Name: 약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: 학습하세요 암 세포 타원체의 로봇 생산 방법을 통해 항암 약물 테스트를 수행하는 고효율 프로토콜입니다. 수성 2상 시스템을 활용하여 96웰 플레이트에서 균일한 스페로이드를 형성하고 약물 효능을 신속하게 평가할 수 있습니다.

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저자는 미국 국립보건원(National Institutes of Health R21CA182333)의 자금 지원을 인정합니다.

고분자 수성 2 단계 시스템 1. 준비 (ATPS) <ol><li> 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) (MW : 35,000) 0.5 g을 달아 수성 PEG 단계 (/ V W) 5 % 10 ㎖를 제조 멸균 15ml의 원뿔에서 완전 성장 배지 9.5 ml의 추가. 주 : 제 중합체를 추가하고 그 다음에 원뿔형 배지의 절반을 추가하는 것은 그 다음 매체의 잔량이 원추형 벽 중합체의 접착 성을 최소화하고, 중합체가 더 빨리 용해 돕는다. </li><li> 덱스 트란 (DEX) 0.128 g (MW : 500,000)를 달아 12.8 % (w / v)의 수용액 DEX 상 1 ㎖를 제조 멸균 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브에 완전 성장 배지의 0.872 ml의 추가. </li><li> 약 1 분 동안 와동 두 솔루션 배지에서 중합체를 용해. </li><li> 용해 및 균질 혼합물을 보장하기 위해 1 시간 동안 37 ℃에서 수욕에서 두 솔루션 유지. 목욕의 솔루션의 오염 가능성을 방지하기 위해 물 수준의 위 뚜껑을 유지물. </li><li> 멸균 플라스틱 주사기 내로 PEG 상 용액을로드 및 불순물을 제거하기 위해 0.2 ㎛의 공극 크기의 주사기 필터를 통해 전달한다. 천천히 필터를 통해 솔루션을 밀어, PEG 용액을 주사기를 채우기 원뿔 튜브의 상단과 힘을 사용하는 방법에 대한 필터의 삽입에 배치 참고. 그것은 주사기 플런저의 움직임에 대한 저항을 경험하는 정상입니다. 용액의 일부는 필터에 남아 있지만, 중합체의 농도가 변화하지 않으므로 중합체 용액 경미한 손실이 발생한다. </li><li> 피펫 10 DEX 위상 솔루션의 μL 및 별도의 튜브에 매체의 10 μL에 희석은 6.4 % (w / v)의 DEX 단계 솔루션을 초래할 수 있습니다. 대기음 100 PEG 상 용액 μL 및 페트리 접시로 분배. <ol><li> PEG 용액 상으로 DEX 상 용액 (V / w) 6.4 % 0.5 μl를 분배. 시각적으로 현미경 DEX 강하를 관찰하여 성공적인 ATPS 형성을 확인합니다. 드롭 경계두 안정, 별도의 수성 단계의 존재를 나타내는, 계속 표시해야합니다. </li></ol></li><li> 사용할 때까지 4 ° C에서의 주식 수성 PEG와 DEX 단계 솔루션을 저장합니다. 주 : 폴리머 솔루션은 이전에 각 실험에 신선한 준비 및 보관 24 시간 내에 사용하는 것이 좋습니다. </li></ol> 인쇄 암의 세포 타원체 2. 준비 <ol><li> 90 % -100 %의 융합 성 단층 관심 (예를 들면, MDA-MB-157 유방암 세포)의 암세포 성장. MDA-MB-157 세포, DMEM은 10 % FBS, 1 %의 글루타민, 및 1 % 항생 물질을 함유 이루어지는 매체를 사용한다. <ol><li> (제조사의 프로토콜에 따라)과 15 ML 원뿔에 서스펜션을로드 셀 분리 버퍼를 사용하여 수확 세포. , 173.3 XG에서 5 분 정도 원심 분리기 뜨는을 제거하고, 재현 탁 세포 완전한 성장 배지 1 ㎖에. </li></ol></li><li> 로드셀 상 혈구 계산하고이를 원하는 숫자를 계산하는원하는 회전 타원체 세포 밀도에 대한 세포의. T75 플라스크에 성장 MDA-MB-157 세포의 합류 단층은 보통 ~ 7 × 10 6 세포를 제공합니다. 주 :. 1.5 × 104 또는 MDA-MB-157 세포에 대한 큰 방울 체적에 필요한 세포 밀도가 단일 회전 타원체는 세포 유형에 의존 할 것이다 생성하기 위해 예를 들어 22, 밀도는 0.3 μL DEX 위상 드롭 당 권장 단일 회전 타원체의 형성을 보장합니다. </li><li> 173.3 XG에서 5 분 동안 원심 분리 두번째 세포 및 원하는 세포 밀도로 현탁 집중 성장 배지의 적당한 용적에 재현 탁 그들을. 참고 : 7 × 106 암세포 수확 예를 들어, 0.3 μL의 DEX 위상 강하는 1.5 × 104 세포 밀도의 타원체를 형성하는데 필요한 세포 현탁액의 총 부피는 140 μL 것이다. 그러나 인해 다음 단계에서 DEX 상 용액으로 희석 만 세포를 재현 탁하는 세포 배양 배지의 70 μl를 사용한다. </li><li&gt; 12.8 %의 동일 부피 (w / v)의 수용액 DEX 상 용액 1.2에서 제조 얻어진 세포 현탁액에 추가. 1.5 × 104 세포 밀도 타원체의 예를 들면, 위상 DEX 용액 70 μl의 세포 현탁액 70 μL를 첨가한다. </li><li> 철저히 세포 DEX 혼합 용액의 균일 한 분포를 보장하기 위해 세포 현탁액을 혼합한다. 피펫 위아래로 거품 형성을 방지하기 위해 조심스럽게 수행해야합니다. </li></ol> 공동 배양 타원체의 인쇄 3. 준비 <ol><li> 암 세포 성장 (예를 들어, MDA-MB-157 인간 유방암 세포) 및 90 % -100 %의 융합 성 단층을지지 세포 (예, 인간 섬유 아세포). (제조사의 프로토콜에 따라) 세포 해리 완충액을 이용하여 각 세포 유형 수확. <ol><li> 각 원뿔형 5 173.3 XG에 분하고, 흡인 상등액을 위해 그들을 원심 분리기, 15 ML 원뿔로 각각의 서스펜션을로드합니다. 완전한 g 1 ml의 각 원뿔의 재현 탁 세포rowth 매체. 참고 : 예컨대 칼 세인 AM (생균 얼룩) 핵 염색 (훽스트) 형광 염료는 두 종류의 세포를 구별하는데 사용될 수있다. </li></ol></li><li> 혈구에 별도로 각 세포 유형을로드하고 공 배양 세포 타원체를 지원하는 암세포의 원하는 비율에 대한 각각의 세포 유형의 필요한 개수를 계산하도록 계산. T75 플라스크에서 재배 합류 MDA-MB-157 세포의 단층 및 섬유 아 세포는 일반적으로 각각 ~ 7 × 10 6 ~ 6 × 10 6 세포를 제공합니다. </li><li> 두 종류의 세포 수의 바람직한 비율을 제공하는 암 세포에 세포 현탁액을지지 현탁액으로부터 정확한 볼륨. 