Name: 코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 22 s
Description: 배우세요 성체 제브라피시 꼬리지느러미 재생에서 TetON 시스템을 이용한 조직 특이적 유전자 발현 방법을. 독시사이클린 유도와 면역형광법을 통해 재생 과정의 유전자 기능을 연구할 수 있습니다.

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저자는 기술 지원을 크리스타 하세, 도리스 웨버와 브리짓 Korte은 감사합니다. WEIDINGER 실험실에서 작업은 도이치 Forschungsgemeinschaft 우리 4223 / 3-1의 보조금 지원, 4223 / 4-1 도이치 먼 대 Kardiologie 오스카 - 라플란드-Stipendium를 통해와 클라우스 - 게오르그 - 싶게 - Sigrid-에 의해 우리 Hengstberger-Forschungsstipendium.

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성인 제브라 피쉬가 성공적으로 많은 내부 장기와 부속을 재생하는 놀라운 능력을 가지고있다. 관련된 분자 및 세포 메커니즘에 대한 철저한 이해는 유전자의 기능과 신호 전달 경로의 조직 특이 적 분석이 필요합니다. 이 무렵, 코스닥 시스템은 배아와 성인 제브라 피쉬의 시공간으로 제어 유전자 발현을위한 효율적인 도구를 제공합니다. 이 논문에 기술 된 TETON 시스템 구축 및 방법론이 성공적으로 우리의 실험실 (3)의 최근 연구에 사용되어왔다. 코스닥의 시스템을 구축 할 때 다음과 같은 추가적인 문제가 고려되어야한다 : TetActivator 유전자 설계 고려 사항 우리는 이전에 보여 그 헤르페스 심플 렉스 바이러스 VP16의 상호 활성화와 융합 역 구정 리프레 도메인의 M2 돌연변이 변종으로 구성된 단일 유도 TetActivator 도메인 파생 3F [irtTAM2 (3 층), IN 짧은 TE...

