Name: 소형 조직 배양 시스템에서 마우스 심장 밸브를 배양 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: 배우세요 소형 조직 배양 시스템(MTCS)을 이용한 마우스 심장 밸브 배양 방법을. 관류 챔버에서 승모판 또는 대동맥 판막을 배양하고 조직학 분석으로 생존율과 형태를 평가하는 이 기법은 심장 판막 생물학 연구에 활용됩니다.

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이 연구는 네덜란드 심장 재단(Dutch Heart Foundation)과 네덜란드 재생 의학 연구소(Netherlands Institute for Regenerative Medicine)의 지원을 받았습니다.

이 프로토콜은 동물 연구 윤리위원회의 LUMC 지침을 따른다. 악기 1. 준비, 문화 매체, 및 MTCS 참고 : 층류 후드에있는 모든 준비를 수행합니다. MTCS 관류 실, 버블 트랩 및 스탠드 리버 등. 2010 년 (11)에 설명되어 있습니다. <ol><li> 70 % 에탄올로 포셉 및 마이크로 가위를 소독. 멸균 타이로드의 버퍼 (130 mM의 염화나트륨, 5.4 밀리미터의 KCl, 6.0 mM의 헤 페스, 1.2 mM의 황산, 1.2 21G 바늘 5 ML의 주사기를 준비 mM의 KH 2 PO 4, 20 mM의 포도당, 1.5 mM의 염화칼슘 2 · 2H 2 O, 의 pH = 7.2). 무균의 KCl 용액 (100 mM의)와 21G 바늘 5 ML의 주사기를 준비합니다. </li><li> 65 심장 당 매체 ml의 준비 : (A /; 페니실린의 100 단위, 100 스트렙토 마이신의 μg의, 및 암포 테리 신 B의 0.25 UG / ㎖) DMEM 10 % 태아 송아지 혈청, 안티 곰팡이 / 항생제로 보충을, 인슐린 Transferrin-셀레늄 (ITS / ml의 인슐린 10 μg의 5.5 μg의 / ㎖ 트랜스페린, 6.7 NG / ㎖ 셀렌 산 나트륨) 및 필터 소독. </li><li> 70 % 에탄올 및 종이 타월 건조와 함께 분사하여 관류 챔버와 버블 트랩을 소독. 초기 관류 챔버없이 그러나 MTCS (도 1D)을 조립한다. 스탠드에 거품 트랩을 배치합니다. 쉬운로드 펌프 헤드와 연동 롤러 펌프를 사용합니다. <ol><li> 실리콘 튜브는 저수지 (50 ML 튜브) 및 펌프, 펌프와 버블 트랩 버블 트랩과 저수지 사이의 연결 (그림 1D 참조)를 만들어 사용. 매체는 가스 투과성 실리콘 호스 (1m)과 가능한 한 짧게 인큐베이터 외부 튜브를 통해 가스 배양기에서 가스와 평형에 도달 할 수 있도록 충분한 시간 동안 인큐베이터 안에 튜브를 만든다. </li></ol></li><li> (적절한 순환을 허용 / 1 ml의 주위 분의 흐름 속도를) 펌프를 켜, 70 % 에탄올로 50 ML 튜브를 입력하고 에탄올 CIR하자모든 튜브를 살균 30 분 동안 culate. 탱크를 비우고 시스템에서 에탄올을 펌핑하여 에탄올을 제거합니다. </li><li> 멸균 증류수로 50 ML 튜브를 입력 펌프를 켜고 30 분 동안 물 순환 에탄올 나머지 없애 보자. 탱크를 비우고 시스템에서 물을 펌핑하여 물을 제거합니다. </li><li> 매체의 45 mL를 50 ml의 튜브를 작성, 인큐베이터에있는 스탠드를 넣어. 펌프 (1 ml / 분의 주위의 흐름 속도)를 켜고 모든 튜브를 채우기 위해 매체를 순환, 모든 기포를 제거하고 배지는 적어도 1 시간 동안 배양기에서 가스 조성에 적응하도록 허용한다. 표준 조직 배양 조건 (5 % CO 2, 37 ℃로)에서 인큐베이터를 유지한다. 기포가 튜브에 존재하지 않는 것을 확인합니다. </li></ol> 마우스 심장의 2. 분리 <ol><li> 헤파린 500 단위와 마우스를 주입한다. 이는 응고로부터 혈액을 방지하고 (B)의 제거를 허용 할 것이다마음에서들 (100d). 10 분 후, 정밀 증발기를 이용하여 4 % 이소 플루 란 유도 챔버에 마우스를 마취. 마우스가 발가락 핀치에 응답하지 않는 경우 마취는 충분하다. </li><li> 해부 보드에 마우스를 전송하고, 동축 회로에 접속 보호구 통해 마취를 유지한다. 70 % 알코올로 마우스의 모피를 소독. 가위 복강을 열고 사용하면 대정맥과 다이어프램을 노출. </li><li> 심장을 노출 마지막에서 첫 번째 갈비뼈에 시작 횡 절개를하고 마우스의 머리 흉부 케이지를 반영합니다. 마우스가 더 이상 숨을 쉬지으로 마취를 중지합니다. 