Name: 인간 A53T를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 ELISA에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: 배우세요 ELISA를 이용하여 M83 형질전환 마우스 뇌에서 질병 관련 α-synuclein을 정량 분석하는 방법을. 중추신경계에서 단백질 축적과 전파를 신속하게 모니터링할 수 있습니다.

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저자는 예방 접종에 대한 데미안 가일 라드 감사 및 후속 동물 실험을하고 싶습니다. 이 작품은 ANSES (식품, 환경 및 산업 보건 및 안전을위한 프랑스 기관)에 의해 재단 프랑스 파킨슨에서 교부금에 의해 지원되었다.

모든 절차와 동물을 포함하는 프로토콜은 EC 지침 609분의 86 / EEC 및 오는, 동물 실험 (프로토콜 11-0043)에서 윤리의 고려에 대한 프랑스의 국가위원회의 비준을 따라했다. 동물 보관 및 ANSES의가 (0801 69387 승인 B) 리옹에 실험 시설을 승인에 마음에 든다고했다. 마우스 1. 준비 <ol><li> 펜토 바르 비탈 나트륨의 치사량의 복강 내 주사하여 마우스를 안락사. </li><li> 마우스 두개골에서 뇌 전체를 검색 및 추출까지 얼음에 35mm 플라스틱 페트리 접시에 넣습니다. </li><li> 자궁 경부 척수의 압축을 풉니 다. 참고 : 추출 αS 중 하나를 표 1에 나와있는 실험을 사용할 수 없습니다 시상 단면 후 또는 해부 마우스의 뇌에서 뇌 반쪽의 하나에서. </li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Experimen티 </td><td> 마우스 접종 (뇌에 해당) </td><td> 생존 기간 수 (dpi) </td><td> 중간 / 최대 생존 (일 이전) </td><td> 엘리사에 의해 D 감지 αS / WB / IHC </td></tr><tr><td> 1 </td><td> Uninoculated 마우스 </td><td> 441 ± 166 </td><td> 736분의 419 </td><td> 8/8 </td></tr><tr><td> (2) </td><td> 접종 한 마우스 (0.2 mg)을 </td><td> 150 ± 52 </td><td> 241분의 140 </td><td> 9/9 </td></tr></tbody></table> M83 마우스에서 수행 실험 표 1. 목록은. 예방 접종은 후, (포도당 1 % 중량 / 권 5 %) 아픈 마우스의 뇌 균질의 20 μL와 striato - 대뇌 피질의 영역에서 실험이 6 주에 실시 하였다 3 % 이소 플루 란 흡입 6 주 오래 된 동형 접합 M83 마우스의 마취. dpi로는 : 일 inocul 게시ATION. 뇌 반쪽 2. αS 추출 <ol><li> Sagittally 두 개의 반쪽을 얻기 위해 뇌를 잘라. 그라인딩 볼을 넣은 ribolysis 튜브에 각각 절반을 단다. </li><li> 에 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 750 mM의 염화나트륨, 5mM의 EDTA, 1mM의 DTT, 1 % 인산 및 프로테아제 저해제 칵테일을 함유 고염 (HS) 버퍼를 준비한다. 20 % (중량 / 부피) 균질를 얻기 위해 뇌의 절반에 높은 소금 버퍼를 추가합니다. </li><li> 6.0 M에서 기계 균질화를 사용하여 뇌의 반쪽에서 샘플을 준비 / S 23 초 동안 두 번. 첫 번째 23 초 균질화 한 후, 두 번째 23 초주기 전에 2 분 동안 얼음에 균질을 포함하는 튜브를 배치합니다. </li><li> 5 분 unground 뇌 조각을 제거하기 위해 1,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. 200 μL 씩에 분할 이후 ELISA 분석을 위해 -80 ° C에서 그들을 유지, 상층 액을 복구 할 수 있습니다. </li></ol> 해부 두뇌 지역에서 3 αS 추출 <ol><li> 해부끝 해마를 해부 할 때를 제외하고 함께 보관이 forcipes를 사용하여 낮은 전력 돋보기 (8 배 확대)와 얼음에 35mm 플라스틱 페트리 접시에 전체 뇌. 