Name: 로봇 액체 처리 시스템을 사용하여 확장 가능한 96 웰 IPSC 문화 기반 플레이트 및 생산 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: 학습하세요 로봇 액체 처리 시스템을 활용한 96웰 플레이트 기반 iPSC 배양 및 확장 기법을 통해 심근세포로의 분화 가능성을 검증하는 방법을. 이 기술은 재생의학 및 맞춤형 치료 개발에 활용됩니다.

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이 작품은 NIH 보조금, R44 GM087784 및 R01 HL109505에 의해 부분적으로 지원하고있다. 저자는 확장 된 기술 지원, 길슨에서 INC을 기술 및 OEM 팀 감사합니다.

저자 MKC, MJG, EEB, NJD 및 소유주 또는 여기에 설명 된 로봇 프로토콜을 잉태하고 개발 InvivoSciences의 개발 직원, INC의 시간에 있었다. TW는 InvivoSciences INC의 CSO이다. SH는 길슨 주식회사의 직원입니다.

본 연구에서 우리는 miniaturizes 또한 효율적인 스케일 업을 가능하게하고있는 동안 96 웰 플레이트 형식으로 공급하고 통로를 자동화 IPSC 생산을위한 로봇 문화의 방법을 개발했다. 액체 처리 로봇은 일상적으로 효소 분해에 의해 정기적으로 IPSC 식민지와 통로를 공급하는 데 사용되었다. 로봇과 같은 세포 외 기질 겔 코팅 된 플레이트를 제조 및 파종 밀도 구배를 수행하도록 프로그램 하였다. 섬유 아세포 및 지방 유래 iPSCs가 큰 20 유로, 약 3 개월 동안이 시스템에서 배양했을 때 안정적인 핵형이었다로, 만능은 유지되었다. 두 세포주는 심근 세포로 분화 할 수 있었다. 함께, 여기에 설명 된 프로토콜의 컬렉션 문화 줄기 세포로, 아주 작은 줄기 세포 문화 체험, 또는 전문 문화 장비에 제한된 액세스 권한이있는 사용자를 가능하게하고 높은 전지 생산 또는 최소한의 노동과 비용으로 처리하는 멀티 라인을 얻을 수 있습니다. 44,47 - 49 능성을 유지하기 위해. 확장 성 줄기 세포 배양 수율 만능 세포의 다른 형식 20,23,29이 판 기반의 방법은 적응 같은 서스펜션에 문화 형식의 본질적 변화, 화학 물질이나의 Rho 키나아제 억제제 (20)의 장시간 사용을 소포제의 사용을 필요로하지 않지만. 배양 조건이 유사하기 때문에이 판 기반의 방법은 따라서 신속하고 예측, 새로운 라인을 수용 할 수 있습니다. 질병 모델링을위한 iPSCs의 사용은 4,6,19,50 증가함에 따라, 새로운 IPSC 라인은 지속적으로 생성됩니다. 형식에 전환 장벽이 L이기 때문에 여기에 설명 된 기술은 높은 볼륨 및 처리량 중간에 문화의 새로운 라인에 가장 적합아야. 이것은 또한 식민지를 유지하기 위해 필요한 노동 및 장비 마찬가지입니다. 포맷 처리는 유도 및 분화와 같은 지시 IPSC 라인 배양 성능을 검증하기 위해 사용되는 환경과 비슷하기 때문에 마지막으로,보다 예측이 될 가능성이 높다. 도 8은 96 웰 플레이트에 줄기 세포 생산의 스케일 업을위한 하나의 전략을 예시한다. 한 접시 (사이클 0) 로봇 (12)의 새로운 판, 12 배 증가 (1주기 0) 시드하는 데 사용됩니다. 공급 몇 일 후, 십이 판 중 하나는 열두 판 (주기 2주기 1)의 또 다른 세트를 시드 계대입니다. 나머지 열한 플레이트 다른 용도로 사용할 수 있으며, 시스템의 구성 요소의 생산을 나타낸다. 이 속도로, 한 판의 통과는 11 판 매 사이클, 또는 3-4 일마다를 제공 할 것입니다. 주기 3 년주기 (3)에주기 2의 전환과 같이 여러 판이 계대 할 때이 방법이 더 확장 할 수 있습니다,이 판은항상 식민지를 유지하고 24 새로운 판을 배정 할. 