Name: 의 분리를위한 최적화 된 농축 기법 박터 박테리오파지 생물 종 토양 샘플에서 격리 된 것 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 24 s
Description: 배우세요 토양 샘플에서 Arthrobacter 박테리오파지를 분리하는 농축 기법을 최적화하는 방법입니다. 이 프로토콜은 빠르고 재현 가능한 결과를 제공하여 미생물학 및 파지 치료 연구에 활용할 수 있습니다.

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이 프로토콜의 개발을위한 자금 조달은 고등 교육의 남동부 펜실베니아 컨소시엄 Cabrini 대학 과학 학부에 의해 제공되었다. 추가 자금 지원은 아카디아 대학과 Immaculata 대학에서왔다. 우리는 특히 친절하게 우리의 고립 된 파지의 전자 현미경 이미지 촬영을 위해 세인트 조셉 대학에서 박사 카렌 Snetselaar 감사합니다. 추가 지원은 유전체학과 진화 과학 (SEA-파지) 프로그램을 진행하는 하워드 휴즈 의학 연구소 과학 교육 얼라이언스 파지 사냥꾼에 의해 제공되었다.

파지 격리를위한 Arthobacter 세포의 1. 준비 <ul><li> 문화 박터 특검팀. KY3901 식민지 2 ~ 3 일 동안 30 ° C에서 배양 루리아 Bertaini (LB) 한천 플레이트 상에 스트리킹. 식민지를 선택하고 30 ° C에서 225 rpm으로 진탕 배양기에서 당황 문화 플라스크에 LB 배지 250 ml의에 추가하고 부화 멸균 루프를 사용합니다. </li><li> 성장의 약 24 시간이 파지 감염 실험 후반 초반 / 지수 정지상 세포를 얻을 수 있습니다. 늦은 성장 정지 상태로 들어가는 중간 세포 않도록 밀접 세균 성장​​의 상태를 모니터한다. 주 : 세포 생장 후술 파지 분리 및 정제 절차 / 단계 0.5 .0.7 사이 광학 밀도 OD (600)로 구성한다. </li></ul> 토양 샘플에서 파지 2. 컬렉션 <ol><li> 원하는 위치에서 토양의 200~400g를 수집합니다. 참고 : Arthroba 세균 이후CTER의 속을 감염 파지가에있는 토양의 대부분의 유형에 만연 될 수있다 그들과 일반적인 토양 박테리아에게 있습니다. </li><li> PB가의 있도록 최소 200 ml의 토양에 파지 버퍼 (PB) (68)의 NaCl, 10mM 황산, 10 mM 트리스 - CL (PH 7.5)] 적어도 400 ML을 추가하고 충분히 큰 플라스크에 혼합 상층 액과 추출 할 수있다. </li><li> 토양이 일시 중단 될 때까지 부드럽게 교반 또는 소용돌이에 의해 혼합 및 토양 침전물, 일반적으로 30 분을 해결 할 수 있습니다. </li><li> 토양 침전물 파편을 제거하기 위해 중력 여과 필터 종이를 통해 &quot;토양 추출물&quot;을 전달합니다. </li><li> LB 분말을 추가하고 2 % 용액 (200 ml의 토양 추출물 4g LB 분말)을 만들기 위해 혼합. </li><li> 멸균 여과 액을 얻기 위해 진공 여과에 의해 0.22 ㎛의 필터를 통해 용액을 통과. 가능하면, 즉시 2.7 단계로 진행합니다. 가능한 파지 입자의 저장 진행하기 전에 주까지 4 ° C에서 샘플을 필터링 할 필요가있는 경우, 그러나, 수감소 될 것이다. </li><li> 나누어지는 다수의 기법을 이용하여 무균 배플 배양 플라스크를 흔들면서 멸균 개별 250 ㎖ 중에 필터 멸균 LB / 토양 추출물 혼합물을 50 ml의 부분. 다른 박터 파지 다른 CaCl2를 조건 하에서 최적의 성장 때문에 원하는 최종 농도 (0-50 mM)을 멸균 2.0 M CaCl2를 솔루션을 추가합니다. 