의 분리를위한 최적화 된 농축 기법 박터 박테리오파지 생물 종 토양 샘플에서 격리 된 것

이 절차의 전반적인 목표는 농축 프로토콜을 사용하여 토양 샘플에서 절지박터 박테리아 단계를 분리하는 것입니다. 이는 먼저 토양 샘플을 수집하고 오염된 토양 미생물로부터 생존 가능한 파지 입자를 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 숙주 절지박터 박테리아 세포를 분리된 파지 입자로 감염시키는 것입니다.

다음으로, 감염된 박테리아 세포를 오거 플레이트에 도금하여 플라크 형성으로 입증된 파지를 식별합니다. 마지막 단계는 줄무늬 플레이트 방법을 사용하여 명확하게 분리된 플라크에서 원하는 파지를 정제하는 것입니다. 궁극적으로, 이 농축 기법은 절지박터 종 KY 3 9 0 1에서 절지박터 파지를 비교적 쉽게 분리하는 데 최적화되어 있습니다.

기존 농축 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 경쟁 박테리아의 성장을 방지하기 위해 숙주 박테리아의 순수한 배양액에 미세하게 여과된 토양 샘플을 추가할 수 있다는 것입니다. 이 방법은 절지박터 파지의 분리에 효과적인 것으로 입증되었지만, 다른 박테리아 숙주로부터 파지를 분리하는 데에도 적용할 수 있어야 합니다. 이 방법에 대한 아이디어는 다른 연구자들이 절지박터 파지를 찾는 데 어려움을 겪고 있다는 것을 알게 되었을 때 처음 떠올랐습니다.

전통적인 농축 기술로. 제 학생들은 절지박터 파지를 성공적으로 분리하는 데 사용되는 기술을 시연할 것입니다. 절지박터 세포는 LB 오거 플레이트에 줄무늬가 있는 콜로니에서 배양하여 섭씨 30도에서 2-3일 동안 배양합니다.

멸균 루프를 사용하여 콜로니를 선택하고 50ml의 lb 육수에 추가합니다. 당황한 배양에서 플라스크는 약 24시간 동안 섭씨 30도에서 225RPM으로 진탕 인큐베이터에서 플라스크를 배양합니다. 파지 감염 실험을 위한 지수 또는 초기 고정상 세포를 얻습니다.

세포가 중간 및 후기 고정 성장으로 진입하는 것을 방지하기 위해 박테리아 성장 상태를 면밀히 모니터링합니다. 상태. 파지 분리를 위한 이상적인 OD 600은 0.5에서 0.7 사이입니다. 절지박터 속의 박테리아는 흔한 토양 박테리아이기 때문에 이들과 그들을 감염시키는 파지는 대부분의 토양 유형에서 발견될 수 있습니다.

원하는 위치에서 200-400g의 토양을 모으십시오. 충분히 큰 비커에 최소 400ml의 파지 완충액을 토양에 추가하여 최소 200ml의 파지 완충액이 상등액에 있고 토양이 매달려 있을 때까지 부드럽게 저어주거나 휘젓는 방식으로 혼합하여 추출할 수 있도록 하고 토양 침전물이 일반적으로 30분 동안 가라앉을 수 있도록 합니다. 다음으로, 진공 여과에 의해 여과지에 토양 추출물을 통과시켜 토양 퇴적물 파편을 제거합니다.

여과된 토양 추출물 200ml에 LB 분말 4g을 넣고 섞어 2% 용액을 만듭니다. 진공 여과로 용액을 0.22 미크론 필터에 통과시켜 멸균 여과액을 얻습니다. 가능한 경우 즉시 다음 단계를 계속합니다.

그럼에도 불구하고 필요한 경우 여과된 샘플은 진행하기 전에 최대 일주일 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다. 그러나 여과기 멸균 LB 토양 추출물 혼합물의 여러 50 밀리리터 부분을 개별 250 밀리리터로 분취 정화조 기술을 사용하여 생존 가능한 파지 입자의 수를 줄일 수 있습니다. 멸균된 쉐이킹, 당황한 배양 플라스크는 멸균 2.0 몰 염화칼슘 용액을 원하는 최종 농도에 추가합니다.