나머지 22 판은 모든 통로 사이클 후 사용 후 사용할 수 있습니다. 유지주기의 어떤 시점에서 사용자는 증산 이상의 플레이트를 시드 할 수있다. 한 가지 예는 통로에 두 개의 성장주기에 대한 모든 열 것입니다. 제 1 통로는 열두 판에 한 판을 변환하고, 열두 판의 각각 144 판을 시드하는 데 사용됩니다. 이 경우, 사용자는 하나의 플레이트로 시작하고 두 개의 통로, 또는 배양의 약 1.5 주 후에, 판 (144)을 갖는다. 예를 들어, 섬유 아세포 및 지방 IPSC 라인 통로 96 웰 플레이트 당 약 25-75000000 세포를 준비 할 때, 수율. 144 판을 따라서 약 4-7 × 10 9 세포를 나타낼 수 있습니다. 로봇 (144) 96 웰 플레이트를 운반 노동 부담은 무엇인가? 이 작품의 목표 중 하나는 세포 배양 줄기 전통 (즉, 6 웰 플레이트)에 비해 노동을 감소 확장 성 줄기 세포 생산했다. 로봇 ACComplishes이 물리적으로 공급 및 계대 동안 각 플레이트를 처리 할 필요성을 경감함으로써. 선형 그것과 같은 96 웰 플레이트 생산 규모는 기존의 6 웰 플레이트에, 기술자가 판 작업 소요 시간이 로봇 문화를 사용하여 훨씬 적은 것입니다 동안. 로봇 문화의 생산 효율이 차이 (도 9)로부터 도출된다. 그것은 기술자의 플레이트 약 3.5 분, 인큐베이터에서 6 웰 플레이트를 제거 현미경에 그것을 확인 후 대기음 및 공급 수 발견되었다. 비교에서, 기술자는 약 30 초 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 제거하고, 로봇에 배치하기 전에 밀도 및 오염 현미경 검사에 보낸다. 상술 한 것과 유사한 확장 프로토콜 급전, 여섯 96- 웰 플레이트를 약 21 분, 또는 플레이트 당 3.5 분 걸린다 로딩 공급 될 수있다. 접시를 공급하는 총 경과 시간은 로봇 사이의 비교입니다기술자가 로봇에 대한 여섯 판 (플레이트 당 30 초 검사) 처리 만 3 분을 소비하는 반면 IC 및 수동 방법,하지만 손 피드 6 판 기술자는 모두 21 분 필요합니다. 수동으로 8 시간에 반대하고 로봇이 실수가 판을 취급 또는 액체를 전송하지 않습니다 않을 것 같은 그림 9에서 볼 수 있듯이, 기술자가 로봇을 사용하여 144 판을 처리 소요 시간은 약 1.2 시간이다. 여기에 설명 된 96 웰 IPSC 배양 방법은 복잡한 심사 작업을위한 다루기 쉬운 플랫폼을 제공합니다. 각 웰은 유 전적으로 동일한 같은 초기 풀에서 동일한 밀도로 시드이기 때문에, 변수는 판에 분산 및 조건을 분리하기 위해 상업적으로 사용할 수 저수지와 로봇에 의해 유지 될 수있다. 여기에는 줄기 세포 성장 배지 개발 34,35,47, 기판 또는 배양 조건 테스트와 줄기 세포를 이용하여 독성 연구와 같은 실험에 유용 할 것이다각 줄기 세포주 최적 콜로니 크기 및 통로 요건의 관점에서 고유하기 때문에 (51). 한 번 수확 열 통로 동안 기계적 교반 및 반송 주파수를 조작하여 파종 밀도, 먹이 주파수 및 통로 처리를 변조하는데,이 시스템을 사용할 수있다. 이러한 변수의 반복을 통해, 사용자가 신속하게 새로운 라인의 배양에 적합한 조건의 세트를 찾거나 새로운 배양 기술을 개발할 수 있도록한다. 로봇 시스템 (96)은 또한 평행하지만 독립적 줄기 세포 콜로니를 유지할 수있다. IPSC는 체세포로부터 유래 또는 유전자 조작 후 복제 할 때, 많은 병렬 클론 가능성 IPSC 라인을 산출하기 상영된다. 단일 세포를 96 웰 플레이트에 접종되면,이 시스템은 공급하고 각 콜로니를 유지 통로 96- 웰 플레이트를 분리. 이것은 잠재적 인 클론을 선택할 때 매우 높은 처리량을 가능하게하고 물리적으로 96 평행선을 배양의 어려움을 제거합니다. 