참고 : 우리는 우리가 확인 된 박터 파지의 대부분이 1 MM-2.5 mM의 염화칼슘 2의 범위 내에있는 것을 찾을 수 있습니다. 그러나, 고립 된 파지 중 일부는 매우 높은 염화칼슘이 농도에서 0 mM의 CaCl2를 불러야에서 독점적으로 우리가 성장했다. 3.1 단계로 바로 진행합니다. </li></ol> 3. 파지 격리 <ol><li> 플라스크에 각각 후반 초반 / 지수 정지상 박테리아 문화의 1-2.5 ML을 추가합니다. 0.5-0.7 OD (600)의 경우, 세포를 1 ㎖를 사용합니다. 0.7의 OD보다 높은 OD (600)의 2.5 mL의 사용세포. 참고 : 지수 상 성장 세포는 일반적으로 더 파지과 정지상 성장 세포보다 더 높은 역가를 얻을 수 있습니다. </li><li> 진탕 배양기에서 약 24 시간 동안 30 ° C에서 250 rpm에서 플라스크를 흔들어. </li><li> 24 시간의 잠복기 후 흔들림이 인큐베이터에서 농축 플라스크를 제거하고 농축 샘플을 파지 버퍼에 10 배 희석. </li><li> 후반 초반 / 지수 정지상 박테리아 문화의 0.5 ml의 문화 튜브를 설정하고 다양한 농축 문화의 양 문화 튜브에 (PB의 10 -1 희석 500 μL 5 μL)를 추가합니다. 주 : 각 토양 시료를 농축 한 후에 다른 파지 역가를 생성 이후 농도의 넓은 범위를 테스트하는 것이 바람직하다. </li><li> 원래 농축 플라스크의 농도 현재까지 최종 농도가 동일하게 문화 튜브에 염화칼슘 (2)를 추가합니다. w 많은 파지를 위해 선택하는 다른 염화칼슘 2 농도의 범위를 사용하여i 번째 염화칼슘 2 종속성을 변화. 주 : 대부분의 파지는 1-2.5 mm의 염화칼슘이 범위 내에서 고립되지만 0-50 mM의 염화칼슘이 농도 어디서나 가장 최적의 고립 파지가 있습니다. 이로 인해 그것의 독특한 절연 박터 파지의 수를 최대화하기 위해 CaCl2를 농도의 범위를 확인하는 것이 최상이다. </li><li> 문화 튜브에 LB 위로 한천의 4.5 ml의 혼합 및 LB 한천 접시에 부어 준다. 균일하게 접시에 걸쳐 배포하고 약 15 분 동안 응고 최고 한천 수 있도록 부드럽게 소용돌이. 주 : 한천 큰 일괄 (250 mL) 및 추가 상부 한천 제조 할 수 인기 RT에 저장된 적어도 2 주 동안 후속 실험을 위해 재사용 될 수있다. 상단 한천을 만드는 데 사용 다른 공식이 있지만, 우리는 (LB)와 혼합 한천 7g / L을 사용하여 한천 상단을 60 ° C의 물 중탕에 넣어 상부 한천 실험 과정에서 액체 상태를 유지한다. </li><li> 반전 t그는 판과 원하는 온도 48 시간에 (온도 30 ° C) O / N 품어. 현재 파지를 최적화하려면 다음 조건이 다릅니다. 가장 고립 된 파지는 24 시간의 잠복기 후 1-2.5 mM의 염화칼슘이 농도에서 30 ° C에서 배양 접시에서 왔습니다. </li></ol> 4. 살균 정화 <ol><li> 접시에 플라크 형성을위한 24 시간 배양 검사 후. 더 플라크가 분명하지 않는 경우 최대 72 시간 동안 배양을 계속하거나 추가 플라크가 나타납니다 있는지 확인합니다. 일주일에 최대 4 ° C에서 계속 진행하기 전에에 대한 추정 플라크와 저장 판을 필요로합니다. 참고 : 한 접시에 다른 플라크 형태학의 다양한를 찾는 것은 어려운 일이 아니다. 배양 3 일 후 플라크를 찾는 것은 가능하지만 드문 경우입니다. </li><li> 줄무늬 플라크 방법을 사용하여 명확하게 고립 된 플라크에서 원하는 파지를 정화. 멸균 나무 막대기로 감사패를 터치합니다. 