Name: 코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 배우세요 성체 제브라피시 꼬리지느러미 재생에서 TetON 시스템을 이용한 조직 특이적 유전자 발현 방법을. 독시사이클린 유도와 면역형광법을 통해 재생 과정의 유전자 기능을 연구할 수 있습니다.

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저자는 기술 지원을 크리스타 하세, 도리스 웨버와 브리짓 Korte은 감사합니다. WEIDINGER 실험실에서 작업은 도이치 Forschungsgemeinschaft 우리 4223 / 3-1의 보조금 지원, 4223 / 4-1 도이치 먼 대 Kardiologie 오스카 - 라플란드-Stipendium를 통해와 클라우스 - 게오르그 - 싶게 - Sigrid-에 의해 우리 Hengstberger-Forschungsstipendium.

<ol><li>Fang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+profiling+of+cardiomyocytes+identifies+an+early+Jak1%2FStat3+injury+response+required+for+zebrafish+heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Translational profiling of cardiomyocytes identifies an early Jak1/Stat3 injury response required for zebrafish heart regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (33), 13416-13421 (2013).</li>
<li>Tryon, R. C., Johnson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+analysis+of+kit+ligand+a+functional+expression+reveals+lineage-specific+competence+to+promote+melanocyte+rescue+in+the+mutant+regenerating+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Clonal analysis of kit ligand a functional expression reveals lineage-specific competence to promote melanocyte rescue in the mutant regenerating caudal fin.</a> PloS one. 9 (7), e102317(2014).</li>
<li>Wehner, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+defines+organizing+centers+that+orchestrate+growth+and+differentiation+of+the+regenerating+zebrafish+caudal+fin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling defines organizing centers that orchestrate growth and differentiation of the regenerating zebrafish caudal fin.</a> Cell Rep. 6 (3), 467-481 (2014).</li>
<li>Huang, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+expression+of+a+myocardium-specific+transgene+in+zebrafish+transgenic+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Conditional expression of a myocardium-specific transgene in zebrafish transgenic lines.</a> Dev Dyn. 233 (4), 1294-1303 (2005).</li>
<li>Knopf, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dually+inducible+TetON+systems+for+tissue-specific+conditional+gene+expression+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).</li>
<li>Provost, E., Rhee, J., Leach, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+2A+peptides+allow+expression+of+multiple+proteins+from+a+single+ORF+in+transgenic+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Viral 2A peptides allow expression of multiple proteins from a single ORF in transgenic zebrafish embryos.</a> Genesis. 45 (10), 625-629 (2007).</li>
<li>Suster, M. L., Abe, G., Schouw, A., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-mediated+BAC+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Transposon-mediated BAC transgenesis in zebrafish.</a> Nat Protoc. 6 (12), 1998-2021 (2011).</li>
<li>Bussmann, J., Schulte-Merker, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+BAC+selection+for+tol2-mediated+transgenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Rapid BAC selection for tol2-mediated transgenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (19), 4327-4332 (2011).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+morpholino+antisense+oligonucleotides+in+zebrafish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos.</a> J Vis Exp. (27), (2009).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+cleavage+efficiency+of+a+2A+peptide+derived+from+porcine+teschovirus-1+in+human+cell+lines%2C+zebrafish+and+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice.</a> PloS one. 6 (4), e18556(2011).</li>
<li>Matthews, M., Varga, Z. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anesthesia+and+euthanasia+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22ILAR+journal+%2F+National+Research+Council%2C+Institute+of+Laboratory+Animal+Resources%22%5BJournal%5D)">Anesthesia and euthanasia in zebrafish.</a> ILAR journal / National Research Council, Institute of Laboratory Animal Resources. 53 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electroporation+of+morpholinos+into+the+regenerating+adult+zebrafish+tail+fin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo electroporation of morpholinos into the regenerating adult zebrafish tail fin.</a> J Vis Exp. (61), (2012).</li>
<li>Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+isolation+of+PCR-ready+genomic+DNA+from+zebrafish+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues.</a> Biotechniques. 43 (5), 610(2007).</li>
<li>Thermes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((I-SceI+meganuclease+mediates+highly+efficient+transgenesis+in+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">I-SceI meganuclease mediates highly efficient transgenesis in fish.</a> Mech Dev. 118 (1-2), 91-98 (2002).</li>
<li>Suster, M. L., Kikuta, H., Urasaki, A., Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenesis+in+zebrafish+with+the+tol2+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system.</a> Methods Mol Biol. , 56141-56163 (2009).</li>
<li>Grabher, C., Wittbrodt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meganuclease+and+transposon+mediated+transgenesis+in+medaka%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Meganuclease and transposon mediated transgenesis in medaka.</a> Genome Biol. 8, Suppl 1S10. (2007).</li>
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저자가 공개하는 게 없다.