예를 들어, 하나의 섬유 아세포 세포에 암 세포를 50의 비율을 사용한다. </li><li> 원심 적절한 부피 173.3 XG 재현 탁하고 세포에서 5 분 동안 혼합 세포 현탁액을 함유하는 수성 원추형 DEX (/ V W)와 동일한 성장 배지의 부피를 12.8 %의 최종 농도로 포함하는 결과(1.2에서 준비) 단계 솔루션입니다. </li><li> 부드럽게 현탁액의 균질성을 확인하기 위해 위아래로 얻어진 세포 현탁액을 피펫. </li></ol> 96- 웰 플레이트 종양 타원체 4. 인쇄 <ol><li> 어느 날 이전에 실험에, 1 % 코트 비 처리 된 둥근 바닥 96 웰 플레이트 24 시간 동안 37 ° C에서 (w는 / v)의 플루로 닉. 이 코팅은 배양 기간 동안 세포 부착을 방지 할 수 있습니다. </li><li> 여과하고, 5 %의 50 μl를 분주를 96 웰 플레이트 (대상 판)의 각 웰에 PEG 수성 상 (/ V w). </li><li> 피펫을 사용하여, 세포 현탁액을 혼합 (2 단계 또는 각각 모노와 공동 문화에 대해 단계 3에서 제조) 및 384 웰 플레이트의 하나의 열 (소스 판)에서 잘 모든 다른 서스펜션의 20 μl를 추가 . </li><li> 액체 핸들러와 &quot;홈&quot;좌표를 등록하는 피펫 팅 머리를 켭니다. 그런 다음 실험 실용을 보장하기 위해 (4.6 이하) 이전에 정의 된 프로토콜을 컴파일하고 매개 변수가 올바른 정의LY. 이 &quot;원점 복귀&quot;단계는 다른 액체 핸들러 다를 수 있습니다. 참고 : 프로토콜의 흐름, 단계별로 아래 4.6에 관계없이 사용되는 로봇 액체 핸들러의 유사합니다 표시; 그러나, 프로그래밍 인터페이스는 다른 의한 소프트웨어의 사용으로 다르​​게 보일 수있다. </li><li> 도 1에 도시 된 바와 같이 액체 핸들러의 워크 스테이션의 위치에 정의 된 소스 플레이트, 대상 판, 피펫 팁 및 박스를 배치. </li><li> 다음 단계를 포함하는 프로토콜을 실행 <ol><li> 로드 워크 스테이션 (그림 1)에서 피펫 팁 (8 팁) 믹싱 액체 핸들러의 피펫 팅 헤드로부터 배럴 중 하나 열입니다. </li><li> 소스 플레이트 (도 1)의 웰에 세포 현탁액을 혼합한다. 기포 형성을 방지하기 웰에 세포 현탁액의 부피보다 작은 혼합 볼륨을 선택. </li><li> 빈 폐기물 팁 상자 (그림 1)에 팁을 꺼냅니다. </li&gt; <li> 부하 10 μL 분배 피펫 팁 피펫 헤드로부터 배럴의 하나의 열 (그림 1). </li><li> 대기음 각 피펫 팁으로 소스 플레이트에서 세포 현탁액 0.3 μL (도 1). </li><li> 대상 판의 하나의 열 (도 1)의 웰에 세포 현탁액을 분배. 0.5 mm의 높이 및 분배 미만 1 μL / sec의 분사 유량을 사용한다. </li><li> 전체 대상 플레​​이트에 컬럼 별 인쇄가 완료 될 때까지 반복 4.6.6을 통해 4.6.1 단계를 반복합니다. </li></ol></li><li> 조심스럽게 워크 스테이션 표면에서 대상 플레이트를 제거하고 CO 2를 37 ° C에서 습기가 인큐베이터에 배치하고 5 %. 세포를 포함하는 위상 DEX 방울의 교란을 방지하기 인큐베이터로 운반시 접시 수평을 유지한다. </li><li> DEX 단계 드롭 내에서 회전 타원체로 세포의 응집을 할 수 있도록 24 시간 동안 접시를 품어. </li></ol> &lt;P 클래스 = &quot;jove_title&quot;&gt; 5. 암 세포 타원체의 약물 치료 다음 프로토콜은 4 일간의 약물 치료이며, 그것은 다른 치료 기간을 수정할 수 있습니다 일 2. 후 신선한 약물과 갱신이 포함되어 있습니다. <ol><li> 시각 24 시간 후 96 웰 플레이트의 회전 타원체의 형성을 확인합니다. 각 회전 타원체의 최소 및 최대 직경을 평균하여 타원체의 크기 측정을위한 이미지 우물을 필요로합니다. </li><li> 소정의 용해도 농도 제조사 권장 용매 및 원하는 약물의 원액을 준비한다. 예를 들어, ㎖ / 2 mg을 물에 시스플라틴을 용해. 주 : 약물이 빛에 민감한 경우 빛으로부터 약물의 원액을 보호합니다. </li><li> 시리얼 희석 기술을 사용하여, 이전 단계에서 제조 스톡 용액으로부터 세포 배양 배지로 희석 약물 농도를 준비한다. 각 회 희석하여 원하는 농도가 이루어져야한다. DIL의 ution 비율은 시작 재고 농도에 따라 달라질 수 및 작업 농도를 원하는 것입니다. </li><li> 각 웰에 이전 단계에서 제조 된 약물 용액 50 μL를 추가한다. 이 로봇 또는 수동 피펫 팅하여 수행 할 수 있습니다. 주 : 각 약물 농도는 각 웰에 50 ㎕의 이미 PEG 수성 상으로 원하는 농도로 반으로 희석한다. <ol><li> 각 농도 96 웰 플레이트 (N = 16)의 두 개의 열에서 타원체를 사용합니다. </li><li> 대조군 웰에서, PEG 수성상의 기존 50 μL 신선한 배지의 50 μL를 추가한다. </li></ol></li><li> 빛으로부터 보호 된 37 ° C에서 48 시간 및 5 % CO 2,위한 약물과 타원체 부화. </li><li> 배양 48 시간 후, 소정 농도의 신선한 약물 희석액을 제조하고 각 웰에 신선한 약물 용액 50 μl를 첨가하여 약제를 갱신. 주 : 웰이 이미 제 약물 t에서 원하는 약물 농도를 포함reatment. 더 희석이 발생하지 않는 것이므로 따라서 갱신이 단계에서, 각각의 농도가 목적하는 농도로 제조한다. </li><li> 빛으로부터 보호 37 ° C에서 또 다른 48 시간 동안 약 5 % CO 2와 타원체를 품어. </li></ol> 6. 타원체의 세포 생존 능력의 분석 <ol><li> 갱신 약물 (즉, 약물과 타원체의 처리의 총 시간 4 일)와 배양 48 시간 후, 잘 매뉴얼 피펫 팅에 의해 하나의 매체의 총 부피를 측정한다. 참고 : 하나 잘 일반적인 볼륨이 140 μl의 (작은 감소는 증발로 인해 발생) ~이다. </li><li> 웰 총 부피의 10 % 농도 세포 생존 시약 (예 PrestoBlue)의 체적을 계산한다. 각 웰에 세포 생존 시약이 볼륨을 추가합니다. 주 : 웰 140 μL의 기존 미디어 부피, 15.6 μL의 부피는 웰의 총 농도 10 %를 제공 할 필요가있다. 이 계산됩니다9 (140 μL / 9 = 15.6 μL)에 의해 기존의 미디어 볼륨을 분할. </li><li> 빛으로부터 보호 된 37 ° C에서 6 시간 동안 각각의 웰에 첨가 세포 생존 시약, 접시를 인큐베이션. </li><li> 마이크로 플레이트 리더에서 접시를 놓고 각각 560 nm에서 590 nm의 여기 및 방출 파장에서 형광 신호를 읽어보십시오. </li><li> 동일한 처리 조건에서 값을 평균 한 후 대조군 웰의 처리함으로써 웰로부터 형광 신호를 정규화하여 타원체에서 세포의 생존 비율을 계산한다. </li></ol>

