Name: Subnormothermic 기계 관류의 수단으로 기능 인간의 간 보존 및 복구 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 54 s
Description: 배우세요 인간 간 이식을 위한 저체온 기계 관류법으로 21°C에서 기능 회복 및 생존율 평가하는 방법입니다. 이 기술은 대사 수요를 낮추면서 장기 기능을 정확히 분석할 수 있습니다.

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미국 국립 보건 연구소에서 자금 조달, CIMIT 프로젝트 번호 12-1732 및 감사 인정 어린이를위한 이너스 병원 (R01EB008678, R01DK096075, R01DK084053, R00DK088962과 F32의 DK103500을 부여). 우리는 기꺼이이 작업을 지원하기 위해 뉴 잉글랜드 장기 은행을 감사드립니다.

인체 조직의 사용은 기관 검토위원회 (IRB) 상당 검토해야합니다. 여기에 설명 된 작업은 승인 매사 추세 츠 종합 병원 임상 시험 심사위원회 (제 2011P001496)에 의해 면제 선언했다. 1. 솔루션 준비 <ol><li> 무균 표 1에 설명 된대로 빨간색이없는 윌리엄스 &#39;매체 E를 페놀 보충제를 추가합니다.이 솔루션은 사용하기 전에 신선한 준비를해야합니다. 인슐린은 사용 직전에 추가해야합니다. </li></ol> 간 2. 위로 표 준비 <ol><li> 멸균, 드리 워진 표면에 얼음 가득 기관 그릇을 놓습니다. 차가운 보존 용액의 가방에두고 상자에서 간을 제거합니다. 주로 침수 간을 유지합니다. </li><li> 대동맥 패치 말단 위치 할 간동맥 (HA)를 확인합니다. Metzenbaum 가위를 사용하여 길이를 따라 다양한 컷 가지를 공개 무료 동맥을 해부하다. 조심스럽게 너가 너무CT 동맥의 전체 길이는 간 공급 용기를 절단 방지한다. 잘라내거나 볼 끝이없는 가지를 묶어하지 마십시오. </li><li> 용기의 크기에 따라 크기가 0 내지 4-0 범위 실크 봉합사를 이용하여 간암을 공급하지 동맥 가지 모두 매달아. 7-0 prolene으로의 스티치 동맥에 구멍 묶어 너무 짧거나 닫기 분기합니다. 넥타이는 복강 트렁크에 자신의 기원에 가까운 지라 왼쪽 위 동맥을 잘라. </li><li> 패치 바로 아래 복강 트렁크를 절단하여 대동맥 패치를 제거합니다. 대동맥 캐뉼라를 사용하여 복강 트렁크 Cannulate. </li><li> 포털 정맥 (PV)를 확인하고 퉁명스럽게 자유를 해부하다. 어떤 지점을 묶어 크기 24 튜브의 제조 세그먼트와 PV를 cannulate. </li><li> 정맥 자체를 절단하지 않고, suprahepatic 대정맥에서 다이아 프램의 섹션을 제거합니다. 직접 장기 챔버로 대정맥 배수에서 유출. </li><li> 이 전체 둘레 TI 컷ssue 샘플 담관의 끝에서 (2-3 밀리미터 길이); 스냅 (-80 ° C에서 보관) 액체 질소를 고정하고 각각 조직과 조직 학적 분석을 위해, 10 % 포르말린에 다른 저장합니다. 용기 캐 뉼러 및 막 형산 튜브 이루어지는 배액관 담관을 Cannulate. </li><li> 확인하고 0 실크 넥타이와 담낭 관을 결찰. 담낭 관을 담관 및 담낭 사이에서 발견된다. </li><li> 모든 공기를 제거 락 테이트 링거 (LR) 솔루션 및 주요 튜브의 얼음처럼 차가운 가방, 설정 플러시 튜브를 연결합니다. </li><li> 느린 물방울에 플러시 튜브의 유량 조절기를 설정합니다. 간문맥 캐 뉼러에 플러시 연결 튜브에 앞서, 폐문에 손가락 문맥을 막고 간문맥으로부터 공기를 제거 플러시 및 정맥 캐뉼라를 채운다. 에 과도한 압력을 방지하기 위해 차가운​​ 세척하는 동안 가방에게 간의 높이를 더 이상 20cm 상승하지 마십시오정맥. </li><li> 플러시 잠시 동안 최저점 PV를 흡장. 누출 PV를 검사합니다. 상술 한 바와 같이 선박 분기 폐쇄 할 수 있습니다. 