성인 제브라 피쉬가 성공적으로 많은 내부 장기와 부속을 재생하는 놀라운 능력을 가지고있다. 관련된 분자 및 세포 메커니즘에 대한 철저한 이해는 유전자의 기능과 신호 전달 경로의 조직 특이 적 분석이 필요합니다. 이 무렵, 코스닥 시스템은 배아와 성인 제브라 피쉬의 시공간으로 제어 유전자 발현을위한 효율적인 도구를 제공합니다. 이 논문에 기술 된 TETON 시스템 구축 및 방법론이 성공적으로 우리의 실험실 (3)의 최근 연구에 사용되어왔다. 코스닥의 시스템을 구축 할 때 다음과 같은 추가적인 문제가 고려되어야한다 : TetActivator 유전자 설계 고려 사항 우리는 이전에 보여 그 헤르페스 심플 렉스 바이러스 VP16의 상호 활성화와 융합 역 구정 리프레 도메인의 M2 돌연변이 변종으로 구성된 단일 유도 TetActivator 도메인 파생 3F [irtTAM2 (3 층), IN 짧은 TE...

제브라 피쉬의 개발, 생리학, 질병, 및 재생의 여러 측면을 연구하는 기초가 튼튼한 척추 동물 모델 생물이다. 유전자 발현 또는 신호 전달 경로의 유도, 조직 특이 적 조작 후 배아 생물학적 과정, 실험 도구에 대한 모델로 제브라 피쉬의 성장 채택으로 점점 더 중요 해지고있다. 특히, 성인 제브라 피쉬의 기관 및 부속 재생에 대한 연구는 이러한 재생 과정에서 신호 전달 경로의 시공간 요구 사항의 해부 도구의 부족으로 고통을. 현재, 세가지 다른 시스템 조건, 조직 - 특이 성인 지브라 피쉬의 장기를 재생 유전자 발현 달성하는데 사용되어왔다 : Cre 호텔-LOX 시스템 트랜스포존 매개 체세포 형질 전환을 사용하여 열 - 충격 유도 유전자의 모자이크 식 및 코스닥 시스템 1 -3. 코스닥은 테트라 사이클린 계속의 변형을 말한다발현은 테트라 사이클린 항생 물질 또는 유도체, 예 독시사이클린의 존재 하에서 활성화 롤 전사 활성 시스템. 그것은 지금까지 성인 물고기에 사용 된 바와 같이 Cre 호텔-LOX 시스템은, 발현 공간적으로 조직 특이 적 조절 요소에 의해 제한되는 타목시펜 제어 Cre 호텔 재조합 효소 (CreERT2)에 의존한다. STOP 카세트의 CRE 구동 제거는 모든 세포 유형 1 활성화되어야 프로모터에 의해 구동되는 목적 유전자의 발현을 촉진한다. mosaically 표현 체세포 유전자의 트랜스포존 매개 창조 개별 세포 계통의 유도 유전자 발현 시스템을 제공한다. 전형적 재생 기관 (2)의 분리 된 세포 계통의 유전자를 운반하는 키메라 개인에 열 충격 프로모터 결과의 전사 제어하에 관심있는 유전자를 운반하는 트랜스포존과 TOL2 지브라 피쉬의 수정란 사출. 두 시스템은 조건부 조직 SPE를 허용하는 동안cific 유전자 발현은 LOX-Cre 호텔 시스템은 가역적없고, 트랜스포존 기반 클론 표지를 사용하는 전략은 스토캐스틱 자연에서 겪고있다. 따라서, 우리 등 최근 시간적 및 가산 및 가역 가변 3-5 인 공간적 조절 유전자 발현 촉진 제브라에 사용하기위한 유전자 코스닥 시스템을 채택 하였다. 여기서 사용 코스닥 시스템은 독시사이클린 (D​​OX) -inducible 전사 활성이 (역방향의 테트라 사이클린 transactivator, irtTA 짧은 TETA 개선) 조직 특이 적 유전자 조절 서열의 제어하에있는 트랜스 제닉 드라이버 라인 (TetActivator)을 포함한다. (; TetRE 구정 응답 요소) (그림 1A) 둘째, 유전자 변형 응답자 라인 테트라 사이클린 연산자의 전사 제어에 관심의 유전자를 품고 (TetResponder)가 필요합니다. 따라서 TetActivator 및 TetResponder 선의 특정 조합의 사용은 조건부 조직 정시 허용유전자 발현의 FIC 조작. 우리는 최근 제브라 피쉬의 꼬리 지느러미 3 재생 성인에서의 Wnt / 베타 카테닌 신호의 조직 특이 적 기능을 위해 프로브 TETON 시스템을 활용했다. 여기에 설명 된 프로토콜에서 우리는 지느러미 재생의 연구에 특히 제브라 피쉬에 Teton 시스템의 설정 및 사용에 대한 작업 흐름을 설명합니다. 이것은 상세한 안정적인 형질 전환 TetActivator과 TetResponder 라인을 생성하는 방법에 대한 지침 및 배아와 성인 제브라 피쉬의 형질 전환 유전자의 유도를위한 프로토콜을 포함한다. 더욱이, 우리는 성인 핀 저온부 지브라 피쉬의 제조를위한 프로토콜을 포함하여 핀 재생성에 조직 특이 적 유전자 발현의 확인을위한 기술을 설명한다. 또한, 우리는 TetResponder 식의 TetActivator 형질 전환 유전자의 설계, 형질 전환 방법의 선택, 및 검출을위한 고려 사항에 대해 설명합니다. 