Name: 의 산화 스트레스 저항을 측정 예쁜 꼬마 선충 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: 배우세요 C. elegans의 산화 스트레스 저항성을 96웰 마이크로타이터 플레이트를 사용한 액상 분석법으로 측정하는 방법을. 이 프로토콜은 생존율 평가를 통해 산화 스트레스 메커니즘 연구에 활용됩니다.

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우리는 C의 Caenorhabditis 엘레 유전학 센터를 인정 엘레 균주. 자금 지원은 테리 폭스 연구소에 의해 제공되었다. 우리는 또한 Rolande과 마르셀 Gosselin의 대학원 재학 및 맥길 통합 암 연구 교육 프로그램의 암 연구 FRN53888에서 CIHR / FRSQ 훈련 보조금에서 EP에 부여 된 지원을 인정합니다.

시약 1. 준비 <ol><li> C의 미디어의 준비 (이 경우, 야생형 동물과 flcn -1- (ok975) 돌연변이 동물) 간스 성장. <ol><li> 트리스 염산 5.5 g을, 트리스베이스의 2.4 G, Bactopetone의 31g, 염화나트륨 20g과 콜레스테롤의 0.08 g의 Youngren 유일의 박토 - 펩톤 (참견 마라) 건조 믹스를 수정 준비합니다. 흔들어 잘 섞는다. 참고 :이 믹스 참견 마라 매체의 10 L를 준비하기에 충분하다. 주 : 정상적인 성장 매체 (NGM) 판 참견 마라 판 (27) 대신에 사용될 수있다. 그러나 판의 동일한 유형 균주간에 독립적 반복 사이의 유효한 비교를 위해 사용되어야한다. 이 프로토콜에서는, 우리는 참견 마라 판을 사용했다. </li><li> 참견 마라 건조 믹스 6g, 한천 17g을 추가하여 참견 마라 매체의 1 리터를 준비하고 122 ℃에서 45 분 동안 H 2 O 및 오토 클레이브와 1 L로 구성한다. 판을 붓고 실온에서 2 일 동안 건조 할 수 있습니다. </li><li> 멸균 기법을 사용 cultu 100 ㎖에 접종E.와 LB 국물 매체의 재 대장균 OP50 박테리아 및 37 ℃에서 O / N 성장. </li><li> E.와 씨앗 참견 마라 판 대장균 OP50 박테리아. 그것은 48 시간 동안 실온에서 성장하도록 허용합니다. </li></ol></li><li> 의 RNAi를 사용하여 유전자의 하향 조절을위한 준비 <ol><li> 참견 마라의 RNAi 수유 판을 준비합니다. 단계 1.1.1과 1.1.2에서와 같이 진행합니다. 오토 클레이브 후, 배지는 약 55 ℃로 냉각하고 추가 할 수있는 1 M 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG), 100 mM의 암피실린 1 ㎖를 1 ㎖. </li><li> 킬 E. 콜라이 HT115 제어 EV 또는 한천 플레이트에 암피실린 flcn -1- 특정의 RNAi (50 μg의 / ㎖) / 테트라 사이클린 (15 μg의 / ㎖)를 발현하는 플라스미드로 형질 전환 된 박테리아. 37 ° C에서 문화 O / N 성장. </li><li> 식민지를 선택하고 E. 접종 대장균 HT115 제어 EV 또는 특정의 RNAi-1 flcn과 하나가 37 &amp; #에서 LB / 암피실린 (50 μg의 / ㎖) 매체와 O / N에서 문화를 성장 표현하는 플라스미드로 형질 전환 된 박테리아를176; C. </li><li> E.와 씨앗 판 대장균 HT115 EV 세균이나 HT115 flcn-1 RNAi의 세균. 참고 : 사용하기 전에 실온에서 판을 48 시간 유지. 공급하여 RNAi의 최저 유효 인 경우, DS-28의 RNA 전달하는 다른 방법을 사용한다. </li></ol></li><li> 파라콰트 (PQ)를 사용하여 산화 스트레스를 유도 : <ol><li> KH 2 PO 4 3g을 혼합하여 M9 버퍼를 준비 나 2의 6g HPO 4, 염화나트륨 5 g 및 황산 0.25 g · 7 H 2 O. 증류수 1 L에 불러옵니다. 