나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

다음 실험의 전반적인 목표는 지질 기반 백신 나노입자를 합성 및 특성화하고, 생체 내(in vivo)에서 항원 특이적 세포독성 T 림프구 증식을 유도하는 능력을 평가하는 것입니다. 이는 항원과 면역증강제가 공동 로딩되어 병원체를 모방한 층간 가교 결합 다층 소포(I CMVs)를 설계하여 미접종 마우스에 백신 접종을 함으로써 달성됩니다. 이후 루시페레이스(luciferase)를 발현하는 항원 특이적 CD8+ T 세포를 입양 전이합니다.

두 번째 단계에서는 전신 동물 내 생체 내 이미징(in vivo imaging)을 통해 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 증식을 평가합니다. 그 후 ICMV가 면역된 동물로부터 수집한 말초혈액 단핵세포를 형광 표지된 테트라머로 염색하고 유세포 분석기로 분석하여, 전신 구획 내 내인성 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 빈도를 정량화합니다. 최종적으로, 생물 발광 이미징을 사용하여 나노입자 백신 접종에 반응하는 항원 특이적 세포 독성 T 림프구의 증식을 추적할 수 있습니다.

이러한 방법들은 나노입자 백신 접종에 반응하여 세포독성 T 림프구의 확장 정도가 어느 정도인지, 그리고 이 세포들이 다양한 조직으로 어떻게 이동하는지와 같은 백신 설계의 핵심적인 예비 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 조직 부검 후 T 세포를 분석하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 T 세포 반응의 생체 내(in vivo) 이미징이 비침습적이라는 점입니다. 이를 통해 동일한 동물에 대한 종단적 모니터링이 가능해집니다. 먼저 20 mL 유리 바이알에 DOPC와 MPB를 1:1 몰비로 클로로포름에 혼합하며, 배치당 총 지질 양을 1.26 µmol로 유지하여 시작하십시오.

다음으로, 원하는 농도로 지질 용액에 친지성 화물을 첨가하고, 유기 용매를 완전히 제거하기 위해 초건조 질소 가스로 용액을 퍼지합니다. 샘플을 하룻밤 동안 진공 상태로 둡니다. 다음 날 아침, 지질 필름을 수화시키기 위해 관심 있는 수용성 화물이 포함된 10 millimolar BTP 200 microliters를 넣고, 실온에서 1시간 동안 10분마다 10초씩 생성된 용액을 볼텍싱합니다. 그런 다음 내용물을 1.5 milliliter 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.

다음으로 튜브를 얼음물 배스에 넣고 125 watt 20 kilohertz 프로브 팁 초음파 처리기를 40% 강도로 설정하여 계속해서 초음파 처리를 수행합니다. 5분 후, 튜브에 150 millimolar DTT 4 µL를 첨가하고 볼텍싱으로 혼합한 뒤 마이크로 원심분리기로 샘플을 스핀 다운합니다. 그런 다음 200 millimolar 염화칼슘 40 µL를 샘플에 혼합하고, 37 °C에서 1시간 동안 DTT를 이용해 lipid 층을 포함하는 MPB를 가교 결합시킵니다.

배양 종료 후, 용액을 세 번 원심 분리하며, 두 번째와 세 번째 원심 분리 과정 중에는 200 µL의 이중 증류수를 첨가하여 상층액으로부터 잔류 염화칼슘, 반응하지 않은 DTT 및 캡슐화되지 않은 화물 물질을 제거합니다. 마지막 원심 분리 후, I CMV를 갓 제조한 pegol 100 µL에 현탁하여 37 °C에서 30분 동안 유지합니다. 그 다음, 소포를 이중 증류수로 두 번 더 세척합니다.

최종 펠릿을 PBS에 재현탁하고 ICMV를 4°C에서 보관하십시오. 입자를 분석하기 위해, 차가운 ICMV 현탁액을 혼합한 후 샘플의 소량을 취해 총 부피 1 mL의 2회 증류수에 희석하십시오. 그다음 ICMV를 제타 사이저 셀에 넣고, 제조사의 지침에 따라 동적 광산란 및 제타 전위 측정 시스템을 사용하여 샘플의 입자 크기, 다분산 지수 및 제타 전위를 측정하십시오.

ova 특이적 luciferase 발현 CD8 양성 T 세포를 분리하려면, 먼저 OT-1 luciferase 형질전환 생쥐에서 비장을 적출하십시오. 조직을 5 mL의 차가운 PBS 및 2% FBS가 담긴 용기에 넣은 후 조직 배양 후드로 옮기십시오.

3 mL 주사기의 플런저를 사용하여 최대 3개의 비장을 한 번에 70 µm 스트레이너를 통해 15 mL 코니컬 튜브로 갈아 넣습니다. 플런저와 스트레이너를 PBS 및 2% FBS로 세척합니다. 그 다음, 비장 하나당 세포 현탁액의 총 부피를 10 mL가 되도록 맞춥니다.