따라서,이 프로토콜의 전반적인 목표는 청사진 역할을하는 것입니다설정해서 기능성 코스닥 시스템 지브라 피쉬의 관심있는 조직에 적용 할 수있는 조건부 조직 특이 적 유전자 발현을 달성하기위한. 우리는 I-SceI 제한 효소 또는 짧은 유전자 조절 서열 사용하여 안정적인 TetActivator 라인의 TOL2 매개 세대를 허용 TetActivator 벡터 만든 (증강 조각, WEIDINGER 랩 플라스미드 데이터베이스없이 1247;. 그림 1B). 이 구조는 단순 포진 바이러스 VP16의 전이 활성화 도메인 파생 3F [irtTAM2 (3 층)]와 융합 역 구정 리프레 도메인의 M2 돌연변이 변종으로 구성된 TetActivator 카세트가 포함되어 있습니다. 이 공동 발현 동일한 오픈 리딩 프레임으로부터의 형광 단으로 AmCyan 때문에 TetActivator (TETA)의 발현을 용이하게 모니터링 할 수있다; 1 비율 5,6 : P2A 펩타이드는 1에서 분리 된 단백질과 같은 TETA과 AmCyan의 생산을 초래할한다 리보솜 건너 뛰기를, 중재. 구조는 또한 T의 &#39;poylinker 5 포함etActivator 카세트는 종래의 클로닝 방법을 사용하여 관심의 유전자 조절 서열의 삽입을 용이하게한다. (큰 게놈 영역을 포함하는 박테리아 인공 염색체로 재조합 될 수있다 (BAC), 또한, 우리는 전술 TetActivator 카세트 플러스 카나마이신 선택 카세트 (도 1C. WEIDINGER 랩 플라스미드 데이터베이스 없음 1180)로 이루어진 구조를 작성한 일반적으로 발현 패턴 트랜스 의해 모방 함) 유전자의 개시 코돈으로. 두 구조는 요청시 WEIDINGER 실험실에서 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>번식 상자</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>복합 형광 현미경</td><td>(예 : Leica, Zeiss</td>)은 <td>형광 조직 단면을 이미지화하는</td>데 <td>제조업체에 따라 다릅니다</td></tr><tr><td>예</td><td>: Leica, Zeiss</td>는 <td>형광 조직 절편</td>저온 유지 장치 (예 : Leica, Thermo-Scientific)를 이미지화하는 데 <td>제조업체에 따라 다릅니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td>. </td><td>냉동 절편</td></tr><tr><td>제조업체 4', 6-디아미디노-2-페닐이노돌(Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td>는 <td>핵</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td>의 <td>50%에서 50%의 50<% ></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>로 재고를 준비합니다.PBS의 4%(w/v) 파라포름알데히드, 고정을 위한 pH 7.5 </td></tr><tr><td>1x 포스팟 완충 식염수(PBS)</td><td></td><td></td><td>1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5</td></tr><tr><td>1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td>1x PBS with 0.1% Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus 접착 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>조직 절편 수집을 위한</td> <td>1014356190</td></tr><tr><td>실체 형광 현미경</td>(<td>예: Leica, Zeiss</td>)은 <td>형광 기반 유전형 분석</td><td>제조업체에 따라 다름</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>(예: Biorad, Applied Biosystems</td>) <td>PCR 기반 유전형 분석</td><td>제조업체에 따라 다름</td></tr><tr><td>조직 동결 배지(TFM)조직 포</td>매닝을 위한 <td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td> 샘플</td></tr><tr>: <td>E3 배아 배지에서 1mg/ml에서 마취 사용을 위한</td> <td>Tricaine(L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td></tr></tbody></table>