얼음처럼 차가운 LR의 2 L의 총 태양 광 발전을 통해 간을 플래시합니다. </li><li> 반복 LR의 1 L에 HA를 위해 2.10, 2.11 단계를 반복합니다. </li></ol> 3. 초벌 SNMP 시스템 <ol><li> 프라임 기관 그릇에 관류 (21 ° C)의 2 L을 추가하고 주요 튜브에 장치를 시작하여 관류 장치. 21 ° C로 온도를 설정, 관류을 준비하기 위해 장치의 지시를 따르십시오. 3 mmHg로 각각 PV와 HA, 30 mmHg로의 압력으로 시작합니다. 가스 탱크를 열고 3 L / min의 유량으로 설정. </li><li> 샘플 포트에서 0.3 ml의 샘플을 드로잉하고 제조자의 지시에 따라 혈액 가스 분석 시스템에서 실행하여 HA 및 PV 모두로부터 유입 가스 혈액 샘플을 채취. 충분한 산소를 확인 (PO 2&gt; 700 mmHg로)과 산도 (7.35-7.45). </li><li> 접속된다 간은 -80 ° C에서 에펜 도르프 튜브 및 저장소의 측정 = 0에서의 관류 액으로 1.0 ml의 샘플을 채취하기 전에. 단일 예리 스틸 칼날을 사용하여 간에서 두 ± 250 mg의 쐐기 생검을 잘라; 스냅 (-80 ° C에서 보관) 액체 질소를 고정하고 10 % 포르말린에 다른 저장합니다. 관류 전에 간 무게. </li></ol> 4. 인간의 간 관류 <ol><li> 디바이스 간 전송. 단계 2.10에서와 같이 PV에서 공기를 제거한 후, PV 정맥에 태양 광 유입을 연결합니다. 비슷한 방식으로 HA를 연결합니다. 설정 PV 3 30 mmHg로에 HA 압력. 간은 거의 관류에 의해 침수되어야한다. 탈수를 방지하기 위해 젖은 멸균 거즈로, 유입 혈관을 포함한 모든 건조한 표면을 커버 </li><li> 수집 용기에 담즙 관 배수를 보자. 오 담즙의 실행을 허용 할 수 담즙 유출의 개방 간 수준에 있는지 또는 낮은 확인자유롭게 유타. </li><li> 간은 21 ° C로 가열되면 대상 유량은 각각 275-325 ㎖ / min.kg 및 PV에 대한 50 ~ 100 ㎖ / min.kg 및 HA 있습니다. 모든 간 관류 다르게 반응하기 때문에, 제 분 동안 흐름을 면밀히 모니터. 증가 또는 목표 유량에 도달하지 않으면 용기 중 하나에 압력을 감소시킨다. HA 50 mmHg로와 PV에 5 mmHg로를 초과하지 마십시오. </li><li> 샘플은 연구자 환경에서 간 조직, 관류 및 담즙에서 취할 수 있습니다. 우리는 관류하는 동안 최소한 다음 샘플 수집 요법을 권장합니다. <ol><li> 조직 생검, N = 2 × 250 ㎎, 매 시간마다. 저장 : -80 ° C 장기에서 액체 질소 저장 한 동결 스냅. 또한, 이전과 관류 후 다른 생검을 10 % 포르말린에 고정 (N = 1) </li><li> 관류 샘플, N = 2 × 1 ㎖, 첫번째 시간 동안 매 15 분 후, 30 분마다. 태양 광 발전 INF에서 샘플을 그립니다낮은 샘플 포트. 저장 : -80 ° C 장기. </li><li> PV 및 HA 유입 및 대정맥 유출의 혈액 가스 분석. N = 3 × 0.3 ml를, 매 30 분. PV 및 HA 샘플 포트 모두에서 샘플을 그립니다. 정맥에 주사기를 삽입하여 대정맥에서 0.3 ml의 샘플을 그리고 혈액 가스 분석기에서 실행 직접. 적절한 산소와 산도를 보장하기 위해 출력을 사용합니다. </li><li> 담즙 생산, N = 1 × 1 ml의 모든 시간. 시각적으로 담즙 생산마다 시간을 정량화하고, 수집 용기에서 샘플을 채취. 샘플링 후의 용기 갱신. 저장 : 드라이 아이스와 -80 ° C 장기. </li></ol></li><li> 3 시간 동안 재관류를 계속합니다. 압력, pH와 산소를 모니터링 및 전반에 걸쳐 샘플을 채취. 관류 액에 탄산 수​​소 나트륨을 첨가하여 그 산도를 조정한다. </li><li> 간이 관류되는 동안 관류 최종 샘플을 채취. 간을 분리하고 담관 정맥을 제거합니다. 2 사후 관류 조직 샘플을 채취C ° 10 % 포르말린에 -80 저장을 위해 전술 한 바와 같이 담관. </li><li> 적절한 생물 학적 처리 지침에 따라 인간의 간을 폐기하십시오. </li></ol>