<ol><li>Butcher, E. C., Berg, E. L., Kunkel, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Systems biology in drug discovery.</a> Nat. Biotechnol. 22, 1253-1259 (2004).</li>
<li>Gonzalez-Nicolini, V., Fussenegger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+assays+for+anticancer+drug+discovery--a+novel+approach+based+on+engineered+mammalian+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Drugs%22%5BJournal%5D)">In vitro assays for anticancer drug discovery--a novel approach based on engineered mammalian cell lines.</a> Anticancer Drugs. 16, 223-228 (2005).</li>
<li>Castel, D., Pitaval, A., Debily, M. A., Gidrol, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+microarrays+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Cell microarrays in drug discovery.</a> Drug Discov. Today. 11, 616-622 (2006).</li>
<li>Gidrol, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2D+and+3D+cell+microarrays+in+pharmacology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opin.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">2D and 3D cell microarrays in pharmacology.</a> Current Opin. Pharmacol. 9, 664-668 (2009).</li>
<li>LaBarbera, D. V., Reid, B. G., Yoo, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multicellular+tumor+spheroid+model+for+high-throughput+cancer+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin.+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">The multicellular tumor spheroid model for high-throughput cancer drug discovery.</a> Expert Opin. Drug Discov. 7, 819-830 (2012).</li>
<li>Ward, D. J., Martino, O. I., Simpson, S., Stevens, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decline+in+new+drug+launches%3A+myth+or+reality%3F+Retrospective+observational+study+using+30+years+of+data+from+the+UK%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">Decline in new drug launches: myth or reality? Retrospective observational study using 30 years of data from the UK.</a> BMJ Open. 3, (2013).</li>
<li>Yamada, K. M., Cukierman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+tissue+morphogenesis+and+cancer+in+3D%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D.</a> Cell. 130, 601-610 (2007).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148, 3-15 (2010).</li>
<li>Ghajar, C. M., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+engineering%3A+the+other+face+of+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+A%22%5BJournal%5D)">Tumor engineering: the other face of tissue engineering.</a> Tissue Eng. A. 16, 2153-2156 (2010).</li>
<li>Kenny, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphologies+of+breast+cancer+cell+lines+in+three-dimensional+assays+correlate+with+their+profiles+of+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Oncol%22%5BJournal%5D)">The morphologies of breast cancer cell lines in three-dimensional assays correlate with their profiles of gene expression.</a> Mol. Oncol. 1, 84-96 (2007).</li>
<li>Carlsson, J., Yuhas, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid-overlay+culture+of+cellular+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Rec.+Results+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Liquid-overlay culture of cellular spheroids.</a> Rec. Results Cancer Res. 95, 1-23 (1984).</li>
<li>Wartenberg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+angiogenesis+studied+in+confrontation+cultures+of+multicellular+tumor+spheroids+and+embryoid+bodies+grown+from+pluripotent+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced angiogenesis studied in confrontation cultures of multicellular tumor spheroids and embryoid bodies grown from pluripotent embryonic stem cells.</a> FASEB J. 15, 995-1005 (2001).</li>
<li>Tekin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimuli-responsive+microwells+for+formation+and+retrieval+of+cell+aggregates%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+chip%22%5BJournal%5D)">Stimuli-responsive microwells for formation and retrieval of cell aggregates.</a> Lab chip. 10, 2411-2418 (2010).</li>
<li>Patra, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+device+for+uniform-sized+cell+spheroids+formation%2C+culture%2C+harvesting+and+flow+cytometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">A microfluidic device for uniform-sized cell spheroids formation, culture, harvesting and flow cytometry analysis.</a> Biomicrofluidics. 7, 54114(2013).</li>
<li>Frey, O., Misun, P. M., Fluri, D. A., Hengstler, J. G., Hierlemann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconfigurable+microfluidic+hanging+drop+network+for+multi-tissue+interaction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconfigurable microfluidic hanging drop network for multi-tissue interaction and analysis.</a> Nat. Commun. 5, 4250(2014).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-ring+structures+stabilize+microdroplets+to+enable+long+term+spheroid+culture+in+384+hanging+drop+array+plates%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed.+Microdev%22%5BJournal%5D)">Micro-ring structures stabilize microdroplets to enable long term spheroid culture in 384 hanging drop array plates.</a> Biomed. Microdev. 14, 313-323 (2012).</li>
<li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Release%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J. Control. Release. 164, 192-204 (2012).</li>
<li>Mueller-Klieser, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+cultures%3A+from+molecular+mechanisms+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell cultures: from molecular mechanisms to clinical applications.</a> Am. J. Physiol. 273, C1109-C1123 (1997).</li>
<li>Minchinton, A., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+penetration+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Drug penetration in solid tumors.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li>
<li>Jeong, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+tension-mediated%2C+concave-microwell+arrays+for+large-scale%2C+simultaneous+production+of+homogeneously+sized+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Healthc.+Mater%22%5BJournal%5D)">Surface tension-mediated, concave-microwell arrays for large-scale, simultaneous production of homogeneously sized embryoid bodies.</a> Adv. Healthc. Mater. 2, 119-125 (2013).</li>
<li>Cavnar, S. P., Salomonsson, E., Luker, K. E., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfer+imaging%2C+and+analysis+plate+for+facile+handling+of+384+hanging+drop+3D+tissue+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%22%5BJournal%5D)">Transfer imaging, and analysis plate for facile handling of 384 hanging drop 3D tissue spheroids.</a> JALA. 19, 208-214 (2014).</li>