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 zebrafish의 재생의 연구를

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

제브라피쉬는 척추동물의 발달, 생리학, 질병, 조직 재생을 연구하는 데 매우 중요한 모델 유기체가 되었습니다. 관련된 분자 및 세포 메커니즘에 대한 철저한 이해를 위해서는 유전자 발현 또는 신호 경로에 대한 유도 가능한 조직 특이적 조작을 허용하는 실험 도구가 필요합니다. 따라서 당사와 다른 사람들은 최근 TetON 시스템을 제브라피쉬에 사용하기 위해 조정했습니다. TetON 시스템은 시간적, 공간적으로 제어되는 유전자 발현을 촉진하며, 최근에는 이 도구를 사용하여 제브라피시 꼬리 지느러미 재생 중 Wnt/베타-카테닌 신호의 조직 특이적 기능을 조사하고 있습니다. 여기에서는 TetON 시스템을 사용하여 성체 재생 제브라피시 꼬리 지느러미에서 유도 가능한 조직 특이적 유전자 발현을 달성하는 워크플로우에 대해 설명합니다. 여기에는 안정적인 형질전환 TetActivator 및 TetResponder 라인의 생성, 전이유전자 유도 및 핀 재생에서 조직 특이적 유전자 발현 검증 기술이 포함됩니다. 따라서 이 프로토콜은 제브라피시에서 기능적인 TetON 시스템을 설정하고 후속 사용, 특히 지느러미 재생을 연구하기 위한 청사진 역할을 합니다.