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</ol>

박사. Uygun, K Uygun 및 Yarmush이 연구 (WO / 2011 / 002926), 및 박사 관련된 특허 출원의 발명자들은이되는지를 확인해야합니다. Uygun, K Uygun 및 Yarmush이 연구 (WO 2011 / / 35223)에 관련 특허 출원의 발명자들은이되는지를 확인해야합니다. 박사. K Uygun 및 Bruinsma이 일에 관련된 임시 특허 응용 프로그램이 있습니다. 닥터 K Uygun 할 Uygun이 장기 솔루션에 재무 적 관심을 가지고, 회사는 장기 보존 기술 개발에 초점을 맞추었다. 닥터 K Uygun과는 Uygun의 관심은 금리 정책의 자신의 충돌에 따라 MGH와 파트너 헬스 케어에 의해 관리 될 수있다.

간 허혈 손상을 복구하기위한 시도에서, 우리는 냉장 기간 후에 사용될 수있다 SNMP 시스템을 개발 하였다. Subnormothermic 기계 관류은 기존의 저온 저장뿐만 아니라 저체온과 정상 체온 기계 관류 양식에 대한 실행 가능한 대안을 제공합니다. 여러 다양한 시스템이 존재; 모두가 서로 다른 장점과 단점의 3,9,20을 제공합니다. SNMP 21에서 산소 대사 요구로서, 산소 담체없이 관류를 허용 ° C는 관류의 활성 산소에 의해 충족된다. subnormothermic 조건에서 감소하지만, 대사가 충실하고 영양이 풍부한 관류 솔루션의 지원이 필요합니다. 이러한 Belzer 기계 관류 솔루션으로 기존의 관류 솔루션은 구성에 일반적으로 최소화 차가운 관류을 위해 설계되었습니다. 윌리엄스 E 중간 수년 동안 간세포 배양 배지로 사용하고, C가 포함되어있다따뜻한 생체 조건에서 특히, 세포 기능을 지원하는 보편적 omponents. 기계 관류 동안 이루어진 측정은 기관의 기능을 반영. 그러한 담즙산 생산 및 산소 섭취량 직접적 관찰 파라미터 간 이식을 미리 평가할 수있다 실시간으로 측정된다. 마찬가지로, 세포 손상 및 허혈 (K +, 젖산 자료)의 마커는 관류 용액에 직접 측정 할 수 있고, 장기의 기능 (20)를 표시 할 수있다. 기계 관류 기술이 더욱 발전하고 더 널리 임상 응용을 달성 같이, 생체 기능 및 임상 결과 사이의 정확한 상관 관계가 만들어 질 수 있고, 관류 매개 이식 또는 한계 품질 간을 거부하는 ​​결정을 돕는데 유용 할 것이다. 또한, 관리 분석 도구를 사전 시점으로,보다 정교한 분석은 직접 perfu 기계 동안 사용할 수있게됩니다시온 (21). 이 작품에서 우리는 간 조직학 및 ALT의 방출에 의해 반사, 간 최소한의 부상으로 SNMP 시스템에서 지원 될 수 있음을 보여준다. 간 기능 회복이 가장 간 생존 상관 관계를 보여 및 동물 모델에 이식 성공 강하게 암시 된 ATP에 의해 반영된다 (22). 예 생체 간 이식의 이식 전 복구는 기증자의 중요한 확장을 허용하는 간 풀, 공급 및 이식의 기증자 간 수요 사이의 불균형을 보정.