심장 박동을 관찰한다. </li><li> (다이아 프램을 통해) 흉강으로 복부에서 하대 정맥에 살균 타이로드의 버퍼를 포함하는 5 ML의 주사기에 부착 된 21G 바늘을 삽입합니다. 혈액이 바늘 삽입의 대정맥에 꼬리를 종료 할 수 있는지 확인합니다. 제 관류전자 타이로드의 버퍼 부드럽게과 대정맥에 일정한 압력으로 심장이 부분적으로 붉은 색을 잃을 때까지. 참고 : 심장은 심장에서 혈액의 제거를 허용 치는 남아있다. </li><li> 무균의 KCl 솔루션을 포함하는 5 ML의 주사기에 부착 된 21G 바늘과 바늘을 교체합니다. 조심스럽게 심장이 박동을 멈출 때까지 대정맥에의 KCl 용액을 관류하고 바늘을 제거합니다. 참고 : KCl을 솔루션은 관상 시스템의 쉽게 관류 바늘의 삽입 및 관류를 허용 편안한 확장기의 마음을 유지합니다. </li><li> 약간 곡선 집게를 사용하여 마음을 들어 올려 사용하는 가위는 심장 손상과 심장에 부착하는 근위부 동맥과 정맥을 주변 조직에서 무료로 심장을 해부 그러나 둡니다. 얼음처럼 차가운 PBS는 항진균제 / 항생제 (/)로 보충이 포함 된 15 ML 튜브에 마음을 전송합니다. 최대 3 시간 동안 얼음처럼 차가운 PBS의 마음을 보관합니다. </li></ol> 3. Cannulatio관류 상공 회의소에서 마우스 마음의 N <ol><li> 층류 후드의 모든 절차를 수행합니다. 10cm 페트리 접시에 15 ML 튜브에서 격리하는 마음을 전송하고 추가 PBS는 A / 보충. </li><li> 해부 현미경, 모든 비 심장 조직을 제거하는 미세 가위와 집게를 사용하지만 상행 대동맥을 보존 마음에 팔 머리 동맥과 폐동맥 혈관, 2mm의 기부와 최소한 분기에. 좌심실 내강 (일반적으로 2mm)에 대한 액세스를 만드는 마음의 정점의 끝을 잘라. 해부 현미경 흐름 후드에서 재관류 챔버를 놓습니다. </li><li> 실리콘 튜브를 사용하여 삽입 바늘 매체 5 ML의 주사기를 연결합니다. 20 ㎖ 매체와 관류 챔버를 입력하고 관류 챔버에서 2 무딘 바늘 (그림 1) 사이에 회전 무대에서 마음을했습니다. 심장이 앞에 위치하도록 회전 스테이지의 높이를 조절바늘. </li></ol> 승모판을 배양 4. 결찰 (그림 1 참조) <ol><li> 봉합사 (실크 7.0)과 대동맥을 결찰. 봉합 좌심방을 결찰. 좌심방에 폐정맥을 통해 (그림 1. 1 NR) 바늘을 삽입하고 좌심방에서 해당 항목에 봉합 근위부와 결찰. 이 승모판 막에 손상을 하듯이 바늘이 좌심방으로 너무 멀리 있지 않은지 확인하십시오. </li><li> 좌심실로 직선 운동으로 바늘 (그림 1 nr.2)를 삽입합니다. 50 ㎖ 튜브에 관류 챔버로부터 전송 매체. 생체 접착제와 심근에 바늘을 밀봉합니다. </li><li> 접착제가 건조 후, 신중하게 nr.1 바늘과 누출이 있는지 확인하기 위해 매체 채워진 주사기를 연결하여 마음에 매체를 주입. 바늘 nr.2 마지막 남은 혈액이 심장에서 관류되어에서 해당 매체 종료를 확인합니다. </li></ol> 5. 리대동맥 판막을 배양 gation (그림 1 참조) <ol><li> 대동맥의 바늘 (그림 1 nr.1)를 삽입하고 봉합 결찰. 이 대동맥 판막을 손상하는 것처럼 바늘이 대동맥으로 너무 멀리 있지 않은지 확인하십시오. 좌심실로 직선 운동으로 바늘 (그림 1 nr.2)를 삽입합니다. 50 ㎖ 튜브에 관류 챔버로부터 전송 매체. 생체 접착제와 심근에 바늘을 밀봉합니다. </li><li> 접착제가 건조 후, 신중하게 nr.2 바늘과 누출이 있는지 확인하기 위해 매체 채워진 주사기를 연결하여 마음에 매체를 주입. 바늘 nr.1 마지막 남은 혈액이 심장에서 관류되어에서 해당 매체 종료를 확인합니다. </li></ol> 스탠드에 6. 관류 상공 회의소 <ol><li> 매체를 옮겨 20 mL를 관류 챔버를 입력합니다. 챔버에 가스켓 및 뚜껑을 놓고 세탁기와 나사로 조입니다. </li><li> incuba에서 조립 MTCS 제거터. 스탠드에 재관류 챔버를 연결합니다. 튜브를 연결합니다 (그림 1D 참조). 인큐베이터 (5 % CO 2, 37 ℃로)에 스탠드를 놓습니다. 펌프에 튜브를 연결합니다. 600 μL / 분 주위에 흐름 속도와 펌프의 전원을 켭니다. </li><li> 저장 및 / 또는 기포 트랩 매질의 레벨이 수신 매체 방울의 하강에 의해 흐름의 존재의 시각화를 허용하는지 확인. 배양 후, 심장, 시스템으로부터 제거 고정 조직 학적 검사를 위해 처리된다. </li></ol>

