Name: 나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: 배우세요 지질 기반 백신 나노입자 합성 및 특성 분석 방법을 통해 생체 내 CD8+ T 세포 반응을 평가하는 기술입니다. 전체 동물 이미징과 유세포 분석으로 면역 반응을 정량화할 수 있습니다.

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이 연구는 국립 보건 연구소 1K22AI097291-01을 부여하여 지원 대상 수 UL1TR000433에서 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 번역 상 과학을 전진을위한 국가 센터로했다. 우리는 또한 백신 나노 입자 및 OT-I / 뤽 형질 전환 마우스의 초기 작업에 기여하기위한 프레드 허친슨 암 센터에서 MIT 교수 마티아스 스테판에서 교수 대럴 어바인을 인정합니다.

이 프로토콜에 설명 된 모든 실험은 기존의 정책과 지침에 따라 사용 및 미시간 대학에서 동물 케어 (UCUCA)에 대학위원회의 승인을 수행 하였다. 1. 합성 및 ICMVs의 특성 단백질 항원과 보조제 분자와 공동로드 <ol><li> 믹스 1 : 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 (DOPC) 및 1,2- dioleoyl- SN -glycero -3- phosphoethanolamine- N의 1 몰비 - [4- (p의 -maleimidophenyl) 부 티르 아미드] 클로로포름 (MPB), 배치 당 1.26 μmol으로 총 지질 양을 유지하는 (즉, DOPC 500 μg의과 MPB 630 μg의) 20 ㎖의 유리 바이알 (직경 = 28mm, 높이 = 61mm)이다. </li><li> 원하는 농도에서 지질 용액에 같은 모노 포스 포릴 지질 A (MPLA) 또는 친 유성 염료 (예를 들어, DID)와 같은 지용성 약물을 추가합니다. 철저하게 추가 건조 nitroge으로 정화하여 유기 용매를 제거N 가스 및 진공 O / N에 따라 샘플을 배치. </li><li> 수용성 약물 (예, 단백질 항원)을 함유 된 10 mM 비스 - 트리스 프로판 (BTP, pH를 7.0) 200 μL를 첨가하여 지질 막을 수화. 10 초 RT에서 1 시간 동안 매 10 분 소용돌이. </li><li> 유리에서 내용, 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 바이알 도시 샘플 빙수 욕에서 및 125 W / 20kHz의 프로브 팁 초음파기에 설정 40 %의 강도를 사용하여 5 분 동안 연속적으로 초음파 처리 옮긴다. </li><li> 각 배치 (작업 농도 2.4 mM)을, 소용돌이, 그리고 탁상 마이크로 원심을 사용하여 간단히 원심 분리기에 150 mM 디티 오 트레이 톨 (DTT)의 4 μl를 추가합니다. </li><li> 200 mM의 염화칼슘 (2) 40 μl를 추가하고 피펫 (작업 농도 33 mM)을 혼합. DTT와 지질 층 MPB가 함유 가교 할 수 있도록, 1 시간 동안 37 ° C에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 원심 분리 샘플을 15 분 동안 20,000 XG에서 ddiH 2 O. 200 μL의 상등액을 제거하고 재현 탁 </li><li> 단계를 반복 1.7 원심 분리기 다시 두 번째 ddiH 2 O를 세척 한 후 상층 액에서 염화칼슘 2, 미 반응 DTT 및 캡슐화화물 물질을 제거합니다. </li><li> ddiH 2 O 2 kDa의 폴리에틸렌 글리콜 - 티올 (PEG-SH)의 10 ㎎ / ㎖를 준비 PEG-SH 용액 100 ㎕의 각 샘플을 ICMV 재현 탁하고, 30 분 동안 37 ° C에서 배양한다. </li><li> 두 ddiH 2 O 세척 (1.7 단계)을 수행하고, 4 ° C에서 최종 ICMV의 PBS의 펠렛 및 저장을 재현 탁. 입자가 장기간 보관 후 바닥에 침전 수 있으므로 앞서, ICMV 현탁액을 혼합, 사용할 수 있습니다. </li><li> 입자의 특성 분석을 위해, 각 배치에서 ICMVs의 작은 분취 량 (~ 10 %)를 제거하고 2 ddiH O. 1 ml의 총 부피로 희석 개별적 제타 세포 측정 및 입경 분산도 지수, 및 DLS 및 (제조사의 프로토콜에 따라) 제타 전위 측정 장치를 이용하여 시료의 제타 전위의 단일 샘플을 놓는다. </li></ol> 의 림프절 배수 2. 시험 공 초점 현미경으로 ICMVs을 형광 - 태그 <ol><li> ICMVs의 준비 형광 표지 된 항원과 친 유성 형광 염료와 함께로드 <ol><li> 제조자의 지시에 따라, 난 알부민 알렉사 형석 555 숙신 에스테르와 반응과 같은 형광 표지 된 단백질을 준비한다. </li><li> 지질 껍질에 형광 태그 ICMVs를 준비하려면, 친 유성 형광 염료 (예를 들면, 1,1&#39;- 디 옥타 데실 3,3,3- &#39;, 3&#39;-Tetramethylindodicarbocyanine, () DID) (지질 필름의 제조시 단계를 추가 1.2) 0.05 % 몰 지질의 양에. 지질 필름 수화 (단계 1.3), 형광 표지 된 항원을 포함하는 사용 버퍼, 완벽한 ICMV 합성 단계 1.4-1.11에 설명 된대로. </li></ol></li><li> 꼬리 기지에서 나노 입자의 피하 투여 <ol><li> 유도 챔버 U 구비 제어 흐름 증발기를 사용하여 마우스를 마취IACUC에 따라 3 % 이소 플루 란과 산소 유량 1.5 L / 분 tilizing 동물 프로토콜을 승인 하였다. 마우스가 무의식되면, 주사 부위에 최적의 액세스를 허용하고 동물에게 불편 함을 최소화하기 위해 오프 입고 마취 신속 전에 다음 단계를 수행한다. 대안 적 마취를 유지하도록 적절한 피팅 노즈콘을 사용한다. 생쥐 이상 5 분 동안 마취 경우, 시술 후 자극을 최소화해야 눈 윤활유를 적용. </li><li> 살균 및 피하 바늘을 가시화하는 데 사용될 수 보이는 피부의 작은 패치를 노출 모피 부품을 젖은 머리카락을 습윤 70 % 에탄올로 꼬리의 기부를 스프레이. </li><li> 목적하는 항원의 양과 PBS에 접종 용량 100 ㎕ 당 보조제를 함유하는 입자 분사 현탁액을 제조 (예를 들어, 10 μg의 OVA 및 사출 량 100 ㎕ 당 0.3 μg의 MPLA는 과거 6,9 사용되고있다). </li><li> 입자 서스펜션 INT 그리기OA의 27 ~ 29 G 바늘과 주사기와 꼬리의 기지에서 바늘을 삽입 (~ 헤어 라인에서 5mm) 경사와 함께 위로 향하게 입자 서스펜션 (22)의 50 μl를 주입. </li><li> 과도한 역류를 방지하고 바늘을 뽑아 동점 압력 몇 초 동안 기다립니다. 