인간 A53T를 과발현 형질 전환 마우스의 뇌에 강화 된 ELISA에 의한 질병 관련 α-synuclein의 검출은 α-synuclein의 돌연변이
2015년 5월 30일
새로운 정량적 접근법을 제공하는 ELISA가 설명되었습니다. 이는 시누클레이노파시(synucleinopathy)의 형질전환 마우스 모델(M83)에서 질병 관련 α-시누클레인(αSD)을 특이적으로 검출하기 위해 인산화된 Ser129 αS 형태 또는 단백질의 C-말단 부분에 대한 여러 항체를 사용합니다.
다음 실험의 전반적인 목표는 정량적 Eliza 접근법을 사용하여 파킨슨 병의 형질전환 마우스 모델에서 질병과 관련된 알파 시누클레인의 축적을 모니터링하는 것입니다. 이는 먼저 접종되지 않은 마우스가 정상적으로 나이가 들도록 하거나 병든 M 83의 뇌 추출물을 뇌 내로 접종하여 완료됩니다. 마우스가 임상 질병을 발병하고 희생된 후, 마우스의 뇌 부위를 해부합니다.
다음으로 각 뇌 부위에서 균질한 샘플을 고염 완충액으로 준비하고 균질 샘플에 Eliza를 수행하여 각 뇌 부위에서 질병과 관련된 알파-시누클레인을 정량화합니다. Eliza 결과는 알파 시누클레인 단백질의 질병과 관련된 형태가 주로 메센세팔론과 뇌간을 포함한 몸통 뇌 부위 및 마우스의 척수에서 축적되고 있음을 보여줍니다. 이 Eliza 기술의 주요 장점은 이전의 서방 혈청 또는 면역조직화학 검사와 비교하여 질병과 관련된 알파 시누클레인의 신속하고 신뢰할 수 있는 정량화를 제공한다는 점입니다.
이 실험 모델에서, 이 방법은 이 MA 3 마우스의 중추 신경계에서 이 단백질의 축적 및 전파를 모니터링하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이는 임상 과학의 발달까지 뇌와 같은 메커니즘의 관여를 시사합니다. 향후 뇌척수액이나 혈액 등 다양한 생물학적 샘플의 연구에 이 방법의 발전을 고려할 수 있습니다. 이 절차는 우리 연구소의 기술자에 의해 시연될 것입니다.
동물을 포함하는 모든 절차 및 프로토콜은 EC 지령 86 6 0 9 EEC에 따라 마우스를 안락사하고 뇌 및 척수를 회수한 후, 프랑스 국립 위원회인 comm ETH에 의해 승인되었습니다. 윤리 및 동물 실험 고려를 위해 동물은 레옹 영의 A 및 S'S 승인 실험 시설에서 숙주 및 관리되었습니다.
텍스트 프로토콜에 따라 냉각된 얼음 위의 페트리 접시에 전체 뇌를 놓습니다. 뇌 뒤쪽에 힘질을 놓고 하향 운동으로 뇌에서 분리합니다. 그런 다음 두 번째 힘질을 같은 방식으로 제거합니다. 이제 힘질을 사용하여 뇌를 제자리에 고정한 채, 두 번째 힘질을 왼쪽 및 오른쪽 피질 사이에 부드럽게 삽입하고 앞쪽으로 이동하여 두 반구를 분리합니다.
이제 뇌를 계속 고정한 채, 두 번째 힘질을 피질에서 2밀리미터 뒤쪽에 위치시키고 위쪽으로 압력을 유지하여 피질을 해마에서 분리합니다. 그런 다음 해마에서 시작하여 뇌 전면으로 이동하면서 피질의 첫 번째 부분을 벗겨냅니다.
두 번째 반구에 대해 반복합니다. 그런 다음 하나의 해마 주변에 열린 힘질을 위치시키고 부드럽게 힘질의 바닥을 닫고 부드럽게 제거합니다.