<ol><li>Go, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+Disease+and+Stroke+Statistics--2014+Update%3A+A+Report+From+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Heart Disease and Stroke Statistics--2014 Update: A Report From the American Heart Association.</a> Circulation. 129, e28-e292 (2013).</li>
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<li>Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF%CE%B2+and+BMP+signaling+in+cardiac+cushion+formation%3A+lessons+from+mice+and+chicken%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+research+in+biological+diversity%22%5BJournal%5D)">TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken.</a> Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).</li>
<li>Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+of+a+miniature+tissue+culture+system+to+culture+mouse+heart+valves%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves.</a> Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).</li>
</ol>

저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.

심장 마우스 밸브를 배양에서 중요한 단계는 흐름의 적절한 방향을 보장하기 위해 마우스에서 심장 절제 밸브에 수직 바늘의 생존과 라이 게이션을 위해 가능한 한 짧은 관류 챔버에서 결찰 사이의 시간을 포함 . 또한, 매체없이 관류 챔버에서 결찰 후 흐름을 확인하는 것은 적절한 삽입 및 바늘의 결찰을 보장합니다. 그것은 멸균 문화를 유지하고 잠재적으로 흐름을 방해 마음에 갇혀 얻을 수있는 튜브에 공기 방울을 방지하는 것이 중요합니다. 심장의 재관류에 사용되는 매체의 총 부피가 45 ml 인 것을 (심장을 통해 관류 매체 관류 챔버에서 매질의 20 ㎖에 접촉하지 않는다). 예는 작은 볼륨에 대한 바이러스의 추가가 바람직 할 수있다. 일시 저장조 (및 배관의 일부) 회로 (L)로부터 제거 될 수있다시스템 5-7 mL로 eaving 것은 밸브의 감염을 허용한다. 심장의 박동의 부재는 제한이 고려 될 수있다. 그러나, 전단 작업 모든 자...

