극한 후, A는 각 하위 집단이 세포 내에서 발현된 사이토카인 단백질에 대응하는 세포 외 생성 또한 나타냄을 보여줍니다. 계통 특이적 전사 인자에 대한 실시간 PCR을 통해 인 비트로(in vitro) 분화된 CD4 양성 T 세포 하위 집단의 적절한 전사 인자 프로필을 추가로 확인하였습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 나이브(naive) CD4 양성 T 헬퍼 세포를 얻기 위해 림프절과 비장 세포를 분리하고 처리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.또한, 이러한 T 세포를 TH1, TH2, TH17 또는 iReg 세포로 분화시킬 수 있습니다.

mouse-nave-cd4-t-cell-isolation-vitro-differentiation-into-t-cell

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

Miltenyi 맥스 키트를 사용 lymphocytes의 격리는 전체 림프 조직 homogenates에서 세포를 정화하는 안정적인 방법입니다. Miltenyi 시스템을 사용하여 정화 세포는 일반적으로 ≥ 96% 순수하고 있습니다. 여기, 우리는 CD4 + T 세포, Miltenyi에서 제공하는 많은 키트 중 하나를 분리하기 위해 취한 단계를 보여줍니다.

CD4의 분리 + Miltenyi 맥을 정제를 사용하여 마우스 림프절에서 T 세포

우리는 retroviral 전달을 사용하여 항원 - 특정 마우스 T - 세포를 생산하는 프로토콜을...

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

이 비디오는 과립구-대식세포-군집-자극 인자 또는 GM-CSF 생산 T 도우미 세포(TH GM)의 체외 분화를 보여줍니다. 분리된 naive T cell은 THGM으로 분화하기 위해 자극되며, 이는 높은 세포 내 GM-CSF 생산과 다른 T helper cell specific cytokine의 낮은 발현을 감지하여 확인됩니다.

GM-CSF 생산 T 헬퍼 세포와 나이브 T 세포를 구별하는 체외 기술

마우스 배아 줄기 세포는 OP9-DL1 공동 배양 시스템을 사용하여 in vitro에서 T 세포로 분화할 수 있습니다. 이 절차를 성공적으로 수행하려면 시약/세포 유지 관리 및 주요 기술에 민감한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 여기에서는 이러한 중요한 매개변수에 대해 논의하고 이 기술의 채택을 장려하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

T 세포의 유도 체외 마우스 배아 줄기 세포에서

이 기사는 T 세포 자손의 생성, 표현형 및 수의 동역학을 분석하여 흉선 침전 전구 세포를 특성화하는 생체 내 및 시험관 내 방법론에 대해 설명합니다.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

여기, 우리가 순진한 CD4 + T 세포, 순진한 CD4 + T 세포, THGM의 차별화의 격리를 포함 하 여에서 murine granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor-producing T 도우미 (THGM) 세포를 분화 하는 프로토콜을 제시 하 고 차별화 된 THGM 셀의 분석. 이 메서드는 규칙의 연구 및 THGM 세포의 기능에 적용할 수 있습니다.

생체 외에서 마우스 Granulocyte 대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)-T (THGM) 도우미 셀 생산

여기, 우리가 순진한 CD4 T 세포 (T 세포) 활성화, 확산, 그리고 GM-CSF 골 (BM)에 의해 유도 된 Th1 차별화의 비보에 결정에 대 한 프로토콜을 제시-파생 된 모 수석 세포 (DCs). 또한,이 프로토콜 BM 및 T-세포 절연, DC 생성, 및 DC 및 T-세포 입양 전송을 설명합니다.

Vivo에서 마우스 모델을 측정 순진한 CD4 T 세포 활성화, 확산 및 골 수 유래 수지상 세포에 의해 유도 된 Th1 차별화

이 프로토콜은 in vitro에서 naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 분화하는 과정을 설명합니다. 특히, 다중 파라미터 유세포 분석 기반 접근법과 결합하면 이 분화 방법을 사용하여 naïve CD4+ T 세포에서 병원성 Th17 세포의 90% 순도를 얻을 수 있습니다.

마우스에서 Naive CD4+ T 세포를 병원성 Th17 세포로 체외에서 분화

현재 연구는 바이러스 특이적 TFH 세포의 조기 운명 헌신을 평가하고 이러한 세포에서 유전자 발현을 조작하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

급성 LCMV에 감염된 마우스에서 바이러스 특이적 여포 도우미 CD4+ T 세포의 조기 분화에 접근

여기에서는 형광 현미경을 사용하여 원발성 쥐 및 인간 T 세포에서 Ca2+ 마이크로도메인으로 알려진 초기 국소 Ca2+ 신호를 분석하기 위한 포괄적인 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜은 면역 세포 내의 Ca2+ 신호 경로를 조사하고 그 기능을 더 자세히 밝히는 데 귀중한 리소스 역할을 합니다.

일차 T 세포에서 초기 Ca2+ 마이크로도메인 이미징

학습하세요 마우스의 CD4+ T 세포를 자기적 구슬 분리와 세포 분류로 분리하여 시험관 내에서 T 세포 하위 집합으로 차별화하는 방법을. 이 기술은 면역학 연구와 면역치료 개발에 활용됩니다.

마우스 나이브 CD4

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