뇌의 무결성을 유지하기 위해 10 분을 초과하지 마십시오. 뇌를 놓고 바로 옆이 순서대로 다음과 같은 뇌 영역을 검색 : <ol><li> 단지 전구 뒤에 배치 집게를 사용하여 두 개의 후각 전구 별도의 하나. 아래쪽으로 이동에 의해 뇌에서 분리. 두 번째 전구에 대해이 작업을 반복합니다. </li><li> 조심스럽게 두 대뇌 피질 사이에 집게를 쐐기 두 대뇌 피질의 분리를 용이하게하기 위해 앞으로 이동합니다. 한 집게와 장소에 두뇌를 유지, 해마에서 대뇌 피질을 분리하는 또 다른를 사용합니다. </li><li> 집게에게 피질 아래 2mm를 놓습니다. 해마의 상단이 보일 때까지 집게에 부드러운 압력을 유지한다. 피질의 첫 번째 부분을 벗겨, 두 번째 부분 반복합니다. 두 개의 대뇌 피질을 분리 집게를 사용하여해마에서 시작하여 뇌의 앞쪽으로 이동. </li><li> 해마 중 하나 주위에 오픈 집게를 놓습니다. 부드럽게 최대한 복구, 제거 해마의 하단에있는 집게를 닫습니다. 두 번째 해마에 대해이 절차를 반복합니다. </li><li> 선조체의 하나 아래 열린 집게를 놓고 부드럽게 뇌에서 분리. 선조체에서 남아있는 피질을 제거하기 위해 집게를 사용합니다. 두 번째 선조체에 대해이 절차를 반복합니다. </li><li> 부드럽게 뇌에서 소뇌의 분리를 용이하게하기 위해 2mm 소뇌의 윤곽에 의해 우울하기 위해 집게를 사용합니다. 다만 소뇌 뒤에 집게를 놓고 앞으로 집게를 이동하여 제거합니다. </li><li> 이 뇌간에 가입되는 시점을 명확하게보기 위해 중뇌 인상 집게의 넓은 부분을 사용합니다. 교차점에서 수직 절개 후 뇌간을 제거합니다. </li><li> , 중뇌 뒤 집게를 배치하는 나는네 개의 둥근 구조로 구성 s의. 중뇌가 완전히 남아있는 뇌에서 분리 될 때까지 수직으로 절개. </li></ol></li><li> 가변 % HS 버퍼 (중량 / 부피), 가능한 조직의 양에 따라, 즉, 10 및 30 mg의 간 중량 5 % 파쇄, 30 및 80 mg의 간 중량 10 %, 및 20 %의 균질 준비 80 mg의 위의 무게. <ol><li> 균질 예상 %를 얻기 위해 해부 뇌 영역에 HS 버퍼의 적절한 볼륨. </li><li> 소용돌이와 조직을 완전히 고속 버퍼에 포장되어 있는지 확인합니다. </li><li> 붕규산 유리 튜브 및 두 방앗, 및 B. 이루어지는 조직 분쇄기로 해부 뇌 영역 또는 자궁 척수로부터 제조 된 샘플 균질화 </li><li> 튜브에 직접 분쇄 할 각 뇌 영역을 따르십시오. 튜브에 유봉을 삽입하고 철회. 조직을 떼어 놓다하기 위해이 운동을 약 10 회 반복한다. 그리고 C에 유봉 (B)를 사용상기 (20)의 움직임과 함께 조직 연마 ontinue. 1 ml의 전송 피펫 1.5 ML 튜브에 균질을 전송합니다. </li></ol></li><li> 어떤 unground 뇌 조각을 제거하기 위해 4 ℃에서 5 분 동안 1,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. , 상층 액을 검색 200 μL 씩에 그들을 분할 이후 ELISA 분석을 위해 -80 ℃에서 보관하십시오. </li></ol> ELISA에 의해 αS 4. 검출 <ol><li> 0.01 ng를 / ㎖으로 코팅 된 항체를 희석. 50 mM의 나 2 CO 3 / NaHCO3를 완충액 (pH 9.6)에 반 αS 토끼 폴리 클로 날 또는 단일 클론 클론 (42) 항체를 사용합니다. </li><li> 코트는 96 웰 마이크로이 코팅 용액을 잘 당 100 μL, 그리고 4 ° CO / N에 둡니다. 검출 항체를 사용하여 ELISA를 syn514 용 코팅 용액에 안티 αS 토끼 폴리 클로 날 항체를 사용하여 42 LB509, AS11, 4D6 또는 8A5 클론. 코팅 용액으로 안티 αS 모노클로 날 항체 클론 (42)을 사용하여항 pSer129 αS 검출 항체와 조합. 주 : 플레이트 ELISA 일주일 전에 4 ℃에서 유지 될 수있다 필요한 경우 수행된다. </li><li> 물론 당 0.05 % 트윈 20 (PBST)와 플레이트를 인산 완충 생리 식염수 300 μL로 5 회 씻어 접시 세척기를 사용합니다. 이후이 단계에서 배양 실온에 있습니다. </li><li> T20 PBS를 잘 당 버퍼를 차단의 200 μl를 추가합니다. 