심장 판막 질환은 서구 세계에서 이환율과 사망률의 주요 원인이다 그 유병률은 연령에 따라 증가하며 75년 인구의 10 % 이상 및 1 이전에 영향을 미친다. 마음의 전신 부분의 밸브는, 대동맥 및 승모판 밸브는 주로 영향을받습니다. 심장 판막 질환 (2)의 기계적 특성 변화를 초래 밸브의 고도로 조직화 구조의 손실을 특징으로한다. 구조적 완전성은 밸브의 기능에 따라서 중요하다. 밸브의 전단지는 판막 간질 세포 (VIC), 판막 내피 세포 (VEC), 고도로 계층화 된 패턴 3,4으로 구성되어 세포 외 매트릭스로 구성되어있다. VIC를은 전자 재료 합성, 분해 및 조직에 대한 책임이 있습니다. 요인은 혈액, 내장 컴퓨터에서 나오는 또는 그 기능을 조율 VIC를에 ECM 행위에 거주. 또한,기계적 힘은 층류 또는 진동형 전단 응력, VIC를도 5의 동작에 영향을주는 압축 또는 인장 응력을 초래 심장주기 동안 전단에 작용. 밸브의 구조를 조절하는 방법을 이해하기 위해서는, 먼저 VIC를가 심장 사이클 동안 경험 한 자극의 다양한 세트에 응답하는 방법을 이해하여야한다. 시험 관내 연구 판막 세포의 특성 및 능력에 대한 매우 유익한왔다. 시험관 내에서 이들 세포의 반응은, 그러나 항상 정확하게 생체 반응 6을 흉내낼 수있다 예를 들면, 자극에 VIC의 반응의 EC의 존재 및 ECM의 조성 5에 따라 달라진다. 더욱이, 자극 판막 세포의 반응은 전단 7에 특정 위치에 달려있다. 생화학 적 자극에 더하여, 판막 셀의 동작은 O 작용 기계적 힘에 의해 결정된다N 밸브 (8). 밸브의 각 지역은 혈역학 적 스트레스의 고유의 세트 실시한다. 현재 생체 모델은 기계적인 힘이 판막의 구조 (5)의 중요한 결정 요인임을 보여 주었다 있지만, 관련 메커니즘은 아직 불분명하다. 생체 내 모델은 판막 개발 9,10의 기초가되는 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고 있지만, 성인 판막 생물학에 대한 통찰력은 여전히 애매하다. 따라서, 생체 외 유동 모델되는 심장 밸브는 11 시간의 연장 된 기간 동안 심장에 자연스러운 위치에서 배양 될 수 개발되었다. 이는 밸브가 구성 천연 유지와 VIC를 최대한 자연스러운 VIC를 자극에 반응을 생체 내와 같은 환경을 경험할 수있는 장점을 갖는다. 또한, 마음에 그들의 자연적인 위치에있는 밸브의 문화는 각 쓰는 용이관련 혈역학 적 스트레스에 판막 지역. 즉,이 생체 모델에서, 소형 조직 배양 시스템 (MTCS)는, 밸브는 심장 밸브 리모델링에서의 역할의 조사를 허용하는 다른 생화학 적 및 혈역학 적 자극에 노출 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>둘베코' s Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>10569-010</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technologies</td><td>26140</td><td></td></tr><tr><td>인슐린-트랜스페린-셀레늄</td><td>Life Technologies</td><td>41400-045</td><td></td></tr><tr><td>항생제-항진균</td><td>Life Technologies</td><td>15240-06</td><td></td></tr><tr><td>실크 7-0</td><td>Ethicon</td><td>768G</td><td></td></tr><tr><td>100mm 배양 접시</td><td>Greiner 바이오 원</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>50ml 튜브</td><td>Greiner 바이오 원</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>5ml 주사기</td><td>BD</td><td>309649</td><td></td></tr><tr><td>21G 바늘</td><td>BD</td><td>304432</td><td></td></tr><tr><td>헤파린</td><td>LEO</td><td>012866-08</td><td></td></tr><tr><td>집게</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11295-00</td><td></td></tr><tr><td>마이크로 가위, 경제, Vannas-type</td><td>Tedpella</td><td>1346</td><td></td></tr><tr><td>실리콘 튜빙</td><td>Thermo Scientific</td><td>8060-0020</td><td>I.D. x O.D. x 벽: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm</td></tr><tr><td>펌프용 실리콘 튜빙</td><td>Masterflex</td><td>96400-13</td><td>I.D. x O.D. x 벽: 0.8 x1.59 x 0.40 mm</td></tr><tr><td>생체 적합성 접착제 (Histoacryl)</td><td>B. Braun</td><td>1050071</td><td></td></tr><tr><td>정밀 기화기</td><td>Dr&auml; ger</td><td>Vapor 200</td><td></td></tr><tr><td>연동 롤러 펌프</td><td>Masterflex</td><td>7521-35</td><td></td></tr><tr><td>이지 로드 펌프 헤드</td><td>Masterflex</td><td>7518-00</td><td></td></tr><tr><td>플로우 챔버</td><td></td><td></td><td>Lieber et al., 2010</td></tr><tr><td>버블 트랩</td><td></td><td></td><td>Lieber et al., 2010 참조</td></tr></tbody></table>

