나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

다음 실험의 전반적인 목표는 지질 기반 백신 나노입자를 합성 및 특성화하고 in vivo에서 항원 특이적 세포독성 T 림프구 확장을 유도하는 능력을 평가하는 것입니다. 이는 미식 마우스의 백신 접종을 위해 항원 및 보조제가 함께 로드된 이중층, 가교 결합된 다중 램 소포 또는 I CMV를 모방한 병원체를 엔지니어링함으로써 달성됩니다. 항원 특이적 CD를 발현하는 루시퍼라아제(luciferase)로 채택적으로 전달되어 8개의 양성 T 세포를 발현합니다.

두 번째 단계에서는 항원 특이적 CD 8개의 양성 T 세포의 확장을 전체 동물 생체 내 이미징으로 평가합니다. ICMV 면역 동물에서 수확한 말초 혈액 단핵 세포를 형광 표지된 사량체로 염색하고 유세포 분석법으로 분석하여 전신 구획 내 내인성 항원 특이적 CD 8개의 양성 T 세포의 빈도를 정량화합니다. 궁극적으로, 생물 발광 이미징은 나노 입자 백신 접종에 대한 반응으로 항원 특이적 세포독성 T 림프구의 확장을 추적하는 데 사용할 수 있습니다.

이러한 방법은 세포 독성 tial 림프구 확장의 정도가 어느 정도인지, 이러한 세포가 나노 입자 백신 접종에 반응하여 다양한 조직으로 어떻게 이동하는지와 같은 백신 설계의 주요 예비 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 조직 부검 후 현장 T 세포 분석과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 TT 세포 반응의 생체 내 이미징이 비침습적이라는 것입니다. 동일한 동물에 대한 종단 모니터링 허용 클로로포름에서 DOPC와 MPB의 1:1 몰 비율을 혼합하여 20밀리리터 유리 바이알에서 배치당 총 1.26마이크로몰의 지질 양을 유지하는 것으로 시작합니다.

다음으로, 원하는 농도의 지질 용액에 친유성 화물을 첨가하고 여분의 건조 질소 가스로 용액을 퍼지하여 유기 용매를 철저히 제거합니다. 다음날 아침 200마이크로리터의 10밀리몰 BTP에서 하룻밤 동안 샘플을 진공 상태에서 놓고 관심 수용성 화물을 포함하고 있으며, 결과 용액인 지질막 와류를 10초 동안 10초마다 실온에서 1시간 동안 수화합니다. 그런 다음 내용물을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

그런 다음 125와트 20킬로헤르츠 프로브 팁 소트에서 40% 강도 설정을 사용하여 연속 초음파 처리로 튜브를 얼음물 수조에 넣습니다. 5분 후 4마이크로리터의 150밀리몰 DTT를 튜브 와류에 첨가하여 마이크로 원심분리기에서 샘플을 혼합하고 스핀다운합니다. 그런 다음 40마이크로리터의 200밀리몰 염화칼슘을 샘플에 혼합한 다음 지질층이 포함된 MPB를 섭씨 37도에서 1시간 동안 DTT와 가교 결합합니다.

배양이 끝나면 두 번째 및 세 번째 원심 분리 중에 200 마이크로 리터의 이중 증류수에서 용액을 세 번 스핀 다운하여 상등액에서 반응하지 않은 DTT 및 캡슐화되지 않은 화물 물질을 제거합니다. 마지막 탈수 후, 우리는 섭씨 37도에서 30분 동안 갓 준비한 페골 100마이크로리터에 I CMV를 매달아 놓습니다. 그런 다음 이중 증류수로 소포를 두 번 더 씻습니다.

Resus는 PBS에서 최종 펠릿을 현탁시키고 ICM VS를 섭씨 4도에서 보관합니다. 입자를 특성화하려면 1ml의 이중 증류수 총 부피에 소량의 시료 분취액을 희석하기 전에 차가운 ICMV 현탁액을 혼합합니다. 그런 다음 I CMV를 제타 사이저 셀에 넣고 동적 광 산란 및 제타 전위 측정 시스템을 사용하여 제조업체의 지침에 따라 샘플의 입자 크기, 폴리 분산도 지수 및 제타 전위를 측정합니다.

CD를 발현하는 난자 특이적 루시퍼라아제를 분리하기 위해, 8개의 양성 T 세포를 분리한다. 먼저 OT 1 luciferase 형질전환 마우스에서 비장을 수확합니다. 조직을 5ml의 얼음처럼 차가운 PBS와 2%FBS에 넣은 다음 조직 배양 후드에 넣습니다.

3밀리리터 주사기의 플런저를 사용하여 70미크론 스트레이너를 통해 한 번에 최대 3개의 비장을 15밀리리터 원뿔형 튜브로 분쇄합니다. 플런저와 스트레이너를 PBS와 2%FBS로 세척합니다. 그런 다음 cyte 현탁액의 총 부피를 비장당 10ml로 가져옵니다.

총 셀 수를 결정한 다음 셀을 스핀 다운합니다. 다음으로, 시판되는 자기 음성 선택 키트를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 CD 8개의 양성 비장 세포를 분리합니다. 그런 다음 PBS에서 T 세포를 씻습니다.