이 방법 또한그 재료가 병렬 분석을 위해 쉽게 사용할 수 있도록 llows 각 클론의 생산을 축소. 마지막으로, 우리와 완전 자동화 된 문화를 활성화 인큐베이터에서 접시를 제공하는 로봇 판 인신 매매 시스템이 배양 기술을 통합 구상. 이 여기에 설명 된 기본 프로토콜이 다른 판 기반 시스템에 양도하기 때문에 더 큰 확장을 위해 더 복잡한 로봇으로 수행 할 수 있습니다. 프로토콜에 해결하기위한 첫 번째 중요한 단계는 방지하고 1.5 및 4.2 단계 등의 오염을 확인 것들이다. 상술 한 바와 같이 양호한 무균 기술 상식이 이용되는 경우 오염은, 성공적으로 회피 할 수있다. 이 지시 단계에서 오염이 프로토콜에서 그렇게하는 연산자 체크 상당히 오염의 위험을 줄일 수 있는지에 관계없이, 줄기 세포 배양 형식에 필수적이다. 적절한 세포 외 기질 겔 애플리케이션 초이다 ESS이 프로토콜의 전반적인 성공에 ential 단계. 적절 96- 웰 플레이트를 코팅없이 줄기 세포는 성장하지 않는다. 한 가지 일반적인 문제는 불완전한 잘 코팅입니다. 경험 기포, 정전 인력과 모세관 작용이 완료된 웰 코팅을 방해 것을 보여 주었다. 사전 습윤 단계 (1.6) 상당히 잘 바닥 코팅을 개선하기 위해 개발되었으며 건너 뛸 수 없습니다. 세포 외 기질 겔 코팅이 균일하게 잘 저면과 측면에 걸쳐 분산되어인가 될 때 사전 습윤 공정되도록 플라스틱 96- 웰 플레이트의 외관상의 소수성을 감소시킬 것으로 보인다. 또한 부드럽게 한 번, 심지어 세포 외 매트릭스 겔 용액 분배를 보장하기 위해 코팅 된 깨끗한 손에 96 웰 플레이트를 누릅니다하는 것이 좋습니다. 해리 파라미터는 또한 최적화하는데 중요하다. 효소 또는 EDTA 기반 해리 시약과 확장 배양은 또는 통과하는 동안 목표되지 않을 수 있습니다 하나의 세포에서 발생합니다. 따라서, 작업자해리 시간, 분쇄 력 및 세척 반복이 식민지의 형태와 건강에 영향을 미칠 그에 따라 조정하는 방법에 특별한주의를 기울여야한다. 여기에 설명 된 기술에 한계를 이해는 성공적인 운영에 매우 중요하다. 다른 세포 배양 환경에서와 같이, 96 웰 플레이트의 사용은 비교적 높은 오염의 위험을 제공한다. 상술 한 바와 같이, 기술자는 먹이 계대 동안 각 플레이트를 처리하고; 예를 들면, 뚜껑을 개방 로봇 침대 플레이트 퍼팅 한 현미경 플레이트를 검사 할 때. 단계 1.5 이후에 언급 한 바와 같이 따라서, 이러한 침대에 경사 가열 블록 또는 수직 핀으로 어떤 접시 뚜껑의 내부를 만지거나 잠재적으로 오염 된 표면에이 부분을 노출하지 필수적입니다. 프로토콜 개발 과정에서이 제한을 발견하고 불임을 유지하기 위해 판 뚜껑을 보유하는 랙을 개발하는 원동력이었다. 마찬가지로, 골 저수지, 피펫 팁과 오그들은 환경에 열고 기술자에 의해 처리하기 때문에 액체 처리 로봇 침대에 THER 공급 장치는 오염의 잠재적 인 소스입니다. 따라서, 좋은 무균 기술은 노출 된 문화 자료 또는 열려있는 액체를 통해 움직임을 줄이는 등의 적용되어야한다. 또 다른 제한은 프로토콜이 시각적&gt; 100 96 웰 플레이트의 각 웰에 의하면, 업 스케일링 될 때 성가신 점이다. 이것은 의심 우물을 식별하기 위해, 시각적으로 같은 혼탁 한 매체와 같은 오염의 징후에 대한 전체 판을 검사하여 처리 할 수​​ 있습니다. 미래의 스케일 업을 위해, 자동화 된 현미경과 세포 성장 및 오염의 가능성 지표의 사용은 인용한다. 요약하면, 여기에서 설명하는 높은 처리량 96 웰 기반 플랫폼 접시 형식으로 줄기 세포 배양 및 생산을위한 재현성, 높은 충실도 방법을 제공합니다. 이 방법은 세포 배양 동안을 막기 위해 최선을 다하고 필요한 경험, 장비 필요하고 노동 시간을 단축전통적인 접착 배양의 장점을 유지.