모두 배수 서혜부 림프절을 대상으로 꼬리베이스의 반대편에 주사를 반복합니다. </li></ol></li><li> 공 초점 현미경으로 림프절 저온부의 준비 및 시험. <ol><li> IACUC 동물 프로토콜을 승인에 따라 유도 기흉 다음 이산화탄소 질식으로 마우스를 안락사. Bedoya 23에서 입증 된 프로토콜에 따라 서혜부 림프절을 추출하고 4 ℃의 PBS 1 ml의 조직을 배치하여 피를 씻어. </li><li> 조직과 조직에서 PBS를 흡수하여 조직 cryomolds에 조직을 배치 (10 × 10 × 5mm 3) OCT를 매체 (24)를 동결 정상에 미리 채워진. 스냅 TIS 동결30 초 동안 액체 질소에 블록을 고소. 또한, 30 분 동안 드라이 아이스에 조직 블록을 배치합니다. ° C의 냉동고에서 -80 냉동 조직을 저장합니다. </li><li> -20 ° C (24)로 설정 저온 유지 장치에 5 ~ 10 μm의 두께 조직 절편을 잘라. </li><li> 필요한 경우, 면역 형광 라벨을 수행하고, 이전에 24 증명으로 공 초점 현미경으로 조직을 검사합니다. </li></ol></li></ol> 항원 특이 3. 모니터링 확장은, 동물 전체 이미징 나노 입자 백신 후 CD8 + T 세포는 루시퍼 라제 발현 <ol><li> OT-I / 인 Luc 형질 전환 마우스에서 OVA 특이 257-264, 루시퍼 라제를 발현하는 CD8 + T 세포의 분리 <ol><li> 이산화탄소 질식과 OT-I / 뤽 형질 전환 마우스를 안락사와 IACUC에 따라 기흉 동물 프로토콜을 승인 유도한다. 췌장 (23)에서 조직을 떼어 조심스럽게 복강에 접근에 의해 멸균 방식으로 비장을 수확하고,조직 문화 후드에 전송을위한 4 ℃의 PBS + 2 % FBS 5 ml의 장소. </li><li> (한 번에 3 비장까지) 50 ML 원뿔 원심 분리 관을 통해 70 μm의 나일론 스트레이너에 비장를 놓습니다. 3 ㎖ 주사기로부터 플런저를 사용하여 여과기를 통해 세포를 분쇄. </li><li> 플런저 및 PBS + 2 % FBS와 스트레이너를 씻어 버린다. 300 x g에서 10 분간, 10 ㎖ / 50 ㎖ 튜브에서 비장에 전량 가져와 혈구 계산 세포 현탁액의 작은 샘플을 채취하고, 원심 분리기. </li><li> 시판 자기 음성 선별 키트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 CD8 + T 세포 집단을 분리. </li><li> PBS로 세포를 세척 한 후, 절연 CD8 + T 세포의 수를 계산. 단리 된 CD8 + T 세포의 순도를 평가하기 위해, 다음 αCD8-APC 항체 20 μL를 추가하고, 10 분 동안 마우스 CD16 / 32 항체 (0.025 ㎎ / ㎖) 20 μL에 ~ 20,000-30,000 세포를 배양 (0.005 ㎎ / ㎖) 30 분 동안 품어. PEBSA V / w PBS에서 4 ° C에서 + 1 % 모든 배양을 rform. 유세포 분석 (25)을 수행합니다. </li></ol></li><li> 자신의 확장 후 예방 접종의 입양 격리 CD8 + T 세포의 전송 및 시각화 <ol><li> 정맥 꼬리 정맥 주입 (22) (일 -1)를 통해 PBS의 200 μL 부피 1-10 × 105 세포를 투여함으로써 순진한 C57BL / 6 마우스에 절연 OT-I / 루크 CD8 + T 세포의 대체 전송을 수행. C57BL / 6 마​​우스에 그 모피와 검은 피부 패치를 감안하면 생물 발광 신호를 방해 할 수 있습니다, 면도 흰둥이 C57BL / 6 마​​우스는 이러한 연구에 이상적입니다. </li><li> 이전 (2.2 절)을​​ 설명 어느 날 (0 일) 후, 백신을 관리 할 수​​ 있습니다. </li><li> 복강 PBS의 300 μL 부피 kg 마우스의 체중 당 150 mg의 루시페린를 관리. 10 분 후 (단계 2.2.1 에서처럼) 이소 플루 란 마취 생쥐 5-10 분 w위한 생물 발광 신호를 취득하여 OT-I / 루크 CD8 + T 세포를 시각화전체 동물 이미징 시스템 i 번째 (IVIS는, 자세한 지침에 대한 윌슨 (26) 참조). 종 연구에 필요한만큼 반복합니다. </li></ol></li></ol> 분석 용 PBMCs를 항 MHC 펩타이드 테트라 머 염색 항원 특이 적 CD8 + T 세포 주 : 다음 프로토콜 절차 적응 적 대체하지 않고 전사 OT-I / 루크 CD8 + T 세포 또는 C57BL / 6 마​​우스로 전송 C57BL / 6 마​​우스를 이용하여 수행 될 수있다. <ol><li> 접종 후, 원하는 시점에서, K 2 EDTA로 피복 튜브 턱밑 출혈 기법 27 통해 마우스에서 혈액의 약 100 μL (4-6 방울)을 수집하고 응고를 방지하기 위해 여러 번 반전. </li><li> , 마이크로 원심 튜브에 혈액 100 ㎕를 이동시켜 용해 완충액 1 ㎖를 추가하고, 적혈구 (적혈구)를 제거하기 위하여 2 ~ 3 분 동안 배양. 원심 분리기 샘플 1,500 XG에 5 분 상층 액을 제거합니다. 여전히 펠렛 경우(적혈구의 불완전한 제거를 나타내는) 적색 ppears는, 용해 완충액의 짧은 인큐베이션 (&lt;1 분)으로 분해하는 단계를 반복한다. </li><li> 5 분 동안 1,500 XG에서 1 (/ BSA V W PBS + 1 %) 외과 버퍼 ㎖의 원심 분리기와 나머지 PBMC를 씻으십시오. </li><li> 기음 뜨는 및 바인딩 비특이적과 FcRγ 쇄 매개 항체를 차단하는 마우스 CD16 / 32 항체의 20 μL의 샘플 (0.025 ㎎ / ㎖)을 재현 탁. 실온에서 10 분 동안 품어. </li><li> 4 ml의 둥근 바닥 외과 튜브에의 microcentrifuge 튜브에서 세포를 전송합니다. 각 샘플에 대한 제조업체의 사양에 따라 OVA 테트라 머 - SIINFEKL-PE의 용액 B H-2K의 20 μl를 추가하고 얼음에 30 분 동안 품어. </li><li> 항체 칵테일을 준비합니다 (예를 들어, αCD8-APC, αCD44-FITC 및 αCD62L-PECy7 항체 (각각 0.005, 0.005, 0.002 ㎎ / ㎖ 농도)). 각 실험 시료 20 μl를 추가하고 얼음에 20 분 동안 품어. 라하여 하나의 형광 컨트롤을 준비위에 표시된 농도에서 각각의 형광 표지 된 사량 또는 항체와 세포를 beling. </li><li> FACS 완충액으로 2 회 세척하고 DAPI의 2 μg의 / ㎖를 포함하는 외과 버퍼의 마지막 펠렛을 재현 탁. 분석 (자세한 내용과 예제는 Scheffold (25)에서 찾을 수있다) 세포 계측법 셀은 흐름에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol>