제브라 피쉬의 개발, 생리학, 질병, 및 재생의 여러 측면을 연구하는 기초가 튼튼한 척추 동물 모델 생물이다. 유전자 발현 또는 신호 전달 경로의 유도, 조직 특이 적 조작 후 배아 생물학적 과정, 실험 도구에 대한 모델로 제브라 피쉬의 성장 채택으로 점점 더 중요 해지고있다. 특히, 성인 제브라 피쉬의 기관 및 부속 재생에 대한 연구는 이러한 재생 과정에서 신호 전달 경로의 시공간 요구 사항의 해부 도구의 부족으로 고통을. 현재, 세가지 다른 시스템 조건, 조직 - 특이 성인 지브라 피쉬의 장기를 재생 유전자 발현 달성하는데 사용되어왔다 : Cre 호텔-LOX 시스템 트랜스포존 매개 체세포 형질 전환을 사용하여 열 - 충격 유도 유전자의 모자이크 식 및 코스닥 시스템 1 -3. 코스닥은 테트라 사이클린 계속의 변형을 말한다발현은 테트라 사이클린 항생 물질 또는 유도체, 예 독시사이클린의 존재 하에서 활성화 롤 전사 활성 시스템. 그것은 지금까지 성인 물고기에 사용 된 바와 같이 Cre 호텔-LOX 시스템은, 발현 공간적으로 조직 특이 적 조절 요소에 의해 제한되는 타목시펜 제어 Cre 호텔 재조합 효소 (CreERT2)에 의존한다. STOP 카세트의 CRE 구동 제거는 모든 세포 유형 1 활성화되어야 프로모터에 의해 구동되는 목적 유전자의 발현을 촉진한다. mosaically 표현 체세포 유전자의 트랜스포존 매개 창조 개별 세포 계통의 유도 유전자 발현 시스템을 제공한다. 전형적 재생 기관 (2)의 분리 된 세포 계통의 유전자를 운반하는 키메라 개인에 열 충격 프로모터 결과의 전사 제어하에 관심있는 유전자를 운반하는 트랜스포존과 TOL2 지브라 피쉬의 수정란 사출. 두 시스템은 조건부 조직 SPE를 허용하는 동안cific 유전자 발현은 LOX-Cre 호텔 시스템은 가역적없고, 트랜스포존 기반 클론 표지를 사용하는 전략은 스토캐스틱 자연에서 겪고있다. 따라서, 우리 등 최근 시간적 및 가산 및 가역 가변 3-5 인 공간적 조절 유전자 발현 촉진 제브라에 사용하기위한 유전자 코스닥 시스템을 채택 하였다. 여기서 사용 코스닥 시스템은 독시사이클린 (D​​OX) -inducible 전사 활성이 (역방향의 테트라 사이클린 transactivator, irtTA 짧은 TETA 개선) 조직 특이 적 유전자 조절 서열의 제어하에있는 트랜스 제닉 드라이버 라인 (TetActivator)을 포함한다. (; TetRE 구정 응답 요소) (그림 1A) 둘째, 유전자 변형 응답자 라인 테트라 사이클린 연산자의 전사 제어에 관심의 유전자를 품고 (TetResponder)가 필요합니다. 따라서 TetActivator 및 TetResponder 선의 특정 조합의 사용은 조건부 조직 정시 허용유전자 발현의 FIC 조작. 우리는 최근 제브라 피쉬의 꼬리 지느러미 3 재생 성인에서의 Wnt / 베타 카테닌 신호의 조직 특이 적 기능을 위해 프로브 TETON 시스템을 활용했다. 여기에 설명 된 프로토콜에서 우리는 지느러미 재생의 연구에 특히 제브라 피쉬에 Teton 시스템의 설정 및 사용에 대한 작업 흐름을 설명합니다. 이것은 상세한 안정적인 형질 전환 TetActivator과 TetResponder 라인을 생성하는 방법에 대한 지침 및 배아와 성인 제브라 피쉬의 형질 전환 유전자의 유도를위한 프로토콜을 포함한다. 더욱이, 우리는 성인 핀 저온부 지브라 피쉬의 제조를위한 프로토콜을 포함하여 핀 재생성에 조직 특이 적 유전자 발현의 확인을위한 기술을 설명한다. 또한, 우리는 TetResponder 식의 TetActivator 형질 전환 유전자의 설계, 형질 전환 방법의 선택, 및 검출을위한 고려 사항에 대해 설명합니다. 따라서,이 프로토콜의 전반적인 목표는 청사진 역할을하는 것입니다설정해서 기능성 코스닥 시스템 지브라 피쉬의 관심있는 조직에 적용 할 수있는 조건부 조직 특이 적 유전자 발현을 달성하기위한. 우리는 I-SceI 제한 효소 또는 짧은 유전자 조절 서열 사용하여 안정적인 TetActivator 라인의 TOL2 매개 세대를 허용 TetActivator 벡터 만든 (증강 조각, WEIDINGER 랩 플라스미드 데이터베이스없이 1247;. 그림 1B). 이 구조는 단순 포진 바이러스 VP16의 전이 활성화 도메인 파생 3F [irtTAM2 (3 층)]와 융합 역 구정 리프레 도메인의 M2 돌연변이 변종으로 구성된 TetActivator 카세트가 포함되어 있습니다. 이 공동 발현 동일한 오픈 리딩 프레임으로부터의 형광 단으로 AmCyan 때문에 TetActivator (TETA)의 발현을 용이하게 모니터링 할 수있다; 1 비율 5,6 : P2A 펩타이드는 1에서 분리 된 단백질과 같은 TETA과 AmCyan의 생산을 초래할한다 리보솜 건너 뛰기를, 중재. 구조는 또한 T의 &#39;poylinker 5 포함etActivator 카세트는 종래의 클로닝 방법을 사용하여 관심의 유전자 조절 서열의 삽입을 용이하게한다. (큰 게놈 영역을 포함하는 박테리아 인공 염색체로 재조합 될 수있다 (BAC), 또한, 우리는 전술 TetActivator 카세트 플러스 카나마이신 선택 카세트 (도 1C. WEIDINGER 랩 플라스미드 데이터베이스 없음 1180)로 이루어진 구조를 작성한 일반적으로 발현 패턴 트랜스 의해 모방 함) 유전자의 개시 코돈으로. 두 구조는 요청시 WEIDINGER 실험실에서 사용할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>번식 상자</td><td>Aqua Schwarz</td><td>AquaBox 1</td><td></td></tr><tr><td>복합 형광 현미경</td><td>(예 : Leica, Zeiss</td>)은 <td>형광 조직 단면을 이미지화하는</td>데 <td>제조업체에 따라 다릅니다</td></tr><tr><td>예</td><td>: Leica, Zeiss</td>는 <td>형광 조직 절편</td>저온 유지 장치 (예 : Leica, Thermo-Scientific)를 이미지화하는 데 <td>제조업체에 따라 다릅니다</td></tr><tr><td></td><td></td><td>. </td><td>냉동 절편</td></tr><tr><td>제조업체 4', 6-디아미디노-2-페닐이노돌(Dapi)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td>는 <td>핵</td></tr><tr><td>Doxycycline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891</td>의 <td>50%에서 50%의 50<% ></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>로 재고를 준비합니다.PBS의 4%(w/v) 파라포름알데히드, 고정을 위한 pH 7.5 </td></tr><tr><td>1x 포스팟 완충 식염수(PBS)</td><td></td><td></td><td>1.7 mM KH2PO4, 5.2 mM Na2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.5</td></tr><tr><td>1x Phosphat-buffer saline + Tween 20 (PBT)</td><td></td><td></td><td>1x PBS with 0.1% Tween 20</td></tr><tr><td>Superfrost Ultra Plus 접착 현미경 슬라이드</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td>조직 절편 수집을 위한</td> <td>1014356190</td></tr><tr><td>실체 형광 현미경</td>(<td>예: Leica, Zeiss</td>)은 <td>형광 기반 유전형 분석</td><td>제조업체에 따라 다름</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>(예: Biorad, Applied Biosystems</td>) <td>PCR 기반 유전형 분석</td><td>제조업체에 따라 다름</td></tr><tr><td>조직 동결 배지(TFM)조직 포</td>매닝을 위한 <td>Triangel Biomedical Sciences</td><td>TFM-C</td><td> 샘플</td></tr><tr>: <td>E3 배아 배지에서 1mg/ml에서 마취 사용을 위한</td> <td>Tricaine(L-Ethyl-m-amino-benzoate-methane sulfonate/MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td></tr></tbody></table>