두 번째 해마에 대해 반복합니다. 힘질을 한 개의 선조체 뒤쪽에 위치시키고 뇌에서 부드럽게 분리합니다. 힘질을 사용하여 선조체에서 남아 있는 피질을 제거한 후 두 번째 선조체를 제거합니다. 힘질을 사용하여 소뇌를 나머지 뇌에서 분리하고 소뇌의 윤곽을 부드럽게 누릅니다.
그런 다음 힘질을 소뇌 뒤쪽에 놓고 앞쪽으로 이동하여 제거합니다. 소뇌는 네 개의 둥근 구조로 구성되어 있으며, 뇌간과 접합되는 부분을 명확하게 볼 수 있습니다. 그런 다음 교차점에서 수직 절개를 만들고 뇌간을 제거합니다. 메센세팔론 뒤쪽에 힘질을 위치시키고 수직으로 크기를 조정하여 나머지 뇌와 완전히 분리합니다. 뇌 균질화물을 준비하기 위해, 해부된 뇌 부위에 HS 완
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개요
본 연구에서는 시누클레인병(synucleinopathy) 전이성 마우스 모델에서 질병 관련 α-synuclein을 검출하기 위한 새로운 정량적 ELISA 방법을 제시합니다. 이 기술을 통해 질병 진행에 따른 다양한 뇌 영역의 α-synuclein 축적 상태를 모니터링할 수 있습니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 생화학
- 형질전환 모델
배경
- α-synuclein은 파킨슨병과 같은 시누클레인병증(synucleinopathies)과 관련이 있습니다.
- 웨스턴 블로팅(western blotting) 및 면역조직화학(immunohistochemistry)과 같은 전통적인 방법은 정량화에 한계가 있습니다.
- ELISA는 단백질 정량화를 위한 빠르고 신뢰할 수 있는 대안을 제공합니다.
- 질병 진행을 연구하기 위해 M83 형질전환 마우스 모델이 사용됩니다.
연구 목적
- 특정 뇌 영역에서 질병 관련 α-synuclein의 축적량을 정량화한다.
- 전통적인 방법과 비교하여 ELISA의 효능을 평가한다.
- 시누클레인병증(synucleinopathy)에서 α-synuclein 분포에 대한 이해를 높인다.
사용된 방법
- 형질전환 마우스에 뇌 추출물을 접종하지 않거나 접종하였습니다.
- 마우스가 노화되거나 임상 질환이 발생할 때까지 기다린 후 희생시켰습니다.
- 뇌 영역을 적출하여 고염 농도 완충액에서 균질화하였습니다.
- ELISA를 수행하여 시료 내 α-synuclein 수치를 정량하였습니다.
주요 결과
- 미부 뇌 영역에서 질병 관련 α-synuclein의 상당한 축적이 관찰되었습니다.
- 중뇌, 뇌줄기 및 척수에서 높은 수치가 검출되었습니다.
- ELISA는 전통적인 방법과 비교하여 신속하고 신뢰할 수 있는 정량을 가능하게 했습니다.
- 이러한 결과는 시누클레인 병증에서 α-synuclein 연구를 위한 ELISA의 활용을 뒷받침합니다.
결론
- 새로운 ELISA 방법은 형질전환 모델에서 α-synuclein을 정량화하는 데 효과적입니다.
- 이 접근 방식은 시누클레인병(synucleinopathies)에 대한 추가 연구를 촉진할 수 있습니다.
- 향후 연구에서는 α-synuclein 축적을 표적으로 하는 치료적 개입을 탐구할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
질환 관련 α-synuclein의 정량적 검출은 시누클레인 병증(synucleinopathy) 약물 개발에서 타겟 검증의 리스크를 줄이는 데 매우 중요합니다. ELISA 기반 접근법은 뇌 영역 전반에 걸쳐 신속하고 신뢰할 수 있는 정량을 가능하게 하여, 전임상 프로그램의 진행 여부(go/no-go)를 결정하는 근거를 제공합니다. 이 방법은 기전 연구 및 치료적 개입 추적을 위한 확장 가능하고 재현 가능한 판독값을 제공함으로써 예측 신뢰도를 높여줍니다.