간 이식 수만 말기 간 질환으로 고통 수천명의 환자에 대한 치료 만 경화제이다. 성공적인 이식, 그것이이 그래프트의 급속한 저하를 방지 할 필요가 수신자에 주입 될 때까지 상기 도너로부터 획득되는 시간으로부터 간 최적의 보존을 용이하게하기 위해. 간 보존을위한 현재 표준은 &#39;정적 냉장&#39;라한다 : 간시켜 간 대사를 감소시키고 허혈 악영향을 늦추고, 빙냉 보존 용액에 냉각된다. 이 냉장 기술이 성공적으로 이식 허용하고 있지만, 이러한 따뜻한 허혈 또는 ​​지방간 쇼 불량 환자에 의해 손상 DCD 기관 등의 한계 품질의 장기는 1 성과. 증거의 급속하게 확장 몸 대안 보존 양상으로 간 이식의 생체 기계 관류는 할 수 잠재적으로 메신저가이러한 한계 장기 2,3에 대한 결과를 증명한다. 간 이식은 자신의 성공의 피해자가되었다. 훨씬 더 많은 환자를 사용할 간이보다 이식라고, 그리고 수천 매년 미국에서 대기자 명단에 죽는다. 기증자 간 부족의 현실과 가난한받는 사람에 대한 최적 품질의 간 이식의 증가 활용 감안할 때, 그것은 널리 주입하기 전에 간 이식의 생체 기계 관류 간 이식의 패러다임의 변화의 약속을 보유하고 있음을 개최한다. 최근 몇 년 동안 4-8에서이 항목의 연구 관심에 띄게 증가 하였다. 다양한 유럽과 북미 센터에서 저체온 기계 관류는 생리적 온도에서 임상 소개 (8)과 정상 체온 기계 관류 최근 폐기 인간의 간 적용되었습니다 및 임상뿐만 아니라 9로 번역되는했다.지속적인 최적화가 최적 관류 10-12 파라미터 식별하면서 광범위한 개발은 다양한 프로토콜의 개발을 유도 하였다. 한계 품질 이식편의 사용은보다 지난 십 (13)를 통해 10 배 증가했다. 간 보존을위한 현재 표준 (정적 냉장)와 비교했을 때, 생체 기계 관류는 기관 풀을 많이 필요로 확장 될 및 잠재적으로 이식 후 합병증의 발생 빈도 감소 모두 다수의 잠재적 인 이점을 제공합니다. 특히, 현재 이식 후 최적 품질의 간 이식을 괴롭히는 담도 합병증은 상당한 문제 14-18 남아있다. subnormothermic 조건에서 기계 관류는 시간 창이 이식 (19)에 대한 적합성 여부를 객관적으로 이식 기능을 평가하기 위해 제공합니다. 간은, 생체 회로에서 관류되는 동안 모두 관류의ND 재관류 동안 생성 담즙 장기의 기능의 마커의 측정에 샘플링 될 수있다. 이러한 방법으로 현재의 기준에 따라 이식 폐기 간 객관적으로 이식 적합성에 대해 평가 될 수있다 &#39;심각한 손상&#39;. 이들의 대부분이 장기 이식을 위해 이용 될 수 있도록 생존력 평가는 잠재적으로 허용한다. 기계 관류 동일하게 강력한 장점은 수리와 따뜻한 / 차가운 허혈에 의해 손상된 간의 개선이다. ATP는 따뜻한 이후 차가운 허혈 동안 매우 빠르게 고갈 전에 간 (20)의 주입에 기계 관류의 기간 동안 repleted 할 수 있습니다. 간은, 에너지 저장 및 대사 상태 보충으로 미리 조정하고,받는 사람에 주입 후 재관류 손상의 해로운 효과를 더 잘 준비. 이 작품은 인간의 간 그라프의 생체 기계 관류하는 방법을 설명합니다기술과 생체 기계 관류의 유익한 효과를 모두 공부하고자하는 연구자 도움이 될 것 실험실에서 TS. 우리는 이식 거부 된 후 연구 목적으로 할당 된 인간 공여자 간 사용한다. 표준 간 조달 기법은 뇌사 기증자 (DBD) 또는 다른 20보다 상세하게 설명 순환 죽음 기증자 (DCD)에서 순환 정지 후 대동맥 클램핑 다음 간 현장 동맥 플러시에 포함됩니다. 또한, 간, 얼음 도너의 복강을 작​​성하여 조달 동안 냉각된다. 세척 용액 기본 설정은 위스콘신 또는 히스티딘 트립토판 - 케 토글 루타 레이트 (HTK) 솔루션의 대학을 사용하여 조달의 대부분으로, 지역에 따라서 다릅니다. 포털 정맥의 또 다시 테이블 플러시 잔여 혈액의 유실을 향상시킨다. 간은 종종 대동맥 세그먼트 쉬르를 떠나 조달복강 트렁크를 반올림. 담낭은 담즙 흡인, 절개 및 담관 플러시된다. 간 빙냉 보존 용액을 함유 멸균 봉지에 포장 상자 나 지정된 냉각기에 수송된다. 대표적인 결과를 따뜻하고 차가운 허혈 시간은 각각 60 분 및 12 시간으로 제한해야합니다. 인간의 장기를 나눠 경우 전염성 병원균에 대한 일상적인 혈청 학적 검사에도 불구하고, 표준 예방 조치, 인간의 기관에서 얻은 샘플 및 폐기물을주의해야합니다. 프로토콜은 여기에 시판 간 관류 장치를 이용하여 기계 subnormothermic 관류를 설명한다. 이러한 장치의 사용은 임상 및 연구 그룹과 이식 센터의 사이에 서로 다른 프로토콜과 장치 설정의 교차 유효성 검사에보다 신속하게 번역 할 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>간 보조 관류 장치</td><td>Organ Assist BV</td><td>간 보조</td><td></td></tr><tr><td>간 보조 일회용 세트</td><td>장기 보조 변환기</td><td>간 보조 일회용</td><td></td></tr><tr><td>윌리엄스 ' 미디엄 E</td><td>시그마</td><td>W1878&ndash; 6x500ml</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Eli Lilly & Co</td><td>Humulin R U-100</td><td></td></tr><tr><td>페니실린/스트렙토마이신 5,000 U/ml</td><td>Life Technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Invitrogen</td><td>25030-156</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone</td><td>MGH pharmacy</td><td>7750500</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen 가스 탱크 95% O2/5% CO2</td><td>Airgas</td><td>ZO2OX9522000043</td><td></td></tr><tr><td>특수 가스 조절기</td><td>Airgas</td><td>Y11244D580</td><td></td></tr><tr><td>Lactated Ringer' s 용액</td><td>Baxter</td><td>2B2324X</td><td></td></tr><tr><td>10% 중성 완충 포르말린</td><td>Fischer Scientific</td><td>316-155</td><td></td></tr><tr><td>톱니 Adson 집게</td><td>Roboz</td><td>RS-5234</td><td></td></tr><tr><td>Debakey 조직 집게, 7.75", 2.25mm</td><td>Roboz</td><td>RS-7562</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum 가위 7" 곡선형 SureCut 텅스텐</td><td>Roboz</td><td>RS-6965SC</td><td></td></tr><tr><td>Castroviejo 바늘 홀더 5.5&ndash; 7인치</td><td>Fine Science Tools</td><td>12565-14</td><td></td></tr><tr><td>0 blackbraided silk sutures</td><td>Ethicon</td><td>SA66G</td><td></td></tr><tr><td>4-0 나일론 봉합사, Nurolon RB1</td><td>Ethicon</td><td>C554D</td><td></td></tr><tr><td>혈액 가스 분석기</td><td>Siemens</td><td>RapidPoint 500</td><td></td></tr><tr><td>밸런스 스케일</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-10000-12</td><td></td></tr><tr><td>압력 표시 상자</td><td>Medtronic</td><td>66000</td><td></td></tr><tr><td>일회용 압력 디스플레이 세트</td>, <td>Medtronic</td><td>61000</td><td></td></tr>, <tr><td>휴대용 열전대 온도계 및 프로브</td>, <td>Cole Parmer</td>, <td>EW-91500-04 및 EW-08516-55</td><td></td></tr>, <tr><td>도토리 팁 용기, 캐뉼라, 4mm</td><td>, Medtronic</td><td>30005</td><td></td></tr>, <tr><td>관개 세트, 플러시 튜빙</td>, <td>Hospira</td><td>06543-01</td><td></td></tr>, <tr><td>믹싱 볼, 4L,</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07300-40</td><td></td></tr></tbody></table>

subnormothermic 기계 관류의 수단으로 기능 인간의 간 보존 및 복구

Functional Human Liver Preservation and Recovery by Means of Subnormothermic Machine Perfusion

