Name: 담즙 중심의 간 재생을 연구하는 Zebrafish의에서 간세포 특이 절제 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: 배우세요 제브라피시에서 담즙 중심 간 재생을 연구하는 간세포 특이 절제법을 메트로니다졸 처리와 형광 현미경을 통해. 이 방법은 간 재생 메커니즘과 담즙 상피세포의 역할을 실시간으로 분석하는 데 활용됩니다.

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저자는 Hukriede 박사와 Tsang 박사의 토론에 감사를 표합니다. M.K.는 NIH 교육 보조금(T32EB001026)의 지원을 받았습니다. 이 연구는 미국 간 재단(American Liver Foundation), 다임스 행진 재단(March of Dimes Foundation, 5-FY12-39) 및 NIH(DK101426)의 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.

Zebrafish의 표준 절차에 따라 제기 자란; 실험은 피츠버그 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었습니다. 배아 / 애벌레 1. 준비 <ol><li> 시간 제한 교배, 설정 성인 남성과 여성의 Tg (fabp10a : CFP-NTR) 수행 S931 hemizygous 또는 동형 접합체 물고기 O / N과 그들 사이에 디바이더를 배치합니다. 상대가 요구 될 때이 분할에게 다음 아침을 제거합니다. 미세 플라스틱 메쉬 스트레이너를 사용하여 물을 긴장에 의해 배아를 수집합니다. </li><li> 거꾸로 스트레이너를 켜고 스퀴즈 병에서 분배 계란 물 좋은 스트림과 메쉬 표면을 씻어. 계란 물 25 ㎖로 100mm 배양 접시에 100 배아를 전송합니다. 페트리 접시 당 최대 100 배아를 유지하지 않고 28 ℃에서을 올립니다. </li><li> 색소 침착을 억제하기 위해, 10 시간 포스트 수정 (HPF) 이전에 배양 접시에 페닐 티오 (PTU)를 추가, 전자를 제기80 HPF까지 mbryos / 애벌레. PTU의 최종 농도는 0.2 mm이다. 주의 : PTU 독성이다. 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. </li><li> 배양 접시에, 0.016 %의 최종 농도에서 3- 아미노 벤조산 에틸 에스터 (Tricaine)을 첨가하여 애벌레를 마취. 그런 다음, 표면 형광 현미경 종류 CFP 양성 유충을 사용. 비슷한 간 크기의 애벌레를 사용하여 작거나 큰 간을 가진 사람을 버린다. 주 : hemizygous 동형 접합체 유충 사이 간세포 박리의 정도에 차이가 없기 때문에 어떤 CFP 양성 유충 관계없이 강도를 사용할 수있다. 주의 : tricaine 독성이다. 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. </li><li> Tricaine을 포함하는 계란 물을 제거하고 0.2 mM의 PTU 보충 계란 물을 추가합니다. 28 ° C에서 배아 / 애벌레를 유지합니다. </li></ol> 2. MTZ 치료 <ol><li> 1 MTZ 분말 0.171 g을 용해하여 신선한 10 mM의 MTZ 솔루션을 준비00 ml의 달걀 물은 0.2 % DMSO 0.2 mM의 PTU 보충. 완전히 MTZ를 해산하기 위해 20 ~ 30 분 동안 신속하게 교반하면서 실온에서 솔루션을 섞는다. MTZ를 준비 할 때 MTZ을 용해하기 위해 및 유충에 MTZ 투과을 향상시키기 위해, DMSO를 추가합니다. 주의 : 장기간 노출 또는 MTZ의 증가 농도는 독성이다. 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. </li><li> 두 개의 서로 다른 100mm 페트리 접시 또는 멀티 웰 플레이트에 유충의 원하는 번호를 전송하여 제어 및 실험 그룹으로 유충을 분리합니다. 