퍼킨 엘머는이 문서의 발행시 발생하는 생산 비용을 제공했다.

본 문서에서 제공된 프로토콜 ICMVs 불리는 합성과 새로운 지질 계 나노 입자 시스템의 특성을 설명하고, 항원 특이 적 CD8 + T 세포 반응을 유도하는 나노 입자 기반 백신 제형의 유효성을 검증하는 방법을 제공한다. ICMV 합성은 종종 손실의 결과로 일반적으로 제조하기위한 유기 용매를 필요로하는 다른 일반적으로 사용되는 고분자 나노 입자 시스템 (예를 들면, 폴리 (락 티드 - 코 - 글리콜 라이드) 산성 입자)에 비해 큰 장점 모든 수성 상태에서 완료 단백질 항원은 29, 30를 항원. 또한, 광범위한 성능 및 안정성에서 ICMVs 이점 따라서 장갑차 (31, 32) 내에서 동일한 세포 내 구획에 표적 항원과 보조제의 동시 전송을 허용하는, 소수성과 친수성을 모두 6 분자를 캡슐화. 모델 백신 나노 입자로 ICMVs를 사용하여, 우리가 절차를 설명했다(1) 나노 입자의 합성 및 특성화 dLNs에 나노 입자의 배수 (2) 검증, 및 항원 특이 적...