실온에서 122 ° C와 저장 병에서 45 분간 고압 솔루션입니다. </li><li> 분석 당일, M9 / PQ - 함유 용액을 제조 하였다. (M9 버퍼의 4 ㎖에 녹이고 PQ의 0.1028 g을 잘 당 M9 / PQ의 40 μL로 전체 96 웰 플레이트를 채우고)이 프로토콜의 경우, 100 mM의 PQ를 사용합니다. 주의 : PQ는 위험하고 독성이 강한 화합물이다. 해당 지침에 따라 처리합니다. 참고 : 때 먼저 새의 실행기차 또는 새 조건, 그것은 7-10 시간 내에 동물을 죽일하기 위해 사용하는 가장 농도를 결정하기 위해 PQ의 농도를 증가에서 생존을 분석하는 것이 좋습니다. </li></ol></li></ol> 나이 동기 L4 인구 2. 준비 <ol><li> E. 시드 신선한 참견 마라 플레이트로 전송 20 임신하는 성인 자웅 동체를 대장균 OP50 박테리아. 분석시 필요한 웜의 수에 따라 몇 접시를 준비합니다. </li><li> 그들이 6 시간 후, 어머니를 제거 백금 와이어 웜을 선택 사용하는 알을 낳는하도록 허용합니다. 누워 계란의 수를 평가하기 위해 현미경으로 번호판을 확인합니다. </li><li> 알이 부화하고 48 시간 동안 20 ℃에서 성장하도록 허용합니다. 이 시점에서, 동물은 늦은 L4 / 젊은 성인 단계에있다. 같은 무대 동물을 선택하고 PQ 솔루션 함유 우물에 전송할 수 있습니다. 참고 : 48 시간 배양 단지 야생형 동물과 유사 성장 돌연변이에 적용하므로,이 발달 모니터링하는 것은 중요새로 테스트 돌연변이 비율은, 야생형 개발 레이트 그렇지 다른 타임 라인이 사용되어야 부합되도록한다. </li><li> 대안 적으로, 동기화 기술을 사용한다. 차아 염소산 용액을 사용하여 L1 유충 웜의 동기 인구 생성 (25 ml의 물, 5.25 %의 차아 염소산 나트륨의 125 ml의 4 M의 NaOH 50 mL로, 빛에서 분리하기 위해 알루미늄 호일로 병 포장). 강렬한 표백 분석 중에 동물의 행동에 영향을 줄 수 있기 때문에,이 분석을 위해, 그것은, 권장되지 않는다. 주의 : 지침에 따라 차아 염소산 용액을 처리합니다. 주 : 다운, 관심 유전자를 조절하는 특정 세균의 RNAi 시드 RNAi의 플레이트에 산모 전사 제외한 제 2 절에 설명 자웅 동체를 동기화 RNAi의 사용시. RNAi에와 최저 약한 경우, 여러 세대에 공급하는 것이 좋습니다. </li></ol> 3. 산화 스트레스 저항 분석을 &lt;공연/ P&gt; <ol><li> 피펫 96 웰 플레이트의 각 웰에 (신선한 제조) 100 mM의 PQ 용액 40 μL. 모든 조건 (치료, 돌연변이 등)의 복제로 최소 12 우물을 사용합니다. 백금선 웜 픽업을 사용하여, 각 웰은 시작 시간과 종료 시간을 나타내는 5-8 L4 유충 동물 옮긴다. </li><li> 다른 조건을 시작할 때, 시작 시간 및 종료 시간을 참고. 시작 시간에서 한 시간 후에 죽은 동물을 벌레를 전송하고 점수 사이의 배양 시간에 20 ° C에서 접시를 놓습니다. </li><li> 해부 현미경을 사용하여, 생존마다 시간을 계산합니다. 조심스럽게 계산을 시작하기 전에 판을 흔들. 죽은 동물로, 심지어 높은 강도의 광을 스폿 팅 한 후에, 이동하지 않은 웜을 표시한다. 또한, 살아있는 동물의 수를 나타낸다. 참고 : 높은 배율에서 벌레 모양, 꼬리와 머리의 움직임을 보면, 살아에서 죽은 벌레를 결정하는 데 도움을줍니다. </li><li> 대부분의 벌레가 죽을 때까지이 단계마다 시간을 반복합니다. </li></ol> &lt;P 클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 4. 모든 시간 시점에서 생존 비율의 결정 <ol><li> 물론 모든 동물에 전송의 총 수를 가산함으로써 조건 당 동물의 총 수를 계산한다. 손상 또는 이전에 사망 동물을 무시합니다. </li><li> 매 시간 포인트 (12 웰에서 죽은 동물의 합) 조건 당 죽은 동물의 총 수를 계산한다. 때마다 포인트, 생존 (100 마이너스 %의 죽음)의 비율 (죽은 동물 (100)에 의해 동물의 총 개수로 나눈 값과 곱의 수) 죽음의 비율을 계산합니다. </li><li> 이 분석을 최소 3 독립 번 반복합니다. </li></ol>