현재 이식에 사용할 수 있는 간 이식편이 심각하게 부족합니다. 기증자 간 풀을 확장하기 위해서는 새로운 장기 보존 기술이 필요합니다. 기증자 간 이식편의 기계 관류는 전통적인 간 냉장 보관의 대안이며 기증자 장기 풀을 확장하기 위한 방식으로 많은 가능성을 가지고 있습니다. 우리는 최근에 인간 간의 비정상 발열 기계 관류의 잠재적 이점에 대해 설명했습니다. 기계로 관류된 간은 조직 ATP 수치의 기능과 회복을 개선한 것으로 나타났습니다. 또한, 정상 이하의 온도에서 간 이식편의 기계 관류를 통해 이식을 위한 간의 기능과 적합성을 객관적으로 평가할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 이전에 차선의 품질로 인해 버려졌던 많은 간이 기계 관류의 회복 효과를 통해 구출되고 이식에 활용될 수 있습니다. 여기에서는 이 준정상 보온 기계 관류 기술에 대해 자세히 설명합니다. 연구를 위해 할당된 인간 간 이식편은 21°C에서 무세포 산소화 관류물로 간 동맥 및 문맥을 통해 관류됩니다.

관찰 및 분석의 수는 이러한 유량 담즙 생산 직접적인 실시간 관측 포함한 관류 동안 간에서 수행 될 수있다; 이러한 관류의 가스 분석, 생화학 관류의 분석 및 조직과 조직 학적 분석을 포함한 시료 채취 후 만들어진 사후 측정을 실시간으로 측정. 여기에 언급 된 결과는 22 관류 인간의 간에서 있습니다. 간 기증자의 연령, 과도한 따뜻한 허혈성 시간, 조직 검사 결과 (지방증, 염증, 섬유증) 및 물류 이유를 포함하여 다양한 이유로 이식 거부했다. 18 간은 뇌사 다음 심장 죽음을 다음과 조달, 4되었다. 두 경우 모두, 도너 헤파린 30,000 유닛으로 전처리하고, 반응계에서 UW 용액과 함께 다시 테이블에 플러시. 냉 허혈 시간이 평균이었다 531 ± 237 (SD) 분, 평균 따뜻한 허혈성 시간이었다 27 ± 10 (SD) 분, 삶의 철수에서 측정차가운 플러시에 지원. 실시간 관측 및 측정은 사후 측정은 재관류 후에 계시하면서, 재관류 동안 간을 평가하는데 사용될 수있다. 실시간 관측 플로 쓰루 간 감기 간에서 높은 저항의 결과로서, 목표 유량보다 낮은 시작한다. 타겟 흐름은 일반적으로 간 후에 달성 될 수 HA에 PV 3 mmHg로 30 mmHg로의 압력을 이용하여 21 개까지 따뜻하게 &#160; 관류 (그림 1A)의 60 분 후에 C를 °. 담즙의 흐름은 일반적으로 관류 10 분 이내에 관찰 될 수 있고, 관류 (도 1b) 동안 지속적으로 생성된다. 담즙의 양이 간의 품질에 따라 18 ml / 분 / kg 0.3 ㎖ / 시간 / kg 간 범위. 심지어 더 안정 또는 짧은 따뜻한 허혈성 시간의 결과를 증가시키는 동시에 더 이상 따뜻한 허혈성 시간 간에서 담즙의 흐름은 점점 줄 경향이담즙 생산. 실시간 측정 두 실험을 위해 필수적인 혈액 가스 분석에 의한 관류 직접 자주 측정뿐만 아니라 유지 적절한 관류 조건, 중요한 것은 산소와 pH를. 용존 산소 분압은 PV 및 HA 모두의 유입에보다 큰 700 mmHg로해야한다. 대정맥에서 측정 유출 산소 압력은 일반적으로 증가하는 산소 섭취량을 반영 관류 이상 감소한다. t = 3 시간 (도 1C)에서 2.4-9.7 ㎖의 O 2 / 분 / kg으로 관류의 시작 이전에 (13)를 설명하고 0.5-2.2 ㎖의 O 2 / 분 / kg에서 ranged로서 산소 흡수 속도가 계산 될 수있다. pH의 감소는 주로 관류 젖산 방출의 결과로서, 제 30 분간 (도 1D)에서 관찰된다. 이는 8.4 % 나트륨 bicarbo으로 보충에 의해지지 될 수있다네이트는 약 90 분 후에 pH는 정상 범위에 빠진다. 일반적으로, 8.4 %의 중탄산 나트륨의 30 ~ 50 ml를가 요구된다. 젖산 농도 빠르게 처음 15 ~ 30 분에 증가하지만 첫 번째 시간 (그림 1E) 후 사망하기 시작합니다. 사후 측정 이러한 ALT 등 간 트랜스 아미나 제는 관류 측정 할 수있다. 처음 30 분에서 ALT의 큰 증가는 일반적으로 국소 빈혈 (그림 1 층) 동안 출시 된 ALT의 유실을 반영하는 관찰된다. ALT는 따뜻한 허혈성 시간 13 상관 관계가 나타났다. 기계 관류는 복구 에너지 상태 (그림 1G)를 반영, ATP 함량이 2.8 배 증가. H &amp; E 조직 학적 분석은 기계 관류 (그림 1H, I) 동안 지속 추가 부상을 알 수 없습니다. 이것은이 프로토콜에서 제안 생검 요법은 입술위한 것임을 주목해야한다earch 목적과 임상 목적으로 적용 할 수없는 경우가 있습니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52777/52777fig1.jpg" /> 도 1 :. 기계 관류 동안 인간 간 평가 관류 (B), 산소 uprate 레이트 (OUR) 유입의 차이로부터 계산 (PV 시간당 정량 PV 및 HA SNMP (A) 중, 담즙 생산 흐르지 + HA) 및 유출 (대정맥)는 선이 관류 (F), ATP에 관류 동안 관류 (C), pH와 젖산 동안 IN- 및 유출에 부분 산소 압력 (D, E), ALT의 방출을 보여 중단 (H)과 후 (I) 관류 전에 간 (54년 된 DCD, 19 분 따뜻한 허혈, 559 분 냉 허혈)의 시간당 생검 (G) 및 H &amp; E 얼룩 조직에서 측정 내용. 결과는 SEM ± 평균으로 표시하고 있습니다. <a= &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/52777/52777fig1large.jpg&quot;대상 = &quot;_ 빈&quot;HREF&gt;이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