전통적인 백신 개발은 주로 시행 착오의 실험 방법을 이용 하였다. 그러나, 생체 재료 및 면역 활성화의 분자 결정의 발견의 다양한 배열의 최근 발전과 함께, 그것은 합리적으로 병원균 1, 2에서 파생 된 생물 물리학 및 생화학 적 단서와 백신 제제를 설계 할 수있게되었습니다. 특히, 다양한 입자 약물 전달 플랫폼은 림프절에 상주 열화 백신 성분을 보호하고, 제시 세포를 항원 (장갑차)에 그들의 공동 전달을 향상 그들이 소단위 항원과 면역 자극 에이전트와 공동으로로드 될 수있는 백신 캐리어로서 검토되어왔다 노드 (림프절)은, 따라서 면역 자극 및 활성화 3-5을 극대화. 이전에 강력한 백신 플랫폼,로 입증 된이 보고서에서 우리는, &quot;병원균 모방&quot;나노 입자 시스템의 합성을 설명이라고 interbilayer 가교 다중 층 소포 (ICMVs)강력한 세포 독성 T 림프구 (CTL) 및 전신과 점막 조직 구획 6-9 모두에서 체액 성 면역 반응의 도출을위한 M. 특히, ICMVs 접종 실질적으로 종래의 보조제 (예를 들면, 명반과 몬타나 이드) (7)와 함께 백신에 비해, 말라리아 항원에 대해 혈청 IgG의 수준이 향상되고 또한 종양 세포 및 쥐 9 바이러스 챌린지 모델에 대해 강력한 CTL 반응을 유도 달성했다. 여기에, 모델 백신 나노 입자 시스템으로 ICMVs를 사용하여, 우리는 입자 크기와 제타 전위 측정 및 배수 림프절에 입자 인신 매매의 추적 저온 절단 된 조직 (7)의 공 초점 영상을 활용 (dLNs)를 포함한 백신 나노 제형의 특성에 대한 방법을 설명합니다. 또, 루시퍼 라제 발현 항원 특이 적 CD8 + T 세포의 대체 9,10- 전송 후에 마우스에서 CTL 반응의 팽창을 분석 전체 동물 이미징 기반 방법을 제시한다. 마지막으로, 우리 드나노 입자 6,9 접종 마우스에서 내인성 T 세포 반응의 길이 정량 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)의 스크라이브 테트라 머 염색. ICMVs는 화학적 가교제 디티 6 지질 층 내에 가교 말레이 미드 기능화 인지질 헤드 그룹에 의해 안정화되는 다중 층 구조로 간단한 제어 리포좀 융합에 의해 합성 지질 나노 입자 기반 제형이다. ICMVs 합성되면, 나노 입자의 작은 분율은 입자의 크기 및 제타 전위 동적 광산란 (DLS) 시스템 및 제타 전위 분석기 (즉, 입자의 표면 전하)를 결정하는데 사용될 수있다. 확산 계수의 결정 입자 (11)의 유체 역학적 크기를 허용 입자 현탁액에 빛의 산란에 DLS는 변화를 측정. 일괄 합성 배치에서 일관된 입자 크기를 달성하는 것은 중요입자 크기 때문에 장갑차 (12, 13)에 의해 dLNs 이후의 세포 흡수에 백신 입자의 림프 배출에 영향을 미치는 주요 요소 중 하나입니다. 또한, 제타 전위는 입자와 입자 표면 전하 (11)의 전기 영동 이동도의 측정을 허용 전류가인가되는 입자 속도를 측정함으로써 얻어 질 수있다. 입자의 표면 전하가 저장 중 및 생체 내 투여 후 14, 15 입자 분산에 직접적인 영향을 콜로이드 안정성을 결정하기 때문에 입자의 일관된 제타 전위 값을 보장하는 것은 중요하다. dLNs에 입자 현지화를 추적하기 위해, ICMVs은 친 유성 염료 및 공유 태그가 항원을 포함하여 원하는 형광으로 표시 할 수 있습니다. 접종 후, 마우스를, 절제 dLNs는, 다양한 시점에서 안락사 저온 절단하고, 공 초점 현미경으로 분석 될 수있다. 이 기술은 림프 드레 이즈의 시각화 할 수 있습니다나노 입자 백신 사업자와 dLNs에 항원 모두 닝. 우리는 이전에 7 도시 한 바와 같이 조직 섹션들은 부가 적 항원과 배 중심의 형성과 관련된 셀 유형과 같은 형광 표지 된 항체 및 더 많은 정보를 획득하기 위해 이용, 물들 일 수있다. 입자 합성이 최적화되고 dLNs에 매매가 확인되면, 생체의 CTL 확대 추출의 유효성을 확인하는 것이 중요하다. 나노 백신에 응답하여 항원 특이 적 CD8 + T 세포의 추출을 분석하기 위해, 우리는 상세한 면역 학적 분석을 허용 OVA 257-264 펩티드 (SIINFEKL) 면역 CD8 + T 세포 에피토프와, 모델 항원, 난백 알부민 (OVA)을 이용했다 초기 백신 개발 16,17 대한 항원 특이 적 T 세포 반응. 특히, 팽창 및 항원 특이 적 CD8 + T 세포의 이동의 역학을 심문, 우리가 생성 한T 세포 수용체 (H-2K의 B와 관련) SIINFEKL 특정 (TCR)와 CD8 + T 세포를 가지고 OT-I 유전자 변형 쥐와 유전자 변형 마우스 (배낭)을 루시 페라 제 - 표현 반딧불 건너 이중 형질 전환 마우스 모델. 이러한 OT-I / 루크 생쥐에서 루시퍼 라제 발현, OT-I CD8 + T 세포를 단리 할 수​​ 있고, 나이브 C57BL / 6 마​​우스에 대체 전송 제조. 씨를 뿌린 후에 OVA 함유 나노 입자가 성공적으로 면역화 동물 전체 촬상 시스템 9,10와 생물 발광 신호를 모니터링함으로써 추적 될 수 전사 T 세포의 확장을 초래할 것이다. 이러한 비 침습적 전신 영상 법은 길이 방식으로 말초 조직에 T 세포 림프 조직에서의 보급 확대와 관련된 프로세스를 드러내는 과거 18-20에 다른 바이러스 또는 종양 항원으로 사용되어왔다. 적응 적 전송 항원 특이 적 CD8 + T 세포의 분석에 상보, endogeno우리 T 세포 반응이 채용되어, 접종 네 형광 표지 된 MHC 클래스 I 분자로 이루어진 펩타이드 MHC 량체 착물, 펩티드 에피토프와 함께로드하는 펩티드 - 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 테트라 분석법 (21)으로 관찰 할 수 남기 항원 - 특이 적으로 TCR 및 레이블 CD8 + T 세포에 결합한다. 펩티드 - MHC 테트라 분석은 림프 및 말초 조직에서 항원 특이 적 CD8 + T 세포를 식별하기위한 단말기 부검 연구에서 또는 일련의 혈액 무로부터 얻은 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)를 가진 길이 방향 연구 중 수행 될 수있다. 펩티드와 MHC 테트라 림프구 묻힌 후, 유동 세포 계측법 분석하는 CD8 + T 세포의 빈도 사이의 CTL의 표현형 또는 정량 분석​​에 대한 상세에 대해 수행된다.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1입니다. 단백질 항원 및 보조제 분자와 함께 로드된 ICMV의 합성 및 특성화</strong</td></tr><tr><td>>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[4-(p-maleimidophenyl)butyramide] (sodium salt) (MPB)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>870012</tr><tr><td>1,2-디올레올sn-글리세로-3-포스포콜린(DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td></td><td></td>850375</tr><tr><td>Monophosphoryl Lipid A (Synthetic) (PHAD&trade;) (MPLA)</td><td>Avanti Polar Lipids, INC.</td><td>699800</td><td></td></tr><tr><td>20 ml 유리 바이알</td><td>Wheaton</td><td>0334125D</td><td></td></tr><tr><td>Symphny 진공 오븐</td><td>VWR</td><td>414004-580</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin (OVA)</td><td>Worthington</td><td>3054</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris 프로판 (BTP)</td><td>Fisher</td><td>BP2943</td><td></td></tr><tr><td>Q125 Sonicator (125&nbsp; 승 20&nbsp; kHz)</td><td>Qsonica</td><td>Q125-110</td><td></td></tr><tr><td>디티오트레이톨 (DTT)</td><td>Fisher</td><td>BP172</td><td></td></tr><tr><td>2 kDa 티올화 폴리에틸렌 글리콜 (PEG-SH)</td><td>Laysan Bio</td><td>MPEG-SH-2000-1g</td><td></td></tr><tr><td>Malvern ZetaSizer Nano ZSP&nbsp;</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZetaSizer Cuvettes</td><td>Malvern</td><td>DTS1070</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">2. 컨포칼 현미경을 사용한 형광 태그 ICMV의 림프절 배출 검사</td></tr><tr><td>1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindodicarbocyanine, 4-Chlorobenzenesulfonate Salt (DID)</td><td>Life Technologies</td><td>D-7757</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555-succinimidyl ester (AF555-NHS)</td><td>Life Technologies</td><td>A37571</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT 동결 매체&nbsp;</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>조직 크라이오몰드</td><td>VWR</td><td>25608-922</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">3. 전체 동물 이미징을 사용한 나노 입자 백신 접종 후 항원 특이적 루시페라제 발현 CD8+ T 세포의 확장 모니터링</td></tr><tr><td>C57BL/6 마우스</td><td>Jackson</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Albino C57BL/6 마우스</td><td>Jackson</td><td>000058</td><td></td></tr><tr><td>OT-1 C57BL/6 마우스</td><td>Jackson</td><td>003831</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; m 나일론 여과기</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; 마우스 CD8+ T 세포 분리 키트</td><td>StemCell</td><td>19853</td><td></td></tr><tr><td>IVIS&reg; 전체 동물 이미징 시스템</td><td>Perkin Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">4. 항원 특이적 CD8+ T 세포의 유세포 분석을 위한 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 펩타이드-MHC 테트라머 염색</td></tr><tr><td>K2EDTA 튜브</td><td>BD</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>ACK 용해 완충액</td><td>Life Technologies</td><td>A10492-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD16/32 Fc Block</td><td>Ebioscience</td><td>14-0161-86</td><td></td></tr><tr><td>H-2Kb OVA Tetramer</td><td>MBL</td><td>TS-5001-1C</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD8-APC</td><td>BD</td><td>553031</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD44-FITC</td><td>BD</td><td>553133</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD62L-PECy7</td><td>Ebioscience</td><td>25-0621-82</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6- 디아미디노-2-페닐린돌 디하이드로클로라이드 (DAPI)</td><td>SIGMA</td><td>D8417-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CyAn 유세포분석기</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo Software</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 cd8 + t 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