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 zebrafish의 재생의 연구를

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

제브라피쉬는 척추동물의 발달, 생리학, 질병, 조직 재생을 연구하는 데 매우 중요한 모델 유기체가 되었습니다. 관련된 분자 및 세포 메커니즘에 대한 철저한 이해를 위해서는 유전자 발현 또는 신호 경로에 대한 유도 가능한 조직 특이적 조작을 허용하는 실험 도구가 필요합니다. 따라서 당사와 다른 사람들은 최근 TetON 시스템을 제브라피쉬에 사용하기 위해 조정했습니다. TetON 시스템은 시간적, 공간적으로 제어되는 유전자 발현을 촉진하며, 최근에는 이 도구를 사용하여 제브라피시 꼬리 지느러미 재생 중 Wnt/베타-카테닌 신호의 조직 특이적 기능을 조사하고 있습니다. 여기에서는 TetON 시스템을 사용하여 성체 재생 제브라피시 꼬리 지느러미에서 유도 가능한 조직 특이적 유전자 발현을 달성하는 워크플로우에 대해 설명합니다. 여기에는 안정적인 형질전환 TetActivator 및 TetResponder 라인의 생성, 전이유전자 유도 및 핀 재생에서 조직 특이적 유전자 발현 검증 기술이 포함됩니다. 따라서 이 프로토콜은 제브라피시에서 기능적인 TetON 시스템을 설정하고 후속 사용, 특히 지느러미 재생을 연구하기 위한 청사진 역할을 합니다.