소형 조직 배양 시스템에서 마우스 심장 밸브를 배양

Culturing Mouse Cardiac Valves in the Miniature Tissue Culture System

심장 판막 질환은 서구 세계에서 큰 부담이며 효과적인 치료법이 없습니다. 이는 주로 판막 구조의 유지 및/또는 손실의 기저에 있는 분자, 세포 및 기계적 메커니즘에 대한 지식이 부족하기 때문입니다. 
판막 생물학을 연구하는 데 사용되는 현재 모델에는 판막 내피 및 간질 세포의 체외 배양이 포함됩니다. 체외 배양 모델은 세포 및 분자 메커니즘을 모두 제공하지만 판막의 3D 조직과 관련된 메커니즘은 불분명합니다. 생체 내 모델은 판막 발달의 기저에 있는 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 제공했지만, 성인 판막 생물학에 대한 통찰력은 여전히 파악하기 어렵습니다. 
조직, 세포 및 분자 수준에서 판막 3D 조직의 조절을 연구할 수 있도록 우리는 미니어처 조직 배양 시스템을 개발했습니다. 이 체외유동 모델에서는 승모판 또는 대동맥 판막이 심장의 자연스러운 위치에서 배양됩니다. 첨판의 자연스러운 구성과 구성이 유지되어 판막 세포가 자극에 가장 자연스럽게 반응할 수 있습니다. 밸브는 실행 가능한 상태를 유지하며 변화하는 환경 조건에 반응합니다. 이 MTCS는 3D 조직이 판막 생물학에 어떤 영향을 미치는지, 어떤 요인이 판막의 3D 조직에 영향을 미치는지, 어떤 신호 경로 네트워크가 판막의 3D 조직을 조절하는지 등을 포함하되 이에 국한되지 않는 질문을 연구하는 데 이점을 제공할 수 있습니다.

대동맥 판막 (그림 2) 또는 승모판 막 (11)은 최소 3 일 동안 배양 할 수있다. (대동맥판과 승모판 대한 확장기의 총수에 대한 수축기 위치를 나타낸다)가 개방 위치에서 배양함으로써, 판막 세포 생존 유지. TUNEL 양성 세포 (도 2H, I) 또는 절단 된 카스파 제 -3 발현의 부재에 의해 결정된 어떠한 세포 사멸이 관찰되지 않는 (도시되지 리버 외., 2010 (11)). (AS의 메이슨 트리 크롬 염색으로 시각화)의 콜라겐 분포는 1 % 혈청 (도 2D, E)에서 배양 기본 조건과 유사하다. 밸브는 배양 조건의 변화에​​ 응답한다. 두꺼운 전단에서 10 %의 결과 (도 2c)에 혈청의 양을 증가시킨다. 또한, 투명한 콜라겐없는 영역이 대동맥 벽에 부착 근처 전단지의 심실 측면에서 관찰된다 (그림 2 층에 화살...