조직 특이 유도 유전자 발현, 유전자 변형 TetActivator 및 TetResponder 라인을위한 기능 TETON 시스템을 구축하기 위해 생성 (그림 1A) 할 필요가있다. 초기 제브라 피쉬 배아 및 후속 세균 라인 통합으로 구축 또는 TetResponder (그림 1E) -이 TetActivator (C 그림 1B)를 마이크로 인젝션하여 수행됩니다. 기능성 TetActivator 구조물 중 하나, 또는 관심 유전자 (도 1C)의 조절 요소를 포함하는 BAC에 TetActivator 카세트 재결합하여 TetActivator 카세트 (도 1B)의 상류 단 조절 서열 (인핸서 요소)의 클로닝에 의해 생성 될 수있다. TetActivator 구조의 생식 계열 통합은 개인이 예상 발현 양상 (그림 1D)에서 G0 물고기와 F1 배아에서 AmCyan ...

여기에서는 TetON 시스템을 사용하여 성체 재생 제브라피시 꼬리 지느러미에서 조직 특이적 유전자 발현을 달성하는 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 제브라피쉬에서 기능적인 TED-on 시스템을 구축하여, 본 영상의 재생 중인 꼬리 지느러미에서 보여주는 것과 같이 조건부 조직 특이적 유전자 발현을 구현하는 것입니다. 이는 먼저 관심 조직에서 am cyan이 태그된 테트라사이클린 유도성 전사 활성제(tetracycline inducible transcriptional activator)를 발현하는 Tet 활성제 형질전환 라인과, Tet 반응 요소(Tet responsive elements)의 조절 하에 ype 태그가 붙은 표적 유전자를 포함하는 Tet 반응기 라인을 생성함으로써 이루어집니다. 그 다음으로, Tet 활성제와 Tet 반응기가 모두 도입된 특정 조합의 이중 형질전환 물고기를 구축합니다.그 다음, 독시사이클린(doxycycline)을 투여하여 조직 특이적 Tet 응답자 트랜스진(transgene) 발현을 유도합니다. 마지막으로, 지느러미 재생 부위의 조직 절편을 제작하여 Tet 응답자 트랜스진 발현을 확인합니다. 최종적으로, 면역형광법을 사용하여 조직 특이적 Tet 응답자 트랜스진의 발현을 시각화합니다.열 충격 유도 유전자 발현과 같은 다른 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 해당 시스템을 통해 조직 특이적인 방식으로 유도 및 가역적인 유전자 발현이 가능하다는 점입니다. 이 방법은 개별 조직에서의 신호 전달 경로와 유전자 기능을 분석할 수 있게 하여, 제브라피시 지느러미 재생을 안내하는 분자 신호 네트워크에 대해 더욱 심도 있게 이해하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 본 연구에서는 제브라피시 지느러미 재생을 연구하기 위해 이 기술을 사용하였으나, 유전자 기능의 조직 특이적 조작이 필요한 다른 많은 상황에서도 유용하게 활용될 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 따라 Tet responder 어류 라인을 생성한 후, 개별 G zero 어류를 기존에 구축된 Tet activator 라인과 교배하여 트랜스유전자의 생식세포 통합 및 유도 가능성을 평가하십시오. 그 다음 배아를 수확하고 Tet responder 유도를 평가할 수 있는 단계까지 배양하십시오. 50% ethanol을 사용하여 doxycycline을 녹여 50 mg/mL 농도로 만든 후, 2000 x doxycycline 스톡 용액을 준비하십시오.docks 분주액을 차광하여 -20 °C에서 보관하십시오. 다음으로, docks의 최종 농도가 25 µg/mL가 되도록 E3 배아 배지를 준비합니다. 