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<li>Buckingham, S. D., Sattelle, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast%2C+automated+measurement+of+nematode+swimming+%28thrashing%29+without+morphometry%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fast, automated measurement of nematode swimming (thrashing) without morphometry.</a> BMC Neurosci. 10, 84(2009).</li>
</ol>

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

C. 엘레 쉽게 배양 될 수 있으므로 생체 내에서 유 전적으로 산화 스트레스 내성을 연구하는 매력적인 모델 생물이며, 급속 전적으로 동일한 자손 다수의 리드. 산화 스트레스 저항을 측정하기 위해 여러 방법이 앞서 설명되어 있으며 그러한 PQ, 로테 논, H 2 O 2, 및 juglone 25,26,29-32 ROS 같은 다양한 소스와 배양 접시의 보충에 기초한다. 여기에서 우리는 100 mM의 PQ를 사용하여 96 웰 플레이트에서 액체 산화 스트레스 저항을 측정하는 프로토콜을 설명합니다. 유사한 분석은 그리어 등. (33)에 의해 수행되었습니다. 이 분석은 또한 다른 ROS 소스를 사용하여 액상에서 산화 스트레스를 연구하기에 적합 할 수있다. 예를 들어, 우리는 (23)뿐 아니라 여러 H 2 O 2 농도 flcn-1이 증가 저항...

A reference was corrected in the publication of <a href="http://www.jove.com/video/52746">Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates</a>. There was an error with reference 34 in the Citations section. It has been updated from:
Allen, E., Walters, I.B., Hanahan, D. Brivanib a dual FGF/VEGF inhibitor,is active both first and second line againstmouse pancreatic neuroendocrine tumors developing adaptive/evasive resistance toVEGF inhibition. Clin Cancer Res. 17, (16) 5299-310 (2011).
to:
Allen, A. T., Maher, K. N., Wani, K. A., Betts, K. E., &#38; Chase, D. L. Coexpressed D1- and D2-like dopamine receptors antagonistically modulate acetylcholine release in Caenorhabditis elegans. Genetics. 188, 579-590 (2011).