150 rpm에서 1 시간 동안 흔들어. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오. </li><li> (: 20 % 균질 100을, 10 %의 균질 1:50 PBST BSA 1 %에서 5 %의 균질 1시 25분 희석 1)를 각 웰에 100 μl를 추가 뇌 균질 액을 희석한다. 150 rpm으로 진탕하면서 다음 2 시간 동안 품어. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오. </li><li> 자료 목록에 언급 된 희석에서 BSA와 PBST 1 %를 다른 αS 검출 항체를 추가합니다. 150 rpm에서 1 시간 동안 품어. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오. </li><li> 안티를 추가150 rpm에서 진탕하면서 1 시간 동안 1 % BSA로 보충 PBST로 8000 : - 마우스 또는 항 - 토끼의 IgG HRP 접합체 (1) 희석 하였다. PBST로 판 다섯 번 씻으십시오. </li><li> 각 웰에, 5,5&#39;- 테트라 메틸 벤지딘 (TMB) 솔루션 &#39;3,3의 100 μl를 추가하고 150 rpm으로 흔들어 동안 어둠 속에서 15 분 동안 품어. </li><li> 그럼 마이크로 플레이트 리더와 450 nm에서 흡광도 측정에 1 N의 HCl 100 μl를 첨가하여 반응을 정지. </li><li> 데이터 분석을 위해, 분석 시료의 각각에 대해 측정 된 OD 값으로부터 임의의 마우스 뇌 샘플 (블랭크 웰)을 제외하고 모든 시약 웰에서 얻어진 OD 값을 뺀다. </li></ol> 5. 에피토프 매핑 <ol><li> 오스만 (16)에 의해 기술 된 방법에있어서, 에피토프 맵핑을 수행한다. 간략하게, 10 중첩 아미노산 니트로 셀룰로오스 12 개의 아미노산을 함유하는 인간 α-synuclein의 시퀀스의 스폿 펩타이드. </li><li> 50mM 트리스 / 150 mM의 염화나트륨 완충액 pH 1 차단0, 0.05 % 트윈 20, 5 % 우유 분말을 함유. 2-10 ° CO / ml의 N에서 당 2 μg의 항체 농도에서 차단 용액에 항체 인큐베이션. </li><li> 세포막을 50mM 트리스 / 150 염소 항 - 마우스 IgG HRP 컨쥬 게이트 0.05 % 트윈 20을 함유하는 인큐베이션 mM의 염화나트륨 완충액 pH 10을 사용하여 세 번 씻는다. 다음 같은 버퍼를 사용하여 다른 5 배 웨스턴 블롯 TMB 염색 키트를 사용하여 얼룩 막 씻으십시오. </li></ol> 6. 통계 분석 <ol><li> 외경을 모델로 혼합 효과 회귀 분석을 수행하기 위해 R 소프트웨어와 NLME 패키지를 사용합니다. 각각의 비교를 위해, 혼합 효과 회귀 모형을 수행합니다. 무증상 그룹에서 증상을 구분하는 고정 효과를 사용합니다. </li><li> 주어진 마우스 반복의 변화를 반영하기 위해 임의의 효과를 사용합니다. 잔류 물을 검사하여 homoscedasticity 확인하고, 필요한 경우 및 핀 헤이 베이츠 1에 아울러 집단 내 에러의 분산 구조를 모델링 분산 함수를 사용7. (P)의 중요성 임계 값 0.05을 설정 </li></ol>

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ELISA의 사용은 구체적 M83 트랜스 제닉 마우스 모델에서 질병 중에 마우스 뇌 균질 물로부터 직접 αS D를 검출하는 것으로 입증되었다. 사실,이 ELISA 쉽게 높은 소금 버퍼 만 전체 뇌 균질를 사용하여 건강한 M83 마우스에서 아픈 M83 마우스를 구별 할 수있다. 이 ELISA를 사용하여 성공적인 결과를 위해 가장 중요한 단계는 다음과 같습니다 제대로 해부하는 동안 손상을 방지하기 위해 필요한 손재주를 개발하여 마우스 뇌의 다른 영역을 해부; 독점적 HS 버퍼에 샘플 희석을 수행하는 단계; 항체의 선택은, 모든 항체는 ELISA 형식으로 작동하기 때문이다. αS D 수준의 일부 변화는 다른 생쥐 사이 그럼에도 불구하고 분명했다. 이러한 결과는 시험의 사크 의해서만 아픈 M83 마우스에서 검출 전형적인 αS D 패턴의 웨스턴 블롯 검출 동등Ser129에 대...