그런 다음, 배아에서 E3 배지의 대부분을 따라내어 제거합니다.이를 E3 배지가 포함된 용액으로 교체하고 배아를 28.5 °C에서 최소 6시간 동안 다시 배양합니다. 배양 후, 형광 실체 현미경을 사용하여 배아에서 YFP 형광을 스크리닝합니다. 방금 확인된 파운더로부터 여러 개의 안정적인 transgenic Tet responder 라인을 구축합니다.예상 발현 영역 내에서 강하게 유도되고 모자이크 현상이 거의 없으며, 개별 배아 간의 변이가 적은 라인을 선택하십시오. TED activator 및 Tet responder 어류 라인이 구축되면, Tet activator carrier와 Tet responder carrier를 교배하여 이중 형질전환체를 생성합니다. 실체 현미경으로 am cyan 형광을 스크리닝하여 Tet activator 트랜스진을 보유한 배아를 선택하고, am cyan 양성 배아를 성체까지 성장시킵니다.PCR 기반의 유전자형 분석 또는 표적 조직 내 Tet 응답자의 발현 유도 능력을 확인하여, Tet 활성제뿐만 아니라 Tet 응답자를 함께 보유한 이중 형질전환 성어의 개체를 식별합니다. 꼬리지느러미 타게이션(Tail Fin Tation)을 수행하기 위해, 160 µg/mL의 tricaine이 함유된 어류 전용수가 채워진 비커에서 성체 제브라피쉬를 마취시킵니다. 물고기의 움직임이 멈추면, 핀셋을 사용하여 뒤집힌 페트리 접시 위로 조심스럽게 옮긴 후, 메스를 사용하여 꼬리지느러미를 부분 절제함으로써 doxycycline을 처리합니다. 25 µg/mL의 doxycycline이 함유된 1 L의 어류 시스템수로 교배 상자를 준비합니다.음성 대조군으로 독시사이클린 대신 250 microliters의 에탄올을 1 liter의 어류 시스템 워터가 담긴 교배 상자에 첨가합니다. 각 교배 상자에 최대 10마리의 이중 형질전환 어류를 옮기고, 스트레스를 줄이기 위해 상자를 암소에 둡니다. 최소 6시간 후, 처리된 어류를 마취시켜 wet aros 코팅 디쉬로 옮기고 핀셋을 사용하여 꼬리를 펼칩니다. 다음으로, 형광 현미경 하에서 재생 조직 내 Y PET의 발현 여부를 스크리닝합니다.이후 물고기를 추가 처리 단계에 사용하거나, 부분 지느러미 절단 및 dox 처리 후 리스폰더 트랜스진(responder transgene) 유도를 종료하기 위해 물고기 사육 시스템으로 되돌릴 수 있습니다. 이 비디오에서 앞서 설명한 바와 같이, 실험 설정에 따른 시점에 초기 절단면에서 근위쪽으로 약 4~5개의 골편(bony segments)이 생성된 지느러미 재생 부위를 핀셋으로 잡습니다. 이때 조직의 그루터기 부분만 잡도록 주의하며, PBS에 4% w/v PFA가 포함된 작은 페트리 접시에 재생 조직을 조심스럽게 평평하게 펴 놓은 후 4°C에서 하룻밤 동안 고정합니다. 다음 날, PBS를 사용하여 재생 조직을 두 번 세척한 후, 0.5 M EDTA-PBS로 옮겨 4°C에서 하룻밤 동안 골 기질을 탈회시킵니다. 그다음, 재생 조직을 실온에서 sucrose PBS 시리즈에 각각 30분씩 배양하고, 마지막으로 30% sucrose PBS와 조직 냉동 매질을 동일한 비율로 섞은 용액에서 30분 더 배양합니다.지느러미를 조직 동결 매질로 옮기고 4 °C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 그다음, 현미경 슬라이드 위에 크라이오 몰드를 놓고 조직 동결 매질을 채웁니다. 재생된 조직을 크라이오 몰드로 옮기고, 종단면 또는 횡단면을 얻을 수 있도록 조직의 방향을 잡습니다.섹셔닝(sectioning)이 용이하도록 재생체가 직선 형태가 되게 합니다. 