6 - 인간 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)의 사용은 시험 화합물, 재생 의학 및 질병 모델 (2) 2007 년 1 그들의 유도 이후 크게 증가하고있다. 이 수요는 비교할 수없는 양에서 체세포로 분화 할 수있는 만능 세포의 많은 수를 산출하는 IPSC의 능력에서 비롯됩니다. 분화 관한 기술들이 향상됨 7 - 그래서 고품질 iPSCs의 대량 생산에 대한 요구를 수행, 14 - 10과 인간 세포 또는 조직 모델링 및 세포 치료의 개발 (11)을 증가시킨다. 18 - 그것은 널리 다른 질병들, 심근 경색 또는 B 세포 기능 교체 IPSC 수십억 수억을 필요로 체세포 (15)을 유도 것을 인용한다. 약물 발견 및 정화 또한, 점점 더 복잡한 3D 조직 모델링herapy 세포 9,13,19 많은 수를 요구할 것이다. 모든 예에서, 정의 균일하고 재현성 iPSCs이 가능하고 생산 간단합니다. 조직 공학 및 이식 세포 및 생물 약제학 유래 줄기 세포를 제조하기 위해서는, 비용 효율적인 셀 제조 기술이 필수적이다. 이러한 기술이 성공적으로 대규모 비 IPSC 진핵 계 생산 배포 부분적 때문에 28 - 마이크로 캐리어 기판 (26)의 이용으로 25 또는 현탁액 - iPSCs의 미늘 생산 현탁 배양 물 (20) 상에 초점을 맞추었다. 몇몇 그룹은 만능 줄기 세포 20,21,23,24,29를 얻을 현탁 배양 시스템을 증명하고있다. 그러나 이러한 접근 방법은 조직 공학을 운전 LABORAT을하고, 새로운 차별화 프로그램을 개발 연구자들에게 쉽게 사용할 수없는 고가의 복잡한 시스템을 활용ORY 규모의 연구. 또한, 서스펜션과 미세 전달체 IPSC 문화가 응집을 조절하는 적응과 기술 또는의 Rho 키나제 억제제의 연속 사용으로 기존의 부착 IPSC 문화에서 찾을 수없는 화학 물질, 소포제 및 여과가 필요합니다. 세포에 물리적 스트레스는 기계적 교반에 의해뿐만 아니라 미세 전달체 충돌시 도입, 현탁 배양에 더 유행이다. 이러한 문제는 세포주는 현탁 배양 될 수 줄기 새롭게 생성되는 예측과 속도를 제한한다. 다른 사람들은 판 배양 기술 (30, 31)을 모방 로봇 플레이트 처리 시스템을 개발하지만, 이러한 플랫폼은 장비와 줄기 세포 배양과 관련된 근본적인 문제뿐만 아니라 작동하는 전문 지식에 대한 상당한 투자를 요구한다. 다음 작품은 자 급식, 표준 8 채널 로봇을 이용하는 액체 현상과 확장 성 IPSC 배양 시스템의 실시를 설명핸들러 및 96 웰 플레이트. 이 방법은 실험실 규모 IPSC 문화와 대량 IPSC 생산을 해소하기 위해 설계되었다 (예를 들어, 10 (7) - 기술자 당 일주일에 1.5 × 10 9 세포) 새로운 IPSC 기술 개발을들을 수 있도록 쉽게 큰 하드웨어 또는 노동 투자없이 생산을 확장합니다. 이 방법은, 설정 비교적 저렴​​없는 줄기 세포 배양, 프로그래밍 또는 엔지니어링 경험이 거의 필요 전용 세포 배양 후드 없이도 작은 설비 풋 프린트를 가지고, 자동화 된 처리량에 매체를 사용하는 표준 세포 배양 용 기재를 이용 전지 생산. 목표는 세포 배양을 막기 위해 새로운 실험실에서 이용 될 수있는 확장 가능한 줄기 세포 배양 할 수있는 시스템을 개발하는 수동 재배 그들의 생각을 개발하거나 줄기 세포를 대량 생산하는 경제적 인 수단을 원하는 사람들에게 장벽을 찾는 사람. 여기에 제시된 플랫폼에 기술자 영향을 제거세포 배양 줄기 일관된 줄기 세포의 생산을 가능하게 공급 통로 및 절차를 정규화한다.