<li>Atefi, E., Lemmo, S., Fyffe, D., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput%2C+polymeric+aqueous+two-phase+printing+of+tumor+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Func.+Mater%22%5BJournal%5D)">High throughput, polymeric aqueous two-phase printing of tumor spheroids.</a> Adv. Func. Mater. 24, 6509-6515 (2014).</li>
<li>Lemmo, S., Atefi, E., Luker, G. D., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+aqueous+biphasic+tumor+spheroid+microtechnology+for+anti-cancer+drug+testing+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Optimization of aqueous biphasic tumor spheroid microtechnology for anti-cancer drug testing in 3D culture.</a> Cell. Mol. Bioeng. 7, 344-354 (2014).</li>
<li>Albertsson, P. -A., Tjerneld, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+diagrams%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzym%22%5BJournal%5D)">Phase diagrams.</a> Methods Enzym. 228, 3-13 (1994).</li>
<li>Frampton, J. P., White, J. B., Abraham, A. T., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+co-culture+patterning+using+aqueous+two-phase+systems%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Cell co-culture patterning using aqueous two-phase systems.</a> J. Vis. Exp. (73), (2013).</li>
<li>Frampton, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aqueous+two-phase+system+patterning+of+detection+antibody+solutions+for+cross-reaction-free+multiplex+ELISA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Aqueous two-phase system patterning of detection antibody solutions for cross-reaction-free multiplex ELISA.</a> Sci. Rep. 4, 4878(2014).</li>
<li>Lai, D., Frampton, J. P., Tsuei, M., Kao, A., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+direct+visual+analysis+of+hydrolytic+enzyme+activity+using+aqueous+two-phase+system+droplet+phase+transitions%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Label-free direct visual analysis of hydrolytic enzyme activity using aqueous two-phase system droplet phase transitions.</a> Anal. Chem. 86, 4052-4057 (2014).</li>
<li>Petrak, D., Atefi, E., Yin, L., Chilian, W., Tavana, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+spatio-temporally+controlled+cell+microprinting+with+polymeric+aqueous+biphasic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotech.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Automated spatio-temporally controlled cell microprinting with polymeric aqueous biphasic system.</a> Biotech. Bioeng. 11, 404-412 (2014).</li>
<li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanolitre+liquid+patterning+in+aqueous+environments+for+spatially+defined+reagent+delivery+to+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Nanolitre liquid patterning in aqueous environments for spatially defined reagent delivery to mammalian cells.</a> Nat. Mater. 8, 736-741 (2009).</li>
<li>Tavana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+aqueous+biphasic+system+rehydration+facilitates+high+throughput+cell+exclusion+patterning+for+cell+migration+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Func.+Mater%22%5BJournal%5D)">Polymeric aqueous biphasic system rehydration facilitates high throughput cell exclusion patterning for cell migration studies.</a> Adv. Func. Mater. 21, 2920-2926 (2011).</li>
<li>Tavana, H., Mosadegh, B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymeric+aqueous+biphasic+systems+for+non-contact+cell+printing+on+cells%3A+engineering+heterocellular+embryonic+stem+cell+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Polymeric aqueous biphasic systems for non-contact cell printing on cells: engineering heterocellular embryonic stem cell niches.</a> Adv. Mater. 22, 2628-2631 (2010).</li>
<li>Tavana, H., Mosadegh, B., Zamankhan, P., Grotberg, J. B., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microprinted+feeder+cells+guide+embryonic+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Microprinted feeder cells guide embryonic stem cell fate.</a> Biotechnol. Bioeng. 108, 2509-2516 (2011).</li>
<li>Kalluri, R., Zeisberg, M. Nat Rev Cancer. 6, 392-401 (2006).</li>
<li>Olsen, C. J., Moreira, J., Lukanidin, E. M., Ambartsumian, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mammary+fibroblasts+stimulate+invasion+of+breast+cancer+cells+in+a+three-dimensional+culture+and+increase+stroma+development+in+mouse+xenografts%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Human mammary fibroblasts stimulate invasion of breast cancer cells in a three-dimensional culture and increase stroma development in mouse xenografts.</a> BMC Cancer. 10, 444(2010).</li>
<li>Ozdemir, B. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Depletion+of+carcinoma-associated+fibroblasts+and+fibrosis+induces+immunosuppression+and+accelerates+pancreas+cancer+with+reduced+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Depletion of carcinoma-associated fibroblasts and fibrosis induces immunosuppression and accelerates pancreas cancer with reduced survival.</a> Cancer Cell. 25, 719-734 (2014).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+system+for+formation+of+PC-3+prostate+cancer+co-culture+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Microfluidic system for formation of PC-3 prostate cancer co-culture spheroids.</a> Biomaterials. 30, 3020-3027 (2009).</li>
<li>Friedrich, J., Seidel, C., Ebner, R., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+drug+screen%3A+considerations+and+practical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based drug screen: considerations and practical approach.</a> Nat. Protoc. 4, 309-324 (2009).</li>
<li>Weigelt, B., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+the+microenvironmental+influences+on+the+normal+mammary+gland+and+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Semin.+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Unraveling the microenvironmental influences on the normal mammary gland and breast cancer.</a> Semin. Cancer Biol. 18, 311-321 (2008).</li>
<li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cance%22%5BJournal%5D)">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nature Reviews Cance. 4, 839-849 (2004).</li>
<li>Bissell, M. J., Radisky, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putting+tumours+in+context%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Putting tumours in context.</a> Nat. Rev. Cancer. 1, 46-54 (2001).</li>
</ol>