행진, 불꽃을 통해 나무 막대기를 실행 allowin에 의한 플라크g 스틱 간략하게 냉각하고, 그림 1과 같이 다음 부드러운 모션 한천 접시에 스틱을 바르고. 각 패스에 대한 깨끗한 스틱을 사용하여이 작업을 반복합니다. </li><li> 또한, 개별 파지 플라크를 분리하기 위해 기존의 플라크 역가 분석을 사용합니다. 플라크 역가 분석은 파지 플라크 격리를위한 페트리 접시 등의 LB 한천과 LB 위로 한천 및 재료 등 이상의 시약의 사용을 필요로한다. 우리는 행진 플라크 방법을 사용하여 매우 성공적이었다하지만 플라크 역가 분석을 사용하여 개별 플라크를 분리하는 것이 기술적으로 쉽다. </li><li> LB 한천 플레이트를 3 회 이상 스트리킹되면, 추정 된 파지 입자의 낮은 농도를 갖는 영역을 표시하고 부드럽게 상위 판으로서 염화 칼슘의 동일한 농도를 함유하는 (박터 0.5ml의 용융 LB 탑 아가의 4.5 ml의 적용 )과는 접시에 걸쳐 균등하게 할 수 있습니다. </li><li> 반전 및 / N을 판 O를 품어. 줄무늬 플라크를 반복순수한 파지 종을 보장하기 위해 적어도 세 번 반복에 대한 기술은 격리됩니다. 파지 생존 능력의 상당한 손실없이 줄무늬 사이에 필요한 주까지로 4 ° C에서 보관 판. </li><li> 일단 원하는 플라크가 최종 줄무늬 접시에 성장 고립 된, 마이크로 피펫 팁 하나 잘 격리 된 플라크를 터치하고 100 μL의 PB에 다시 일시 중지합니다. 직렬 신선한 PB 180 μL로 샘플의 20 μl를 전달하여 10-8 희석이 10 0 솔루션을 희석. </li><li> 파지를 분리하는데 사용 염화칼슘 (2)의 동일한 농도를 함유 용융 LB 상부 한천 4.5 ml로 감염된 세균을 혼합하여 실온에서 10 분 플레이트 5 배양 관에서 성장 박터 0.5ml를 각 희석액 10 μl를 추가 원래의 토양 샘플에서. 다음 날까지 4 ° C에서 만든 모든 희석을 저장합니다. </li><li> 전통적인 플라크 역가 등을 사용하여 웹 패턴을 확인하는 데 필요한 시리얼 희석 된 파지를 결정말한다. 플라크 역가 분석의 목적은 웹 형판을 얻기 위해 필요한 파지 역가를 결정하는 것이다. 등 대부분의 세균없는 아직 파지에 의해 용해되지 않은 세균의 잔해를 포함하는 웹 패턴 플레이트를 확인합니다. 멸균 50 ㎖ 문화 플라스크에 후반 초반 / 지수 고정 박터 문화의 5 ML을 추가합니다. <ol><li> 문화 플라스크에 희석 (즉 박터 문화에 웹 패턴을 준)의 100 μl를 추가하고 파지는 실온에서 5 ~ 10 분 동안 박테리아 세포를 감염 할 수 있습니다. 처음 파지를 식별하고 10 신선한 LB 플레이트 상에 그 혼합물을 5 mL를 플레이트에 사용 된 염화칼슘 (2)의 동일한 농도를 함유 용융 LB 한천 위쪽으로 섞는다. 응고 및 30 ° C에서 거꾸로 판을 배양 할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 다음 날, 4 ° C에서 PB 및 저장 O / N 5 ㎖ 또는 실온에서 4 시간으로 웹 패턴 판을 홍수. </li><li> 0.22 μm의 주사기 필터로 파지 해물 필터4 ℃에서 저장한다. 이러한 파아지 입자의 전자 현미경 화상, 표준 절차를 이용하여 DNA를 제한 효소 분석 및 게놈 시퀀싱 파지 게놈 DNA 분리와 같은 추가적인 실험의 마지막 파지 스톡을 사용. 파지 주식의 장기 저장을 위해, -80 ° C에서 재고 보관을위한 작은 튜브에 멸균 글리세롤로 파지 해물의 동일한 금액을 추가합니다. 참고 :이 파지 기술과 경험하지 않은 사람들을 위해, 훌륭한 자원은 온라인으로 액세스 할 수 www.phagesdb.org 웹 사이트입니다. </li></ol>