실험군의 경우, 10 mM의 MTZ 용액 유충을 유지; 대조군을 위해, 0.2 % DMSO를 함유하는 달걀 물에 보관. </li><li> 플레이트 또는 MTZ의 광 불 활성화를 막기 위해 알루미늄 호일로 MTZ 용액을 함유하는 페트리 접시를 커버하고, 28 ° C에서 배양한다. MTZ 치료 기간은 애벌레 단계 및 형질 전환 라인에 의존한다. </li><li> 비슷한 심한 간세포 절제를 관찰하려면 <em은&gt;의 Tg (fabp10a : CFP-NTR) 라인은 (36 시간의 기간 동안) 또는 5 DPF에서 (24 시간의 기간 동안) 중 3.5 일 이후 수정 (DPF)에서 MTZ 솔루션 유충을 취급합니다. </li></ol> 담즙 중심의 간 재생 3. 분석 <ol><li> 절제 기간의 끝에서, 판에서 MTZ 용액을 제거한다. 계란 물 25 ㎖를 추가하여 MTZ 처리 유충을 씻으십시오. 계란 물을 폐기하기 전에 유충을 씻어 판을 2 ~ 3 회 소용돌이 친다. 세 번 반복 한 후 다시 한 번 달걀 물에 애벌레를 체험. 유충 고정화, 0.008 %의 최종 농도에서 Tricaine의 낮은 농도를 추가 MTZ 처리 된 유충 심장 부종 및 유생 사망을 방지한다. </li><li> 간 기능 분석을 위해, CFP 필터 표면 형광 현미경 MTZ 처리 된 유충의 간 크기를 조사한다. 간 상대적인 크기에 기초하여 간세포 박리 수준을 평가 : 대 (비 절제 0-10 %의 유충), 중간 (부분적으로 절제하는 단계; 10-20 %), 및 완전히 절제 (매우 작은; 80~90%). </li><li> 비 절제된 또는 부분적으로 절제 간와 유충을 제거합니다. 만 심각한 간세포 절제 나타내는 작은 간으로 유충을 유지합니다. 재생 0 시간 시점 (R0H)에서 간 분석을 위해, MTZ의 세척 및 CFP 정렬 후 유충을 수확. 그렇지 않으면, 수확에 대한 준비가 될 때까지 0.2 mM의 PTU 보충 달걀 물에 정렬 된 유충을 유지합니다. </li><li> 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 수확 유충을 전송하고 PEM 버퍼에 3 %의 포름 알데히드의 고정 솔루션 계란 물을 교체합니다. 회 전자의 O / N에서 4 ° C의에 튜브를 품어. </li><li> PBSDT 1 ㎖​​로 고정 솔루션을 교체하고 5 분 동안 회전에 애벌레가 들어있는 튜브를 회전. </li><li> 수동으로 해부 현미경 노른자와 가슴 지느러미를 제거, 100mm 페트리 접시 PBSDT를 포함하고 집게를 사용으로 고정 된 유충을 전송합니다. 1.5 ML 튜브에 20 해부 유충 TP까지 전송합니다. </li> &lt;리&gt; 차단 솔루션 1 ml의 PBSDT 솔루션을 교체하고 2 시간 동안 실온에서 회 전자에 튜브를 바위. </li><li> 일차 항체를 함유 용액을 차단 100 ㎕로 차단 솔루션 교체합니다. 천천히 회전의 O / N에서 4 ° C의에 튜브를 바위. </li><li> 10 분마다 5 회 차 항체 용액을 제거하고 PBSDT 씻어. 그런 다음 차 항체를 포함하고 2 시간 동안 실온에서 회 전자에 바위 차단 솔루션의 100 UL를 추가합니다. </li><li> 회 전자에 흔들어 실온에서 10 분마다에 대한 PBSDT 5 회 반복한다. </li><li> 현미경 슬라이드에 옆으로 유충의 방향과 설치 미디어의 한 방울을 추가합니다. 조심스럽게 커버 유리로 커버 및 손톱 광택제와 커버 글래스를 밀봉. 지금, 그것은 공 초점 현미경에 대한 준비가되어 있습니다. </li></ol>

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저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

심각한하지만 온화한하지, 간세포 절제는 담즙의 중심 간 재생을 유도한다. CFP-NTR 트랜스 : 따라서 MTZ 처리 및 세척을 다음, 그것은 fabp10a에서 극한 CFP 형광에 의해 평가 될 수 MTZ 처리 된 유충의 간 크기를 조사하는 것이 중요하다. 절제된 비 (0~5%) 또는 부분 (10 내지 20 %의) 간 절제를 표시 MTZ 처리 애벌레의 적은 비율 때문에, 소트 및 매우 작은 간으로 유충을 분석하는 것이 필수적이다 심한 간세포 절제를 나타낸다. 우리의 프로토콜에서, 우리는 5 DPF (36 시간 처리주기)에서 3.5으로 MTZ 제브라 유충을 처리하지만, 다른 단계 및 MTZ 처리 시간도 가능하다. 예를 들면, 애벌레는 5 내지 36 시간, 상기 처리 기간 유사한 6 DPF (24 시간 치료 기간)도 나타냈다 심한 간세포 절제로 처리 하였다. 두 개의 추가 그룹은 독립적으로 생성비슷한 fabp10a : NTR 형질 ...