Erratum: Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

진핵 세포에서 미토콘드리아의 전자 전달계에서 일어나는 산화 적 인산화는 ATP의 형태로 에너지 생산의 주요인이다. 반응성 산소 종 (ROS)은이 프로세스의 자연 부산물이다. 분자 신호로서의 중요한 역할에도 불구하고, 과도한 활성 산소는 DNA 손상, 단백질 카르 보닐, 및 지질 산화 될 수 있습니다. ROS 생산 및 해독 간의 불균형 에너지 고갈, 세포 손상에 이르게 산화 스트레스를 유발하고 세포 사멸을 유발 1,2-. 산화 스트레스는 노화, 암, 당뇨, 심혈관 질환 및 신경 퇴행성 질환 3-9 포함한 많은 생명을 위협하는 질병의 발달에 기여한다. ROS 세포를 적절한 수준을 유지하고 산화 손상 1,2- 대하여 그들의 구성 성분을 보호하는 효소와 비 효소 적 방어 전략을 진화했다. 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제는 (SOD) 효소는 conve 먼저 행동나중에 카탈라아제 또는 과산화 효소에 의해 물로 변환 H 2 O 2에 RT의 슈퍼 옥사이드. 비 효소 적 방어 전략은 대부분 필수 세포 성분을 보호하는 세포 거대 분자에 비해 활성 산소와 빠르게 반응하는 분자를 포함한다. 활성 산소가 효소를 해독의 보호 역할에도 불구하고, 일부 활성 산소 분자는 항산화 방어 메커니즘을 탈출 및 산화 적 손상을 초래할. 감지, 복구 및 손상된 세포 성분의 저하는 산화 스트레스 1,2시 필수적인 방어 전략이다. 스트레스 저항 특히 산화 스트레스에 관여하는 신호 전달 경로 것은 매우 진화 (10, 11)를 보존하고 있습니다. 생명체의 조건이 부분적으로 만 재생되는 세포 배양 실험, 12, 13은 큰 의미를 가지고 모델 생물에서 산화 스트레스의 연구와는 달리. C. 엘레는 막 다른 쉽고 저렴하게 할 수있는 자유 생활 선충이다한천 매체에 세균 잔디밭에 냈다는. 그것은 크기가 작고 일반적으로 (약 1 길이 ㎜) 및 유전자 조작을 용이하게하는 자기 시비 자웅 동체로 성장한다. 그것은 빠른 라이프 사이클과 높은 생식 능력, 세대 당 약 300 자손을 생산하고 그것을 대규모 유전 스크린 (14)을 수행 할 수있는 강력한 도구를하고있다. C. elegans의 게놈 염기 서열을 완전히하고 유전자 40-50 %가 인간의 질병 관련 유전자 15 ~ 18의 동체가 될 것으로 예상된다. 의 RNAi를 사용하여 관심의 유전자의 최저 신속하고 C에서 쉽게 엘레. 유전자 다운 조절은 E. 동물을 공급함으로써 달성 될 수있다 관심 19의 mRNA를 표적의 이중 가닥 RNA를 발현하는 플라스미드를 대장균 박테리아 항구. 따라서, 대규모의 RNAi 스크린을 이용한 유전자 기능의 결정은 암 (20, 21)을 포함하여 인간의 질병을 이해하는데 큰 영향을 미친다. O의 연구C에서 xidative 스트레스 저항 엘레은 산화 스트레스 13,22에 대한 저항의 보존 메커니즘의 식별을 주도했다. 확인 된 일부 경로는 저산소증, 열, 삼투압 스트레스 같은 다른 스트레스뿐만 아니라 이러한 장수와 저항을 조절하는 일반적인 경로이다. 이 경로는 인슐린 신호, TOR 신호, 그리고 자식 작용을 포함한다. 다른 주요 경로는, 또는 손상의 수리 등의 열 충격 및 보호자 단백질 11,13,22 같은 슈퍼 옥사이드 디스 뮤 타제 효소와 카탈라아제 효소로 활성 산소의 해독을 포함한다. 이 프로토콜은 C의 산화 적 스트레스에 대한 저항을 확인하는 방법에 대해 설명합니다 액체에 간스. 우리는 이전에 C. 손실시 flcn -1- (ok975)를 산화 적 스트레스에 대한 증가 된 내성을 보여 주었다 때문에 우리는 프로토콜을 설명하기 flcn -1- (ok975) 및 야생형 동물을 사용 엘레 (23). 우리는 또한이 증가 저항이 달려 있음을 보여 주었다AMPK와 자식 작용, 세포 생체 에너지를 향상시키고 응력 저항 (23)을 촉진 시그널링 축. PQ는 반응성 산소 종 (24)를 생성하기 위해 전자 전달계를 방해 산화성 스트레스이다. 같은 분석은 적용 할 수 있고, 다른 ROS 소스 또는 활성 산소 생성 화합물은 H 2 O 2와 로테 논 등 사용할 수 있습니다. 유사한 분석은 PQ의 낮은 농도 (25, 26)를 사용하는 플레이트에 개발되어왔다. 이 분석의 장점은 매우 빠르고, 그 결과는 하루에 획득 될 수 있다는 것이다. 또한, 96 웰 플레이트에서 산화 적 스트레스 저항성 검정을 수행하는 데 사용되는 액체의 총량은 PQ - 함유 플레이트를 제조하는 데 사용되는 체적에 비해 낮다. 따라서, 사용 된 PQ의 양이 분석에서 액체 인 것은 저가 분석을 렌더링하고 유해 폐기물의 생성을 제한하는 낮다. 그러나, 플레이트 분석에 비해이 분석의 한계 라 포함액체 분석에서 음식과 액체 산소의 낮은 농도의 CK는 공기에 비해. 이러한 경우에, 결과에 영향을 줄 수있는 중요한 인자이다. 따라서,이 분석에서 얻어진 결과를 지원하기 위해 권장 산화 스트레스 저항성 다른 방법을 사용하여 재현성을 확인하기.