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</ol>

저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.

많은 이전의 시도는 호스트 박터 감염시킬 파아지를 분리에도 불구하고, 우리는 표준 농축 과정을 사용하여 약간의 성공을 거두었 다. 개발 환경 시료로부터 파지를 풍부하게하고 반 Twest Kropinski (10)에 의해 구성된 박테리아의 농축 방법은 일반화 농축 과정의 대부분 기초 남아있다. 이전의 연구에서 증거가 직접 도금의 방법은 분리 (5)의 매우 낮은 성공률에도 불구하고 박터 균주에 검출 플라크를 생산하는 것이 좋습니다. 직접 도금법으로 파지 파지 버퍼에 토양 시료로부터 추출 및 박테리아 오염을 제거하기 위해 여과된다. 파지 입자를 함유하는 여과 추출물은 숙주 세포의 감염을 허용하도록 원하는 박테리아 숙주에 첨가하고, 박테리아 성장 및 파지 증폭 부가 발사없이 도금된다. 우리의 농축 기술은 강력하고 영업 이익이다박터 특검팀. KY3901에서 박터 파지의 상대적으로 쉽...

토양 환경에서 박터 종의 편재는 호스트 박테리아의이 종으로부터 격리 될 수있는 파지의 광대 한 수와 다양성을 제공합니다. Acintobacteriaceae 가족의 세균 회원 아트라진 및 기타 다양한 살충제와 제초제 1,2,3 등의 난 분해성 화합물을 분해 자신의 이화 작용 경로에 가장 주목할 만하다. 대부분의 연구가 박터의 환경 균주를 사용하여 수행 하였지만,이 속에의 임상 분리는 혈액, 소변, 눈, 모든 계통 발생 학적 이질성 (4)를 표시하는 많은 다른 사람의 소스에서 발견된다. 박터 세균에 대한 연구의 다소 광범위한 몸이 있지만, 단지 소수의 연구는 이러한 다양한 속의 구성원을 감염시킬 파아지에보고한다. 흥미롭게도하지만, 박터에 이전 할 작품은 &lt;토양의 입력으로 몇 가지 주요 별개의 주제에 대한 접촉을 파지EM&gt; 박터 종 활성 오니 처리 설비 (6)에 해로운 거품 감소 및 작업 부위 특이 적 재조합 인테그라 7 유전자를 강조 할 목적으로 5 공업용. 다양한 농축 기술 프로토콜 순수한 파지 박터 종에서 분리 생성하는데 이용되어왔다. 초기 절차는 감염 A. 할 수있는 파지 8 일년 이상주는 상승의 기간 동안 니코틴 염과 같은 추가 독성 제와 토양의 배양을 포함 globiformis. 불안정한 유기물 플라크 분석 기술을 통해 검출 된 파지를 생산하기 위해 등장과 함께 흙을 사용하여 수행 할 연구는 긴 잠복기 (8)을 생략하고, 여과 된. 흥미롭게도하지만, 직접 도금을 닮은 기술은 낮은 성공률과 과거의 연구를 인용, 여전히 연구자 (5)에 의해 현저하게 낮은 성공률을하면서 여러 파지에 이르게 된 과거에 사용되었다 <s&gt; 8입니다. 전반적으로, 과거에 사용 된 분리 기술은 가장 일반적인 호기성 토양을 나타내는 박터 속에도 불구하고 실제로는 약간의 효과를 갖는 떠들썩했었다 자연 4,9에서 분리, 물과 토양에서 파지를 분리하는 반 Twest 및 Kropinski 10 현재 농축 방법 환경 박테리아 균주 만이 우라늄 농축 기술을 풍부하게하는 데 사용 이전 기술에서 적응은 박터 파지를 분리 비효율적 증명했다. 여기에 설명 된 방법의 목적은 이른 농축 방법은 일관되고 효과적으로 박테리아 속에서 파지를 단리와 연관된 이전의 기술적 과제를 극복 박터 파아지를 분리하도록 채택 될 수 있음 &quot;개념 증명&quot;보여주기위한 것이다.

<table><tbody><tr><td>LB 육수 분말</td><td>Fisher</td><td>BP9722-2</td><td>대량으로 주문하는 것이 가장 좋습니다.</td></tr><tr><td>과립 한천</td><td>Fisher</td><td>BP1423-2</td><td>대량으로 주문하는 것이 가장 좋습니다.</td></tr><tr><td>0.22 um 주사기 필터</td><td>Fisher</td><td>09-719A</td><td></td></tr><tr><td>0.22 um buchner 필터</td><td>Fisher</td><td>430320</td><td>수용 튜브를 조심스럽게 교체하여 50ml 이상의 액체를 얻을 수 있습니다.</td></tr><tr><td>Eppendorf 튜브</td><td>Fisher</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 피펫 개별</td><td>Fisher</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>50 ml 원뿔형 튜브</td><td>Fisher</td><td>76002844</td><td></td></tr><tr><td>15 ml 코니컬 튜브</td><td>Fisher</td><td>76002845</td><td></td></tr><tr><td>10 ml 피펫 개별</td><td>Fisher</td><td>13-676-10J</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 피펫 개별</td><td>Fisher</td><td>13-676-10K</td><td></td></tr><tr><td>Whatman 질적 여과지</td><td>피셔</td><td>1001-824</td><td></td></tr></tbody></table>