간은 고도로 회생 기관이다. 간 재생 중에 간세포를 재생, 간 실질 세포, 간세포 선재 (간세포 중심 간 재생) 또는 BECS (담도 중심 간 재생) -1,2-로부터 유도된다. 간 손상은 일반적으로 기존의 간세포의 증식을 유도한다; 간세포 증식가 손상된 경우에는, BECS 2-4 간세포에 기여할 수있다. 간 재생이 두 모드는 임상 적으로 중요하다. (인해 간 종양 또는 라이브 간 도너의 예), 인간 간 부분의 수술 제거하여 남은 간세포가 간에서 간 질량 손실을 복구하기 위해 증식. BECS 간 또는 전구 세포 (된 LPC)는 간세포의 재생에 기여하는 5,6- 나타나도록 반대로, 중증 간 질환 환자에서, 간세포 증식이 크게 손상된다. 설치류 2/3 부분 절제술 모델있는간세포가 잃어버린 간 질량을 복구 할 증식, 크게 간세포 중심의 간 재생 7,8의 현재 이해에 기여하고있다. 그러나, 재생 간세포가 주로 BECS에서 파생되는 유효한 설치류 모델이 없습니다. 여러 설치류 간 독소 모델 담즙 중심의 간 재생 2-4의 식별을 주도하지만, 생쥐에서 최근 혈통 추적 연구는 이러한 모델 9,10에서 간세포 재생에 BECS 최소한의 기여를 나타냅니다. 부분 간절 11-13 및 아세트 아미노펜 유도 간 손상을 포함 14,15 쥐 간 손상 모델의 일부는 제브라 피쉬인가 간 재생에 관여하는 유전자 또는 신규 경로의 식별을 주도하고있다. 그러나 간세포가 주도하지만, BEC-구동되지, 간 재생이 제브라 피쉬의 간 손상 모델에서 발생합니다. 따라서, 신규의 간 손상 모델되는 BECS 광범위 regenerat 기여간세포를 보내고하는 BEC 중심의 간 재생의 더 나은 이해를 위해 필요하다. 간세포 절제 모델의 전체적인 목적은 (1) BECS 광범위 재생 간세포에 기여하고, (2) BEC 중심 간 재생을 기본 분자 세포 메커니즘을 규명 된 간 손상 모델을 생성하기 위해 여기에 설명. 우리는 부상의 정도가 간 재생의 모드를 결정한다는 가정; 따라서, 우리는 담즙 중심의 간 재생이 심한 간세포 손상에 시작할 것이라고 예측했다. 이 가설을 테스트하기 위해, 우리는 유전자 변형 라인을 생성하여 제브라 피쉬의 간 손상 모델을 개발, Tg는 (fabp10a : CFP-NTR) S931, 즉 높은 간세포 특이 fabp10a에서 시안 형광 단백질 (CFP)와 융합 박테리아 Nitroreductase (NTR)를 표현 발기인. NTR은 세포 독성 약물에 비 독성 전구 약물, 메트로니다졸 (MTZ)를 변환하기 때문에, 단지 의도 절제한다 NTR-이 경우에는, 세포를 16-18을 발현, 간세포. MTZ 치료의 지속 시간을 조작함으로써, 간세포 박리의 정도를 제어 할 수있다. 이 모델을 사용하여, 우리는 최근 심한 간세포 손실시 BECS 광범위 또 다른 두 개의 독립적 인 연구에 의해 확인 하였다 (20, 21)의 재생 간세포 (19)을 야기한다는보고. 따라서, 상기 설치류 및 지브라 피쉬 간 손상 모델에 비해, 우리 간세포 절제 모델 BEC 중심 간 재생을 연구하는데 더욱 유리하다. 이 프로토콜은 제브라 간세포 절제 모델을 사용하여 간 재생 실험을 수행하기위한 절차를 설명한다. 이 모델은 담즙의 중심 간 재생을 기본 메커니즘을 결정하기위한 화학 화면을 억제 또는 간 재생을 보강 할 수 있습니다 작은 분자를 식별하기에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>3-아미노 벤조산 에틸 에스테르(트리카인) 분말</td><td>시그마-알드리치</td><td>A5040</td><td>0.4%(15mM) 트리카인 육수 만들기 : 트리카인 0.4g을 달걀 물과 함께 100mL에 넣습니다. pH 7로 조정하십시오.</td></tr><tr><td>디메틸 설폭사이드 (DMSO)</td> <td>시그마 - 알드리치</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>메트로니다졸</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>M1547</td><td></td></tr><tr><td>트리톤 X-100</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>포름 알데히드</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>황산 칼슘 이수화물</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>C3771</td><td></td></tr><tr><td>N- 페닐 티오우레아 (PTU)</td> <td>시그마 알드리치</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>마운팅 미디어 (Vectashield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm 페트리 디쉬&nbsp;</td><td>덴빌 사이언티픽 Inc.</td><td>M5300</td><td></td></tr><tr><td>클리어 네일 폴리</td>시 <td>Fisher Scientific</td><td>50949071</td><td></td></tr><tr><td>파인 펜치</td><td>파인 사이언스 도구</td><td>11251-20</td><td>Dumont #5&nbsp;</td></tr><tr><td>유리 슬라이드</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>유리 커버 슬립</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-A 및 12-542-A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>zn-5 (마우스 안티 Alcam)</td> <td>ZIRC</td><td>zn-5</td><td>1:10 희석</td></tr><tr><td>염소 안티 Hnf4a</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6556 (C-19)</td> <td>1:50 희석</td></tr><tr><td>쥐 안티 RFP</td><td>대립 유전자 생명 공학</td><td>ACT-CM-MRRFP10</td><td>1:300 희석</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure 당나귀 안티 염소 IgG (H + L)</td> <td>Jackson laboratories</td><td>705-605-147</td><td>1 : 500 희석</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H + L)</td> <td>Invitrogen</td><td>A21240</td><td>1 : 500 희석</td></tr><tr><td>Cy3 당나귀 안티 쥐 IgG</td><td>Jackson laboratories</td><td>712-165-150</td><td>1 : 500 희석</td></tr><tr><td>해부 현미경</td><td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td></td></tr><tr><td>상피 형광 현미경</td><td>라이카 마이크로 시스템</td>즈 <td>M205FA</td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 현미경</td><td>칼 자이스</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>달걀 물</td><td></td><td></td><td>0.3 g/L 바다 소금 ' 인스턴트 오션' 및 0.5mM CaSO4 증류수. 
&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; </td></tr><tr><td colspan="4">[헤더]</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td></td><td></td><td>25.6 g Na2HPO4&middot; 7H2O, 80g NaCl, 2g KCl, 2g KH2PO4.&nbsp; 증류수와 함께 1L에 넣으십시오.&nbsp; pH 7을 조정합니다. 121°C에서 20분 동안 오토클레이브합니다.</td></tr><tr><td>1 X PBS에 1X PBSDT, 0.2% Triton X-100 및 0.2% DMSO.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PEM 버퍼</td><td></td><td></td><td>30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4.&nbsp; 증류수와 함께 1L에 넣으십시오.&nbsp; pH 7을 조정합니다.</td></tr><tr><td>차단 용액</td><td></td><td></td><td>: 열 비활성화 호스 세럼 1ml와 1X PBSDT 9ml를 혼합합니다.</td></tr></tbody></table>