여기에서는 쥐의 심장 판막을 배양할 수 있는 생체 외 흐름 모델을 제시하여 판막의 생물학을 연구할 수 있습니다.

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 초소형 조직 배양 시스템(miniature tissue culture system, MTCS)을 사용하여 생쥐의 심장 판막을 배양하는 것입니다. 먼저 관류 챔버 없이 MTCS를 조립하고 배지를 순환시켜 시스템을 사전 처리합니다. 두 번째 단계에서는 생쥐의 심장을 적출하여 캐뉼라 삽입을 위한 준비 과정을 거칩니다.다음으로, 심장을 관류 챔버에 넣고 승모판 또는 대동맥판 배양을 위해 캐뉼라를 삽입합니다. 그 후 관류 챔버를 MTCS에 배치하고 펌프를 작동시킵니다. 최종적으로, 조직학적 분석을 통해 판막의 생존력, 형태 및 세포외 기질 분포를 평가합니다.먼저 실리콘 튜브 조각을 사용하여 리저버와 펌프, 펌프와 버블 트랩, 그리고 버블 트랩과 리저버 사이를 연결합니다. 모든 튜브 연결이 완료되면 리저버에 70% ethanol을 채웁니다.펌프를 분당 1mL의 유속으로 가동하여 에탄올을 순환시켜 튜브를 멸균합니다. 30분 후, 저장조를 비우고 시스템 내의 에탄올을 펌프로 배출합니다. 다음으로, 저장조에 멸균 증류수를 채우고 시스템에 물을 펌핑하여 잔류 알코올을 제거합니다.그 다음 물을 다시 펌프로 배출하고, 갓 조제한 배지 45 milliliters를 저장조에 채웁니다. 배지를 순환시켜 모든 튜브를 채우고, 표준 조직 배양 조건의 인큐베이터 내 가스 조성에 배지가 적응할 수 있도록 최소 1시간 동안 둡니다.마우스 심장을 분리하려면, 먼저 동물에게 heparin 500 units를 복강 내(ip)로 주사하십시오. 10분 후, 마우스를 해부판 위에 놓고 발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 적절한 마취 수준을 확인하십시오. 70% ethanol로 털을 소독한 다음, 가위를 사용하여 복강을 열고 대정맥(vena cava)과 횡격막을 노출시켜 심장을 시각화하며, 갈비뼈 하단에서 시작하여 상단에서 끝나는 측면 절개를 실시하십시오.그 다음 흉곽을 동물의 머리 쪽으로 젖혀 심장이 뛰는 것을 관찰하십시오. 이어서 멸균 tyros 완충액이 담긴 5 mL 주사기에 21 gauge 바늘을 연결하여, 복강에서 흉강 방향으로 횡격막을 통해 하대정맥에 삽입하십시오. 하대정맥에서 바늘 삽입 지점을 통해 혈액이 배출될 수 있는지 확인한 후, 심장의 붉은색이 부분적으로 사라질 때까지 완충액을 하대정맥으로 천천히 일정한 압력으로 관류하십시오.이제 완충액이 든 주사기를 5 mL의 멸균 염화칼륨 용액으로 교체하고, 심장

culturing-mouse-cardiac-valves-in-the-miniature-tissue-culture-system

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

이 비디오에서는 성인 마우스의 심장에서 대동맥 판막 간질 세포를 2단계 콜라겐분해효소 절차를 사용하여 분리하고 이후 소량의 성장 배지에서 배양하는 방법을 보여줍니다.

Isolation of Mouse Valve Interstitial Cells: 마우스 대동맥 판막에서 VIC를 분리하고 배양하는 효소 방법

이 비디오는 in vitro에서 대동맥 판막 간질 세포의 석회화를 평가하기 위한 분석 기술을 보여줍니다. 이 분석은 칼슘 이온과 반응하여 자주색 칼슘-비소 복합체를 형성하는 칼슘에 민감한 염료인 arsenazo III 시약을 사용하여 칼슘 농도를 정량화하는 데 도움이 됩니다.