서로 다른 절지활성 파지가 서로 다른 염화칼슘 조건에서 최적으로 성장하기 때문에 필터 멸균 LB 토양 추출물 혼합물이 포함된 각 플라스크에 2.5ml의 후기 지수 또는 초기 고정상 박테리아 배양액을 1-2.5ml씩 추가하여 이 절차를 시작합니다. 배양물의 OD 600이 0.5 내지 0.7인 경우, 1밀리리터를 사용한다. OD 600이 0.7보다 높으면 2.5밀리리터를 사용하십시오.

진탕 인큐베이터에서 약 250시간 동안 섭씨 30도에서 250RPM으로 플라스크를 흔듭니다. 24시간의 배양 기간이 끝나면 진탕 인큐베이터에서 농축 플라스크를 꺼냅니다. 농축 샘플을 파지 완충액에서 10배 희석합니다.

0.5 밀리리터의 후기 지수 또는 초기 고정식으로 배양 튜브를 설정합니다. 단계 박테리아 배양. 5마이크로리터에서 500마이크로리터까지 다양한 양의 희석된 농축 배양을 배양 튜브에 첨가합니다.

배양 튜브에 염화칼슘을 첨가하여 원래 농축 플라스크에 존재하는 농도와 동일한 5ml 단위의 최종 농도를 만듭니다. 다양한 염화칼슘 농도를 사용하여 다양한 염화칼슘 의존성을 가진 많은 파지를 선택할 수 있습니다. 각 배양 튜브에 4.5ml의 LB 상단 오거를 추가하고 혼합물을 LB 오거 플레이트에 붓습니다.

부드럽게 소용돌이쳐 플레이트 전체에 고르게 분포시키고 상단 오거가 약 15분 동안 응고되도록 합니다. 플레이트를 뒤집고 섭씨 30도에서 하룻밤부터 48시간까지 배양합니다. 배양 시간을 변경하여 플레이트의 플라크 형성을 24시간 배양 확인 후 존재하는 파지에 맞게 최적화합니다.

대부분의 분리된 파지는 24시간의 배양 기간 후 1-2.5밀리몰의 염화칼슘 농도로 섭씨 30도에서 배양된 플레이트에서 나오며, 이 절차에서 가장 어려운 부분으로 나무 막대기를 사용하여 명확하게 분리된 플라크에서 원하는 파지를 정제합니다. 균일한 줄무늬 플레이트를 생성하기 위해 오거 플레이트를 가로질러 플라크를 부드럽게 퍼뜨리려면 기술 전문 지식이 필요합니다. 나무 막대기를 화염에 통과시키고 식혀서 소독하십시오.

멸균 된 나무 막대기로 플라그를 짧게 만지고 그림과 같이 부드러운 동작으로 오거 플레이트에 막대기를 문지릅니다. 각 패스에 대해 깨끗한 스틱을 사용하여 이 작업을 반복합니다. LB 오거 플레이트에 최소 3회 줄무늬가 생기면 추정 파지 입자의 농도가 가장 낮은 영역을 표시합니다.

0.5ml의 절지극과 4.5ml의 용융 LB 상단 오거를 표시된 영역에 부드럽게 바르고 플레이트 전체에 고르게 펴 바릅니다. 플레이트가 응고되면 상단 오거가 최소 한 시간 동안 응고되도록 하고 뒤집어 밤새 배양합니다. 순수한 파지 종이 분리되도록 최소 3회 동안 줄무늬 플라크 기술을 반복합니다.

플레이트는 파지 생존력의 큰 손실 없이 줄무늬 사이에 필요에 따라 최대 일주일 동안 섭씨 4도에서 보관할 수 있습니다. 원하는 플라크가 성장하고 최종 줄무늬 플레이트에서 분리되면 마이크로 피펫 팁으로 잘 분리된 플라크 하나를 만지고 100마이크로리터의 파지 완충액에 직렬로 재현탁합니다.20마이크로리터의 샘플을 180마이크로리터의 새로운 파지 완충액에 통과시켜 이 용액을 10에서 영하 8분의 1로 희석합니다. 배양 튜브에 0.5ml의 성장한 절지박터에 각 희석액 10마이크로리터를 실온에서 5-10분 동안 첨가합니다.