명반과 같은 전통적인 백신 보조제는 차선의 CD8+ T 세포 반응을 유도합니다. 백신 개발의 이러한 주요 과제를 해결하기 위해 다양한 나노입자 시스템이 병원체의 특징을 모방하도록 설계되어 배출되는 림프절에 대한 항원 전달을 개선하고 항원 제시 세포의 항원 흡수를 증가시켜 항원 특이적 CD8+ T 세포 반응 유도에 최적화된 새로운 백신 제형을 개발했습니다. 이 기사에서는 서브유닛 항원과 면역자극제의 동시 전달을 위한 효과적인 백신 운반체 역할을 하고 강력한 세포독성 CD8+ T 림프구(CTL) 반응을 유도할 수 있는 ICMV(interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles)라고 하는 "병원체 모방" 나노입자 시스템의 합성에 대해 설명합니다. 동적 광 산란 및 제타 전위 분석기를 사용하여 백신 나노 입자의 유체역학적 크기 및 표면 전하를 특성화하는 방법을 설명하고 나노 입자 매개 항원 전달을 배액 림프절로 분석하기 위한 컨포칼 현미경 기반 절차를 제시합니다. 또한, 루시페라아제 발현, 항원 특이적 CD8+ T 세포를 수용 마우스로 이식한 후 나노 입자 백신 접종을 통해 CTL의 확장 및 이동 패턴에 대한 비침습적 조사를 실시간으로 수행하는 새로운 생물 발광 전체 동물 이미징 기술을 보여줍니다. 또한 나노 입자를 접종한 마우스에서 내인성 T 세포 반응의 종적 정량화를 위해 말초 혈액 단핵 세포의 테트라머 염색 및 유세포 분석을 설명합니다.

