배아의 형광 라벨의 DNA 특정 얼룩 메틸 녹색의 응용 프로그램

이 비디오에서는 매우 일반적인 조직학적 염색인 메틸 그린이 전체 배아와 같은 두꺼운 생물학적 표본의 레이저 컨포칼 현미경 검사에서 특수 응용 프로그램과 함께 형광 현미경 검사에서 매우 편리한 핵 라벨로 사용될 수 있는 방법을 보여줍니다. DNA 특이적 염색으로 메틸 그린을 잠시 소개한 후, 형광 염색을 위한 스톡 및 작업 용액을 준비하는 방법에 대해 설명합니다. 그런 다음 핵 염색을 달성하기 위한 실험 절차를 보여주고 여러 물고기 배아와 얻은 컨포칼 이미지의 예를 보유합니다.

마지막으로, 메틸 그린의 우수한 물리적 화학적 특성을 입증하고 논의합니다. 프레디 미샤(Freddy Misha)는 1869년에 DNA를 발견했고, 몇 년 후에 DNA가 비교적 새로운 연보와 메틸 그린으로 염색된 침전물을 형성했다는 것을 보여주었다. 메틸 그린은 두 개의 양전하를 가지고 있어 주요 그룹의 DNA와 강하게 상호 작용할 수 있으며, 도달 영역에서 우선적으로 결합합니다.

메틸 그린의 가장 확장 된 사용은 20 세기 초에 UNA와 Poppen Heim이 개발 한 메틸 인 RNA 염색 페린과 비강 용액의 조합이었습니다. 그러나 메틸 그린의 형광 특성에 대해서는 분석된 바가 거의 없기 때문에 매우 높은 친화도 및 특정 형광 표지로 사용될 수 있는 가능성을 테스트하기로 결정했습니다. 세포의 DNA용.

메틸 그린은 7개의 메틸 뿌리가 있는 알 메탄 염색입니다. 이 일곱 번째 그룹은 쉽게 잃어버리고 수정 보라색으로 되돌아갑니다. 이러한 이유로 결정을 제거하기 위해 메틸 그린과 혼합 된 크리스탈 바이올렛의 도착량이 있습니다.

바이올렛 메틸 그린 용액은 클로로포름으로 세척하여 크리스탈 바이올렛을 추출할 수 있습니다. 이 목적을 위해 즉시 보여주겠지만 흄 후드 아래에 4%ACU 솔루션을 준비합니다. 우리는 상 분리를 가속화하기 위해 적어도 두 부분의 클로로포름 및 원심 분리기와 혼합합니다.

centrification 후에, 우리는 methyl green를 가진 수성 단계 및 클로로포름과 결정 제비꽃을 가진 더 낮은 유기물을 얻습니다. 우리는 상부기를 회복하고 하부기가 명확해질 때까지 반복했습니다. 마지막에는 상부 단계가 회수되고 희석됩니다.

이것은 해결책입니다 몇 달 동안 작업대에서 안정되어 있습니다. 이제 우리는 메스 그린으로 배아 층에서 전체 MO를 경향하는 방법을 보여줄 것입니다. 컨포칼 마이크로잉을 위해 이식이 많은 물고기 배아를 사용할 것입니다.

예를 들어, 제브라피시 배아를 얻고 여과기로 잔해를 씻어냅니다. 어항 물 또는 배아 배지에서 원하는 단계로 배양하십시오. 가는 핀셋으로 진피를 제거하고 이 몇 시간 동안 또는 하룻밤 동안 포름알데히드를 위해 배아를 4%로 고정합니다.

그런 다음 PBST에서 배아를 여러 번 세척합니다. 원료 해결책을 5 10, PBST에서 000배 묽게 해서 메틸 녹색 작동되는 해결책을 준비하십시오. 용액에 배아를 실온에서 최소 3시간 동안 또는 섭씨 4도 감소된 하룻밤 동안 배양합니다.

이 예에서 컨포칼 이미지는 스펙트럼 검출기가 있는 더 작은 컨포칼 현미경에서 얻을 수 있습니다. 633 나노미터 레이저로 최대 여기가 달성되며 검출기는 넓은 범위로 설정됩니다. 가시 스펙트럼의 빨간색 영역에서.

메틸 그린 레드 방출은 신호 손실을 최소화하면서 전체 배아와 같은 깊은 표본에서도 우수한 품질의 핵 이미징을 얻을 수 있습니다. 이 첫 번째 시리즈는 제브라피시 망막의 핵이 잘 확립된 DNA 염색으로 염색된 것을 보여줍니다. 1분 후 축소합니다.

ABL 스캔 영역은 메틸 그린으로 동일한 실험을 수행할 때 분명해지며, 뚜렷한 백화는 보이지 않습니다. 다음 시리즈에서는 여기에 설명된 프로토콜, 즉 유사분열 수치를 관찰할 수 있는 제브라피시 표피의 유사분열 세포를 사용하여 얻을 수 있는 것의 대표적인 결과를 보여줍니다. 핵 구조를 볼 수 있는 동일한 표본에서 나온 IIC 핵.

메틸 그린 아말린으로 표지된 제브라피시 유충 표피 세포의 일부를 3D 재구성, 48시간 동안 다양한 핵 모양에 대한 보다 탁 트인 보기, 포트 수정, 좀벌레, br 망막. 우리는 여기에서 핵 라벨에 사용할 수 있는 매우 저렴한 형광 DNA 염색을 준비하는 쉬운 방법을 보여주었지만, 예를 들어 몇 가지를 보여줍니다. 이 기술은 배아 또는 조직, 전체 마운트 또는 단면에 적용할 수 있습니다.

또한 겔의 DNA 염색 및 측광법을 사용한 용액의 DNA 측정에도 사용할 수 있습니다.