<table><tbody><tr><td>한천 세균 학년</td><td>Multicell</td><td>800-010-LG</td><td></td></tr><tr><td>세균 펩톤</td><td>옥소이드</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>염화나트륨 생명 공학 학년</td><td>Bioshop</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>콜레스테롤</td><td>시그마</td><td>C8503-25G</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure tris 염산염</td><td>Invitrogen</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris 아미노메탄</td><td>Bio Basic Canada Inc</td><td>77-86-1</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-202185A</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Bioshop</td><td>69-52-3</td><td></td></tr><tr><td>효모 추출물</td><td>Bio Basic Inc.</td><td>8013-01-2</td><td></td></tr><tr><td>메틸 바이올로겐 디클로라이드 수화물</td><td>Aldrich 화학</td><td>856177-1G</td><td></td></tr><tr><td>페트리 접시 60 x15mm</td><td>피셔</td><td>FB0875713A</td><td></td></tr><tr><td>피펫 10ml</td><td>피셔</td><td>1367520</td><td></td></tr><tr><td>인산칼륨 일염기성</td><td>G-Biosciences</td><td>RC-084</td><td></td></tr><tr><td>황산마그네슘 헵타하이드레이트</td><td>시그마</td><td>M-5921</td><td></td></tr><tr><td>인산나트륨 이염기성</td><td>Bioshop</td><td>7558-79-4</td><td></td></tr><tr><td>Discovery v8 스테레오 자이스 현미경</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 웰 클리어 마이크로타이터 플레이트</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>flcn-1 RNAi 출처</td><td>Ahringer Library</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

의 산화 스트레스 저항을 측정<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 96 웰 마이크로 타이 터 플레이트에

Measuring Oxidative Stress Resistance of Caenorhabditis elegans in 96-well Microtiter Plates

생산 및 반응성 산소 종의 해독 사이의 불균형의 결과이다 산화 스트레스는 심혈관 및 신경 퇴행성 질환, 당뇨, 노화, 암, 인간을 포함한 만성 질환의 주요 원인이다. 따라서, 세포 시스템에서뿐만 아니라 전체 유기체를 사용뿐만 아니라 산화 스트레스를 연구하는 것이 중요하다. C. 엘레 매우 진화 적으로 보존되어 산화 스트레스 신호 전달 경로의 유전학을 연구하는 매력적인 모델 생물이다. 여기서, 우리는 C.에서 산화 적 스트레스 내성을 측정하기 위해 프로토콜을 제공 액체에 간스. 예컨대 파라쿼트 (PQ) 및 H 2 O 2 등 간단히, ROS는 유도 시약 M9 완충액에 용해하고, 용액을 96 웰 마이크로 티터 플레이트의 웰에 분주한다. 동기화 L4 / 젊은 성인 C. 엘레 동물의 우물에 전송된다 (5-8 동물 / 웰) 및 생존율을 측정매 시간마다 대부분의 웜은 죽을 때까지. 데이터의 잘못된 해석을 초래할 수있는 산화 스트레스시 동물의 행동에 영향을 줄 수있는 노화, 스트레스 번호판의 낮은 농도를 사용하는 산화 적 스트레스 내성 시험을 수행 할 때. 그러나, 본원에 기재된 분석에서,이 문제는 L4 / 젊은 성인 동물이 사용되기 때문에 발생하기 어렵다. 또한,이 프로토콜은 저렴하고 결과는 유전 스크린의 매력이 기술을 렌더링 일일에서 얻을 수있다. 전반적으로,이 산화 스트레스 관련 인간의 장애의 더 나은 특성화로 번역 될 수있는 산화 스트레스 신호 전달 경로를 이해하는 데 도움이 될 것입니다.

비교 야생형 C. 엘레은 flcn-1 (ok975) 돌연변이 동물 여기서 우리는 야생형 C.의 저항을 결정하기 위해 100 밀리미터 PQ 사용 산화 스트레스, 열, 산소 결핍 (23)에 저항하는 것으로 나타났다 flcn -1- (ok975)에 비해 간스 동물. 치료 4 시간, 야생형의 48.3 % 이후 생존으로 flcn-1 (ok975) 동물에서 77.8 %의 생존에 비해. 예상대로, flcn -1- (ok975) 돌연변이 동물은 야생형 (도 2 및 표 1)에 비해 100 mM의 PQ 더 내성이었다. 제어 EV가 공급 또는 flcn-1의 RNAi 박테리아 야생형 동물 비교 사용 RNA...