의 분리를위한 최적화 된 농축 기법<em&gt; 박터</em&gt; 박테리오파지 생물 종 토양 샘플에서 격리 된 것

An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates

환경 샘플에서 박테리오파지 분리는 미생물학의 선구자들이 제시한 원칙에 따라 수십 년 동안 수행되어 왔습니다. Arthrobacter 숙주를 감염시키는 파지의 분리는 제한적이었는데, 아마도 이전의 많은 분리 기술의 낮은 성공률로 인해 연구에 사용할 수 있는 절지박터 파지 그룹이 과소 대표되었기 때문일 수 있습니다. 여기에 설명된 농축 기술은 다른 많은 기술과 달리 오염 박테리아가 없는 여과된 추출물을 지표 박테리아 성장의 기초로 사용하는 Arthrobactersp. 특히 KY3901입니다. 먼저 토양 박테리아를 제거함으로써 표적 파지는 초기 토양 샘플에 존재하는 토착 토양 박테리아와의 경쟁에 의해 방해받지 않습니다. 이 농축 방법을 통해 여러 가지 다른 토양 유형에서 수십 개의 고유한 파지가 생성되었으며 동일한 농축 토양 샘플 분리물에서 다른 유형의 파지도 생성되었습니다. 이 절차의 사용은 매우 다양한 흥미로운 숙주 박테리아에서 파지를 분리하기 위해 대부분의 영양이 풍부한 호기성 배지로 확장될 수 있습니다.

박터 파지에 대한 개선 농축 기술의 재현성을 입증하기 위해, 30 개 토양 샘플은 고유 박터 파지이 우라늄 농축을 사용하여 수집 한 토양 샘플의 22에서 얻었다이 30 토양 샘플의 2014 년 봄과 여름 동안 서로 다른 시간과 장소에서 사용되었다 절차. 표준 농축 과정은 동일한 토양 시료로부터 3 고유 파지를 수득 하였다. 농축 샘플 플라크 또는 플라크의 성공적인 검출 용 풍부 박터의 더 많은 양을 필요로하는 비교적 낮은 파지 역가를 분리 초기 희석이 필요한 매우 높은 파지 역가를 가질 수있다. 우리는 초기 농축 및 LB 한천에 도금 (그림 2) 후 순수한 파지 인구를 분리하는 플라크 행진 방법을 사용합니다. 대안 적으로, 기존의 표준 플라크 역가 분석은이 방법은 더 많은 시간, 시약 및 물질을 취하더라도 순수 분리 된 파지를 분리하는데 사용될 수있다의. 앞서 언급 한 바와 같이, 우리. 경험적 접시 웨빙 패턴을 형성 파지 역가 번호 및 플라크 형성...

우리는 Arthrobacter 속의 박테리아를 감염시키는 박테리오파지의 분리를 위한 농축 프로토콜을 제시합니다. 이 농축 프로토콜은 토양 분리물에서 Arthrobacter 파지의 분리 및 증폭을 위한 빠르고 재현 가능한 결과를 생성합니다.

Bacteriophage isolation from environmental samples has been performed for decades using principles set forth by pioneers in microbiology. The isolation of ...

