말 건 병증에 골수 중간 엽 줄기 세포를 레이블 테크네튬 99m의 생체 ​​이미징 및 추적에서

본 프로토콜의 전반적인 목표는 감마 신티그래피를 통해 골수 유래 중간엽 줄기세포를 표지한 후 주입하여, 이들의 분포와 운명을 비침습적으로 추적하는 것입니다. 주입 후 줄기세포의 운명에 대해서는 아직 알려진 바가 적습니다. 이 기술의 주요 장점은 투여 후 여러 장기로 이동하는 줄기세포를 비침습적으로 추적할 수 있다는 점과, A osteo의 짧은 반감기 덕분에 48시간 이내에 제거된다는 점입니다.

이러한 방식은 자연 발생적으로 발생하는 건병증 치료에 있어 줄기세포 활용에 대한 통찰을 제공해 왔으나, 뼈 및 심장 질환 치료 연구에도 활용될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 연구자가 겪는 어려움은 세포의 배양 조정, 라벨링을 위한 세트 준비, 그리고 환자의 배치 설정입니다. 세포를 즉시 적용하려면, 먼저 고정된 사지에 초음파 접촉 젤을 도포하고 선형 탐촉자를 사용하여 전체 수장 중수골 부위를 체계적으로 스캔함으로써, 일련의 횡단 및 종단 영상을 얻어 최대 손상 부위를 식별하십시오.

국소 마취제 투여 후, 이식 부위를 클로르헥시딘 외과용 세정액으로 최소 5분 동안 문질러 닦고, 에탄올에 적신 거즈로 닦아냅니다. 동물의 준비가 완료되면 장갑을 착용하고, 원심분리를 통해 1 mL의 골수 상층액에 포함된 1 × 10⁷개의 골수 중간엽 줄기세포 분획을 펠렛화합니다. 그런 다음 18 또는 19 gauge 바늘이 장착된 2 mL 주사기로 상층액을 흡입하며, 튜브에 약 100 µL의 용액을 남깁니다.

상청액을 얼음 위에 놓인 마이크로 원심분리 튜브로 옮긴 후, 손가락으로 가볍게 튕겨 남은 100 µL의 상청액에 세포를 다시 현탁합니다. 이때 세포가 완전히 현탁되었는지, 눈에 보이는 조직 덩어리가 없는지 주의 깊게 확인하십시오. 그 후 세포를 실온에 둡니다.

이제 1 mL의 technetium pertechnetate를 HMPAO가 담긴 바이알에 혼합하십시오. 5분 후, 1 mL 주사기와 바늘을 사용하여 mesenchymal stem cells에 TECHNETIUM 99m-HMPAO 분액 전체를 처리하십시오. 그런 다음 튜브의 캡을 닫고, 튜브를 가볍게 튕겨 세포를 혼합한 후 납 차폐막 뒤의 상온에 튜브를 두십시오.

30분 후, 포셉으로 튜브를 열고 21 gauge 바늘이 장착된 1 mL 시린지를 사용하여 세포에 PBS 1 mL를 추가합니다. 튜브 뚜껑을 닫고 세포를 혼합합니다. 다음으로, 세포를 원심분리하고 2 mL 시린지를 사용하여 상층액을 'wash one'이라고 표시된 차광 튜브로 조심스럽게 옮깁니다.

그런 다음 방금 시연한 것과 같이 PBS 1 mL로 펠렛을 세척하십시오. 두 번째 세척 후, 해당 세척액을 W2라고 표시된 차폐 튜브로 옮깁니다. 잔류 PBS 내에서 세포를 충분히 재현탁하고, 트랜스듀서를 바늘과 평행하게 유지한 상태에서 얼음처럼 차가운 골수 상청액 분주액을 첨가합니다.