C. elegans는 산화 스트레스 저항성과 관련된 신호 전달 경로를 연구하기 위한 매력적인 모델 유기체입니다. 여기에서는 96개의 웰 플레이트에서 여러 산화제를 사용하여 액상에서 C. elegans 동물의 산화 스트레스 저항성을 측정하는 프로토콜을 제공합니다.

Oxidative stress, which is the result of an imbalance between production and detoxification of reactive oxygen species, is a major contributor to chronic ...

본 절차의 전체적인 목표는 액체 상태의 *C. elegans* 선충의 산화적 스트레스와 저항성을 측정하는 것입니다. 이를 위해 먼저 파라콰트(paraquat)와 같은 활성산소종(ROS) 유도제를 M9 완충액에 용해한 후, 해당 용액을 96웰 마이크로타이터 플레이트에 분주합니다. 다음 단계로, 조건당 최소 12개의 웰을 사용하여 모든 웰에 동기화된 후기 L4 단계의 선충을 5~8마리씩 옮깁니다.다음으로, 해부 현미경을 사용하여 대부분의 동물이 죽을 때까지 매시간 살아있는 동물과 죽은 동물의 수를 측정합니다. 마지막 단계는 산화 스트레스 저항성 분석을 수행하기 최소 6일 전에 모든 조건에 대해 각 시간대별로 생존한 동물의 백분율을 계산하는 것입니다. modified young grins only bact PEPIN 또는 MYOB 건조 혼합물을 준비하여 MYOB 배지를 만들고, 흔들어 잘 섞습니다.1리터의 MYOB 배지를 준비하려면, 6g의 MYOB 건조 혼합물을 17g의 agar와 혼합한 후 H2O를 사용하여 1리터로 맞추고 122°C에서 45분 동안 오토클레이브 멸균합니다. 멸균 기술을 사용하여 MYOB 배지를 플레이트에 붓고 실온에서 이틀 동안 건조시킵니다. 100mL의 LB broth 배지에 e coli, OP 50 박테리아를 접종하고 37°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날 사용합니다.E coli OP 50 박테리아를 MYOB 플레이트에 접종하고 실온에서 48시간 동안 배양합니다. RNA 간섭을 통해 유전자 억제를 수행하는 경우에는 M-Y-O-B-R-N-A-I 공급 플레이트를 준비하는 것으로 절차를 시작하십시오. 오토클레이브 처리 후, MYOB 배지를 약 55 °C까지 식힙니다.그 다음, isopropyl beta D one thito peroxide(IPTG)와 ampicillin을 MYOB 배지에 첨가합니다. 플레이트를 부어 실온에서 이틀 동안 건조시킨 후, ampicillin과 tetracycline이 함유된 한천 배지에 E coli HT one 15 박테리아를 스트리킹합니다.한 균주는 대조군 공벡터(empty vector 또는 ev)를 발현하는 플라스미드로 형질전환되었습니다. 다른 균주는 FOLLIN 1을 표적으로 하는 이중 가닥 RNA를 발현하는 플라스미드로 형질전환되었습니다. Mr.NA를 37°C에서 하룻밤 동안 배양한 후 다음 날 사용합니다.콜로니를 선택하여 암피실린이 포함된 LB 배지에 접

measuring-oxidative-stress-resistance-caenorhabditis-elegans-96-well

Research

연구

JoVE Journal

Biology

생물학

이 프로토콜에서 우리는 측정하는 방법을...

측정 Caenorhabditis 엘레간스</em96 웰 플레이트에 Microtiter> 수명

이 동영상은 급성 독성 치료법을 테스트하거나 독성 상태에 대한 내성을 위해 유전적 균주를 테스트하는 단기 생존 분석을 소개합니다. 예제 프로토콜은 파라콰트(PQ)에 의해 유발된 산화 스트레스에 저항하는 기생충의 능력을 테스트하는 생존 분석의 예를 보여줍니다.