우리는 subnormothermic 온도 (21 ° C에서)에서 인간의 간 이식의 생체 기계 관류하는 방법을 설명합니다.

Subnormothermic 기계 관류의 수단으로 기능 인간의 간 보존 및 복구

There is currently a severe shortage of liver grafts available for transplantation.  Novel organ preservation techniques are needed to expand the pool of ...

본 절차의 전반적인 목표는 장기의 보존, 회복 및 평가를 위해 인간 간의 아정온성 기계 관류를 수행하는 것입니다. 전임상 연구 환경에서 이는 먼저 간을 장치에 연결할 수 있도록 준비함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계에서는 기계 관류 시스템을 프라이밍하고 간을 연결하며, 마지막 단계에서 관류를 시작합니다.기계 관류된 간은 정상보다 낮은 온도 상태에서 기능적으로 활성화되어 담즙을 생성하게 됩니다. 최종적으로, 관류 중에 간에서 수집한 샘플을 분석하여 장기의 대사 회복 및 기능을 연구할 수 있습니다. 냉장 관류 및 정상 온도 관류와 같은 기존 보존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 저온 기계 관류가 체온 관류의 높은 대사 요구량을 충족할 필요 없이 간의 기능적 회복과 생존력 평가를 가능하게 한다는 점입니다.이 기술의 많은 부분은 성공적인 수행을 위해 경험이나 시연이 필요합니다. 예를 들어, 동맥, 정맥 및 관 도관의 절제를 포함하는 간의 백 테이블 준비(back table preparation) 방법 시연은 이전에 외과적 훈련을 받은 적이 없는 연구자들에게 도움이 될 수 있습니다. 간을 수령하면, 멸균 드레이프가 덮인 표면에 얼음이 채워진 장기 보관 용기를 놓고, 간을 운송 박스에서 꺼내어 차가운 보존액이 담긴 백에 대부분 잠긴 상태로 둡니다. 다음으로, Metzenbaum 가위를 사용하여 대동맥부터 고유간동맥까지 간으로 연결되는 동맥 공급 경로를 따라 다양한 분지들을 노출시킵니다.그 후, 끝부분이 보이지 않는 분지들을 자르거나 묶지 않도록 주의하면서, 간에 혈액을 공급하는 혈관이 손상되지 않도록 동맥의 나머지 부분을 조심스럽게 박리합니다. 동맥이 완전히 분리되면, 0~4-0 크기의 실크 봉합사를 사용하여 간에 공급되지 않는 모든 동맥 분지들을 결찰합니다. 비동맥과 위동맥은 복강동맥의 기시부 근처에서 묶고 절단합니다.복강동맥 주변으로 대동맥 패치를 절개합니다. 그다음 동맥 관류 캐뉼라를 사용하여 복강동맥에 캐뉼라를 삽입합니다. 이제 문맥을 박리하여 분리하고, 문맥의 분지들을 결찰하거나 구멍 난 부위를 봉합한 후 문맥 관류 캐뉼라로 캐뉼라를 삽입합니다.정맥 자체를 절단하지 않도록 주의하며 간상대정맥으로부터 횡격막 부위를 제거합니다. 그런 다음 총담관 끝부분에서 2~3 mm 길이의 전체 둘레 조직 샘플 두 개를 절단합니다. 샘플은 매우 조심스럽게 다루어야 합니다.한 샘플은 액체 질소로 급속 동결하여 -80°C에서 보관하고, 다른 샘플은 10% buffered formin에 보관하십시오. 그 다음, 혈관 캐뉼라를 사용하여 총담관에 캐뉼라를 삽입하고 소구경 튜브로 제작된 배액관을 연결하십시오. 이어서, 0번 실크사(silk tie)로 담낭관을 결찰하십시오.플러싱 튜빙 세트를 차가운 젖산 링거액 백에 연결하고, 튜빙 내의 공기를 제거하기 위해 프라이밍합니다. 플러싱 튜빙의 유량 조절기를 천천히 흐르는 정도로 설정하고, 혈관 내의 공기를 제거하기 위해 간문부에서 간문맥을 차단합니다. 이제 간문맥 내의 공기를 제거하기 위해 캐뉼라를 통해 플러싱 용액을 채우되, 정맥에 과도한 압력이 가해지는 것을 방지하기 위해 백의 높이를 간 높이보다 20 centimeters 이상 높이지 않도록 주의합니다.그런 다음, 총 2L의 ICEC 냉각 젖산 링거액으로 간을 세척합니다. 