담즙 중심의 간 재생을 연구하는 zebrafish의에서 간세포 특이 절제

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

간은 재생 할 수있는 좋은 능력을 가지고있다. hepatocyte- 또는 담즙 중심의 간 재생 : 간세포, 간 실질 세포는 두 가지 방법 중 하나를 다시 생성 할 수 있습니다. 담즙 중심의 재생에, 재생 간세포가 담도 상피 세포 (BECS)에서 파생 된 반면 간세포 중심의 간 재생에 재생 간세포는, 기존의 간세포에서 파생됩니다. 간세포 중심의 간 재생에 크게 간 재생의 현재 이해에 기여한 우수한 설치류 모델이 있습니다. 그러나, 이러한 설치류 모델은 담즙 중심의 간 재생에 존재하지 않습니다. 우리는 최근에 BECS 광범위 심한 간세포 손실시 간세포을 야기하는 제브라 피쉬 간 손상 모델에보고했다. 이 모델에서, 간세포는 특히 약물 유전 학적 방법으로 절제되어있다. 여기에서 우리는 간세포를 브레이션과 BEC 중심의 간 재생 과정을 분석하는 상세 방법을 제시한다.이것은 간세포 특이 절제 모델은 또한 담즙 중심 간 재생의 기본 분자 세포 메커니즘을 발견하는데 사용될 수있다. 더욱이, 이러한 방법은 보강 또는 간 재생을 억제 작은 분자를 식별하는 화학 스크린에 적용될 수있다.

3.5 DPF 5에 극적으로 감소 간 크기 (그림 1B)에서 36 시간 (A36h,이 절제를 의미)에 대한 MTZ 처리. CFP-NTR 및 fabp10a : MTZ의 세척 한 후, 간 재생 (R), 강한 fabp10a의 시작으로 간주을 DsRed 발현 30 시간 (그림 1B)에서 다시 나타났다. 간내 담즙 네트워크 BECS (22)의 막에 존재 ALCAM의 발현에 의해 평가로, 초기 붕괴 그러나 54 시간의 후 세척 (R54h) (그림 1C)에 다시 설립되었다. 이러한 데이터는 간 재생과 회복이 빠른 속도로 우리의 간 손상 모델에서 발생하는 것을 나타냅니다. 그림 2는 재생 간세포가 BECS에서 파생 된 것을 알 수있다. Tg는 (TP1 : H2B-mCherry) s939 라인은...

제브라피시 담즙 유도 간 재생의 기저에 있는 분자 메커니즘을 평가하는 데 도움이 되도록 우리는 니트로환원효소 발현 간세포가 메트로니다졸 처리 시 유전적으로 절제되는 간 손상 모델을 확립했습니다. 이 프로토콜에서는 간세포 절제 및 담즙 주도 간 재생을 능숙하게 조작, 모니터링 및 분석하는 방법을 설명합니다.