파킨슨병(PD)의 실험 모델에서 질병과 연관된 α-시누클레인(αSD)을 검출하는 현재의 방법으로는 면역조직화학 또는 웨스턴 블롯이 있으며, 이들은 시간이 많이 소요되고 정량적이지 않습니다. 이 신경퇴행성 질환은 정상적으로 용해성인 시냅스전 단백질인 αS1,2(Lewy체와 Lewy 신경섬유)의 집합체 형태로 주로 알파-시누클레인 침착을 특징으로 합니다. 일반적으로 마진적으로 인산화된 αS는 이러한 침착에서 세린 129 잔기에서 과인산화되며3, Ser129 인산화된 αS에 특이적으로 결합하는 항체에 의해 모니터링될 수 있어 병리의 신뢰성 있는 마커를 제공합니다.
최근 연구는 환자의 신경계에서 αS 침착의 전파에 "프리온 유사" 메커니즘이 관련될 수 있다는 것을 제안합니다4,5. 이러한 연구는 αSD를 함유한 뇌 추출물을 변이된 A53T 인간 αS 단백질과 관련된 심각한 운동 장애를 나타내는 M83 형질 전환 마우스 모델에 접종하여 시누클레인병의 가속화를 보고했습니다6. 같은 방식으로, 동일한 M83 마우스 모델에 재조합 αS를 뇌 내 접종하여 침착의 가속화를 확인했습니다5. 인간 DLB 환자의 뇌 추출물 또는 섬유상 재조합 αS를 C57Bl/6 야생형 마우스에 접종한 후에도 인산화된 αS 침착의 유도가 보고되었습니다7,8. Sacino et al.9는 최근에 섬유상 인간 αS를 주사한 후 M83 마우스에서 광범위하고 진행성인 뇌 αS 침착 형성이 유도될 수 있으나, E46K 형질 전환 마우스 또는 유도된 αS 침착이 일시적이고 주사 부위에 제한된 비 형질 전환 마우스에서는 그렇지 않다고 지적했습니다. 최근 원숭이에 대한 연구는 인간에 더 가까운 종에서 PD 유래 추출물 접종 후 αS 집합체의 전파를 확인했습니다10.
αS 변화와 파킨슨병 간의 연관성은 αSD가 파킨슨병의 잠재적 바이오마커라는 것을 시사합니다11. 최근 연구는 인간 뇌척수액(CSF) 및 혈장에서 α-시누클레인의 올리고머 용해성 집합체를 탐지하여 파킨슨병의 잠재적 바이오마커로 하는 기존의 샌드위치 시스템 ELISA를 사용하여 같은 항체로 αS를 포획하고 검출한 것을 보여주었습니다12. 이 방법에 기반하여, 생물학적 시료, 뇌를 포함한 다중 단백질이 인식되었는데, 조립된 형태에 여러 에피토프 복사가 존재하기 때문입니다13. 아주 최근에, 증명된 Lewy체 병리를 가진 환자의 CSF에서 병리학적 αS를 고도로 특이적인 αSD(5G4)에 대한 ELISA 키트 및 면역침전 분석을 사용하여 검출했습니다14. 이러한 방법은 PD/DLB 환자를 다른 치매 유형과 구별할 수 있습니다.
αS 침착의 "프리온 유사" 전파는 M83 형질 전환 마우스 모델에서 αSD를 특이적으로 식별하도록 설계된 ELISA 접근법을 사용하여 추가로 연구되었습니다. 이 연구에서, 우리는 병든 M83 마우스로부터 αSD를 접종한 것과 관계없이 병든 마우스에서, 그리고 특히 이 M83 형질 전환 마우스 모델에서 병리학적 과정에 의해 특히 타겟팅된 뇌 영역에서 αSD를 정량적으로 검출하는 데 사용된 상세한 ELISA 프로토콜을 보고합니다4.