ICMVs의 합성에 관련된 단계는도 1 내지 6에 도시된다. 간략하게, 모든 친 유성 약물 또는 형광 염료를 함유하는 지질 막이 친수성 약물의 존재 하에서 수화된다. 이러한 칼슘과 같은 가의 양이온은, 다중 층 소포에 음이온 성 리포좀의 융합을 드라이브에 추가됩니다. DTT 등, 지질 층 apposing, 마지막 외부 말레이 미드 그룹을 나머지의 &quot;스테이플&quot;말레이 미드 기능화 지질에 첨가되는 가교제는 다이 티올, 티올-PEG 잔기와 반응에서 급냉된다. 각 배치의 작은 부분은 용이 DLS 및 제타 전위 분석 시스템과 입경 분산도 지수, 및 제타 전위를 측정함으로써 품질 제어 측정을 실시 할 수있다. 그 결과 입자는 OVA-캡슐화 P에 대한 평균 130 ± 20 나노 미터의 크기, 0.22 ± 0.02의 다 분산 지수 및 -54 ± 3 MV의 제타 전위와 상대적으로 균일하다기사 (그림 1B 및 1C). 입자의 건조...

쥐 백신 접종 모델에서 나노 입자를 사용한 면역에 대한 반응으로 항원 특이적 CD8+ T 세포의 확장을 모니터링하기 위한 전체 동물 이미징 및 유세포 분석 기반 기술에 대해 설명합니다.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