그런 다음 감염된 박테리아를 원래 토양 샘플에서 파지를 분리하는 데 사용된 것과 동일한 농도의 염화칼슘이 포함된 4.5ml의 용융 LB 상단 오거와 혼합하여 플레이트를 만듭니다. 플레이트를 밤새 배양하십시오. 섭씨 4도에서 만든 모든 희석은 다음날까지 보관하십시오.

기존 플라크 역가 분석을 사용하여 웹 패턴을 만드는 데 필요한 파지 시리얼 희석을 측정합니다. 웹 패턴 플레이트는 대부분 박테리아가 없지만 아직 파지에 의해 묶이지 않은 박테리아의 잔해가 포함되어 있는지 확인합니다. 5ml의 후기 지수 또는 초기 고정 절지극동물 배양을 멸균 50ml 배양 플라스크에 첨가합니다.

절지박터 배양액에 거미줄 패턴을 만든 희석액 100마이크로리터를 첨가하고 파지가 5-10분 동안 박테리아 세포를 감염시키도록 합니다. 실온에서 파지 플레이트를 처음 식별하는 데 사용된 것과 동일한 농도의 염화칼슘을 함유한 플라스크 용융 lb 상단 오거에 추가합니다. 이 혼합물을 10개의 새 LB 플레이트 각각에 5밀리리터씩 넣습니다.

상단 오거가 플레이트를 응고, 뒤집어 다음 날 밤새 섭씨 30도에서 배양한 후, 플레이트당 5ml의 파지 완충액을 웹 패턴 플레이트에 주입하고 섭씨 4도에서 밤새 보관합니다. 0.22 미크론 주사기 필터를 통해 파지 용해물을 여과합니다. 이 최종 파지 스톡은 장기 보관을 위해 섭씨 4도에서 보관하십시오.

이 비디오에서 시연된 농축 절차에서 섭씨 영하 80도의 재고 보관을 위해 작은 바이알의 멸균 글리세롤에 동일한 양의 파지 용해물을 첨가하고, 초기 농축 후 순수한 파지 집단을 분리하는 플라크 줄무늬 방법과 표시된 LB 오거에 도금하는 방법은 실온에서 파지 DI에 대한 플라크를 분리한 대표적인 결과입니다. 섭씨 30도, 섭씨 37도. 두 개의 판에 있는 빨간색 원은 명확하게 격리된 플라크를 둘러싸고 있습니다. 파지 딜런(Phage Dylan)은 세 가지 다른 온도에서 유사한 플라크를 생산합니다.

또는 기존의 표준 플라크 역가 분석을 사용하여 순수한 파지 분리물을 분리할 수 있습니다. 이 분석은 여기에서 파지 역가 수와 플레이트에 웨빙 패턴을 형성하기 위한 플라크 형성 단위의 수를 경험적으로 결정하는 데 사용되었습니다. 파지 바나나에 대한 연속 희석 세트가 좋은 웹 패턴이 어떻게 보여야 하는지에 대한 예와 함께 표시됩니다.

이것은 농축 기술을 사용하여 분리된 20개의 절지박터 파지의 전자 현미경 이미지입니다. 현재 분리된 25개의 파지 중 23개는 다소 긴 꼬리를 가진 cifo 바이러스입니다. 분리된 파지 중 두 개는 꼬리와 비슷한 길이의 머리 직경을 가진 근육 바이러스입니다.

일단 마스터되면, 농축 도금을 통해 다양한 토양 샘플에서 절지박터 파지를 성공적으로 분리할 수 있어야 합니다. 이 비디오를 시청한 후에는 환경 토양 샘플에서 줄무늬 페인트 방법에 사용되는 Phage를 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.