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<table><tbody><tr><td>LB509</td><td>Abcam</td><td>ab27766</td><td>Detection antibody 1/2,000</td></tr><tr><td>AS11</td><td>Produced at Anses</td><td></td><td>Detection antibody 1/1,000</td></tr><tr><td>4D6</td><td>Abcam</td><td>ab1903</td><td>Detection antibody 1/2,000</td></tr><tr><td>PSer129</td><td>Abcam</td><td>ab59264</td><td>Detection antibody 1/3,000</td></tr><tr><td>PSer129&nbsp;EP1536Y</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td>Detection antibody 1/1,000</td></tr><tr><td>syn514</td><td>Abcam</td><td>ab24717</td><td>Detection antibody 1/500</td></tr><tr><td>clone 42</td><td>BD Biosciences</td><td>610787</td><td>Coating and detection antibody (1/2,000)</td></tr><tr><td>8A5</td><td>Provided by Dr. Anderson</td><td></td><td>Detection antibody 1/2,000</td></tr><tr><td>polyclonal anti-&alpha;syn antibody</td><td>Millipore</td><td>AB5038P</td><td>Coating antibody</td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG HRP conjugate</td><td>Southern Biotech</td><td>1010-05</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG HRP conjugate</td><td>Southern Biotech</td><td>4010-05</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG HRP conjugate</td><td>Dianova</td><td>115-035-164</td><td></td></tr><tr><td>HS buffer</td><td></td><td></td><td>pH 7.5에서 조정하고 4 &#176;C에서 보관</td></tr><tr><td><ul>
<li>Tris-HCl 50&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl 750 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>EDTA 5 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>EU0007-B</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>DTT 1 mM </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td>pH 7.5에서 조정</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2HPO4 1&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1309</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KH2PO4 1.5&nbsp;mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>2018</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>NaCl&nbsp; 137 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>1112-A</td><td></td></tr><tr><td><ul>
<li>KCl 2.7 mM </li>
</ul></td><td>Euromedex</td><td>P017</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Euromedex</td><td>2001-C</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>DTT 1 mM</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td>100 mM 스톡 용액, 독성</td></tr><tr><td>1% phosphatase cocktail</td><td>Pierce</td><td>78428</td><td></td></tr><tr><td>1% protease inhibitor cocktail</td><td>Roche</td><td>04&nbsp;693&nbsp;132&nbsp;001</td><td>50배 농축</td></tr><tr><td>Microplate MaxiSorpTM</td><td>Thermo Scientific</td><td>442404</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">탐폰 카보네이트 50 mM pH 9.6</td></tr><tr><td><ul>
<li>Na2CO3, 10H2O </li>
</ul></td><td>Sigma</td><td>71360</td><td>2.86 g/L</td></tr><tr><td><ul>
<li>NaHCO3 </li>