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스페 로이드 잘 종양 생리학 및 약물 효능을 이해하고 항암 약물 개발을위한 유용한 도구를 제공하는 실제적인 모델을 제시한다. 이러한 응용 프로그램은 크게 만 표준 실험 실용 액체 처리 도구 및 선별 장비를 필요로 간단한 회전 타원체 생성 및 유지 보수 기술 혜택을 누릴 것입니다. 수성 개의 상 시스템 드롭 위상 내로 자발적 집합체 암세포의 사용은 효율적인 생산과 로봇 액체 핸들러 타원체의 유지, 및 인 시츄 약물 치료 및 상업적인 시약 및 도구 세포 반응의 종점 분석을 허용한다. 따라서,이 기술의 주요 장점은 3D 암 세포 배양의 기존 접근 방식을 통해이며, 신약 개발을 촉진 할 수있는 검사 플랫폼을 제공한다. 마이크로 웰 플레이트 내에서 균일 한 크기의 타원체를 생성하면 유사한 기준 셀룰러 교류를 보장하기 위해 높은 처리량 검사 애플리케이션을위한 매우 중요하다모든 타원체에 tivity 수준. 공기 변위 피펫 팅기구 액체 핸들러를 사용하여, 상...

세포 기반 분석법을 개발 및 새로운 항암 약물의 발견을위한 중요한 도구를 제공한다. 1,2 역사적으로, 암 세포의 단층 배양 물은 암 세포의 특정 유형에 대한 후보 화합물의 효과를 조사하기 위해 사용되어왔다. 표준 배양 플레이트에 단층 문화의 유지 보수의 용이성, 시약을 첨가 한 상용 로봇 도구와 표준 플레이트의 호환성 및 화학 물질에 대한 세포 반응의 다운 스트림 분석을위한 검사 장비와는 2D 문화에게 매력적인 도구를 렌더링의 주요 장점은 약물 테스트를 위해. 3 불행하게도, 단층 세포 분석은 종종 신약 개발과 발견을 매우 비용이 많이 드는 과정을, 생체 내에서 화합물의 효능을 예측하지 못한다. 4,5 제약 회사 학술 단위, 만 ~ 1 %로 상당한 투자와 노력에도 불구하고 항암제의 임상 시험에서 약물이 승인되었다지난 20 년간 FDA에 의해. 차원 배양 및 생체 내에서 암세포의 복잡한 3D 환경 사이 6 격차가 단층 배양 시스템의 주요 단점이다. (7) 따라서, 설정에서 종양 세포에 대한 후보 화합물 스크리닝은 더 밀접하게 닮았다 3D 종양 환경은 새로운 화학 요법 약물의 개발을 촉진 할 수있다. (8) 암세포 타원체는 시험관 내에서 중요한 3D 종양 모델을 제시한다. 9,10 타원체는 비 - 부착 표면 또는 스피너 플라스크, 액체 오버레이, 미세 마이크로 같은 기법을 사용하여 현탁액 중의 암세포의 자발 또는 유도 조립체를 통해 형성 컴팩트 클러스터 아르 . 어레이, 미세 유체 및 매달려 방울도 11 ~ 16 타원체는 형상과 중앙 영역에 산소, 영양분, 약물 화합물의 제한으로 전송을 포함한 고형 종양의 주요 기능을 모방; 따라서, 그들은 더 밀접하게 약물 respon를 재생단층 문화에 비해 고형 종양의 자체.이 현저한 이점에도 불구하고 17 ~ 19, 타원체 정기적으로 암 세포에 대한 화학 물질의 스크리닝에 사용되지 않습니다. 상업적으로 이용 가능한 로봇 및 심사 / 이미징 도구와 호환되는 표준 높은 처리량 설정에서 균일 한 크기의 타원체를 생산 난이도는 신약 개발 파이프 라인으로 회전 타원체 문화의 결합을 방해. 사용자 정의 재료와 플레이트는 최근 이러한 요구를 해결하기 위해 시중에서 판매되고 있지만, 비용을 고려은 광범위한 사용을 방지. 새로운 매달려 드롭 플랫폼과 미세 마이크로 우물을 사용하여 높은 처리량의 일관된 크기의 타원체를 생산하는 기능이있는 두 가지 주요 기술. 13,16,20 그러나, 두 가지 접근 방식은 특별한 접시와 제작이 비싸고 엔드 포인트 사용자를위한 불편 장치가 필요 핵심 연구 센터 및 제약 산업 대부분의 주요 EF에서새로운 항암 약물의 발견을위한 요새가 만들어진다. 드롭 플레이트 매달려의 최근 디자인 세포 함유 방울의 안정성에 약간의 개선에도 불구하고, 판 매 다른 구멍은 여전히 방울의 확산 / 병합을 방지하기 위해 문화 중에 사용됩니다. (16)이 크게 실험 처리량을 감소시킨다. 의약품 추가 및 갱신은 수동 또는 로봇 피펫으로 어려운이 판 구성은 플레이트 리더로 기존의 검사 장비와 쉽게 호환되지 않기 때문에 타원체는 생화학 적 분석을위한 표준 플레이트에 전달 될 ​​필요가있다. (21) 마이크로 웰은 또한 소프트 리소그래피를 사용하여 제작 제어 크기 회전 타원체 생산을 할 수 있습니다. 13, 20을하지만, 표준 피펫 팅 툴이 플랫폼의 호환성은 단일 처리 조건에 모든 구 상체를 노출, 다른 약 화합물 / 농도 개별 타원체의 치료 방지 할 수 있습니다. 따라서,이 방법은 높은 적합하지 않다여러 화합물 / 농도의 동시 테스트를 필요로 처리 화합물 스크리닝. 이러한 장애를 극복하기 위해, 표준 96 웰 플레이트에서 일관 크기 암세포 타원체의 높은 처리량의 생산을위한 새로운 기술이 개발되었다. 22, 23 접근법은 폴리에틸렌 글리콜 중합체 수성 개의 상 시스템 (ATPS ()에 기초 상 형성 중합체와 같은 PEG)과 덱스 트란 (DEX). (24) ATPSs는 최근 셀의 미세화를 가능하게하는 새로운 세포 생물학적 다양한 응용 분야에 활용이 높은 수성 미디어의 셀에 생물학적 시약의 전달을 현지화하고있다. 25 ~ 32을 형성하기 회전 타원체가 암세포 DEX 수성 상과 현탁액의 서브 드롭 마이크로 리터와 혼합이 잘 함유 수성 침지 PEG 용액 상으로 피펫 팅한다. 드롭 타원체의 형성을 용이하게하기 위해 침지 위상 및 경계 셀에서 혼화 남아있다. 꼬마 도깨비ortantly, 높은 수성 침지 단계는 회전 타원체의 세포에 영양분을 제공하며, 미디어 삼투압 변화 및 ​​약물 농도의 변동을 일으키는 다른 분석법에 공통 매체 증발의 잘 알려진 문제를 최소화한다. 이 기술은 회전 타원체 생산에만 표준 96- 웰 플레이트에서 시판 시약 피펫 팅 도구를 사용하여 약물 치료를 가능하게한다. 중요한 것은, 타원체의 세포 반응의 분석은 표준 생화학 검정 및 플레이트 판독기를 사용하여 동일한 플레이트에서 수행된다. 로봇 액체 처리에 대한 접근 방식의 ATPS과 적응성 작업의 용이성 모노 문화 및 공동 문화 모두의 높은 처리량 생성이 간단 실험실 기술을 타원체 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 개선 된 테스트 처리량 및 테스트 화합물과 redu의 수가 증가 비용 효율성 (와 약물 개발 및 검색 프로세스에 암 세포 타원체의 통합을 향해 앞으로 중요한 단계가 될 것입니다CED 시약 소비)과 효율성 (시간에 손을 감소). ATPS 접근법을 사용하여 96- 웰 플레이트에서 암세포 타원체의 로봇 제조 상세한 프로토콜 설명한다. 또한, 얻어진 타원체와 상용 생화학 분석을 이용하여 세포 반응의 분석 하류의 약물 치료의 세부 사항이 제시된다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents and Consumables</td></tr><tr><td>Polyethylene glycol, MW: 35,000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94646</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, MW: 500,000</td><td>Pharmacosmos</td><td>5510 0500 9007</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>12306C</td><td></td></tr><tr><td>글루타민</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>항생제</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>클라세인 AM</td><td>라이프 테크놀러지</td><td>C3100MP</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>라이프 테크놀러지</td><td>33342</td><td></td></tr><tr><td>시스플라틴</td><td>스펙트럼 케미컬</td><td>15663-27-1</td><td></td></tr><tr><td>프레스토블루</td><td>라이프 테크놀로지</td>스<td>A-13261</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-108</td><td>시그마 알드리치</td><td>542342</td><td></td></tr><tr><td>일회용 팁 (10 &마이크로; l)</td> <td>형광</td><td>C-P10V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>일회용 팁 (70 &micro; l)</td> <td>Fluotics</td><td>C-P70V11.ST</td><td></td></tr><tr><td>둥근 바닥 96 웰 플레이트</td><td>Nunc</td><td>268200</td><td></td></tr><tr><td colspan = "4">Equipment</td></tr><tr><td>Liquid Handler</td><td>Agilent Technologies</td><td>SRT Bravo</td><td></td></tr><tr><td>Microplate Reader</td><td>Biotek Instruments</td><td>Synergy H1M</td><td></td></tr></tbody></table>