조직 특이 유도 유전자 발현, 유전자 변형 TetActivator 및 TetResponder 라인을위한 기능 TETON 시스템을 구축하기 위해 생성 (그림 1A) 할 필요가있다. 초기 제브라 피쉬 배아 및 후속 세균 라인 통합으로 구축 또는 TetResponder (그림 1E) -이 TetActivator (C 그림 1B)를 마이크로 인젝션하여 수행됩니다. 기능성 TetActivator 구조물 중 하나, 또는 관심 유전자 (도 1C)의 조절 요소를 포함하는 BAC에 TetActivator 카세트 재결합하여 TetActivator 카세트 (도 1B)의 상류 단 조절 서열 (인핸서 요소)의 클로닝에 의해 생성 될 수있다. TetActivator 구조의 생식 계열 통합은 개인이 예상 발현 양상 (그림 1D)에서 G0 물고기와 F1 배아에서 AmCyan ...

여기에서는 TetON 시스템을 사용하여 성체 재생 제브라피시 꼬리 지느러미에서 조직 특이적 유전자 발현을 달성하는 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 제브라피쉬에서 기능적인 TED-on 시스템을 구축하여, 본 영상의 재생 중인 꼬리 지느러미에서 보여주는 것과 같이 조건부 조직 특이적 유전자 발현을 구현하는 것입니다. 이는 먼저 관심 조직에서 am cyan이 태그된 테트라사이클린 유도성 전사 활성제(tetracycline inducible transcriptional activator)를 발현하는 Tet 활성제 형질전환 라인과, Tet 반응 요소(Tet responsive elements)의 조절 하에 ype 태그가 붙은 표적 유전자를 포함하는 Tet 반응기 라인을 생성함으로써 이루어집니다. 그 다음으로, Tet 활성제와 Tet 반응기가 모두 도입된 특정 조합의 이중 형질전환 물고기를 구축합니다.그 다음, 독시사이클린(doxycycline)을 투여하여 조직 특이적 Tet 응답자 트랜스진(transgene) 발현을 유도합니다. 마지막으로, 지느러미 재생 부위의 조직 절편을 제작하여 Tet 응답자 트랜스진 발현을 확인합니다. 최종적으로, 면역형광법을 사용하여 조직 특이적 Tet 응답자 트랜스진의 발현을 시각화합니다.열 충격 유도 유전자 발현과 같은 다른 방법들과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 해당 시스템을 통해 조직 특이적인 방식으로 유도 및 가역적인 유전자 발현이 가능하다는 점입니다. 이 방법은 개별 조직에서의 신호 전달 경로와 유전자 기능을 분석할 수 있게 하여, 제브라피시 지느러미 재생을 안내하는 분자 신호 네트워크에 대해 더욱 심도 있게 이해하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 본 연구에서는 제브라피시 지느러미 재생을 연구하기 위해 이 기술을 사용하였으나, 유전자 기능의 조직 특이적 조작이 필요한 다른 많은 상황에서도 유용하게 활용될 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 따라 Tet responder 어류 라인을 생성한 후, 개별 G zero 어류를 기존에 구축된 Tet activator 라인과 교배하여 트랜스유전자의 생식세포 통합 및 유도 가능성을 평가하십시오. 그 다음 배아를 수확하고 Tet responder 유도를 평가할 수 있는 단계까지 배양하십시오. 50% ethanol을 사용하여 doxycycline을 녹여 50 mg/mL 농도로 만든 후, 2000 x doxycycline 스톡 용액을 준비하십시오.docks 분주액을 차광하여 -20 °C에서 보관하십시오. 다음으로, docks의 최종 농도가 25 µg/mL가 되도록

use-teton-system-to-study-molecular-mechanisms-zebrafish

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 조건부 성인 zebrafish 지느러미 재생 중에 대상 단백질의 표현을 분해하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 마이크로 주사와 상처 치유, 아체 형성 및 재생 파생물을 포함하여 지느러미 재생의 다양한 단계에서 단백질의 역할을 테스트하고 있습니다 지느러미 조직,에 안티 센스 oligonucleotide의 morpholinos를 electroporating을 포함한다.