현미경 슬라이드와 함께 크라이오 몰드를 드라이아이스 위에 놓인 금속 랙으로 옮겨 동결 과정을 시작합니다. 배지가 고체 상태가 되면, 크라이오 몰드를 다시 상온으로 옮겨 플라스틱과 배지의 계면에서 배지가 녹도록 합니다.그 다음 펜과 같은 도구를 사용하여 냉동 블록을 크라이오 몰드에서 밀어내고, 크라이오 마이크로톰으로 절편을 제작할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오. 10~14 µm 두께의 절편을 접착 슬라이드 글라스에 수집하고, 필요할 때까지 슬라이드를 -20 °C에서 보관하십시오. 지느러미 절편에서 Tet 리스폰더 발현을 분석하려면, -20 °C로 냉각된 100% MEOH로 절편을 30분 동안 처리하십시오.종이 타월을 사용하여 액체를 조심스럽게 제거합니다. 그다음 PBT로 2회, PBS로 1회 세척하며 각 세척 단계는 5분 동안 수행합니다. dappy에서 10분 동안 배양한 후, PBS를 사용하여 10분씩 2회 세척합니다.그 다음 Antifade 마운팅 제제와 커버슬립을 사용하여 샘플을 마운팅한 후, 공초점 또는 광시야 형광 현미경을 이용해 제브라피쉬에서 기능적인 TET-on 시스템이 구축된 샘플을 이미지화합니다. 이 시스템은 개별 조직에서의 유전자 또는 신호 전달 경로의 기능을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서 보여주는 바와 같이, HER 4.3 프로모터에 의해 구동되는 tet 활성화제는 재생 조직의 일부 조직에서만 TET 응답자의 발현을 유도합니다. 증식하는 근위부 blastema에서는 YFP 형광이 검출되는 반면, 원위부 blastema와 표피에서는 발현이 나타나지 않습니다.HER 4.3 도메인 내의 증식성 세포를 포함하는 blastema에서 WNT beta-Catenin 길항제인 axin 1의 발현은 놀랍게도 재생 세포 증식에 아무런 영향을 미치지 않았습니다. 이는 증식성 근위 blastema에서의 Wnt/beta-catenin 신호 전달이 blastema 세포 증식 조절에 필수적인 역할을 하지 않음을 시사합니다. 이와 대조적으로, ubiquitin 프로모터 구동 Tet 활성제 라인을 사용하여 지느러미 재생 조직 전체에서 axin 1 발현을 유도했을 때는 재생 세포 증식이 강하게 억제되었습니다.또한, 조골세포를 포함하지 않는 HER 4.3 도메인에서 axon one의 발현은 재생 조직의 골 형성을 강력하게 방해합니다. 따라서 Tet-on 시스템을 이용한 Wnt 신호 전달의 조직 특이적 간섭은 세포 증식 및 골 재생 조절에 있어 Wnt 신호 전달의 예상치 못한 간접적 기능들을 드러냅니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 관심 있는 모든 조직에서 유도성 표적 유전자 발현을 위해 사용될 수 있습니다.우리는 이 방법을 성공적으로 적용하여 재생 중인 제브라피쉬 꼬리 지느러미에서 wind bed 니코틴 신호 전달의 조직 특이적 기능을 탐구했습니다. 이 방법을 사용하면 조직 재생을 조절하는 분자적 결정 요인에 대해 더욱 포괄적인 이해를 얻는 데 도움이 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 조건부 성인 zebrafish 지느러미 재생 중에 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 마이크로 주사와 상처 치유, 아체 형성 및 재생 파생물을 포함하여 지느러미 재생의 다양한 단계에서 단백질의 역할을 테스트하고 있습니다 지느러미 조직,에 안티 센스 oligonucleotide의 morpholinos를 electroporating을 포함한다.