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

암세포 스페로이드는 항암제 검사 응용을 위한 유의미한 무혈관 종양의 체외 모델을 제시합니다. 이 작업에는 고처리량 96웰 플레이트 형식으로 단일 배양 및 공동 배양 스페로이드를 모두 생산하기 위한 자세한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 이 접근법은 수성 2상 시스템을 사용하여 세포를 두 번째 수성 상 내에 침지된 더 밀도가 높은 수성 상의 한 방울로 제한합니다. 방울은 웰 표면에 놓이고 세포를 근접하게 유지하여 단일 스페로이드를 형성합니다. 이 기술은 크기 제어 스페로이드를 생산하고 화합물 스크리닝 응용 분야를 위한 스페로이드 생산 프로세스를 촉진하기 위해 로봇 액체 처리기에 적용되었습니다. 임상적으로 사용되는 약물로 처리된 스페로이드는 약물 투여량이 증가함에 따라 세포 생존율이 감소하는 것으로 나타났습니다. 스페로이드 생성을 위해 표준 마이크로 웰 플레이트를 사용하면 마이크로 플레이트 리더로 약물 처리된 스페로이드의 암세포 생존력을 간단하게 분석할 수 있습니다. 이 기술은 로봇으로 구현하거나 수동 파이펫과 같은 다른 액체 취급 도구와 함께 간단하게 구현할 수 있습니다.

로봇 액체 핸들러의 워크 스테이션. 그림 1의 피펫 팅 헤드와 4.6에서 타원체의 로봇 인쇄에 사용 된 모든 방송국이 표시되어있다. 이미지는 팁 상자에 대한 두 개의 서로 다른 스테이션 (한 믹싱 팁 세트와 세포 현탁액 수성 DEX 상 혼합물의 / 분배를 흡입에 대한 두 번째 세트)를 사용하는 방법을 보여줍니다. 전체 셋업은 무균 상태를 유지하기 위해 표준 생물학적 안전 캐비닛 내에 수납된다. 2 개의 상, 수성 시스템 &quot;인쇄&quot;프로세스의 개략적 인 도표를 나타낸다. 수성 DEX 단계 (블루, 패터닝 단계)에서 세포 현탁액 로케이션 피펫 팁은 가까이에 그 콘텐츠를 분배하도록 수성 PEG 단계 (핑크, 침지 단계)를 함유하는 96 웰 플레이트의 둥근 바닥 웰 내로 하강 잘 바닥. 얻어진 DEX 위상 강하 확산되는 암세포를 제한하고 결과 세포 - 세포 상호 작용을 촉진세포 및 회전 타원체 형성 응집. 회전 타원체 형성은 <s...

수성 2상 시스템을 사용하여 고처리량 96웰 플레이트 형식으로 암세포 스페로이드를 로봇 프린팅하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