담즙 중심의 간 재생을 연구하는 Zebrafish의에서 간세포 특이 절제

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

본 절차의 전반적인 목표는 담즙에 의해 유도되는 간 재생 분석을 위해 제브라피시의 간세포 제거를 유도하는 것입니다. 이는 먼저 간세포에서 니트로 환원효소를 발현하는 형질전환 치어를 메트로니다졸(metronidiazole) 또는 MTZ에 노출시킴으로써 수행됩니다. 두 번째 단계에서는 간의 상대적 크기를 바탕으로 간세포 제거 수준을 평가합니다.마지막 단계에서 MTZ 처리를 거친 후, 간이 매우 작아진 bully 결손 유생을 수집하여 최종적으로 간의 크기를 측정하고, 재생 중인 간에서 간 마커의 발현을 각각 에피 형광 현미경과 공초점 현미경으로 측정합니다. 설치류 난형 세포 활성화 모델과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 이 기술을 통해 재생되는 간세포가 주로 담관 상피 세포에서 유래한다는 점입니다. 이 방법은 담관 또는 간 전구 세포가 간 재생에 어떻게 기여하는지와 같은 간 재생 분야의 핵심 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 사람은 결손 및 재생 중인 유생의 간 크기가 가변적이기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다.시간을 맞춘 교배를 수행하려면, 성체 수컷과 암컷 헤미접합체 또는 동형접합체 물고기를 분리막으로 구분하여 하룻밤 동안 함께 둡니다. 교배를 원하는 다음 날 아침에 분리막을 제거하고, 미세 플라스틱 메쉬 체를 사용하여 배아를 수집합니다. 체를 뒤집은 후 스퀴즈 보틀을 이용해 미세한 흐름의 난자수로 메쉬 표면을 헹굽니다. 그런 다음 최대 100개의 배아를 25 mL의 난자수가 담긴 100 mm 페트리 접시에 옮기고, 색소 침착을 억제하기 위해 접시를 28 °C에 둡니다.배양액에 PTU를 첨가하고 10시간 동안 유지합니다. 수정 후 80시간이 경과한 시점입니다. 개인화 이후, trica를 사용하여 치어를 마취시키고 형광 현미경을 이용해 CFP 양성 치어를 수집하며, 간의 크기가 유사한 개체들만 선별합니다.그런 다음 trica egg water를 PTU가 첨가된 신선한 egg water로 교체하고, CFP 양성 제브라피쉬 치어를 28 °C 인큐베이터로 옮깁니다. 제브라피쉬 치어에 MTZ를 처리하려면, 먼저 적절한 수의 치어를 두 개의 서로 다른 배양 용기에 나눕니다. 실험군 치어는 갓 조제한 MTZ 용액에 두고, 대조군은 egg water에 둡니다.DMSO로 보충합니다. MTZ의 광불활성화를 방지하기 위해 실험군을 알루미늄 호일로 덮고, 절제 기간이 종료되면 두 그룹의 제브라피쉬 유생을 28 °C에서 배양합니다. 플레이트에서 MTZ 용액을 제거하고, MTZ 처리된 유생을 25 mL의 난수(egg water)로 2~3회 세척하며, 매 세척 후에는 난수를 흔들어 버립니다.마지막 세척 후, MTZ 처리된 유충의 심장 부종 및 사망을 방지하기 위해 이전에 사용했던 trica 농도의 절반으로 유충을 고정합니다. 그런 다음 에피 형광 현미경의 CFP 필터를 사용하여 MTZ 처리된 유충의 상대적 간 크기에 따라 간세포 제거 수준을 평가합니다. 간의 크기가 커서 유충의 0~5%에 해당하는 제브라피쉬는 제거되지 않은 것으로 간주하십시오.