C. 예쁜꼬마선충 생존 분석: 단기 독성 테스트

이 동영상은 박테리아 균주의 산화 스트레스 반응을 평가하기 위해 맞춤화된 스폿 플레이트 분석을 보여줍니다. 일부 균주는 항산화 색소인 피오멜라닌(pyomelanin)을 생성합니다. 반대로, 시험제로 처리되어 피오멜라닌 생산이 감소한 균주는 산화 스트레스에 대한 민감성이 증가하여 피오멜라닌 생성 균주에 비해 세포 생존력이 감소합니다.

박테리아 균주에서 산화 스트레스 반응을 평가하기 위한 Spot Plate Assay

여기 우리는 빠르게 잘 당 Caenorhhabditis 선 충 의 일관 된 번호 96 잘 문화 접시 선 충 성장 미디어 agar의 수백을 생산에 대 한 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 이러한 문화는 전체 생물의 phenotypic 심사에 대 한 유용 합니다. 우리는 여기 화면 화학 물질에 이러한 culture를 사용 하 여 프로 장 수 효과 초점.

꼬마 선 충 에서 높은 처리량 화학 심사 하는 간단한 방법

이 프로토콜에서는 고체 미디어 꼬마 선 충 의 대규모 재배 하는 방법을 설명합니다. 액체 문화 하는 대신,이 프로토콜 플레이트 기반 재배 아래 다른 비늘의 매개 변수를 얻기 수 있습니다. 액체와 고체 미디어 문화 형태학 및 대사 차이 생략 하 여 결과의 comparability를 늘어납니다.

꼬마 선 충의 대규모 재배 플레이트 기반: 당뇨병에서 대사 변경의 연구에 대 한 샘플 준비

미토 콘 드리 아 호흡은 중요 organismal 생존; 따라서, 산소 소비 속도 미토 콘 드리 아 건강의 훌륭한 지표 이다. 이 프로토콜에 기저 측정 하는 상업적으로 사용할 수 있는 respirometer 사용 하 여 설명 하 고 최대 산소 소비 속도에 라이브, 그대로, 그리고 자유롭게 운동 꼬마 선 충.

그대로 꼬마 선 충 에 산소 소비 속도의 측정

선 충 류 꼬마 선 충 호스트 병원 체 상호 작용을 해 부에 우수한 모델입니다. 여기에 설명 된 멤버 mitis 그룹 streptococci와 웜 감염 유 기체의이 그룹에 의해 생산 H2O2 에 대 한 산화 스트레스 반응의 활성화를 결정 하는 프로토콜이입니다.

산화 스트레스는 Mitis 그룹 Streptococci 꼬마 선 충 에 의해 발생 하는 공부

여기서, 우리는 선충 C. 예쁜꼬마선충에서 세포 단백질 독성 스트레스 반응을 형광 전사 기의 활성화를 측정하고 생리적 스트레스에 대한 감수성을 측정하여 특성화한다.

C. Elegans의 생리적 스트레스 반응 측정

여기서, 표준화된 프로토콜은 분자 수준에서 RT-qPCR을 이용하여, 세포 수준에서 형광 기자, 유기체 수준에서의 열회수를 사용하여 Caenorhabditis elegans에서 열 충격 반응(HSR)의 유도를 평가하기 위해 제시된다.

Caenorhabditis elegans의 열 충격 반응 유도를 측정하는 표준화된 방법

장내 미생물은 특정 또는 보존 메커니즘을 통해 숙주의 건강에 긍정적 또는 부정적 영향을 미칠 수 있습니다. Caenorhabditis elegans 는 그러한 미생물을 스크리닝하는 편리한 플랫폼입니다. 본 프로토콜은 웜 건강의 대용으로 사용되는 선충 스트레스 저항성에 미치는 영향에 대한 48개의 박테리아 분리주의 고처리량 스크리닝을 설명합니다.

Caenorhabditis elegans 건강에 영향을 미치는 미생물 분리물의 고처리량 스크리닝

Caenorhabditis elegans는 건강, 수명 및 스트레스에 대한 탄력성을 조사하기위한 강력하고 저렴한 방법을 갖춘 우수한 모델 시스템 역할을합니다.

Caenorhabditis elegans의 수명과 건강 상태를 측정하기위한 저비용 방법 조사

배우세요 C. elegans의 산화 스트레스 저항성을 96웰 마이크로타이터 플레이트를 사용한 액상 분석법으로 측정하는 방법을. 이 프로토콜은 생존율 평가를 통해 산화 스트레스 메커니즘 연구에 활용됩니다.

의 산화 스트레스 저항을 측정

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