이 절차의 전반적인 목표는 항암제 테스트에 활용하기 위해 표준 고처리량 형식으로 암세포 pH를 형성하는 것입니다. 이는 먼저 정해진 농도의 두 가지 폴리머인 폴리에틸렌 글리콜과 덱스트란을 세포 배양 배지에 용해하여 성공적인 수성 이상 시스템을 형성함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 대상 세포를 원하는 세포 밀도의 2배로 준비하고, 세포 현탁액을 동일한 부피의 수성 덱스트란 상과 혼합하는 것입니다.그 다음 96-웰 플레이트를 수성 폴리에틸렌 글리콜 상으로 채우고, 액체 핸들링 로봇을 사용하여 세포가 포함된 덱스트란 상의 서브 마이크로리터 방울을 웰에 분주합니다. 다음 단계는 24시간 배양 후 96-웰 플레이트 내의 스페로이드 형성을 확인하고, 관심 있는 항암제를 웰에 직접 첨가하는 것입니다. 마지막으로, 표준 플레이트 리더와 호환되는 생존능 분석법을 사용하여 대조군인 비처리 스페로이드 대비 약물 처리된 스페로이드의 생존율(%)을 나타냅니다.이 기술이 현수 적하법(hanging drop method)이나 미세 가공 웰(micro fabricated well) 방식과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은 맞춤형 플레이트나 장치가 필요하지 않으며, 고효율의 구체(sphere) 형성 및 약물 테스트가 가능하다는 점입니다. 이 방법은 암 연구의 핵심 질문을 해결하고 항암 화학요법제의 발견을 가속화하는 데 도움이 될 수 있습니다. 또한, 이 기술은 보다 관련성 높은 종양 모델을 통해 화학 화합물의 고효율 스크리닝을 가능하게 하여 새로운 항암제를 식별할 수 있으므로, 암 치료에까지 그 영향이 미칩니다.본 방법에 익숙하지 않은 연구자라도 암세포 스페로이드와 마이크로 웰 플레이트를 편리하게 제작할 수 있으며, 표준 실험 도구와 로봇 툴을 사용하여 약물 처리 실험을 용이하게 수행할 수 있습니다. 먼저, 폴리에틸렌 글리콜 0.5 g을 정밀하게 측정하여 멸균된 15 mL 원추형 튜브에 담긴 완전 성장 배지 9.5 mL에 첨가합니다. 혼합물을 1분 동안 Vortex하여 5% w/v 수용성 폴리에틸렌 글리콜 상 10 mL를 준비합니다. 그다음, 덱스트란 0.128 g을 측정하여 0.87에 첨가합니다.멸균된 1.5 mL 마이크로 원심 분리 튜브에 2 mL의 완전 성장 배지를 넣고 Vortex 합니다. 이 혼합물을 1분 동안 섞어 12.8% w/v 수성 dextran 상 1 mL를 준비합니다. polyethylene glycol 용액과 dextran 용액을 모두 37 °C 항온 수조에 1시간 동안 둡니다.완전한 용해를 돕기 위함입니다. 1시간 후 발생할 수 있는 오염을 방지하기 위해 캡이 수면 위에 유지되도록 하십시오. 폴리에틸렌 글리콜 안면 용액을 꺼내 5 mL 멸균 플라스틱 주사기에 넣으십시오.불순물을 제거하기 위해 용액을 0.2 micron 공극 크기의 시린지 탑 필터로 여과합니다. 폴리에틸렌 글리콜과 덱스트란 상 용액은 사용 전 4°C에서 최대 24시간 동안 보관하십시오. M-D-A-M-B 1 57 유방암 세포주와 같이 분석하고자 하는 암 세포를 90~100% 합쳐질(confluent) 때까지 배양합니다.그런 다음 표준 기술을 사용하여 세포를 수확하고 헤모사이토미터(hemo cytometer)로 수율을 측정합니다. 펠렛을 성장 배지와 STRAND 용액을 1:1로 혼합한 액체에 재현탁하여 1mL당 5,000만 개의 세포 농도가 되도록 합니다. 이렇게 하면 0.3µL 방울당 약 15,000개의 세포 밀도가 확보됩니다. 동봉된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 Oncoat로 사전 코팅된 비부착성 96-웰 플레이트의 각 웰에 여과된 5% 수성 폴리에틸렌 글리콜 상을 50µL씩 분주합니다. 폴리에틸렌 글리콜 첨가는 멀티채널 피펫을 사용하여 수동으로 수행하거나, 액체 핸들러를 사용하여 로봇 방식으로 수행할 수 있습니다. 피펫으로 세포 현탁액을 부드럽게 위아래로 섞어 재현탁합니다.시간이 지나 가라앉은 세포들을 현탁시킵니다. 384 웰 플레이트의 한 열에서 매 다른 웰(every other well)에 현탁액 20 µL를 첨가합니다. 그런 다음 액체 핸들러의 전원을 켜고 피펫팅 헤드를 홈 위치로 이동시킵니다.좌표를 등록하려면 소스 플레이트, 목적지 플레이트 및 피펫 팁 박스를 액체 핸들러 워크스테이션의 지정된 위치에 배치하십시오. 자동 액체 핸들러를 사용하여 세포 현탁액 부피의 약 3분의 1에 해당하는 혼합 부피를 선택하고, 워크스테이션에서 혼합용 피펫 팁을 사용하여 액체 핸들러 피펫팅 헤드의 배럴 한 열을 채웁니다. 액체 핸들러를 사용하여 384-웰 소스 플레이트 내의 세포 현탁액을 혼합하십시오.그런 다음 팁을 빈 팁 박스에 배출하십시오. 다음으로, 피펫팅 헤드의 배럴 한 열에 10 µL 분주용 피펫 팁을 장착하십시오. 액체 핸들러를 사용하여 소스 플레이트의 각 피펫 팁으로 세포 현탁액 0.3 µL를 흡입하십시오.그 다음, 5% polyethylene glycol 상이 50 µL 포함된 목적 플레이트의 한 열 웰에 세포 현탁액을 분주합니다. 분주 높이는 0.5 mm로 설정하고, 유속을 1 µL/s 또는 그보다 느리게 하여 방울을 분주합니다. 목적 플레이트의 모든 열에 세포가 배치될 때까지 이 과정을 반복합니다. 완료 후, 워크스테이션에서 목적 플레이트를 조심스럽게 꺼내어 약물 처리 전 37 °C, 5% CO2 조건의 습윤 환경에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.배양 24시간 후 96웰 플레이트의 각 웰에서 스테로이드 형성을 시각적으로 확인합니다. 테스트를 위해 시스플라틴과 같은 관심 약물을 연속 희석하여 준비합니다. 각 희석액이 최종 희망 농도의 2배가 되도록 스톡 약물 용액을 배양액에 희석합니다.96-웰 플레이트당 최대 5가지의 서로 다른 농도를 테스트할 수 있습니다. 각 웰의 폴리에틸렌 글리콜 상에 약물 용액 50 µL를 첨가하십시오. 배지만 첨가한 대조군을 포함하여 처리 그룹당 8개 웰로 구성된 2개 열을 사용하십시오.스테로이드를 약물과 함께 37°C, 5% CO₂ 조건에서 빛을 차단한 상태로 48시간 동안 배양합니다. 48시간 후, 신선한 약물 희석액을 준비하고 원하는 농도의 신선한 약물이 포함된 배지를 50 µL 추가하여 약물을 교체합니다. PHE를 다시 37°C, 5% CO₂ 조건에서 빛을 차단한 상태로 48시간 동안 더 배양합니다.다음으로, 함께 제공된 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 각 웰에 세포 생존율 시약을 추가하고, 빛이 차단된 상태에서 37 °C 및 5% CO2 조건으로 6시간 동안 플레이트를 배양합니다. 분석이 완료되면 플레이트를 마이크로플레이트 리더기에 넣고, 여기 및 방출 파장을 각각 560 nm 및 590 nm에서 형광 신호를 측정합니다. 항암제의 고처리량 스크리닝을 위해서는 수백 개의 균일한 크기의 스테로이드를 형성할 수 있는 재현성 있는 방법이 필요합니다.여기에 제시된 그래프는 스페로이드를 형성하는 이 방법의 재현성을 강조합니다. 표준 96-웰 플레이트에서 스페로이드 직경의 평균은 332 µm였으며 표준 편차는 10% 미만이었습니다. 스페로이드 직경의 변동은 일반적인 정규 분포를 따르는 것으로 나타났습니다. 임상 화학요법 제제인 cisplatin의 다양한 농도에 4일 동안 노출되었을 때, 스페로이드는 처치 농도에 따른 의존적 반응을 보였습니다.결과적인 50% 치사량 약물 농도는 4.67 Micromolar로 나타났습니다. 치사 농도의 약물 처리 시 암세포가 붕괴되었습니다. 이 기술을 숙달하면 약 2시간 이내에 완료할 수 있습니다. 이 절차를 수행하는 동안, 스테로이드 프린팅 실험으로 넘어가기 전에 수성 2상 형성 여부를 빠르게 확인하는 것이 중요합니다. 이 절차 이후에는 암세포 스테로이드 내 약물의 분자 표적에 관한 추가적인 질문에 답하기 위해 샘플의 스테로이드 면역 조직 화학 염색의 저온 절편 제작 및 기타 생물학적 분석과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.이 영상을 시청한 후, 여러분은 표준 플레이트와 장비를 사용하여 간편한 방식으로 3D 암세포 배양물을 형성하고 고처리량 방식으로 약물 테스트를 수행하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

