코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

이 절차의 전반적인 목표는 이 비디오의 재생 꼬리 지느러미에서 입증된 바와 같이 조건부 조직 특이적 유전자 발현을 달성하기 위해 제브라피시의 기능적 TED 시스템을 설정하는 것입니다. 이는 먼저 관심 조직에서 am cyan으로 태그된 테트라사이클린 유도성 전사 활성제와 Tet 반응 요소의 제어 하에 관심 ype 태그 유전자를 포함하는 Tet 반응 세포주를 발현하는 Tet 활성제 형질전환 라인을 생성함으로써 달성됩니다. 다음으로 Tet 활성제, Tet 응답자, 이중 형질전환 물고기의 특정 조합이 확립됩니다.

그런 다음 독시사이클린의 투여를 통해 조직 특이적 Tet 반응자 전이유전자 발현이 유도됩니다. 마지막으로, Tet responder transgene 발현은 여기에서 fin 재생의 조직 절편을 준비하여 검증됩니다. 궁극적으로 면역형광은 조직 특이적 Tet 반응자 전이유전자 발현을 시각화하는 데 사용됩니다.

열 충격에 의한 유전자 발현과 같은 다른 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 시스템에 대한 증서가 조직 특이적 방식으로 유도 가능하고 가역적인 유전자 발현을 허용한다는 것입니다. 이 방법은 개별 조직의 신호 전달 경로와 유전자 기능을 분석할 수 있으므로 S 어지느러미 재생을 안내하는 분자 신호 전달 네트워크에 대한 보다 심층적인 이해를 얻는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 이 기술을 사용하여 제브라피시 지느러미 재생을 연구하지만, 유전자 기능의 조직 특이적 조작이 필요한 다른 많은 상황에서도 도움이 될 수 있습니다.

텍스트 프로토콜에 따라 Tet responder fish line을 생성한 후, 개별 G zero fish를 이전에 설정된 Tet activator line과 교배하여 transgene의 생식세포 통합 및 유도성을 평가합니다. 그런 다음 배아를 채취하여 Tet 반응자 유도를 평가할 수 있는 단계까지 올립니다. 2000% 에탄올을 사용하여 50 x 독시사이클린 원액을 준비하여 도크를 용해시켜 밀리리터당 50밀리그램의 농도에 도달합니다.

빛으로부터 보호되는 부두의 부분 표본을 섭씨 영하 20도에서 보관하십시오. 다음으로, 도크를 포함하는 E 3개의 배아 배지를 밀리리터당 25마이크로그램의 최종 농도로 준비합니다. 그런 다음 배아에서 E 3 개의 매체의 대부분을 디캔팅합니다.

E 3 배지를 포함하는 dos로 교체하고 배아를 최소 6시간 동안 섭씨 28.5도로 되돌립니다. 배양 후 형광 실체 현미경을 사용하여 Y pet 형광에 대한 배아를 스크리닝합니다. 방금 확인된 설립자로부터 여러 안정적인 형질전환 Tet 반응 라인을 구축합니다.

강하게 유도하고 예상 발현 영역 내에서 모자이크가 거의 나타나지 않을 뿐만 아니라 개별 배아 간의 변동이 거의 없는 라인을 선택합니다. TED 활성제와 Tet 응답자 낚싯줄이 설정되면 Tet 활성제 캐리어를 Tet responder 캐리어와 함께 만들어 이중 형질전환을 생성합니다. 물고기는 실체 현미경에서 am cyan 형광을 스크리닝하여 Tet activator 전이유전자를 운반하는 배아를 선택하고 am cyan 양성 배아를 성인으로 키웁니다.

PCR 기반 유전형 분석 또는 관심 조직에서 Tet Responder의 발현을 유도하는 능력에 의해 Tet 활성제 외에 Tet 응답자를 운반하는 이중 형질전환 성어를 식별하여 Tail Fin Tation을 수행하여 트리카 밀리리터당 160마이크로그램을 함유한 물고기 물로 채워진 비커에서 성체 얼룩말 물고기를 마취합니다. 물고기가 움직임을 멈추면 핀셋을 사용하여 거꾸로 된 페트리 접시에 조심스럽게 옮기고 메스를 사용하여 꼬리 지느러미를 부분적으로 절단하여 의사로 치료합니다. 독시사이클린 1밀리리터당 25마이크로그램이 함유된 어류 시스템 물 1리터로 번식 상자를 준비합니다.

음성 대조군으로, 독시사이클린 대신 에탄올 250마이크로리터를 사육 상자에 추가하고, 1리터의 물고기 시스템이 있는 사육 상자에 물을 공급하고, 최대 10마리의 이중 형질전환 물고기를 각 사육 상자에 전달하고, 스트레스를 줄이기 위해 상자를 어두운 곳에 두십시오. 최소 6시간 후, 처리된 물고기를 마취하고 젖은 아로스 코팅 접시에 옮기고 핀셋을 사용하여 꼬리를 펼칩니다. 다음으로, 형광 현미경으로 물고기를 스크리닝하여 재생 조직 내에서 Y PET가 나타나는지 확인합니다.

