코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

이 실험 절차의 전반적인 목표는 제브라피쉬에서 기능적인 TED-on 시스템을 구축하여, 본 영상의 재생 중인 꼬리 지느러미에서 보여주는 것과 같이 조건부 조직 특이적 유전자 발현을 구현하는 것입니다. 이는 먼저 관심 조직에서 am cyan이 태그된 테트라사이클린 유도성 전사 활성제(tetracycline inducible transcriptional activator)를 발현하는 Tet 활성제 형질전환 라인과, Tet 반응 요소(Tet responsive elements)의 조절 하에 ype 태그가 붙은 표적 유전자를 포함하는 Tet 반응기 라인을 생성함으로써 이루어집니다. 그 다음으로, Tet 활성제와 Tet 반응기가 모두 도입된 특정 조합의 이중 형질전환 물고기를 구축합니다.

그 다음, 독시사이클린(doxycycline)을 투여하여 조직 특이적 Tet 응답자 트랜스진(transgene) 발현을 유도합니다. 마지막으로, 지느러미 재생 부위의 조직 절편을 제작하여 Tet 응답자 트랜스진 발현을 확인합니다. 최종적으로, 면역형광법을 사용하여 조직 특이적 Tet 응답자 트랜스진의 발현을 시각화합니다.

열 충격 유도 유전자 발현과 같은 다른 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 해당 시스템을 통해 조직 특이적인 방식으로 유도 및 가역적인 유전자 발현이 가능하다는 점입니다. 이 방법은 개별 조직에서의 신호 전달 경로와 유전자 기능을 분석할 수 있게 하여, 제브라피시 지느러미 재생을 안내하는 분자 신호 네트워크에 대해 더욱 심도 있게 이해하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 본 연구에서는 제브라피시 지느러미 재생을 연구하기 위해 이 기술을 사용하였으나, 유전자 기능의 조직 특이적 조작이 필요한 다른 많은 상황에서도 유용하게 활용될 수 있습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 Tet responder 어류 라인을 생성한 후, 개별 G zero 어류를 기존에 구축된 Tet activator 라인과 교배하여 트랜스유전자의 생식세포 통합 및 유도 가능성을 평가하십시오. 그 다음 배아를 수확하고 Tet responder 유도를 평가할 수 있는 단계까지 배양하십시오. 50% ethanol을 사용하여 doxycycline을 녹여 50 mg/mL 농도로 만든 후, 2000 x doxycycline 스톡 용액을 준비하십시오.

docks 분주액을 차광하여 -20 °C에서 보관하십시오. 다음으로, docks의 최종 농도가 25 µg/mL가 되도록 E3 배아 배지를 준비합니다. 그런 다음, 배아에서 E3 배지의 대부분을 따라내어 제거합니다.

이를 E3 배지가 포함된 용액으로 교체하고 배아를 28.5 °C에서 최소 6시간 동안 다시 배양합니다. 배양 후, 형광 실체 현미경을 사용하여 배아에서 YFP 형광을 스크리닝합니다. 방금 확인된 파운더로부터 여러 개의 안정적인 transgenic Tet responder 라인을 구축합니다.

예상 발현 영역 내에서 강하게 유도되고 모자이크 현상이 거의 없으며, 개별 배아 간의 변이가 적은 라인을 선택하십시오. TED activator 및 Tet responder 어류 라인이 구축되면, Tet activator carrier와 Tet responder carrier를 교배하여 이중 형질전환체를 생성합니다. 실체 현미경으로 am cyan 형광을 스크리닝하여 Tet activator 트랜스진을 보유한 배아를 선택하고, am cyan 양성 배아를 성체까지 성장시킵니다.

PCR 기반의 유전자형 분석 또는 표적 조직 내 Tet 응답자의 발현 유도 능력을 확인하여, Tet 활성제뿐만 아니라 Tet 응답자를 함께 보유한 이중 형질전환 성어의 개체를 식별합니다. 꼬리지느러미 타게이션(Tail Fin Tation)을 수행하기 위해, 160 µg/mL의 tricaine이 함유된 어류 전용수가 채워진 비커에서 성체 제브라피쉬를 마취시킵니다. 물고기의 움직임이 멈추면, 핀셋을 사용하여 뒤집힌 페트리 접시 위로 조심스럽게 옮긴 후, 메스를 사용하여 꼬리지느러미를 부분 절제함으로써 doxycycline을 처리합니다. 25 µg/mL의 doxycycline이 함유된 1 L의 어류 시스템수로 교배 상자를 준비합니다.

음성 대조군으로 독시사이클린 대신 250 microliters의 에탄올을 1 liter의 어류 시스템 워터가 담긴 교배 상자에 첨가합니다. 각 교배 상자에 최대 10마리의 이중 형질전환 어류를 옮기고, 스트레스를 줄이기 위해 상자를 암소에 둡니다. 최소 6시간 후, 처리된 어류를 마취시켜 wet aros 코팅 디쉬로 옮기고 핀셋을 사용하여 꼬리를 펼칩니다. 다음으로, 형광 현미경 하에서 재생 조직 내 Y PET의 발현 여부를 스크리닝합니다.