</ul></td><td>Merk</td><td>6329</td><td>3.36 g/L, pH&nbsp;9.6</td></tr><tr><td>Superblock T20 PBS blocking buffer</td><td>Pierce</td><td>E6423H</td><td>10배 농축</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Sigma</td><td>T0440</td><td>ELISA에 사용</td></tr><tr><td>TMB</td><td>Analytik Jena AG</td><td>847-0104200302</td><td>에피토프 매핑에 사용</td></tr><tr><td>HCl 1&nbsp;N</td><td>Chimie plus</td><td>40030</td><td></td></tr><tr><td>Ribolyser</td><td>Thermo</td><td>Fast prep FP120</td><td>이 단계에서 얼음위에 보관</td></tr><tr><td>Grinding tubes</td><td>Biorad</td><td>355-1197</td><td></td></tr><tr><td>Plate washer</td><td>Tecan</td><td>Columbus Pro</td><td></td></tr><tr><td>Plate reader</td><td>Biorad</td><td>Model 680</td><td></td></tr><tr><td>Low power magnifier&nbsp;</td><td>VWR</td><td>630-1062</td><td>8X 배율</td></tr><tr><td>Forceps Dumont#7</td><td>WPI</td><td>14097</td><td>해부 단계에 사용</td></tr><tr><td>Transfer pipette 1ml Samso</td><td>Samso</td><td>043231</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml tubes</td><td>Dutscher</td><td>033290</td><td></td></tr></tbody></table>
```

인간 a53t를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 elisa에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이

Detection of Disease-associated &#945;-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated &#945;-synuclein

웨스턴 블롯 등의 설립 방법과 더불어, 새로운 방법을 쉽고 빠르게 synucleopathies의 실험 모델에서 질병 관련 α-synuclein의 (αS D)를 정량화하기 위해 필요하다. 과발현 인간 A53T의 αS를 자발적으로 체중 감소, 쇠약, 및 심각한 운동 장애 등의 증상을 특징으로 나이 여덟 22 개월 사이 극적인 임상 표현형을 개발하는 트랜스 제닉 마우스 선 (M83)는이 연구에 사용 하였다. 이 마우스 αS D (질병 관련 αS)의 분자 분석을 위해, ELISA 특별히 아픈 쥐에서 αS D를 정량화하기 위해 설계되었습니다. 이 마우스 모델에서 중추 신경계의 분석은 주로 꼬리 뇌 영역과 척수 αS D의 존재를 보여 주었다. 즉, 임상 질환으로 이어지는 다른 실험 조건 사이의 αS D 분포의 차이는 uninocul에 없었다ated 정상적으로 형질 전환 마우스를 노화와 병 마우스의 뇌 추출물 접종 생쥐에서. Ser129에 대한 항체를 사용하여 αS D 면역 반응의 구체적인 검출은 본질적으로 웨스턴 블롯 및 면역 조직 화학에 의해 얻어진 그 상관 관계를 ELISA로 αS를 인산화. 예기치 않게, 유사한 결과 αS의 C 말단 부위에 대해 여러 가지 다른 항체를 관찰 하였다. &quot;프리온 같은&quot;기구의 관련을 암시 αS D의 전파는, 쉽게 감시되고 따라서, ELISA 접근법을 사용하여이 마우스 모델에서 정량화 할 수있다.

이 연구에서 사용 된 ELISA를 특별히 아픈 M83 마우스에서 높은 소금 버퍼에 준비 뇌 균질 질병 관련 αS (αS D)를 확인했다. 특히 pSer129 αS (P = 0.0074)를 인식하는 항체를 사용하여 ELISA 쉽게 젊은 (구 2-5개월), 건강 M83 마우스 (그림 1)에서 이전, 아픈 마우스 (&gt; 8 개월)를 구별한다. 몇 가지 다른 항체는 유사하게 높은 신호 만 아픈 마우스의 뇌 균질 (&gt; 0.6 OD)를 보여 주었다. 이 4D6에 대한 경우 (P = 0.01) 단백질 (124-134, 115-122의 C- 말단 부분의 다른 시퀀스에 대하여, LB509 (P = 0.0047) 및 8A5 (P &lt;0.001), 그리고 129-140입니다 각각)과, 훨씬 적은 정도로 단백질 (p = 0.0003)의 N 말단 (2-12)에 대하여 syn514. 또한, AS11 모노클로 날 항체는 C57BL / 6S의 예방 접종 후 인간의 섬유의 재조합 αS ...

새로운 정량적 접근법을 제공하는 ELISA가 설명되었습니다. 이는 시누클레이노파시(synucleinopathy)의 형질전환 마우스 모델(M83)에서 질병 관련 α-시누클레인(αSD)을 특이적으로 검출하기 위해 인산화된 Ser129 αS 형태 또는 단백질의 C-말단 부분에 대한 여러 항체를 사용합니다.

인간 A53T를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 ELISA에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이

In addition to established methods like Western blot, new methods are needed to quickly and easily quantify disease-associated &#945;-synuclein (&#945;SD) ...