유충의 10~20%에 해당하는 중간 크기의 간을 가진 개체는 부분 절제된 것으로 간주하고, 유충의 80~90%에 해당하는 매우 작은 간을 가진 개체는 완전 절제된 것으로 간주합니다. 모든 동물을 분류한 후, 절제되지 않았거나 부분 절제된 간을 가진 유충을 찾아 제외하고, 간 분석을 위해 심각한 간세포 절제를 나타내는 아주 작은 간을 가진 제브라피쉬만 남깁니다. 재생 0시간 시점에서 유충을 1.5 milliliter 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다.MTZ 세척 및 CFP 소싱 직후, 배아 배양액을 3% formaldehyde MPEM 버퍼로 교체하고 4 °C 로터에서 하룻밤 동안 고정합니다. 다음 날 아침, 고정액을 1 mL의 PBS-T로 교체하고 유생을 5분 동안 더 회전시킵니다. 그다지, 해부 현미경 하에서 신선한 PBS-T가 담긴 100 mm 페트리 접시에 고정된 모든 유생을 옮기고, 모든 유생의 절단이 완료되면 핀셋을 사용하여 난황과 가슴지느러미를 수동으로 제거합니다.최대 20마리의 동물을 1.5 milliliter 튜브로 옮기고 P-B-S-D-T를 1 milliliter의 블로킹 용액으로 교체합니다. 상온의 로테이터에서 2시간 동안 반응시킨 후, 블로킹 용액을 100 microliters의 1차 항체 칵테일로 교체하여 4 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날 로킹하며 1차 항체 용액을 제거하고, 제브라피시를 P-B-S-D-T로 10분씩 5회 세척합니다.마지막 세척 후, 2차 항체 100 µL를 첨가하고 실온에서 로킹(rocking)하며 2시간 동안 배양합니다. 마지막으로, 앞서 시연한 것과 같이 PBS-DT로 유충을 5회 세척합니다. 유충을 현미경 슬라이드 위에 측면으로 배치하고 마운팅 용액을 한 방울 첨가합니다.그 다음, 각 제브라피쉬를 커버글라스로 조심스럽게 덮고 매니큐어로 커버글라스를 밀봉합니다. 수정 후 3.5일에서 5일까지 36시간 동안 MTZ 처리를 하면 간의 크기가 급격히 감소합니다. MTZ 세척 후 30시간 이내에 강력한 CFP 및 적색 발현이 다시 나타나며, 이는 담관 상피 세포의 막에서 LCAM의 발현을 통해 확인할 수 있습니다.간내 담도 네트워크는 처음에 붕괴되지만, 세척 후 54시간이 지나면 다시 재구축되어 간의 빠른 재생과 회복을 나타냅니다. 이 이미지들에서는 간의 담관 상피 세포에서만 독점적으로 발현되는 핵 적색 형광 단백질의 형질전환 재생 간세포들이 보여집니다. 재생 중인 간의 H2B-mCherry 양성 세포 대부분은 재생 0시간 및 재생 48시간에서 HNF4α를 발현합니다. MTZ 처리된 CFP 양성 간세포들은 여전히 H2B-mCherry 발현을 유지하고 있으며, 이는 심각한 간세포 손실 시 담관 상피 세포가 간세포로 전환됨을 나타냅니다.이 절차를 수행할 때, MTT 처리 후 후속 간 재생을 위해 용해 작용(lysis Action)이 발생한 뒤 완전히 절제(fully ablated)된 상태를 선택하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오. 이 기술은 간 재생 분야의 연구자들이 간 전구세포 주도의 간 재생 기전을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다. 이 영상을 시청한 후, 여러분은 담관 주도의 간 퇴행 연구를 위해 이 지리학적 세포 특이적 조작 모델을 사용하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