이후 물고기를 추가 처리 단계에 사용하거나, 부분 지느러미 절단 및 dox 처리 후 리스폰더 트랜스진(responder transgene) 유도를 종료하기 위해 물고기 사육 시스템으로 되돌릴 수 있습니다. 이 비디오에서 앞서 설명한 바와 같이, 실험 설정에 따른 시점에 초기 절단면에서 근위쪽으로 약 4~5개의 골편(bony segments)이 생성된 지느러미 재생 부위를 핀셋으로 잡습니다. 이때 조직의 그루터기 부분만 잡도록 주의하며, PBS에 4% w/v PFA가 포함된 작은 페트리 접시에 재생 조직을 조심스럽게 평평하게 펴 놓은 후 4°C에서 하룻밤 동안 고정합니다. 다음 날, PBS를 사용하여 재생 조직을 두 번 세척한 후, 0.5 M EDTA-PBS로 옮겨 4°C에서 하룻밤 동안 골 기질을 탈회시킵니다. 그다음, 재생 조직을 실온에서 sucrose PBS 시리즈에 각각 30분씩 배양하고, 마지막으로 30% sucrose PBS와 조직 냉동 매질을 동일한 비율로 섞은 용액에서 30분 더 배양합니다.

지느러미를 조직 동결 매질로 옮기고 4 °C에서 최소 2시간 동안 배양합니다. 그다음, 현미경 슬라이드 위에 크라이오 몰드를 놓고 조직 동결 매질을 채웁니다. 재생된 조직을 크라이오 몰드로 옮기고, 종단면 또는 횡단면을 얻을 수 있도록 조직의 방향을 잡습니다.

섹셔닝(sectioning)이 용이하도록 재생체가 직선 형태가 되게 합니다. 현미경 슬라이드와 함께 크라이오 몰드를 드라이아이스 위에 놓인 금속 랙으로 옮겨 동결 과정을 시작합니다. 배지가 고체 상태가 되면, 크라이오 몰드를 다시 상온으로 옮겨 플라스틱과 배지의 계면에서 배지가 녹도록 합니다.

그 다음 펜과 같은 도구를 사용하여 냉동 블록을 크라이오 몰드에서 밀어내고, 크라이오 마이크로톰으로 절편을 제작할 때까지 -80 °C에서 보관하십시오. 10~14 µm 두께의 절편을 접착 슬라이드 글라스에 수집하고, 필요할 때까지 슬라이드를 -20 °C에서 보관하십시오. 지느러미 절편에서 Tet 리스폰더 발현을 분석하려면, -20 °C로 냉각된 100% MEOH로 절편을 30분 동안 처리하십시오.

종이 타월을 사용하여 액체를 조심스럽게 제거합니다. 그다음 PBT로 2회, PBS로 1회 세척하며 각 세척 단계는 5분 동안 수행합니다. dappy에서 10분 동안 배양한 후, PBS를 사용하여 10분씩 2회 세척합니다.

그 다음 Antifade 마운팅 제제와 커버슬립을 사용하여 샘플을 마운팅한 후, 공초점 또는 광시야 형광 현미경을 이용해 제브라피쉬에서 기능적인 TET-on 시스템이 구축된 샘플을 이미지화합니다. 이 시스템은 개별 조직에서의 유전자 또는 신호 전달 경로의 기능을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 여기서 보여주는 바와 같이, HER 4.3 프로모터에 의해 구동되는 tet 활성화제는 재생 조직의 일부 조직에서만 TET 응답자의 발현을 유도합니다. 증식하는 근위부 blastema에서는 YFP 형광이 검출되는 반면, 원위부 blastema와 표피에서는 발현이 나타나지 않습니다.

HER 4.3 도메인 내의 증식성 세포를 포함하는 blastema에서 WNT beta-Catenin 길항제인 axin 1의 발현은 놀랍게도 재생 세포 증식에 아무런 영향을 미치지 않았습니다. 이는 증식성 근위 blastema에서의 Wnt/beta-catenin 신호 전달이 blastema 세포 증식 조절에 필수적인 역할을 하지 않음을 시사합니다. 이와 대조적으로, ubiquitin 프로모터 구동 Tet 활성제 라인을 사용하여 지느러미 재생 조직 전체에서 axin 1 발현을 유도했을 때는 재생 세포 증식이 강하게 억제되었습니다.

또한, 조골세포를 포함하지 않는 HER 4.3 도메인에서 axon one의 발현은 재생 조직의 골 형성을 강력하게 방해합니다. 따라서 Tet-on 시스템을 이용한 Wnt 신호 전달의 조직 특이적 간섭은 세포 증식 및 골 재생 조절에 있어 Wnt 신호 전달의 예상치 못한 간접적 기능들을 드러냅니다. 일단 숙달되면, 이 기술은 관심 있는 모든 조직에서 유도성 표적 유전자 발현을 위해 사용될 수 있습니다.

우리는 이 방법을 성공적으로 적용하여 재생 중인 제브라피쉬 꼬리 지느러미에서 wind bed 니코틴 신호 전달의 조직 특이적 기능을 탐구했습니다. 이 방법을 사용하면 조직 재생을 조절하는 분자적 결정 요인에 대해 더욱 포괄적인 이해를 얻는 데 도움이 될 것입니다.