이 절차의 전반적인 목표는 증식 프로토콜을 사용하여 토양 샘플에서 arthrobacter 박테리아 파지를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 토양 샘플을 수집하고 오염된 토양 미생물로부터 생존 가능한 파지 입자를 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 분리된 파지 입자로 호스트 arthrobacter 박테리아 세포를 감염시키는 것입니다.다음으로 감염된 세균 세포를 아가 플레이트에 도말하여 플라크 형성으로 확인되는 파지를 식별합니다. 마지막 단계는 스트리크 플레이트법을 사용하여 명확하게 분리된 플라크로부터 원하는 파지를 정제하는 것입니다. 결과적으로, 이 농축 기술은 Arthrobacter species KY 3 9 0 1로부터 Arthrobacter 파지를 비교적 쉽게 분리할 수 있도록 최적화되었습니다.기존의 농축 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 경쟁 박테리아의 성장을 방지하기 위해 정밀하게 여과된 토양 샘플을 숙주 박테리아의 순수 배양액에 추가한다는 점입니다. 이 방법은 arthrobacter 파지를 분리하는 데 효과적임이 입증되었으나, 다른 박테리아 숙주의 파지를 분리하는 데에도 적용 가능할 것입니다. 우리는 다른 연구자들이 arthrobacter 파지를 찾는 데 어려움을 겪고 있다는 사실을 알게 되었을 때 처음으로 이 방법에 대한 아이디어를 얻었습니다.전통적인 농축 기술을 이용하여, 제 학생들이 Arthrobacter 파지를 성공적으로 분리하는 데 사용되는 기술들을 시연할 것입니다. Arthrobacter 세포는 LB agar 플레이트에 스트리킹하여 생성된 콜로니로부터 배양하며, 30 °C에서 2~3일 동안 배양합니다.멸균된 루프를 사용하여 콜로니를 채취한 후 50 milliliters의 lb broth에 접종합니다. 배플 플라스크(baffled culture flask)를 사용하여 30 degrees Celsius의 진탕 배양기에서 225 RPM으로 약 24시간 동안 배양합니다. 이는 파지 감염 실험을 위해 대수 성장기 또는 초기 정지기 세포를 얻기 위함입니다.세포가 정지기 중기 또는 후기에 진입하는 것을 방지하기 위해 박테리아의 성장 상태를 면밀히 모니터링하십시오. 파지 분리를 위한 이상적인 OD 600은 0.5에서 0.7 사이입니다. Arthrobacter 속에 속하는 박테리아는 흔한 토양 박테리아이므로, 해당 박테리아와 이를 감염시키는 파지는 대부분의 토양 유형에서 발견될 수 있습니다.원하는 위치에서 200~400 g의 토양을 채취합니다. 충분한 크기의 비커에 담긴 토양에 최소 400 mL의 파지 완충액을 추가하여, 상층액에 최소 200 mL의 파지 완충액이 남고 추출이 가능하도록 합니다. 토양이 현탁될 때까지 부드럽게 젓거나 흔들어 섞은 후, 일반적으로 30분 동안 토양 침전물이 가라앉도록 둡니다. 그다음, 진공 여과를 통해 토양 추출물을 여과지에 통과시켜 토양 침전물 찌꺼기를 제거합니다.여과된 토양 추출물 200 milliliters에 LB 분말 4 grams를 넣고 섞어 2% 용액을 만듭니다. 진공 여과를 통해 이 용액을 0.22 micron 필터로 통과시켜 멸균된 여과액을 얻습니다. 가능하다면 즉시 다음 단계로 진행하십시오.그럼에도 불구하고, 필요한 경우 여과된 시료는 다음 단계를 진행하기 전까지 4°C에서 최대 일주일 동안 보관할 수 있습니다. 하지만 이 경우 생존 가능한 파지 입자의 수가 감소할 것입니다. 무균 조작법을 사용하여 멸균된 LB 토양 추출물 혼합물을 50 mL씩 여러 분량으로 나누어 각각 250 mL의 멸균된 배플 쉐이킹 배양 플라스크에 분주합니다. 여기에 멸균된 2.0 M 염화칼슘 용액을 최종 희망 농도가 되도록 첨가합니다.각기 다른 arthrobacter 파지가 서로 다른 염화칼슘 조건에서 최적으로 성장하므로, 필터 멸균된 LB 토양 추출물 혼합물이 들어 있는 각 플라스크에 후기 대수 성장기 또는 초기 정지기 단계의 박테리아 배양액을 1~2.5 mL 추가하여 이 절차를 시작하십시오. 배양액의 OD 600이 0.5에서 0.7 사이인 경우 1 mL를 사용하십시오. OD 600이 0.7보다 높은 경우 2.5 mL를 사용하십시오.진탕 배양기에서 30 °C, 250 RPM으로 약 24시간 동안 플라스크를 흔들어 배양합니다. 24시간의 배양 기간이 지난 후, 농축 플라스크를 진탕 배양기에서 꺼냅니다. 농축 시료를 파지 버퍼(phage buffer)로 10배 희석합니다.후기 대수 증식기 또는 초기 정지기 단계의 박테리아 배양액 0.5 milliliters를 배양 튜브에 준비합니다. 희석된 농축 배양액 5 microliters에서 500 microliters까지 다양한 양을 배양 튜브에 첨가합니다.배양 튜브에 염화 칼슘을 첨가하여 5 mL당 최종 농도가 기존 농축 플라스크의 농도와 동일하게 만듭니다. 다양한 염화 칼슘 의존성을 가진 여러 파지를 선택하기 위해 다양한 범위의 염화 칼슘 농도를 사용하십시오. 각 배양 튜브에 4.5 mL의 LB top auger를 넣고, 혼합물을 LB auger 플레이트에 붓습니다.플레이트 전체에 고르게 퍼지도록 부드럽게 회전시킨 후, 상단 아가(agar)가 약 15분 동안 굳도록 둡니다. 플레이트를 뒤집어 30°C에서 하룻밤부터 48시간까지 배양합니다. 