다음 실험의 전반적인 목표는 정량적 Eliza 접근법을 사용하여 파킨슨 병의 형질전환 마우스 모델에서 질병과 관련된 알파 시누클레인의 축적을 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 접종되지 않은 마우스가 정상적으로 나이가 들도록 하거나 병든 M 83의 뇌 추출물을 뇌 내로 접종하여 완료됩니다. 마우스가 임상 질병을 발병하고 희생된 후, 마우스의 뇌 부위를 해부합니다.다음으로 각 뇌 부위에서 균질한 샘플을 고염 완충액으로 준비하고 균질 샘플에 Eliza를 수행하여 각 뇌 부위에서 질병과 관련된 알파-시누클레인을 정량화합니다. Eliza 결과는 알파 시누클레인 단백질의 질병과 관련된 형태가 주로 메센세팔론과 뇌간을 포함한 몸통 뇌 부위 및 마우스의 척수에서 축적되고 있음을 보여줍니다. 이 Eliza 기술의 주요 장점은 이전의 서방 혈청 또는 면역조직화학 검사와 비교하여 질병과 관련된 알파 시누클레인의 신속하고 신뢰할 수 있는 정량화를 제공한다는 점입니다.이 실험 모델에서, 이 방법은 이 MA 3 마우스의 중추 신경계에서 이 단백질의 축적 및 전파를 모니터링하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 임상 과학의 발달까지 뇌와 같은 메커니즘의 관여를 시사합니다. 향후 뇌척수액이나 혈액 등 다양한 생물학적 샘플의 연구에 이 방법의 발전을 고려할 수 있습니다. 이 절차는 우리 연구소의 기술자에 의해 시연될 것입니다.동물을 포함하는 모든 절차 및 프로토콜은 EC 지령 86 6 0 9 EEC에 따라 마우스를 안락사하고 뇌 및 척수를 회수한 후, 프랑스 국립 위원회인 comm ETH에 의해 승인되었습니다. 윤리 및 동물 실험 고려를 위해 동물은 레옹 영의 A 및 S'S 승인 실험 시설에서 숙주 및 관리되었습니다.텍스트 프로토콜에 따라 냉각된 얼음 위의 페트리 접시에 전체 뇌를 놓습니다. 뇌 뒤쪽에 힘질을 놓고 하향 운동으로 뇌에서 분리합니다. 그런 다음 두 번째 힘질을 같은 방식으로 제거합니다. 이제 힘질을 사용하여 뇌를 제자리에 고정한 채, 두 번째 힘질을 왼쪽 및 오른쪽 피질 사이에 부드럽게 삽입하고 앞쪽으로 이동하여 두 반구를 분리합니다.이제 뇌를 계속 고정한 채, 두 번째 힘질을 피질에서 2밀리미터 뒤쪽에 위치시키고 위쪽으로 압력을 유지하여 피질을 해마에서 분리합니다. 그런 다음 해마에서 시작하여 뇌 전면으로 이동하면서 피질의 첫 번째 부분을 벗겨냅니다.두 번째 반구에 대해 반복합니다. 그런 다음 하나의 해마 주변에 열린 힘질을 위치시키고 부드럽게 힘질의 바닥을 닫고 부드럽게 제거합니다.두 번째 해마에 대해 반복합니다. 힘질을 한 개의 선조체 뒤쪽에 위치시키고 뇌에서 부드럽게 분리합니다. 힘질을 사용하여 선조체에서 남아 있는 피질을 제거한 후 두 번째 선조체를 제거합니다. 힘질을 사용하여 소뇌를 나머지 뇌에서 분리하고 소뇌의 윤곽을 부드럽게 누릅니다.그런 다음 힘질을 소뇌 뒤쪽에 놓고 앞쪽으로 이동하여 제거합니다. 소뇌는 네 개의 둥근 구조로 구성되어 있으며, 뇌간과 접합되는 부분을 명확하게 볼 수 있습니다. 그런 다음 교차점에서 수직 절개를 만들고 뇌간을 제거합니다. 메센세팔론 뒤쪽에 힘질을 위치시키고 수직으로 크기를 조정하여 나머지 뇌와 완전히 분리합니다. 뇌 균질화물을 준비하기 위해, 해부된 뇌 부위에 HS 완

detection-disease-associated-synuclein-enhanced-elisa-brain

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

단백질 분해 효소로 배양하여 정상적인 프리온을 소화하고 저항성 응집체는 그대로 둡니다.

웨스턴 블로팅(Western Blotting)을 이용한 마우스 뇌 조직에서 잘못 접힌 프리온 단백질 응집체 검출

출처: Bétemps, D., et al.,  Detection of Disease-associated α-synuclein by Enhanced ELISA in the Brain in the Brain of Transgenic Mice Overexpressing Human A53T Mutated α-synuclein. J. Vis. 특급 (2015). 이 비디오는 ELISA를 사용하여 형질전환 마우스의 뇌 조직에서 신경퇴행성 질환 관련 단백질 α-synuclein을 검출하는 절차를 보여줍니다. 단계에는 조직 균질화, 원심분리 및 α-synuclein 단백질의 ELISA 검출이 포함되어 질병 관련 형태를 정량화합니다.

ELISA를 사용하여 신경퇴행성 질환 관련 단백질 α-Synuclein 검출

우리는 높은 처리량 로봇 형질과 집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석을 사용하여 전사 규제를 식별하기위한 신속하고 저렴한 검사 방법을 제시한다. 이 프로토콜은 빠른 속도로 유전자의 수천을 위해 직접 나란히 기능 데이터를 생성하고, 관심의 유전자를 대상으로 쉽게 변경 가능합니다.