hepatocyte-specific-ablation-zebrafish-to-study-biliary-driven-liver

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

이 기사는 형질전환 제브라피시 유충에서 메트로니다졸로 간세포 사멸을 유도하는 방법인 표적 간 절제술에 대해 설명합니다. 샘플 프로토콜은 제브라피시에서 표적 간 절제를 생성, 조작 및 평가하는 프로세스를 설명합니다.

표적 간 절제술: 형질전환 제브라피시 유충에서 메트로니다졸을 사용한 간세포 사멸 유도

과도한 세포외 기질 단백질의 침착으로 인한 지속적인 섬유화는 간경변증을 유발합니다. 알코올 남용은 심각한 간 질환의 주요 원인 중 하나입니다. 우리는 알코올로 인한 부상 시 간세포 재생을 촉진하는 메커니즘과 전략을 연구하기 위해 에탄올 유도 제브라피시 섬유성 간 모델을 구축했습니다.

Zebrafish의에서 에탄올에 의한 섬유 성 간 모델의 개발은 전구 세포 매개 간세포의 재생을 연구하는

이 프로토콜은 24 시간 동안 2 % 에탄올로 치료 zebrafish의 유충에서 간 조직 분석을 설명합니다. 이러한 급성 에탄올 처리는 간 지방증 및 간 혈관계의 팽창을 초래한다.

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리보솜 친화도 정제(TRAP)를 번역하면 세포 유형별 번역 mRNA를 신속하고 효율적으로 분리할 수 있습니다. 여기서, 우리는 간 재모독 및 TRAP의 마우스 모델에서 유체역학적 꼬리 정맥 주입을 결합하여 간세포를 재채우는 발현 프로필을 검사하는 방법을 입증한다.

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여기에서 우리는 애벌레 얼룩말어에 있는 간 크기를 정량화하는 방법을 보여줍니다, 간 성장 및 발달에 유전과 약리학 적인 조작의 효력을 평가하는 쪽을 제공하는.

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제브라피쉬에서 비알코올성 지방간 질환 관련 간세포암의 초기 진행 중 간 미세환경 분석

여기에서는 겐타마이신 주사로 급성 신장 손상을 유발하여 성인 신장 재생을 연구하는 신뢰할 수 있는 방법을 제시합니다. 우리는 부상이 겐타마이신 투여량과 환경 온도에 따라 달라진다는 것을 보여주며, LHX1a+가 새로운 네프론을 개발하기 위해 현장 교잡법을 사용합니다.

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

여기에서는 TetON 시스템을 사용하여 성체 재생 제브라피시 꼬리 지느러미에서 조직 특이적 유전자 발현을 달성하는 워크플로우를 간략하게 설명합니다.

코스닥 시스템의 사용은 분자 메커니즘 Zebrafish의 재생의 연구를

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수술 절제 분석 플라나리아에 아이 재생을 유학을위한

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담즙 중심의 간 재생을 연구하는 Zebrafish의에서 간세포 특이 절제

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