다음 실험의 전반적인 목표는 지질 기반 백신 나노입자를 합성 및 특성화하고, 생체 내(in vivo)에서 항원 특이적 세포독성 T 림프구 증식을 유도하는 능력을 평가하는 것입니다. 이는 항원과 면역증강제가 공동 로딩되어 병원체를 모방한 층간 가교 결합 다층 소포(I CMVs)를 설계하여 미접종 마우스에 백신 접종을 함으로써 달성됩니다. 이후 루시페레이스(luciferase)를 발현하는 항원 특이적 CD8+ T 세포를 입양 전이합니다.두 번째 단계에서는 전신 동물 내 생체 내 이미징(in vivo imaging)을 통해 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 증식을 평가합니다. 그 후 ICMV가 면역된 동물로부터 수집한 말초혈액 단핵세포를 형광 표지된 테트라머로 염색하고 유세포 분석기로 분석하여, 전신 구획 내 내인성 항원 특이적 CD8 양성 T 세포의 빈도를 정량화합니다. 최종적으로, 생물 발광 이미징을 사용하여 나노입자 백신 접종에 반응하는 항원 특이적 세포 독성 T 림프구의 증식을 추적할 수 있습니다.이러한 방법들은 나노입자 백신 접종에 반응하여 세포독성 T 림프구의 확장 정도가 어느 정도인지, 그리고 이 세포들이 다양한 조직으로 어떻게 이동하는지와 같은 백신 설계의 핵심적인 예비 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 조직 부검 후 T 세포를 분석하는 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 T 세포 반응의 생체 내(in vivo) 이미징이 비침습적이라는 점입니다. 이를 통해 동일한 동물에 대한 종단적 모니터링이 가능해집니다. 먼저 20 mL 유리 바이알에 DOPC와 MPB를 1:1 몰비로 클로로포름에 혼합하며, 배치당 총 지질 양을 1.26 µmol로 유지하여 시작하십시오.다음으로, 원하는 농도로 지질 용액에 친지성 화물을 첨가하고, 유기 용매를 완전히 제거하기 위해 초건조 질소 가스로 용액을 퍼지합니다. 샘플을 하룻밤 동안 진공 상태로 둡니다. 다음 날 아침, 지질 필름을 수화시키기 위해 관심 있는 수용성 화물이 포함된 10 millimolar BTP 200 microliters를 넣고, 실온에서 1시간 동안 10분마다 10초씩 생성된 용액을 볼텍싱합니다. 그런 다음 내용물을 1.5 milliliter 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.다음으로 튜브를 얼음물 배스에 넣고 125 watt 20 kilohertz 프로브 팁 초음파 처리기를 40% 강도로 설정하여 계속해서 초음파 처리를 수행합니다. 5분 후, 튜브에 150 millimolar DTT 4 µL를 첨가하고 볼텍싱으로 혼합한 뒤 마이크로 원심분리기로 샘플을 스핀 다운합니다. 그런 다음 200 millimolar 염화칼슘 40 µL를 샘플에 혼합하고, 37 °C에서 1시간 동안 DTT를 이용해 lipid 층을 포함하는 MPB를 가교 결합시킵니다.배양 종료 후, 용액을 세 번 원심 분리하며, 두 번째와 세 번째 원심 분리 과정 중에는 200 µL의 이중 증류수를 첨가하여 상층액으로부터 잔류 염화칼슘, 반응하지 않은 DTT 및 캡슐화되지 않은 화물 물질을 제거합니다. 마지막 원심 분리 후, I CMV를 갓 제조한 pegol 100 µL에 현탁하여 37 °C에서 30분 동안 유지합니다. 그 다음, 소포를 이중 증류수로 두 번 더 세척합니다.최종 펠릿을 PBS에 재현탁하고 ICMV를 4°C에서 보관하십시오. 입자를 분석하기 위해, 차가운 ICMV 현탁액을 혼합한 후 샘플의 소량을 취해 총 부피 1 mL의 2회 증류수에 희석하십시오. 그다음 ICMV를 제타 사이저 셀에 넣고, 제조사의 지침에 따라 동적 광산란 및 제타 전위 측정 시스템을 사용하여 샘플의 입자 크기, 다분산 지수 및 제타 전위를 측정하십시오.ova 특이적 luciferase 발현 CD8 양성 T 세포를 분리하려면, 먼저 OT-1 luciferase 형질전환 생쥐에서 비장을 적출하십시오. 조직을 5 mL의 차가운 PBS 및 2% FBS가 담긴 용기에 넣은 후 조직 배양 후드로 옮기십시오.3 mL 주사기의 플런저를 사용하여 최대 3개의 비장을 한 번에 70 µm 스트레이너를 통해 15 mL 코니컬 튜브로 갈아 넣습니다. 플런저와 스트레이너를 PBS 및 2% FBS로 세척합니다. 그 다음, 비장 하나당 세포 현탁액의 총 부피를 10 mL가 되도록 맞춥니다.총 세포 수를 측정하고 세포를 원심 분리합니다. 다음으로, 제조사의 지침에 따라 시판되는 자기 음성 선택 키트를 사용하여 CD8 양성 비장 세포를 분리합니다. 그런 후 T 세포를 PBS로 세척합니다.세포 수를 측정하고 20 µL의 mouse CD1632 차단 항체에서 2~3 × 10⁵개의 세포를 배양합니다. 10분 후, 세포에 20 µL의 anti-CD8 APC 항체를 첨가하여 30분간 반응시킨 다음, 유세포 분석법(flow cytometry)을 통해 자기 비드(magnetic bead)로 분리된 CD8 양성 T 세포 집단의 순도를 평가합니다. 다음으로, 1~10 × 10⁵개의 OT-1 luciferase CD8 양성 T 세포를 200 µL의 PBS에 희석하여 털을 깎은 naive albino C57BL/6 마우스의 꼬리 정맥에 정맥 주사로 입양 전이(adoptively transfer)합니다. 24시간 후, 백신 접종 후 해당 일자에 맞춰 백신을 투여합니다.10분 후 동물에게 Lucifer를 kg당 150 mg 투여하고, 전신 동물 영상 시스템을 사용하여 5~10분 동안 생물 발광 신호를 획득함으로써 OT-I Lucifer CD8+ T 세포를 시각화하고, 적절한 시점에서 항원 특이적 CD8+ T 세포의 수를 결정합니다. 백신 접종 후, 하악 하혈법을 통해 백신이 접종된 마우스로부터 약 100 µL의 혈액을 potassium EDTA가 코팅된 튜브에 채취하고, 응고를 방지하기 위해 튜브를 여러 번 뒤집어 섞어줍니다. 그런 다음 혈액 100 µL를 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 CK lysis buffer 1 mL를 첨가합니다.2~3분 후, 세포를 원심 분리하고 상층액을 제거합니다. 남은 pbmc를 1 mL의 fax 버퍼로 세척하고, 앞서 시연한 대로 CD 1632를 사용하여 비특이적 결합을 차단합니다. 10분 후, 세포 현탁액을 4 mL 라운드 바텀 fax 튜브에 나누어 담고, 제조사의 사양에 따라 각 샘플에 20 µL의 H two KB over tetramer syn fecal PE 용액을 첨가합니다.얼음 위에서 30분간 방치한 후, 각 실험 시료에 적절한 항체 칵테일 20 µL를 첨가하고, 각 fluoro four 태그 테트라머 또는 항체에 해당하는 단일 fluoro four 대조군 항체를 각 대조군 시료에 첨가합니다. 마지막으로, 20분간 더 배양한 후 모든 시료를 fax buffer로 세척하고 DPI가 첨가된 fax buffer에 펠릿을 재현탁하여 유세포 분석기로 시료를 분석합니다. fluoro four tact 단백질 항원과 형광성 친지성 염료가 공동 로딩된 CMV는 체내에서 항원 및 나노입자의 전달을 시각화할 수 있게 합니다. 예를 들어, 공초점 현미경 이미징 결과, 꼬리 기저부에 피하로 투여된 수용성 항원은 투여 후 4시간 이내에 배수 림프절에 도달하며 24시간 이내에 제거됨을 보여줍니다.이와 대조적으로, 과적재된 I CMV는 투여 후 24시간 이내에 배출 림프절 주변부에서 처음 검출되며, 지속적인 축적을 통해 배출 림프 조직 내에 대량의 ova I CMV 침전물이 형성됩니다. 실제로 백신 접종 당일 OT one Luciferase CD eight 양성 T 세포를 입양 이식한 C 57 BL six 마우스의 생체 내 발광 이미징 결과, 백신 접종 후 4일째에는 OT one luciferase tcell의 배경 수준이 최소한으로 나타납니다. 그러나 ova MPI CMV로 면역화된 마우스는 배출 서혜부 림프절 내에서 강력한 생체 내 발광 신호를 보입니다.반면에 가용성 OVA를 접종한 마우스는 배출 림프절 내에서 OT-I Lucifer CD8 양성 T 세포의 확장이 훨씬 적게 나타납니다. 또한, 항원 특이적 T 세포를 입양 이식하지 않고 가용성 OVA와 MPLA를 면역한 마우스에서는 PBMC를 매주 모니터링한 결과 OVA 특이적 CD8 양성 T 세포의 뚜렷한 확장이 관찰되지 않았습니다. 하지만 ICMV 백신 접종은 훨씬 더 강력한 내인성 CD8 양성 T 세포 반응을 유도하여, 41일째에 PBMC 내 CD8 양성 T 세포 군집 중 syn fecal 테트라머 양성 T 세포가 정점인 28%에 도달했습니다. 이 영상을 시청하고 나면 지질 기반 나노입자를 합성하고, 면역 접종을 수행하며, 생체 내(in vivo)에서 CTL 확장을 시각화하고 정량화하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.이러한 방법들은 CTL 반응에 관한 추가적인 정보를 밝혀내기 위해 더 수정될 수 있습니다. 예를 들어, 세포의 기억 표현형(memory phenotype)을 평가하기 위해 CD 1 27, BCL two, K lrg one과 같은 추가 마커를 teer 염색 분석법에 보완하여 사용할 수 있습니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서에서는 RAW 264.7 세포에 의한 polyanhydride의 nanoparticles이나 박테리아의 내면화를 수치 멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법을 활용한 방법을 설명합니다.