세척하는 동안 누출 여부를 확인하기 위해 가장 낮은 지점의 간문맥을 잠시 폐쇄하고, 방금 시연한 것과 동일하게 간동맥을 1L의 용액으로 다시 세척합니다. 간이 세척되는 동안 기관 용기에 상온의 profuse eight 2L를 추가하여 관류 시스템을 프라이밍하고, 장치를 작동시켜 튜빙을 프라이밍합니다. 온도를 21 °C로 설정합니다.그런 다음 문맥(portal vein)의 압력을 3 mmHg로, 간동맥(hepatic artery)의 압력을 30 mmHg로 설정합니다. 카보젠(carbogen) 가스 탱크를 열고 유량을 분당 3 L로 설정합니다. 다음으로, 문맥과 간동맥 유입 샘플 포트에서 혈액 가스 샘플을 채취하고, 제조사의 지침에 따라 혈액 가스 분석기로 샘플을 분석하여 산소 공급 상태와 pH가 적절한지 확인합니다.필요에 따라 중탄산나트륨 또는 염화수소를 사용하여 pH를 교정합니다. 그 다음 간을 연결하기 전에, 시간 0 측정값으로 관류액 1 mL 샘플을 채취하여 -80 °C에 보관합니다. 이때 단면 강철 칼날을 사용하여 간에서 약 250 mg 크기의 쐐기 생검 조직 2개를 절제합니다.한 개의 시료는 액체 질소로 급속 냉동하여 -80 °C에서 보관하고, 다른 시료는 10% 완충 포르말린으로 고정합니다. 관류를 시작하기 전에 간의 무게를 잰 다음, 장기를 장치의 장기 챔버로 옮기고 캐뉼라 내부의 공기를 제거합니다. 방금 시연한 내용과 같습니다.캐뉼라 삽입이 완료되면, 문맥 및 간동맥 유입로를 해당 캐뉼라에 연결합니다. 관류를 시작하고, 유입 혈관을 포함하여 건조한 모든 표면을 젖은 멸균 거즈로 덮어 간이 관류액에 완전히 잠기도록 합니다. 탈수를 방지하기 위해 담즙 튜브를 수집 용기에 연결하여 배출시킵니다.담즙이 원활하게 흐를 수 있도록 담즙 배액관의 개구부가 간 높이 또는 그보다 낮게 위치하도록 주의합니다. 간의 온도가 21 °C까지 상승하면, 문맥과 간동맥의 유량을 각각 kg당 분당 275~325 mL 및 50~100 mL로 설정합니다. 관류 과정 동안, 필요에 따라 관류된 간 조직과 담즙 샘플을 채취합니다.압력, pH 및 산소포화도를 모니터링하고 필요에 따라 중탄산나트륨으로 pH를 조절하면서 3시간 동안 관류를 계속합니다. 관류가 끝나면 최종 샘플을 수집하고, 간의 연결을 해제한 뒤 담관 캐뉼라를 제거합니다. 마지막으로, 방금 시연한 것과 같이 담관의 관류 후 조직 샘플 두 개를 수집하고 인체 간을 폐기합니다.적절한 생물학적 위험물 폐기 지침을 준수하십시오. 저온 상태의 간은 저항이 높기 때문에 문맥에 3 mmHg, 간동맥에 30 mmHg의 압력을 가했을 때 초기 유량은 낮게 시작됩니다. 일반적으로 60분간의 관류 후 간의 온도가 21 °C까지 올라가면 목표 유량에 도달할 수 있습니다. 실험 목적뿐만 아니라 적절한 관류 조건을 유지하기 위해 혈액 가스 분석을 통해 관류액을 빈번하게 측정하는 것이 필수적입니다.예를 들어, 문맥과 간동맥 모두의 유입부에서 용존 산소 분압은 700 mmHg보다 높아야 합니다. 반면, 대정맥에서 측정된 유출 산소 분압은 일반적으로 관류 시간이 길어짐에 따라 산소 섭취량의 증가를 반영하여 감소해야 합니다. 또한, PERFU 8에서 간 트랜스아미나제 등을 측정할 수 있습니다.일반적으로 관류 시작 후 첫 30분 동안 alanine transaminase 또는 LT의 수치가 증가하며, 나머지 관류 시간 동안에는 추가 증가폭이 최소한으로 관찰됩니다. 기계 관류된 간에서 TP 생성에 대해 추가로 평가한 결과, 간의 A TP 함량이 2.8배 증가하여 에너지 상태가 회복되었음을 보여주었습니다. 또한, h and e 조직학적 분석 결과, 시술 과정 동안 추가적인 손상이 발생하지 않았음이 확인되었습니다.이 절차를 따르면 분리된 간에 대한 광범위한 분석이 가능하며, 간의 생리학 및 병리학에 대한 독특한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 체외에서 간 기능을 평가하기 위해 체외 기계 관류 동안 인체 간을 유지 관리하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