집에서 만든 듀얼 글로우 루시 페라 제 분석 실험을 사용하여 높은 처리량 기능 검사

여기에서는 사후 인간 뇌 조직에서 점점 더 불용성/응집된 알파-시누클레인(α-syn)을 분리하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 세제 강도가 증가하는 완충액과 고속 초원심분리 기술을 통해 병든 조직과 그렇지 않은 조직에서 α-syn 응집의 다양한 특성을 검사할 수 있습니다.

파킨슨 뇌에서, 수용성 알파 시누 클레인의 순차 추출

이 원고는 바이러스 벡터 매개 국소 유전자 전달이 어떻게 중추 신경계에서 전이 유전자를 발현하는 매력적인 방법을 제공하는지 설명합니다.  이 프로토콜은 파킨슨병에 대한 바이러스 벡터 기반 동물 모델을 개발하기 위해 쥐의 흑질에 바이러스 벡터 주입을 수행하기 위한 모든 중요한 단계를 설명합니다.

재조합 아데노 - 관련 바이러스 성 벡터의 정위 주사를 통해 파킨슨 병에 대한 알파 - 시누 클레인 기반 쥐 모델 개발

(+/- M83 : GFAP의 -luc +/-)의 Tg는 복막 내로 또는 혀의 α- 시누 클레인 브릴의 말초 주입 가족적 A53T 돌연변이와 반딧불이 루시퍼 라제와 인간의 α- 시누 클레인 표현 마우스, 신경 염증을 포함한 신경 병리학을 유도 할 그들의 중추 신경계한다.

알파 - 시누 클레인 브릴의 주변 접종 후 형질 전환 마우스의 신경 염증의 생물 발광 영상

이 프로토콜의 목표는 vivo에서집계 하는 알파 synuclein의 형성을 복제 하는 셀 기반 시스템을 제공 하는입니다. 세포내 알파 synuclein 포함은 국제화에 의해 주 뉴런에 시드는 고 세의 전파 관리 네이티브 microsomes 관련 알파 synuclein 집계 병 알파 synuclein 유전자 변형 쥐에서 분리.

소 대형의 강력한 셀 모델로 기본 신경 하 Microsomes 관련 알파 synuclein 집계의 외 인 관리

여기서, 우리는 1 차 마우스 도파민 뉴런에 신경 α-synuclein 축적을 연구하기 위하여 상세한 프로토콜을 제시합니다. 뉴런의 인광α-시뉴클레인 골재는 미리 형성된 α-시뉴클레인 피브릴로 유도된다. 면역형으로 표지된 세포와 편견없는 이미지 분석의 자동화된 이미징은 α-synuclein 축적을 억제하는 약물의 중간-고처리량 스크리닝에 적합한 강력한 프로토콜을 만듭니다.

1 차 배아 마우스 중뇌 도파민 뉴런에서 사전 형성 된 피브릴 유도 α-시뉴클레인 축적 연구

이 연구는 파킨슨 병의 전임상 모델에서 신경 염증, 신경 변성 및 운동 장애를 유도하는 데 필요한 벡터 용량과 노출 시간을 분석합니다. 인간 α시누클레인을 코딩하는 이들 벡터는 파킨슨병과 관련된 시누클레인 병리를 재분석하기 위해 흑질로 전달된다.

인간 α-시누클레인을 코딩하는 아데노 관련 바이러스 벡터에 의해 유도된 파킨슨병 마우스 모델 분석

마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 편리한 중력 공급 관류 방법이 제시된다. 인산화된 α시누클레인의 면역형광 검출은 파킨슨병의 마우스 모델에서 입증된다. 이 연구는 또한 심질 관류, 해부, 조직 동결 / 임베딩 및 냉동 절개 단계를 포괄적으로 설명합니다.

마우스 중추 신경계의 조직학적 분석을 위한 중력 공급 심질 관류 방법

α-시누클레인의 생체 내 생리학적 모델은 파킨슨병의 발병기전을 연구하고 이해하는 데 필요합니다. 인간화 효모 모델을 사용하여 α-synuclein의 세포 독성 및 응집체 형성을 모니터링하는 방법을 설명합니다.

인간화 효모 모델을 이용한 α-시뉴클레인 독성 및 응집을 연구하는 방법

배우세요 ELISA를 이용하여 M83 형질전환 마우스 뇌에서 질병 관련 α-synuclein을 정량 분석하는 방법을. 중추신경계에서 단백질 축적과 전파를 신속하게 모니터링할 수 있습니다.

인간 A53T를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 ELISA에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이

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