배양 시간을 다양하게 조절하여 최적화하며, 24시간 배양 후 플레이트에서 플라그(plaque) 형성 여부를 확인합니다.대부분의 분리된 파지는 24시간 배양 후 1~2.5 mM 농도의 염화칼슘 조건에서 30°C로 배양된 플레이트에서 얻어집니다. 나무 막대를 사용하여 명확하게 분리된 플라크로부터 원하는 파지를 정제하는 것이 이 절차에서 가장 까다로운 부분입니다. 균일한 스트리크 플레이트를 만들기 위해 오거 플레이트 전체에 플라크를 부드럽게 펴 바르는 기술적 숙련도가 필요합니다. 나무 막대를 화염에 통과시켜 멸균한 후 식히십시오.멸균된 나무 스틱으로 플라크를 살짝 터치한 후, 보여주는 것과 같이 부드러운 동작으로 오거 플레이트에 스틱을 문지릅니다. 깨끗한 스틱을 사용하여 이 과정을 각 패스마다 반복합니다. LB 오거 플레이트에 최소 3회 이상 스트리킹을 수행한 후, 추정 파지 입자의 농도가 가장 낮은 영역을 표시합니다.표시된 영역에 0.5 milliliters의 arthrobacter와 4.5 milliliters의 용해된 LB top auger를 조심스럽게 도포하고, 플레이트 전체에 고르게 퍼지도록 합니다. top auger가 최소 1시간 동안 굳도록 둡니다. 플레이트가 굳으면 뒤집어서 하룻밤 동안 배양하십시오. 순수한 파지 종이 분리되었는지 확인하기 위해 streak plaque 기술을 최소 3회 반복하십시오.플레이트는 필요에 따라 스트리킹 단계 사이에 4°C에서 최대 일주일 동안 보관할 수 있으며, 이때 파지의 생존력은 유의미하게 감소하지 않습니다. 최종 스트리킹 플레이트에서 원하는 플라크가 성장하고 분리되면, 잘 분리된 플라크 하나를 마이크로 피펫 팁으로 터치하여 100 µL의 파지 버퍼에 재현탁하십시오. 이 용액 20 µL를 180 µL의 신선한 파지 버퍼에 넣어 10⁻⁸ 희석 배수까지 순차적으로 희석하십시오. 각 희석액 10 µL를 배양 튜브에 든 0.5 mL의 배양된 arthrobacter에 첨가하고 실온에서 5~10분 동안 둡니다.그 후, 원래의 토양 샘플에서 파지를 분리할 때 사용했던 것과 동일한 농도의 염화 칼슘이 포함된 4.5 milliliters의 용융 LB 상층 아가(top agar)에 감염된 박테리아를 혼합하여 도말합니다. 플레이트를 하룻밤 동안 배양하십시오. 제조한 모든 희석액은 다음 날까지 4°C에서 보관하십시오.전통적인 플라크 역가 측정법을 사용하여 웹 패턴(web pattern)을 형성하는 데 필요한 파지 시리얼 희석 배수를 결정하십시오. 웹 패턴 플레이트는 대부분의 박테리아가 제거되었으나, 아직 파지에 의해 용해되지 않은 박테리아의 잔해만 남아 있는 상태로 정의합니다. 멸균된 50 milliliter 배양 플라스크에 후기 지수 성장기 또는 초기 정지기의 arthrobacter 배양액 5 milliliters를 넣으십시오.거미줄 패턴(web pattern)을 형성했던 희석액 100 µL를 arthrobacter 배양액에 첨가하고, 파지가 박테리아 세포를 감염시키도록 5~10분 동안 둡니다. 실온에서, 파지 플레이트를 처음 확인하는 데 사용했던 것과 동일한 농도의 calcium chloride가 포함된 용융된 lb top agar를 플라스크에 넣습니다. 이 혼합액 5 mL를 10개의 새로운 LB 플레이트에 각각 분주합니다.상단 아가(agar)가 굳은 후, 플레이트를 뒤집어 다음 날 30°C에서 하룻밤 동안 배양하고, 웹 패턴 플레이트에 플레이트당 5 mL의 파지 버퍼를 가득 채워 4°C에서 하룻밤 동안 보관하십시오. 파지 용해물을 0.22 µm 시린지 필터로 여과하십시오. 이 최종 파지 스톡을 장기 보관을 위해 4°C에 보관하십시오.본 영상에서 시연한 농축 절차에 따라, 보관용 스톡을 만들기 위해 소형 바이알에 멸균 글리세롤과 동일한 양의 파지 용해물을 첨가하여 -80 °C에서 보관하십시오. 초기 농축 및 LB agar 도말 후 순수 파지 집단을 분리하기 위한 플라크 스트리킹(plaque streak) 방법이 제시되어 있으며, 실온, 30 °C 및 37 °C에서 파지 DI의 플라크를 분리한 대표적인 결과가 나타나 있습니다. 두 개의 플레이트에 표시된 빨간색 원은 명확하게 분리된 플라크를 둘러싸고 있습니다. 파지 Dylan은 세 가지 서로 다른 온도에서 유사한 플라크를 생성합니다.또는, 순수한 파지 분리물을 분리하기 위해 전통적인 표준 플라크 역가 분석법을 사용할 수 있습니다. 본 실험에서는 이 분석법을 사용하여 파지 역가 수치와 플레이트 상에 웨빙(webbing) 패턴을 형성하는 플라크 형성 단위 수를 경험적으로 결정하였습니다. 파지 banana의 일련 희석 세트와 함께 이상적인 웹 패턴이 어떻게 나타나야 하는지에 대한 예시가 제시되어 있습니다.이 사진들은 농축 기술을 사용하여 분리한 20종의 arthrobacter 파지의 전자 현미경 이미지입니다. 현재 분리된 25종의 파지 중 23종은 상당히 긴 꼬리를 가진 cifo 바이러스입니다. 분리된 파지 중 2종은 머리 직경이 꼬리 길이와 유사한 myo 바이러스입니다.숙련되면, 농축 도말법을 통해 다양한 토양 샘플로부터 arthrobacter 파지를 성공적으로 분리할 수 있습니다. 이 영상을 시청한 후에는 환경 토양 샘플에서 스트릭 도말법(streak paint method)을 사용하여 파지를 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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Research