생성중 성인 Zebrafish 테일 핀으로 Morpholinos의 생체내 Electroporation에

척추 절개 한 후, 성인 zebrafish의 육주 후 손상에 의한 기능 회복이있다. 유생의 투명성과 빠른 복구를 이용하려면, 우리는 애벌레 척수에 병행하는 방법을 제시한다. 절개 한 후, 우리는 3 일 후 부상으로 이일 후 상해에서 시작 감각 회복을 관찰하고 C-굴곡 운동.

애벌레 Zebrafish의 척수 절개

이러한 유전자의 특정 morpholinos와의 뇌 실내 주사를 사용하여 조직 재생 등의 개발 및 생리 학적 항상성 이후 단계에서 유전자 기능을 평가하는 제브라 피쉬에 대한 적응력이 역 유전 방법.

Zebrafish의 유충의 여러 어려운 대상 조직을 형질 심장 심실 사출을 사용하여 유전 모르 폴리 노의 접근을 반전

제브라피시 성체 신경 발생 및 재생의 세포 및 분자 메커니즘을 밝히기 위해 우리는 제브라피시 성체 텔렌스팔론에서 기계적 손상을 일으키는 침습적 수술과 면역조직화학 또는 현장 교잡화에 의한 찌른 반구의 변화를 모니터링하는 프로토콜을 개발했습니다.

Zebrafish의 성인 Telencephalon의 자상 부상 : 척추 동물의 뇌 신경 발생과 재생을 조사하는 방법

여기에서는 겐타마이신 주사로 급성 신장 손상을 유발하여 성인 신장 재생을 연구하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. 우리는 부상이 겐타마이신 투여량과 환경 온도에 따라 달라진다는 것을 보여주며, LHX1a+가 새로운 네프론을 개발하기 위해 현장 교잡법을 사용합니다.

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

명시야 기반 입체 현미경을 사용하여 전체 조직 규모에서 제브라피시 유충 꼬리 지느러미 재생의 역학을 캡처하기 위한 프로토콜을 제시합니다. 이 기술을 사용하면 단일 세포 해상도로 재생 역학을 캡처할 수 있습니다. 이 방법론은 CCD 카메라와 타임랩스 소프트웨어가 장착된 모든 실체현미경에 적용할 수 있습니다.

시간 경과 브라이트 실체 현미경으로 Zebrafish의 애벌레에서 조직 복구를 캡처

골격 근 재생 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동, 근육 이영양증 등 많은 근육 질환에서 손상 되는, 그리고이 재생 하는 근육의 무능력 결과. 여기서는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생을 검사할 수 있는 프로토콜을 설명합니다.

근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토

성인 제브라피쉬의 기계적 뇌 손상 모델은 높은 재생 능력을 조절하는 분자 메커니즘을 조사하기 위해 설명됩니다. 이 방법은 형광 면역 염색을 사용하여 재생 반응을 평가하기 위해 여러 종의 작은 물고기의 시신경에 찔린 상처 손상을 만드는 것을 설명합니다.

재생 능력의 비교 분석을 위해 Zebrafish와 Medaka를 사용한 성인 시신경의 찔린 상처 부상 모델

본 프로토콜은 유충 취급을 위한 자동화된 미세유체 플랫폼과 결합된 레이저 병변 시스템을 사용하여 제브라피쉬 유충에서 조직 특이적이고 재현성이 높은 부상을 유도하는 방법을 기술한다.

제브라피쉬 유충의 척수 재생 연구를위한 제어 된 반자동 레이저 유도 부상

여기에서 우리는 수정 후 최소 1일에서 7일 사이의 모든 단계에서 제브라피시 배아와 유충에서 높은 공간적 및 시간적 해상도로 세포를 이식하기 위한 프로토콜을 제시합니다.

배아 및 유충 제브라피시에서의 고분해능 세포 이식

배우세요 성체 제브라피시 꼬리지느러미 재생에서 TetON 시스템을 이용한 조직 특이적 유전자 발현 방법을. 독시사이클린 유도와 면역형광법을 통해 재생 과정의 유전자 기능을 연구할 수 있습니다.

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

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