<table><tbody><tr><td>96웰 플레이트</td><td>Corning</td><td>3596</td><td>96웰; 우물 부피: 360&nbsp; &#956; l; 세포 성장 면적 : 0.32&nbsp; cm2; 개별 포장</td></tr>된 <tr><td>Seahorse Trough</td><td>SeahorseBio</td><td>201308-100</td><td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td></tr><tr><td>Gilson Tips</td><td>Gilson</td><td>F167023</td><td>10 랙 Gilson 96 팁 D200 팁</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12500062</td><td>DMEM/F12 powder.&nbsp; 1L 정제된 세포 배양 등급의 물과 멸균 필터에 재현탁합니다.</td></tr><tr><td>성장 인자 감소 마트리겔</td><td>코닝</td><td>354230</td><td>본문에서는 "세포외 기질 겔"이라고 합니다. 마트리겔 GFR, 10&nbsp; ml</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>StemCell Technologies</td><td>5857</td><td>mTeSR1 hES 유지보수를 위한 완벽한 키트.</td></tr><tr><td>E8 Media</td><td>StemCell Technologies</td><td>5940</td><td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td></tr><tr><td>Y27632</td><td>AdooQ BioScience</td><td>A11001-50</td><td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Innovative Cell Technologies</td><td>ACCUTASE</td><td>본문에서 "단백질 분해 및 콜라겐 분해 해리 시약"이라고 합니다. 아카타제 500&nbsp; ml 멸균 세포 용액</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher</td><td>SH30256FS</td><td>PBS w/o Ca Mg 500&nbsp; ml, 6/pk</td></tr><tr><td>길슨 PIPETMAX</td><td>길슨</td><td>PIPETMAX</td><td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td></tr></tbody></table>