대동맥 판막 간질 세포의 칼슘 농도를 측정하기 위한 석회화 분석

여기서 우리는 랑겐 관류 시스템을 사용하여 성인 마우스 된 심근의 분리에 대해 설명합니다. 얻어진 세포 + 내성 전기적 무부하 외 Ca2이며 배양 및 아데노 - 또는 유전자 발현을 조작하기 lentiviruses로 형질 감염 될 수있다. 그 기능 또한 MMSYS 시스템 및 패치 클램프 기술을 이용하여 분석 될 수있다.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

마우스 발달 연구는 임신 기간 동안 태아의 어려움에 의해 방해된다. 임신의 후반 단계에서 배아 심장의 장기 문화를 촉진하기 위해, 우리는 절제 마음이 반 고체, 희석 리겔에 배양되는 프로토콜을 개발했다.

소설<em&gt; 생체</em배아 마우스 사랑을&gt; 문화 방법

우리는 성인 마우스 심근의 분리를 위해 신뢰할 수있는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 유전자 변형 마우스의 다양한 기능에서 성인 심근의 문화에 대한 일관성있는 결과를 얻을 수 있습니다.

분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의<em&gt; 시험관</em&gt; 심장 비대

조직 공학 심장 판막에 neotissue 형성 및 협착증 개발을 기초 세포 및 분자 메커니즘을 이해하기 위해, 이소성 심장 판막 이식 뮤린 모델이 개발되었다. 폐동맥 판막은 이소성 심장 이식 기술을 사용하여 수신자에게 이식 하였다.

이소성 심장 이식 마우스 모델을 사용하여 폐동맥 판막 이식

심장 판막 내피 세포(VEC)를 분리하는 능력은 판막 발달, 유지 및 질병의 메커니즘을 이해하는 데 매우 중요합니다.  여기에서는 FACS를 사용하여 배아 및 성인 Tie2-GFP 마우스에서 VEC를 분리하는 방법을 설명하며, 이를 통해 발달 및 질병 과정에서 VEC의 기여도를 결정하는 연구를 수행할 수 있습니다.

쥐과 밸브 내피 세포의 분리

이 프로토콜은 높은 수율, 순도 및 생존력을 가진 성체 마우스 심근세포의 재현 가능한 분리 및 장기 배양을 위한 단계별 방법을 설명합니다.

격리, 문화 및 성인 마우스 심근 세포의 형질 도입

관상 동맥 혈관신생의 시험관내 모델은 관상 동맥 혈관신생의 세포 및 분자 기전의 발견을 위해 이용될 수 있다. 부비동 및 심내막 조직의 체외 배원 배양은 VEGF-A에 반응하여 견고한 성장을 나타내고 생체 내에서와 같이 COUP-TFII 발현의 유사한 패턴을 표시한다.

관상 동맥 혈관 신생의 체외 모델

여기서, 우리는 성인 마우스와 쥐 심근세포의 격리, 형질 전환 및 장기 문화에 대한 프로토콜을 제시합니다.

성인 마우스및 쥐 심근세포의 격리, 트랜스페션 및 장기 문화

이 문서에서는 2단계 콜라게나아제 절차에 의한 마우스 대동맥 판막 세포의 분리에 대해 설명합니다. 격리된 마우스 밸브 세포는 체외 석회화 분석과 같은 상이한 분석체를 수행하고 대동맥 판막 광물화로 이어지는 분자 경로를 조사하는 데 중요합니다.

시험관 내 대동맥 판막의 석회화를 연구하기 위해 마우스 간막판 세포의 격리

배우세요 소형 조직 배양 시스템(MTCS)을 이용한 마우스 심장 밸브 배양 방법을. 관류 챔버에서 승모판 또는 대동맥 판막을 배양하고 조직학 분석으로 생존율과 형태를 평가하는 이 기법은 심장 판막 생물학 연구에 활용됩니다.

소형 조직 배양 시스템에서 마우스 심장 밸브를 배양

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