robotic-production-cancer-cell-spheroids-with-an-aqueous-two-phase

Research

연구

JoVE Journal

Bioengineering

생명공학

우리는 상업적으로 이용 가능한 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 균일 한 크기 및 구성 제어 종양 상체의 (수천 수백 수천) 많은 수의 생성을위한 프로토콜을 소개합니다.

마이크로 웰 플레이트를 사용하여 크기 조절 종양 상체 많은 수의 생산

여기에서는 세포 응집을 통해 3D 세포 스페로이드를 형성하기 위한 빠르고 유연한 프로토콜에 대해 설명합니다. 이는 여러 세포 유형에 쉽게 적용할 수 있으며 세포 이동, 침습 또는 아노이키스 분석을 포함한 다양한 응용 분야와 세포-매트릭스 상호 작용의 이미징 및 정량화에 적합합니다.

3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법

우리는 치료 평가 우리 셀 라인에 머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 실험적인 치료 regimens의 현재 표준 테스트를 가능 하 게 한 회전 타원 체를 기반으로, 3 차원 생체 외에서 모델의 진화 설명 민감성 및 미래에 인간의 표본에서 1 차 셀에 저항.

머리와 목 편평 상피 세포 암에 대 한 회전 타원 체 기반 3D 셀 문화 모델에서 테스트 하는 치료

다양 한 질병의 표시 더 순수 관련 모델 개발 및 구현에 약물 발견 프로그램 되. 여기에 설명 된 새로운 모델 시스템 spheroids를 경작 하 고 종양학 신약에 대 한 검색 하는 높은 처리량 1536-잘 접시 기반 시스템에서 상영 될 수 방법을 3 차원 종양을 보여 줍니다.

마약 검사에 대 한 높은 처리량 3 차원 종양 Spheroids의 생성

이 프로토콜에 대 한 3 차원 구조적된 암 세포 (spheroids)에서 실시간으로 immunotherapeutic 리디렉션된 T-셀 (자동차 T-세포) 세포 독성을 평가 하기 위해 설계 되었습니다.

자동차 T 세포에 의해 회전 타원 체 살인 분석 결과

이 프로토콜은 약물 을 평가하기 위해 증식, 세포 독성 테스트, 유세포 분석, 면역 형광 염색 및 공초점 이미징의 정량화를 포함한 환자 유래 스페로이드 생성 및 하류 분석을 설명합니다. 반대로 신생물 치료제로 후보자의 잠재력. 이 프로토콜은 각 환자 및 질병 단계에 대한 특정 약물을 식별하여 정밀 의학을 지원합니다.

암 줄기 세포를 표적으로 하는 반대로 신 생물 성 약 검열을 위한 생리학 환자 파생된 3D Spheroids

이 프로토콜은 대규모 고함량 스크리닝 및 분석에 적합한 방식으로 세 가지 유형의 구상체를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이들이 스페로이드 및 개별 세포 수준에서 어떻게 분석될 수 있는지를 보여주는 예들이 제시된다.

고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

현재 프로토콜은 원발성 암세포에서 3D 종양 배양 모델을 생성하고 세포 생존력 분석 및 현미경 검사를 사용하여 약물에 대한 민감도를 평가하는 것을 설명합니다.

환자 유래 종양 샘플에서 3차원 스페로이드 설정 및 약물에 대한 민감도 평가

재현성이 높은 스페로이드를 성장시키고 이미지 캡처 및 단백질체학을 사용하여 표현형 특성을 분석하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

기능적 3D 스페로이드 세포 배양의 반자동 표현형 분석

이 글에서는 3차원 종양 스페로이드를 구성하기 위한 표준화된 방법을 보여줍니다. 자동화된 이미징 시스템을 사용한 스페로이드 관찰 및 이미지 기반 딥러닝 분석을 위한 전략도 설명합니다.

약물 평가 연구를 위한 3D 종양 스페로이드 생성

여기에서는 후속 다중 파라미터 라이브 셀 현미경을 수행하기 위한 다양한 다세포 스페로이드 형성 방법을 설명합니다. 형광 평생 이미징 현미경(FLIM), 세포 자가형광, 염색 염료 및 나노 입자를 사용하여 살아있는 3차원(3D) 암 및 줄기 세포 유래 스페로이드에서 세포 대사, 저산소증 및 세포 사멸을 분석하는 접근 방식을 시연합니다.

다세포 스페로이드의 생산 및 다중 파라미터 Live Cell Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (FLIM)

학습하세요 암 세포 타원체의 로봇 생산 방법을 통해 항암 약물 테스트를 수행하는 고효율 프로토콜입니다. 수성 2상 시스템을 활용하여 96웰 플레이트에서 균일한 스페로이드를 형성하고 약물 효능을 신속하게 평가할 수 있습니다.

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

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