functional-human-liver-preservation-recovery-means-subnormothermic

Research

연구

JoVE Journal

Medicine

의학

지방산 간, 오래된 기증자로부터 이식, 또는 심장 죽음 (DCD) 후 검색 간장 등의 한계 이식 만이 저조한 기존의 차가운 정적 스토리지를 허용. 우리는 이전에 이식 한계 간 이식의 보존, 평가, 수리 subnormothermic 생체 간 관류의 새로운 모델을 개발했다.

Subnormothermic의 기술<em&gt; 전의 VIVO</em&gt; 간 스토리지, 평가를위한 관류 및 한계 간 이식의 수리

여기에서 우리는 기증자 간 이식의 산소 전 현장 기계 관류를 설명하는 프로토콜을 제시한다. 이 문서에서는 조달 및 기계 관류에 대한 간 이식을 준비, 관류 액, 주요 관류 시스템을 준비하고 간 이식의 산소 정상 체온 기계 관류를 수행하는 단계 프로토콜에 의해 단계가 포함되어 있습니다.

기증자의 간을의 현지 외 정상 체온 기계 관류

상당한 간 기증자 부족 이며 간 기증자에 대 한 기준을 확대 했습니다. Normothermic ex vivo 간 관류 (NEVLP)를 평가 하 고 장기의 기능을 수정 개발 되었습니다. 이 연구 NEVLP의 쥐 모델을 보여 줍니다 고 간 보존 부상 완화 pegylated catalase의 능력을 테스트 합니다.

Ex Vivo Normothermic 간 관류의 작은 동물 모델

여기에 설명된 간 정상열 기계 관류(NMP)의 돼지 모델은 보존 전략, 생존력 평가 도구 및 장기 복구를 위한 플랫폼으로서 NMP를 연구하는 데 성공적으로 사용될 수 있습니다. 이는 높은 번역 가치를 지니고 있지만 기술적으로 까다롭고 노동 집약적입니다.

Porcine Normothermic 격리 간 관류

정상 체온 생체 외 간 관류(NEVLP) 시스템이 마우스 간을 위해 만들어졌습니다. 이 시스템은 미세 수술에 대한 경험이 필요하지만 재현 가능한 관류 결과를 허용합니다. 마우스 간을 활용하는 능력은 새로운 관류액 첨가제를 식별하기 위한 분자 경로의 조사를 용이하게 하고 장기 복구에 중점을 둔 실험의 실행을 가능하게 합니다.

마우스의 Normothermic Ex Vivo 간 기계 관류

이 프로토콜은 기증자 간의 보존을 위해 다양한 온도 제어 기계 관류(MP)를 활용한 돼지 모델을 구축한 후 기교 간 이식(OLTx)을 수행하는 방법론을 설명합니다. 순환사(DCD) 간 후 기증자 기증을 이용한 OLTx의 성공률을 높이고 안정적인 모델을 확립하는 것을 목표로 합니다.

관류 및 정형외과 간 이식에 의한 순환 사망(DCD) 간 후 돼지 기증 보존

여기에서는 기존 플랫폼의 높은 비용과 제한된 유연성을 극복하도록 설계된 오픈 소스의 수정 가능한 규범 보온 외 관류 시스템에 대한 프로토콜을 제시하여 전임상 생물 의학 연구에서 보다 접근하기 쉽고 비용 효율적이며 반복적인 사용을 가능하게 합니다.

연구 과학자를 위해 설계된 오픈 소스 normothermic 관류 시스템

목적은 새로운 방법, neuropathic 고통과 spasticity의 관리를위한 호흡 제어 전기 자극 (BreEStim)를 제시하는 것입니다.

Neuropathic 고통과 Spasticity의 관리를위한 호흡 조절 전기 자극 (BreEStim)

내막 증식증 (IH) 및 정맥 이식 실패의 개발로 이어지는 메커니즘은 아직 제대로 이해하고 있습니다. 이 연구는 제어 흐름과 압력 하에서 인간의 혈관을 관류하는 생체 시스템을 설명합니다. 또한 외부 메쉬 보강 효율 IH의 개발 평가 하였다 제한한다.

인간 복재 정맥 절차 전의 VIVO 관류 및 외부 보강

여기에서는 멜팔란으로 격리된 간 관류(IHP)를 수행하는 방법에 대한 프로토콜을 제시하고 포도막 흑색종의 간 전이에 대한 치료 옵션으로서 IHP에 대해서도 논의합니다.

포도막 흑색 종의 간전이에 대한 치료로 고립 간 관류

배우세요 인간 간 이식을 위한 저체온 기계 관류법으로 21°C에서 기능 회복 및 생존율 평가하는 방법입니다. 이 기술은 대사 수요를 낮추면서 장기 기능을 정확히 분석할 수 있습니다.

Subnormothermic 기계 관류의 수단으로 기능 인간의 간 보존 및 복구

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