1.5 또는 2인치 길이의 20 gauge 바늘을 병변 중심의 최대 손상 부위에 세로 방향으로 천천히 삽입합니다. 다음으로, 적절한 차폐물을 사용하여 20 gauge 바늘이 장착된 2 mL luer lock 주사기로 세포를 흡입하고, 액체가 손실되지 않도록 주의하며 바늘을 폐기합니다. 주사기를 힘줄에 미리 배치한 바늘에 연결한 후, 조직 내 바늘의 경로가 명확하게 보이도록 초음파 프로브를 바늘 아래에 배치하고, 병변 내로 세포를 느리지만 일정한 속도로 주입합니다.

모든 세포가 투여되었을 때, 병변으로 분사되는 액체가 초음파 이미지 상에서 고에코성 공기 방울을 포함한 고에코성 액체로 보이는지 확인한 후 바늘을 제거하십시오. 프로세싱 소프트웨어의 study selection 및 bone static 옵션을 사용하여 각각 60초 동안 정지 영상을 획득하십시오. 다음으로, 지정된 시간에 병변 부위, 수근관절부터 말단 부위까지, 반대측 사지의 해당 부위, 왼쪽 폐 영역 및 왼쪽 갑상선을 측면에서 촬영하십시오.

그런 다음 관심 영역(ROI) 및 타원 도구를 선택하고, 병변 부위에 맞게 선택 마스크의 모양을 적절히 조정합니다. 마지막으로, 두 가지 통계 추가 옵션을 선택하여 관심 영역의 수치를 얻습니다. 이때 서로 다른 시점에서 각 동물에 대해 동일한 크기의 관심 영역이 기록되도록 주의하십시오.

병변 내 투여 후, 세포는 시간이 경과함에 따라 주변 건 조직으로의 확산이 제한적인 국소 신호 영역으로 관찰될 것입니다. 이와 대조적으로, 수지 디지털 팔머 정맥(digital Palmer vein)을 통한 국소 관류로 세포를 투여하면 주사 부위에서 신호가 점진적으로 감소하는 것이 관찰됩니다. 시간이 지나면 일반적으로 병변 내 주사 후 폐 영역에서는 음성 반응이 나타나지만, 초기 시점에는 때때로 시간이 흐를수록 더 광범위해지는 매우 국소적인 신호가 검출될 수 있습니다.

이 투여 경로에서도 갑상선은 음성으로 유지됩니다. 국소 관류 또한 폐에서 국소적인 신호를 나타내며, 이는 시간이 지남에 따라 더 확산되지만, 그 신호는 병변 내 투여 경로에서 관찰된 것보다 훨씬 더 강합니다. 갑상선에서도 종종 국소 신호가 나타나므로, 주사 전 0시점의 세포 총 초기 방사성 동위원소 계수와 관심 영역의 초기 감마그램 계수를 확인합니다.

주입 후 0시점의 수치를 사용하여 주입 후 각 시점의 계수 감소율(%)을 계산함으로써, 초기 계수로부터 예측되는 TC 99 M의 붕괴 정도를 결정할 수 있습니다. 이를 통해 주입 후 각 시점에서 주입 부위에 남아 있는 세포의 잔존량 또한 계산할 수 있습니다. 이 절차를 통해, 중간엽 줄기세포의 발달 후 호밍(homing) 능력에 관한 추가적인 의문을 해결하기 위해 다른 세포 투여 경로를 적용할 수 있습니다.

이 기술은 지역 의학 분야의 연구자들이 건 부상 부위 내의 세포 유지력을 향상시키기 위한 방법을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청하고 나면, 세포를 라벨링하고 서로 다른 장기 시스템에서의 분포와 농도를 기록하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 전리 방사선을 사용하는 작업은 매우 위험할 수 있으므로, 이 절차를 수행하는 동안 개인 보호 장구, 방사선 모니터, 납 차폐와 같은 예방 조치 및 오염된 폐기물의 적절한 처리가 필수적이라는 점을 잊지 마십시오.