로봇 액체 처리 시스템을 사용하여 확장 가능한 96 웰 ipsc 문화 기반 플레이트 및 생산

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

다 능성 줄기 세포 배양의 지속적인 발전은 재생 의료, 약물 발견 및 안전성 시험에서 이들 세포를 사용하기위한 벤치 맡 사이의 갭을 ​​폐쇄한다. 조직 공학 및 이식 세포 및 생물 약제학 유래 줄기 세포를 제조하기 위해서는, 비용 효율적인 셀 제조 기술이 필수적이다. 만능 시간 경과 하류 애플리케이션 (예, 세포 분화) 세포의 안정적인 성능 유지 대규모 셀 생산에 가장 중요하다. 그러나 그 운영자가 상당한 변동성을 소개뿐만 아니라 스케일 업을하는 엄청나게 비싼 수있는 세포가 수동으로 배양되어 특히 달성하기 어려울 수 있습니다. 최소 기술자 참여 또는 경험을 필요로 액체 핸들링 로봇이 개발 된 멀티 채널 벤치 탑을 이용하여 오퍼레이터 영향 신규 줄기 세포 배양 프로토콜을 높은 처리량, 대규모 줄기 세포의 생산을 가능하게하거나 제거. 와이러한 프로토콜 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 직접 냉동 재고에서 공급이없는 조건에서 배양 96 웰 플레이트에서 유지. 때 통로 세포주 원하는 스케일 업 속도에 따라, 운전자는 쉽게 분할을위한 최적의 집단 밀도를 나타낸 일련의 이미지들에 기초하여 결정할 수있다. 그런 다음 필요한 시약은 원심 분리 단계없이 새로운 판에 식민지 분할을 수행 할 준비가되어 있습니다. 통로 (20) (~ 3 개월) 한 후, 두 IPSC 라인은 안정적인 핵형을 유지 줄기 세포 마커를 발현하고, 고효율로 심근 세포로 분화. 이 시스템은 96 웰 플레이트 용으로 설계된 새로운 분화 프로토콜 또는 유전자 조작의 후속 높은 처리량 검사를 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 애플리케이션에 대해 동일 줄기 세포의 대량 생산 기술 노동 부담을 감소시킬 것이다.