그 후, 물고기는 추가 치료에 사용되거나 물고기 사육 시스템으로 돌아가 부분 지느러미 절단 및 문서 치료 후 반응자 이식 유전자 유도를 종료할 수 있습니다.다시 절단 지느러미는 초기 절단 평면에 근접한 약 4-5개의 뼈 분절에서 재생되며, 이 비디오에서 이전에 설명한 바와 같이 핀셋을 사용하여 실험 설정에 따라 조직의 그루터기 부분만 처리합니다. 조심스럽게 조직을 평평하게 재생합니다.PBS의 PFA 부피당 4%무게를 포함하는 작은 페트리 접시에 넣고 다음날 섭씨 4도에서 밤새 고정합니다. PBS를 사용하여 재생을 두 번 세척한 후 0.5 어금니 E-D-T-A-P-B-S로 옮겨 밤새 섭씨 4도에서 뼈 매트릭스를 석회질 제거하세요. 다음으로, 실온에서 각각 30분 동안 슈크로스 PBS 시리즈에서 재생을 배양하고, 최종적으로 30% 슈크로스 PBS 및 조직 동결 배지와 동일한 비율로 추가로 30분 동안 배양한다.

지느러미를 조직 동결 매체로 옮기고 최소 2시간 동안 섭씨 4도에서 배양합니다. 그런 다음 극저온 주형을 현미경 슬라이드에 놓고 조직 동결 매체로 채웁니다. 재생을 극저온 주형으로 옮기고 조직의 방향을 지정하여 세로 또는 가로 단면을 얻습니다.

절편을 용이하게 하기 위해 재생이 직선인지 확인하십시오. 현미경 슬라이드와 함께 크라이오 몰드를 드라이아이스 베드에 위치한 금속 랙으로 옮겨 동결 과정을 시작합니다. 매체가 고체가 되면 극저온 금형을 다시 실온으로 옮겨 매체가 플라스틱 매체 계면에서 해동될 수 있도록 합니다.

그런 다음 펜과 같은 도구를 사용하여 냉동 블록을 극저온 주형에서 밀어내고 극저온 마이크로톰으로 절편화할 때까지 섭씨 영하 80도에서 보관합니다. 접착 현미경 슬라이드에서 10-14마이크로미터 단면을 수집하고 필요할 때까지 섭씨 음의 20도에서 슬라이드를 보관합니다. 핀 절편에서 Tet 반응자 발현을 특성화하려면 절편을 100% MEOH로 30분 동안 섭씨 영하 20도로 냉각합니다.

종이 타월을 사용하여 액체를 조심스럽게 제거하십시오. 그런 다음 PBT로 두 번, PBS로 한 번 각각 5분씩 절편을 세척합니다. PBS를 사용하여 각각 10분씩 두 번 세척하기 전에 dappy에서 10분 동안 섹션을 배양합니다.

그런 다음 컨포칼 또는 광시야 형광 현미경을 사용하여 제브라피시 시스템에 기능적 TET를 설정한 샘플을 이미지화하기 전에 Antifa 마운팅 에이전트와 커버 슬립을 사용하여 샘플을 장착합니다. 이 시스템은 개별 조직에서 유전자 또는 신호 경로 기능을 테스트하는 데 사용할 수 있습니다. 여기에서 볼 수 있듯이, HER 4.3 promoter driven tet activator는 증식 근위 블라사에서 검출되는 재생 YFP 형광의 하위 집합에서만 TED 반응자 발현을 유도하는 반면, 원위 블라사와 표피에는 발현이 없습니다.

블라사의 증식 세포를 포함하는 HER 4.3 도메인에서 WINT 베타-카테닌 길항제의 발현은 놀랍게도 재생 세포 증식에 영향을 미치지 않습니다. 이는 증식성 근위 모세포종의 바람 베타인과 신호전달이 아세포 ML 세포 증식 조절에 필수적인 역할을 하지 않는다는 것을 시사합니다. 대조적으로, 유비퀴틴 프로모터 구동 Tet 활성제 라인을 사용하여 지느러미 재생의 모든 조직에서 axin one 발현을 유도하는 것은 재생 세포 증식을 크게 방해합니다.

또한 조골세포를 포함하지 않는 HER 4.3 영역에서 축삭 1의 발현은 재생의 뼈 형성을 크게 방해합니다. 따라서 TE on 시스템을 사용하여 바람 신호에 대한 조직 특이적 간섭은 세포 증식 및 뼈 재생 조절에서 바람 신호의 예상치 못한 간접 기능을 보여줍니다. 일단 마스터가 되면 이 기술은 관심 있는 모든 조직에서 유도 가능한 표적 유전자 발현에 사용할 수 있습니다.

우리는 재생 S 물고기 꼬리 지느러미에서 바람층 니코틴 신호의 조직 특이적 기능을 조사하기 위해 이 방법을 성공적으로 적용했습니다. 이 방법을 사용하면 조직 재생을 조절하는 분자 결정 요인을 보다 포괄적으로 이해하는 데 도움이 됩니다.