연구

JoVE Journal

Environment

환경

출처: 왓슨, DC, et.al. 대장균 및 기타 박테리아로부터 세포외 소포의 확장 가능한 분리 및 정제. J. Vis. 경험. (2021년)이 비디오는 유전자 조작 박테리아의 외막에서 파생된 세포외 소포(EV)의 분리 및 농축을 보여줍니다. 이 과정에는 박테리아를 배양하여 EV를 방출한 다음 세포와 잔해물을 제거하기 위한 순차적 원심분리 및 여과 단계가 포함됩니다. 마지막으로, 한외여과는 다운스트림 분석을 위해 EV를 농축하는 데 사용됩니다.

박테리아로부터 외막 유래 세포외 소포의 분리 및 농축

출처: Cross, T. 외, 토양 샘플 분리주에서 Arthrobacter 박테리오파지 종 분리를 위한 최적화된 농축 기법. J. Vis. 경험(2015)이 영상은 박테리오파지 생산을 위한 박테리아 배양 준비 과정을 보여줍니다. 이 방법은 토양 박테리아를 배플링 플라스크에 접종하는 과정, 산소 공급과 흔들림을 통한 균일한 성장 촉진, 그리고 광학 밀도 측정을 이용한 세포 밀도 모니터링 과정을 다룹니다. 배양물이 최적의 성장 단계에 도달하면 효율적인 박테리오파지 생산이 가능합니다.

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Isolation of Bacteriophages from a Soil Sample

Source: Cross, T., et al. An Optimized Enrichment Technique for the Isolation of Arthrobacter Bacteriophage Species from Soil Sample Isolates. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the isolation of Arthrobacter bacteriophages from a soil sample using enrichment and plaque assay techniques. It highlights the infection, amplification, and visualization of phages as clear lysis zones formed on a bacterial lawn.

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