설명된 프로토콜을 통해 실험실은 프로그래밍 가능한 액체 처리 로봇과 96웰 플레이트를 사용하여 최소한의 노동력, 경험 및 장비 투자 비용으로 높은 처리량으로 확장 가능하고 접착력이 있는 줄기 세포 배양을 수행할 수 있습니다. 이 시스템에서 20회 이상 통과한 iPSC는 다능성, 정상 핵형을 유지했으며 심근세포로 분화되었습니다.

로봇 액체 처리 시스템을 사용하여 확장 가능한 96 웰 IPSC 문화 기반 플레이트 및 생산

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

다음 실험의 전반적인 목표는 확장 가능한 다능성 세포 배양을 재현성 있게 구축하는 것입니다. 이를 위해 먼저 사전 프로그래밍된 액체 핸들링 로봇을 사용하여 다양한 밀도로 인간 다능성 줄기세포를 분주합니다. 두 번째 단계에서는 96웰 플레이트에서 최적의 콜로니 밀도를 가진 웰을 시각적으로 식별하여 패키징합니다.그 후 유도 인간 다능성 줄기세포를 새로운 플레이트에 분주하여 자동 배양 및 추가 패키징 과정을 거칩니다. 결과적으로, 이 절차를 통해 인간 유도 다능성 줄기세포를 증식시켜 최종적으로 심근세포로 분화시키기 위한 최적의 분주 밀도를 선택할 수 있습니다. 이 기술의 함의는 중간 규모의 개인 맞춤형 및 재생 치료법 개발로 확장됩니다.URI potent 배양 로봇은 수일 내에 수억 개의 URI potent 줄기세포를 생산하는 데 적합하며, 이렇게 생산된 세포는 맞춤형 약물 테스트나 세포 및 조직 이식 치료를 위해 다양한 세포로 분화될 수 있습니다. 이 방법은 최적의 다능성 세포 배양 확장을 위한 파종 밀도 스크리닝에 적용되어 왔으나, 다른 다양한 세포 유형에 대한 새로운 분화 프로토콜을 최적화하고 확인하는 데에도 사용될 수 있습니다. 해당 절차는 본 연구실의 Neil Daily 제약 과학자가 시연할 것입니다. 배양액 공급 절차를 시작하기 전, 96웰 줄기세포 콜로니 플레이트의 오염 여부를 확인하고 세포 콜로니가 이상적인 계대 밀도 미만인지 확인하십시오.세포 상태가 양호하면 플레이트를 베드에 놓습니다. 액체 핸들링 로봇의 37 °C 경사 램프에 3번 위치를 지정하고 팁 랙을 베드에 로드합니다. 상온의 200 µL 피펫 팁을 1번 위치에 배치합니다.4웰 트러프를 베드 위치 2에 배치하고, 트러프의 3번 웰에 RO 키나아제 억제제가 포함되지 않은 상온의 신선한 줄기세포 성장 배지 8 mL를 채웁니다. 그런 다음 플레이트를 플레이트 홀딩 랙으로 옮기고, 로봇 제어 터치패드를 사용하여 순차적으로 Run the protocol colony feed one plate와 next를 선택한 다음, test run을 눌러 단계별 마법사를 통해 선택한 프로그램을 사전 테스트합니다. 프로토콜이 승인되면 run protocol을 선택하십시오. 피딩이 완료되면 96웰 줄기세포 콜로니 플레이트를 회수합니다.그런 다음 플레이트 커버에 피딩 세부 사항을 기록하고, 다음 피딩 또는 계대 배양 전까지 24시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 다시 넣습니다. 분할할 웰의 선택은 콜로니 밀도에 따라 달라집니다. 이 플레이트에 시딩 밀도 구배를 설정하고 며칠이 지나면, 분할하기에는 너무 밀도가 높은 웰, 분할하기에 이상적인 밀도의 웰, 그리고 여러 번의 피딩 사이클 후 계대 배양하기에는 너무 희소한 웰을 확인할 수 있습니다.96-웰 플레이트 내 대부분의 콜로니 사이 간격이 인접한 콜로니 직경의 25%인지 확인하십시오. 그렇지 않으면 후속 배양 시 콜로니들이 서로 겹쳐서 자라게 됩니다. 그런 다음 콜로니에 오염이 없다면 플레이트를 베드에 놓으십시오. 37°C 램프 위에 3개를 배치하고 베드에 팁 랙을 로드하십시오.실온의 200 µL 피펫 팁을 1번 위치에 배치합니다. 4-웰 트러프를 2번 베드 위치에 놓은 다음, 4번 웰은 비워 두고 3번 웰에는 Rho kinase 억제제 Y-27632가 첨가된 줄기세포 성장 배지 8.5 mL를, 2번 웰에는 30% 단백질 분해 및 콜라겐 분해 해리 시약 3.5 mL를, 그리고 1번 웰에는 PBS 4.5 mL를 각각 분주합니다.다음으로, 37 °C에서 예열하여 extracellular matrix gel이 코팅된 새로운 96-well plate를 bed의 5번 위치에 배치하고, 기존의 plate 뚜껑과 새로운 plate 뚜껑을 plate lid holder rack로 옮깁니다. 이제 로봇 제어 터치패드를 사용하여 run a protocol colony split one to 12 column one을 순차적으로 선택한 후 next를 누릅니다. 그런 다음 test run을 선택하여 단계별 마법사를 통해 선택한 프로그램을 사전 테스트하고, 이어서 run protocol을 선택합니다.계대 배양 프로토콜이 완료되면 두 플레이트를 모두 회수하십시오. 새 플레이트에 관련 정보를 표시하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌려 놓습니다. 24시간 동안, 세포와 콜로니는 분할 후 2~3시간 이내에 플레이트에 부착되어야 하며, RO 키나아제 억제제의 존재로 인해 매우 넓게 퍼진 모습으로 나타납니다.첫 번째 RO 키나아제 억제제 제거 급여 후, 세포는 응축되며 특징적인 자갈 모양(cobblestone)의 줄기세포 형태를 나타냅니다. 줄기세포 배양 중에는 염색체 이상이 흔히 관찰되지만, 본 이미지에 제시된 것과 같은 다능성 마커의 분포에는 영향을 미치지 않을 수 있습니다. 실제로 방금 시연한 프로토콜로 배양한 세포의 핵형 분석 결과, 로봇으로 계대 배양한 두 유도만능줄기세포 라인 모두 46개의 정상 염색체를 보유하고 있어, 로봇 배양법이 일반적인 수준을 넘어서는 염색체 불안정성을 유발하지 않았음을 시사합니다. 로봇으로 배양한 유도만능줄기세포 라인에서 확립된 줄기세포 유전자 발현 마커를 조사하기 위해 총 RNA 또한 수집되었습니다.본 실험에 사용된 두 가지 유도만능줄기세포 라인은 모두 유사한 다능성 마커 발현을 보인 반면, 각 라인에서 분화된 심근세포와 별도의 인간 진피 섬유아세포 라인에서는 이러한 발현이 나타나지 않았습니다. 또한, 두 유도만능줄기세포 라인을 심근세포로 분화시켰을 때 명확한 근절(sarcomere) 형성이 관찰되었습니다. 종합적으로, 이러한 데이터는 3개월 및 20회 이상의 계대 배양을 거친 로봇 배양 결과, 염색체적으로 정상이며 다능성과 일치하는 전사 프로그램을 나타내고 심근세포로 분화 가능한 세포들이 생성되었음을 시사합니다.이 영상을 시청하신 후에는, 액체 핸들링 로봇 또는 이와 유사한 장비를 사용하여 다능성 세포를 확장 가능한 방식으로 배양하는 방법에 대해 충분히 이해하시게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

계절 hypoxic 피요르드의 수직 깊이 연속으로부터 격리 환경 게놈 DNA와 fosmid 라이브러리의 구축이 설명되어 있습니다. 그 결과 클론 라이브러리는 384 잘 접시에 들어서 자동 식민지 따기 시스템의 응용 프로그램에서 스트림 시퀀싱 및 기능 검사를 위해 보관됩니다.