총 세포 수를 측정하고 세포를 원심 분리합니다. 다음으로, 제조사의 지침에 따라 시판되는 자기 음성 선택 키트를 사용하여 CD8 양성 비장 세포를 분리합니다. 그런 후 T 세포를 PBS로 세척합니다.

세포 수를 측정하고 20 µL의 mouse CD1632 차단 항체에서 2~3 × 10⁵개의 세포를 배양합니다. 10분 후, 세포에 20 µL의 anti-CD8 APC 항체를 첨가하여 30분간 반응시킨 다음, 유세포 분석법(flow cytometry)을 통해 자기 비드(magnetic bead)로 분리된 CD8 양성 T 세포 집단의 순도를 평가합니다. 다음으로, 1~10 × 10⁵개의 OT-1 luciferase CD8 양성 T 세포를 200 µL의 PBS에 희석하여 털을 깎은 naive albino C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥에 정맥 주사로 입양 전이(adoptively transfer)합니다. 24시간 후, 백신 접종 후 해당 일자에 맞춰 백신을 투여합니다.

10분 후 동물에게 Lucifer를 kg당 150 mg 투여하고, 전신 동물 영상 시스템을 사용하여 5~10분 동안 생물 발광 신호를 획득함으로써 OT-I Lucifer CD8+ T 세포를 시각화하고, 적절한 시점에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 수를 결정합니다. 백신 접종 후, 하악 하혈법을 통해 백신이 접종된 마우스로부터 약 100 µL의 혈액을 potassium EDTA가 코팅된 튜브에 채취하고, 응고를 방지하기 위해 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어줍니다. 그런 다음 혈액 100 µL를 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 CK lysis buffer 1 mL를 첨가합니다.

2~3분 후, 세포를 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 남은 pbmc를 1 mL의 fax 버퍼로 세척하고, 앞서 시연한 대로 CD 1632를 사용하여 비특이적 결합을 차단합니다. 10분 후, 세포 현탁액을 4 mL 라운드 바텀 fax 튜브에 나누어 담고, 제조사의 사양에 따라 각 샘플에 20 µL의 H two KB over tetramer syn fecal PE 용액을 첨가합니다.

얼음 위에서 30분간 방치한 후, 각 실험 시료에 적절한 항체 칵테일 20 µL를 첨가하고, 각 fluoro four 태그 테트라머 또는 항체에 해당하는 단일 fluoro four 대조군 항체를 각 대조군 시료에 첨가합니다. 마지막으로, 20분간 더 배양한 후 모든 시료를 fax buffer로 세척하고 DPI가 첨가된 fax buffer에 펠릿을 재현탁하여 유세포 분석기로 시료를 분석합니다. fluoro four tact 단백질 항원과 형광성 친지성 염료가 공동 로딩된 CMV는 체내에서 항원 및 나노입자의 전달을 시각화할 수 있게 합니다. 예를 들어, 공초점 현미경 이미징 결과, 꼬리 기저부에 피하로 투여된 수용성 항원은 투여 후 4시간 이내에 배수 림프절에 도달하며 24시간 이내에 제거됨을 보여줍니다.

이와 대조적으로, 과적재된 I CMV는 투여 후 24시간 이내에 배출 림프절 주변부에서 처음 검출되며, 지속적인 축적을 통해 배출 림프 조직 내에 대량의 ova I CMV 침전물이 형성됩니다. 실제로 백신 접종 당일 OT one Luciferase CD eight 양성 T 세포를 입양 이식한 C 57 BL six 마우스의 생체 내 발광 이미징 결과, 백신 접종 후 4일째에는 OT one luciferase tcell의 배경 수준이 최소한으로 나타납니다. 그러나 ova MPI CMV로 면역화된 마우스는 배출 서혜부 림프절 내에서 강력한 생체 내 발광 신호를 보입니다.

반면에 가용성 OVA를 접종한 마우스는 배출 림프절 내에서 OT-I Lucifer CD8 양성 T 세포의 확장이 훨씬 적게 나타납니다. 또한, 항원 특이적 T 세포를 입양 이식하지 않고 가용성 OVA와 MPLA를 면역한 마우스에서는 PBMC를 매주 모니터링한 결과 OVA 특이적 CD8 양성 T 세포의 뚜렷한 확장이 관찰되지 않았습니다. 하지만 ICMV 백신 접종은 훨씬 더 강력한 내인성 CD8 양성 T 세포 반응을 유도하여, 41일째에 PBMC 내 CD8 양성 T 세포 군집 중 syn fecal 테트라머 양성 T 세포가 정점인 28%에 도달했습니다. 이 영상을 시청하고 나면 지질 기반 나노입자를 합성하고, 면역 접종을 수행하며, 생체 내(in vivo)에서 CTL 확장을 시각화하고 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

이러한 방법들은 CTL 반응에 관한 추가적인 정보를 밝혀내기 위해 더 수정될 수 있습니다. 예를 들어, 세포의 기억 표현형(memory phenotype)을 평가하기 위해 CD 1 27, BCL two, K lrg one과 같은 추가 마커를 teer 염색 분석법에 보완하여 사용할 수 있습니다.