생성중 성인 Zebrafish 테일 핀으로 Morpholinos의 생체내 Electroporation에

여기에 제시된 방법은 고 에너지 레이저 펄스와 시간을 통해 이러한 부상과 회복의 후속 분석 라이브 zebrafish 배아의 정확한 부상을 포함한다. 우리는 또한 유전자 하나의 표시 또는 골격근 세포의 그룹이 동안 레이저 광 유도 손상 후 추적 할 수있는 방법을 보여줍니다.

Zebrafish 배아 골격근의 레이저 쏜 부상

척추 절개 한 후, 성인 zebrafish의 육주 후 손상에 의한 기능 회복이있다. 유생의 투명성과 빠른 복구를 이용하려면, 우리는 애벌레 척수에 병행하는 방법을 제시한다. 절개 한 후, 우리는 3 일 후 부상으로 이일 후 상해에서 시작 감각 회복을 관찰하고 C-굴곡 운동.

애벌레 Zebrafish의 척수 절개

이러한 유전자의 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사를 사용하여 조직 재생 등의 개발 및 생리 학적 항상성 이후 단계에서 유전자 기능을 평가하는 제브라 피쉬에 대한 적응력이 역 유전 방법.

Zebrafish의 유충의 여러 어려운 대상 조직을 형질 심장 심실 사출을 사용하여 유전 모르 폴리 노의 접근을 반전

제브라피시 성체 신경 발생 및 재생의 세포 및 분자 메커니즘을 밝히기 위해 우리는 제브라피시 성체 텔렌스팔론에서 기계적 손상을 일으키는 침습적 수술과 면역조직화학 또는 현장 교잡화에 의한 찌른 반구의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 개발했습니다.

Zebrafish의 성인 Telencephalon의 자상 부상 : 척추 동물의 뇌 신경 발생과 재생을 조사하는 방법

여기에서는 겐타마이신 주사로 급성 신장 손상을 유발하여 성인 신장 재생을 연구하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. 우리는 부상이 겐타마이신 투여량과 환경 온도에 따라 달라진다는 것을 보여주며, LHX1a+가 새로운 네프론을 개발하기 위해 현장 교잡법을 사용합니다.

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

명시야 기반 입체 현미경을 사용하여 전체 조직 규모에서 제브라피시 유충 꼬리 지느러미 재생의 역학을 캡처하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술을 사용하면 단일 세포 해상도로 재생 역학을 캡처할 수 있습니다. 이 방법론은 CCD 카메라와 타임랩스 소프트웨어가 장착된 모든 실체현미경에 적용할 수 있습니다.

시간 경과 브라이트 실체 현미경으로 Zebrafish의 애벌레에서 조직 복구를 캡처

골격 근 재생 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동, 근육 이영양증 등 많은 근육 질환에서 손상 되는, 그리고이 재생 하는 근육의 무능력 결과. 여기서는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생을 검사할 수 있는 프로토콜을 설명합니다.

근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토

성인 제브라피쉬의 기계적 뇌 손상 모델은 높은 재생 능력을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 설명됩니다. 이 방법은 형광 면역 염색을 사용하여 재생 반응을 평가하기 위해 여러 종의 작은 물고기의 시신경에 찔린 상처 손상을 만드는 것을 설명합니다.

재생 능력의 비교 분석을 위해 Zebrafish와 Medaka를 사용한 성인 시신경의 찔린 상처 부상 모델

본 프로토콜은 유충 취급을 위한 자동화된 미세유체 플랫폼과 결합된 레이저 병변 시스템을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 조직 특이적이고 재현성이 높은 부상을 유도하는 방법을 기술한다.

제브라피쉬 유충의 척수 재생 연구를위한 제어 된 반자동 레이저 유도 부상

여기에서 우리는 수정 후 최소 1일에서 7일 사이의 모든 단계에서 제브라피시 배아와 유충에서 높은 공간적 및 시간적 해상도로 세포를 이식하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

배아 및 유충 제브라피시에서의 고분해능 세포 이식

배우세요 성체 제브라피시 꼬리지느러미 재생에서 TetON 시스템을 이용한 조직 특이적 유전자 발현 방법을. 독시사이클린 유도와 면역형광법을 통해 재생 과정의 유전자 기능을 연구할 수 있습니다.

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

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