대형 삽입 환경 게놈 라이브러리 제작

양적 피트니스 분석 (QFA)는 미생물 문화 fitnesses을 계산하는 실험 및 전산 방법을 보완 시리즈입니다. QFA는 유전자 변이, 약물이나 미생물의 성장에있는 다른 적용 트리 트먼트의 효과를 추정하고있다. 단일 문화권의 focussed 분석에서 병렬 문화 수천 실험 스케일링을 설계할 수 있습니다.

양적 휘트니스 분석 워크플로우

수성 2상 시스템을 사용하여 고처리량 96웰 플레이트 형식으로 암세포 스페로이드를 로봇 프린팅하기 위한 프로토콜이 제시됩니다.

약물 테스트를위한 수성 2 단계 시스템으로 암 세포 타원체의 로봇 생산

여기에서는 고효율 단세포 분리 및 장기 클론 배양을 가능하게 하는 새로운 마이크로웰 설계 개념을 활용하는 미세유체 플랫폼으로 단일 세포를 분리 및 배양하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

높은 처리량 단일 세포의 분리 및 문화를위한 미세 유체 플랫폼

높은 처리량, 자동화, 담배 원형질체 생산 및 변환 방법이 설명되어 있습니다. 로봇 시스템이 아닌 모델 작물로 번역해야한다 모델 BY-2 시스템에 대규모 병렬 유전자 발현 및 검색 할 수 있습니다.

높은 처리량 원형질체 분리 및 변환을위한 로봇 플랫폼

자동화 시스템 및 스크린의 많은 수의 일상적인 준비에 대 한 프로토콜 및 nanoliter 결정 화 방울 증기 확산 실험에 대 한 설명 이며 토론.

분자 생물학의 MRC 실험실에서 고분자 결정에 대 한 프로토콜을 자동

Microbioreactor 시스템에 다양 한 조건에서 48 병렬 세포 배양의 동시 작업에 대 한 자세한 프로토콜 제공 됩니다. 셀 문화 과정, 수확 및 후속 항 체 titer 분석을 설명 합니다.

높은 처리량의 사용 모델 IgG1 조 세포에서의 생산을 위한 Microbioreactor 시스템 자동화

이 프로토콜은 점성 재료의 표준화되고 재현 가능한 혼합을 위한 포괄적인 자습서역할을 하며, 새로운 오픈 소스 자동화 기술이 있습니다. 새로 개발된 오픈 소스 워크스테이션 의 작동, 오픈 소스 프로토콜 디자이너의 사용, 재현 가능한 혼합물을 식별하기 위한 유효성 검사 및 검증에 대한 자세한 지침이 제공됩니다.

하이드로겔 기반 3D 문화 모델을 자동화및 표준화방식으로 제조하는 오픈 소스 기술 플랫폼

우리는 자동화된 화상 진찰 및 분석과 호환되는 인간 유도만능 줄기 세포 (hiPSC) 배양 및 신경 분화의 자동화를 보여줍니다.

통합 된 라이브 셀 모니터링을 통해 인간 유도 만능 줄기 세포 유래 피질 및 도파민 뉴런의 자동화 된 생산

여기서는 자동화된 세포 배양 시스템을 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 자동 배양 시스템은 iPS 세포의 유지에서 다양한 유형의 세포로의 분화에 이르기까지 유도만능줄기세포(iPS) 세포 취급에 익숙하지 않은 연구자를 포함하여 노동력을 줄이고 사용자에게 이점을 제공합니다.

인간 유도 만능 줄기 세포의 유지 및 분화를 위한 자동 배양 시스템

이 프로토콜은 처리량이 많은 스캐폴드 기반 배양 플랫폼인 SPOT의 제작 및 조립을 96웰 및 384웰 형식으로 문서화합니다. 또한 수동 및 상업적으로 이용 가능한 액체 처리기를 사용하여 SPOT의 파종 프로세스에 대해 자세히 설명합니다.

고처리량 스캐폴드 기반 배양 플랫폼으로서의 SPOT의 재현 가능한 제조

학습하세요 로봇 액체 처리 시스템을 활용한 96웰 플레이트 기반 iPSC 배양 및 확장 기법을 통해 심근세포로의 분화 가능성을 검증하는 방법을. 이 기술은 재생의학 및 맞춤형 치료 개발에 활용됩니다.

로봇 액체 처리 시스템을 사용하여 확장 가능한 96 웰 IPSC 문화 기반 플레이트 및 생산

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