멀티 스펙트럼 이미징 유동세포계측법 의해 Nanoparticles과 박테리아의 세포 내면화 분석

이 비디오는 항원 펩타이드가 로드된 MHC-Igs 및 항-CD28 항체로 기능화된 자기 나노입자 기반 인공 항원 제시 세포(aAPC)를 사용하여 희귀 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분리하는 프로토콜에 대해 설명합니다. aAPC와 항원 펩타이드 표적 T 세포 수용체를 특이적으로 발현하는 CD8+ T 세포의 상호 작용 후 in vitro 확장은 이 CD8+ T 세포 집단의 농축 및 확장을 초래합니다.

항원 특이적 CD8+ T 세포의 나노 입자 기반 농축 및 증식

이 동영상은 다양한 세포주기 단계에서 항원 특이적 CD8+ T 세포를 분석하는 분석을 보여줍니다. 형광 표지된 생존 세포는 유세포 분석을 사용하여 선택되며, 세포 증식 관련 핵 단백질 및 핵산 염색에 대한 항체를 사용하여 서로 다른 세포 주기 단계에 있는 세포를 DNA 함량으로 식별합니다.

항원 특이적 CD8+ T 세포의 세포주기 분석을 위한 분석

이 비디오는 in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte 또는 CTL 생산을 모니터링하는 면역학적 방법을 보여줍니다. 마우스에는 유전자 조작된 증식성 염료 염색 공여체 CD8+ T 림프구가 사전 주입됩니다. 보조제와 함께 오브알부민을 피하 주사하면 세포독성 CD8+ T 림프구가 생성되며, 이는 면역염색 및 유세포 분석을 통해 수확 후 확인됩니다.

보조 매개 세포독성 T 림프구 생성을 모니터링하기 위한 면역학적 기술

유동 세포 계측법에 의해 면역 세포의 정의 모집단을 가진 나노 입자의 상호 작용의 분석.

유동 세포 계측법에 의해 주요 면역 세포 모집단과 형광 나노 입자의 상호 작용의 검출

이 프로토콜은 형광단 표지 나노체 및 기존 항체를 사용하여 마우스에서 생체 내 근적외선 형광 이종 이식 이미징 실험의 생체 외 검증을 수행하는 데 필요한 단계를 간략하게 설명합니다.

나노 바디 및 항체 기반의 검증<em&gt; 생체</em마우스에서&gt; 종양 이종 이식 NIRF 이미징 실험 사용<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 유동 세포 계측법 및 현미경

여기, 우리는 기본 인간 T 세포와 항 원 제시 세포 면역 시 냅 스의 정성 및 정량 분석을 위한 완벽 한 워크플로우를 설명합니다. 메서드 인수 및 시간의 상대적으로 짧은 기간 내에 몇 천 셀 이미지의 평가 허용 하는 이미징 cytometry를 기반으로 합니다.

Cytometry 이미징 사용 하 여 인간의 시스템에 면역 시 냅 스의 질적 및 양적 분석

항 원 특정 T 세포는 특성 또는 그들의 매우 낮은 주파수로 인해 치료에 활용 하기 어렵다. 우리이 세포를 풍부 하 게 항 원 특정 T 세포에 바인딩할 수 있는 자석 입자를 개발 하는 프로토콜을 제공 하는 여기, 그리고 그들에 게 몇 가지 확장 특성 및 치료에 대 한 배.

풍부 하 고 확장 하는 자성 나노 입자와 희귀 한 항 원 특정 T 세포

여기, 전 대 한 프로토콜 선물이 vivo 항 원 특정 CD8의 질적 검색+ T 세포. 분석은 단일 셀 정지 적은 양의 혈액 또는 기관에서 가능 합니다. 광범위 한 연구는 세포 독성 T 세포 응답 (예방 접종과 암 immunotherapy 연구)의 분석을 필요로 합니다.

반대로 벡터 및 안티 transgene 특정 CD8의 동시 정량화+ T 세포가 MHC를 통해 내가 Tetramer 바이러스 성 벡터와 예방 접종 후 얼룩

클로날 팽창은 항원 특이적 T 세포 반응의 주요 특징이다. 그러나, 항원 반응 T 세포의 세포 주기는 기술적인 한계 때문에 부분적으로, 제대로 조사되었습니다. 우리는 예방 접종 마우스의 비장 및 림프절에서 복제 확장 항원 특정 CD8 T 세포를 분석하는 유동 세포 측정 방법을 설명합니다.

예방 접종 된 마우스에서 항원 특정 CD8 T 세포의 세포 주기 분석을위한 DNA / Ki67 기반 유동 세포 분석

이 프로토콜은 나노 에멀젼 오피오포고닌 D 보조제가 효과적인 세포 면역 반응을 촉진하는지 여부를 평가하기 위한 상세한 방법을 제시합니다.

체외 나노에멀젼 백신 보조제인 오피오포고닌 D의 세포 활성 평가

배우세요 지질 기반 백신 나노입자 합성 및 특성 분석 방법을 통해 생체 내 CD8+ T 세포 반응을 평가하는 기술입니다. 전체 동물 이미징과 유세포 분석으로 면역 반응을 정량화할 수 있습니다.

나노 입자 백신 접종 후 분석 항원 특이 CD8 + T 세포 반응에 대한 전체 동물 이미징 및 유세포 기술

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