그(것)들을 세고 2개에서 3 시간 배, 10개에서 다섯번째 세포를 20 마이크로리터의 쥐 CD 1632 막는 항체를 배양하십시오. 10분 후, 20마이크로리터의 anti CD eight A PC 항체를 30분 동안 세포에 첨가하고 유세포 분석으로 마그네틱 비드 분리 CD 8 양성 T 세포 집단의 순도를 평가합니다. 다음으로, 1-10 곱하기 10 곱하기 5 OT 1 루시페라제 CD 8 양성 T 세포를 200 마이크로리터의 PBS에 있는 미숙한 면도 알비노 C 57 블랙 6 마우스로 24시간 후 꼬리 정맥 주사를 통해 이식하고, 백신 접종 후 적절한 일수에 백신을 투여합니다.

10분 후 동물에게 1kg당 150mg의 루시퍼를 주입하고, 전체 동물 이미징 시스템으로 5-10분 동안 생물 발광 신호를 획득하여 OT 1개의 루시퍼 CD 8개의 양성 T 세포를 시각화하여 적절한 시간에 항원 특이적 CD 8개의 양성 T 세포의 수를 결정합니다. 백신 접종 후 턱밑 출혈 기술을 통해 백신을 접종한 마우스에서 약 100마이크로리터의 혈액을 EDTA 칼륨으로 코팅된 튜브에 수집하고 튜브를 여러 번 뒤집어 응고를 방지합니다. 그런 다음 100마이크로리터의 혈액을 마이크로 원심분리기 튜브로 옮기고 1밀리리터의 CK 용해 완충액을 추가합니다.

2-3분 후 세포를 원심분리하고 상층액을 제거합니다. 남은 pbmc를 1ml의 팩스 버퍼로 세척하고 방금 설명한 것처럼 CD 1632로 비특이적 바인딩을 차단합니다. 10분 후, 세포 현탁액을 4밀리리터 원형 하단 팩스 튜브로 나누고 제조업체의 사양에 따라 각 샘플에 20마이크로리터의 H 2KB over tetramer syn 대변 PE 용액을 추가합니다.

얼음에서 30분 후 각 실험 샘플에 적절한 항체 칵테일 20마이크로리터를 추가하고 각 플루오로 4태그 사량체 또는 항체를 각 대조 샘플에 추가합니다. 마지막으로, 또 다른 20분 배양 후, 모든 샘플을 팩스 버퍼에서 세척하고, DPI가 보충된 팩스 버퍼에서 펠릿을 재현탁하고, 플루오로 4촉 단백질 항원과 형광 친유성 염료가 함께 로드된 유세포 분석 I CMV로 샘플을 분석하여 생체 내에서 항원 및 나노 입자 전달을 시각화할 수 있습니다. 예를 들어, 컨포칼 현미경 이미징은 꼬리 기저부에서 피하로 전달된 용해성 항원이 투여 후 4시간 이내에 배액 림프절에 도달하고 24시간까지 제거됨을 나타냅니다.

대조적으로, 과부하된 I CMV는 투여 후 24시간까지 배액 림프절 주변에서 먼저 검출되며, 지속적으로 축적되어 배액 림프 조직 내에 난자 I CMV가 많이 침착됩니다. 실제로 4일차까지 백신 접종 당일 OT 1 Luciferase CD 8개의 양성 T 세포로 이식된 C 57 BL 6 마우스의 생물 발광 영상은 백신 접종 후 4일째까지 OT 1 루시페라제 tcell의 최소 배경 수준을 보여줍니다. 그러나 난자 MPI CMV로 면역된 마우스는 배출되는 서혜부 림프절 내에서 강력한 생물 발광 신호를 나타냅니다.

반면에 수용성 난자 백신을 접종한 마우스는 배출 림프절 내에서 OT 1 Lucifer CD 8 양성 T 세포의 확장이 훨씬 감소했음을 보여줍니다. 항원 특이 T 세포의 채택 전달 없이 용해성 난자 및 MPLA로 면역된 추가 마우스는 pbmc ICMV 백신 접종의 주간 모니터링에 의해 나타난 바와 같이 난자 특이적 CD 8 양성 T 세포의 눈에 띄는 확장을 나타내지 않지만, 상당히 강력하고 내인성 CD 8 양성 T 세포 반응을 유도하여 CD 8 양성 T 세포 구획 내에서 syn 분변 사량체 양성 T 세포의 최대 28%를 달성합니다 PBMC 41일차. 이 동영상을 시청한 후에는 지질 기반 나노입자를 합성하고, 면역을 수행하고, in vivo에서 CTL 확장을 시각화 및 정량화하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.

이러한 방법을 추가로 수정하여 CTL 응답에 대한 추가 정보를 표시할 수 있습니다. 예를 들어, 티어 염색 에세이는 세포의 기억 표현형을 평가하기 위해 CD 1 27, BCL 2 및 K lrg 1과 같은 추가 마커로 보충될 수 있습니다.