바이오 제약 R&D의 전략적 응용
초기 발견 및 표적 검증
- 과학적 가치: 파킨슨병 모델에서 치료 표적으로서의 α-synuclein 병리를 조사할 수 있게 합니다.
- 운용적 가치: 표적 결합 및 경로 조절을 명확히 하기 위한 정량적이고 항체 특이적인 판독 결과를 제공합니다.
- 예측적 가치: 분자 축적과 표현형적 질병 진행 간의 상관관계를 분석함으로써 생물학적 리스크 감소를 지원합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 질환 관련 α-synuclein의 표준화되고 고속 처리 가능한 정량을 제공합니다.
- 운영적 가치: 검출에 뇌 등가물 10 μg만 필요하여 Western blot보다 분석 효율성을 향상시킵니다.
- 재현성 가치: 접종 및 노화 조건 전반에서 일관된 결과를 보여주어 신뢰할 수 있는 종단적 추적을 가능하게 합니다.
중개 및 전임상 연구
- 과학적 가치: CNS 내 프리온 유사 전파의 모니터링을 용이하게 하여, 질환 확산의 기전 모델에 대한 정보를 제공합니다.
- 운용적 가치: 임상 병리학과 일치하는 뇌 미측 영역 및 척수 내 축적을 검출합니다.
- 중개적 가치: 정량 가능하고 질환과 연관된 단백질 판독값을 제공함으로써 바이오마커 검증 노력을 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로우 통합
ELISA 방법은 타겟 검증부터 전임상 효능 시험에 이르는 발견 연속체 내에 적합하며, α-synuclein 조절 화합물에 대한 반복적인 평가를 가능하게 합니다.
- 발견 생물학: 형질전환 모델에서 α-synuclein 응집 및 신경 독성에 대한 가설 검증을 지원합니다.
- 스크리닝: 화합물 라이브러리 평가를 위해 정량적 결과물을 생성하는 분석 준비 완료 생물학적 시스템을 가능하게 합니다.
- 분석: 450 nm에서 흡광도 기반 판독값을 제공하여 뇌 영역별 처리 효과의 통계적 비교를 가능하게 합니다.
- 중개 연구: 분자 검출을 표현형 결과와 연결하여 위험 조정된 진전 결정 사항을 지원합니다.
- 기업적 재사용: 여러 질환 모델 및 치료 양식에 적용 가능한 α-synuclein 정량을 위한 표준화된 플랫폼을 구축합니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 질환 관련 α-synuclein의 특이적이고 정량적인 검출을 통해 타겟 검증의 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: Western blot의 수일이 소요되는 것과 달리 수 시간 내에 신속한 결과를 제공하여 프로젝트 일정을 단축합니다.
- 전략적 가치: 초기 단계에서 기전 기반의 진행/중단(go/no-go) 결정을 가능하게 하여 후기 단계의 실패 위험을 줄입니다.
- 포트폴리오 영향: in vivo에서 타겟 결합 능력이 입증된 화합물을 우선순위에 둠으로써 자본 효율성을 개선합니다.
실행 시 고려 사항
- ELISA 최적화, 항체 검증 및 뇌 조직 균질화에 관한 전문 지식이 필요합니다.
- 고염 버퍼 조제 및 흡광도 측정을 위한 마이크로플레이트 리더 접근 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 일관된 시료 처리 및 배양 프로토콜을 위해 팀 간의 표준화가 필수적입니다.
- 다른 모델 시스템에 적용하려면 항체 특이성 및 에피토프 접근성에 대한 검증이 필요할 수 있습니다.
- 실질적 제한 사항: 신호 검출은 질환 관련 α-synuclein의 충분한 축적 정도에 따라 달라지며, 이는 모델과 연령에 따라 차이가 있을 수 있습니다.
