담즙 중심의 간 재생을 연구하는 Zebrafish의에서 간세포 특이 절제

이 절차의 전반적인 목표는 담즙 유도 간 재생의 분석을 위해 제브라피시에서 간세포 절제를 유도하는 것입니다. 이것은 먼저 간세포에서 니트로 환원효소를 발현하는 형질전환 유충을 메트로나 또는 MTZ에 노출시킴으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 간의 상대적 크기에 따라 간세포 절제 수준을 평가합니다.

마지막 단계에서 MTZ 처리 후 간이 작은 괘박을 제거한 유충을 채취하여 최종적으로 간의 크기와 재생간 내 간 마커의 발현을 각각 epi 형광과 컨포칼 현미경으로 측정합니다. 설치류 타원형 세포 활성화 모델과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 이 기술을 사용하면 재생 간세포가 주로 담도 상피 세포에서 파생된다는 것입니다. 이 방법은 담즙 또는 간 전구 세포가 간 재생에 어떻게 기여하는지와 같은 간 재생 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 납 및 퇴화 실험실의 간 크기가 가변적이기 때문에 고군분투할 것입니다.

시간 제한 짝짓기를 수행하려면 성인 수컷과 암컷 반접합 또는 동형접합 물고기를 하룻밤 사이에 칸막이를 설정하여 놓습니다. 짝짓기가 필요할 때 다음날 아침 칸막이를 제거하고, 미세한 플라스틱 메쉬 스트레이너를 사용하여 배아를 적출하고, 스트레이너를 거꾸로 뒤집고, 짜기 병을 사용하여 메쉬 표면을 고운 계란 물로 헹굽니다. 그런 다음 최대 100개의 배아를 25ml의 달걀수가 들어 있는 100mm 페트리 접시에 옮기고 접시를 섭씨 28도에 두어 색소 침착을 억제합니다.

최대 10시간까지 배양에 PTU를 추가합니다. 80 시간에 수정 후. 개인화 후 trica로 유충을 마취하고 epi 형광 현미경을 사용하여 CFP 양성 유충을 수집하고 비슷한 크기의 간을 가진 동물만 유지합니다.

그런 다음 트리카 달걀 물을 PTU가 보충된 신선한 달걀 물로 교체하고 CFP 양성 제브라피시 유충을 섭씨 28도의 인큐베이터로 되돌립니다. 제브라피시 유충을 MTZ로 처리하려면 먼저 적절한 수의 유충을 두 개의 다른 배양 용기로 나눕니다. 실험용 유충 그룹은 갓 준비된 MTZ 용액에 보관하고 대조군 그룹은 달걀 물에 보관하십시오.

DMSO로 보충되었습니다. MTZ의 광비활성화를 방지하기 위해 실험 그룹을 알루미늄 호일로 덮고 절제 기간이 끝날 때 섭씨 28도에서 두 그룹의 제브라피시 유충을 모두 배양합니다. 플레이트에서 MTZ 용액을 제거하고 MTZ 처리 된 유충을 25ml의 달걀 물로 2-3 번 씻고 소용돌이 치며 세척 할 때마다 달걀 물을 버립니다.

마지막 세척 후, MTZ 처리된 유충에서 심장 부종과 죽음을 피하기 위해 이전에 사용된 트리카 농도의 절반으로 유충을 고정시킵니다. 그런 다음 epi 형광 현미경의 CFP 필터를 사용하여 MTZ 처리된 유충의 상대적 간 크기를 기반으로 간세포 절제 수준을 평가합니다. 큰 간을 가진 얼룩말 물고기는 유충의 0-5%를 제거하지 않는 것으로 간주합니다.

중간 크기의 간을 가진 자는 부분적으로 절제해야 할 유충의 10-20%를 차지하고, 간이 매우 작은 자는 완전 절제할 유충의 80-90%를 차지한다. 모든 동물을 분류한 후, 간이 절제되지 않았거나 부분적으로 절제된 유충을 발견하고, 간 분석을 위해 심각한 간세포 절제를 나타내는 작은 간을 가진 얼룩말 물고기만 유지합니다. 재생 제로 아워 시점에서 유충을 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.

MTZ 세척 및 CFP 소싱 직후, 달걀 물을 3% 포름알데히드 MPEM 완충액으로 교체하여 섭씨 4도의 로터에 하룻밤 동안 고정합니다. 다음 날 아침, 고정 용액을 1ml의 P-B-S-D-T로 교체하고 유충을 5분 더 회전시킵니다. 다음으로, 모든 고정된 유충을 해부 현미경으로 신선한 P-B-S-D-T가 들어 있는 100mm 페트리 접시에 넣고 집게를 사용하여 모든 유충이 잘렸을 때 난황지느러미와 가슴지느러미를 수동으로 제거합니다.

최대 20마리의 동물을 1.5ml 튜브에 옮기고 P-B-S-D-T를 1ml의 차단 용액으로 교체합니다. 실온에서 회전체에서 2시간 후 차단 용액을 100마이크로리터의 1차 항체 칵테일로 교체하여 섭씨 4도에서 하룻밤 배양합니다. 다음 날 흔들면서 기본 항체 용액을 제거하고 제브라 피쉬를 P-B-S-D-T로 10분 동안 5번 씻습니다.

마지막 세척 후 2차 항체 100마이크로리터를 첨가하여 실온에서 흔들면서 2시간 배양합니다. 마지막으로, 방금 시연한 것처럼 P-B-S-D-T로 유충을 5번 씻습니다. 현미경 슬라이드에서 유충을 측면으로 향하게 하고 장착 매체 한 방울을 추가합니다.

그런 다음 각 얼룩말 물고기를 커버 유리로 조심스럽게 덮고 매니큐어로 커버 유리를 밀봉합니다. 수정 후 3.5일에서 5일까지 36시간 동안 MTZ 치료를 하면 간 크기가 크게 줄어듭니다. MTZ 세척 후 담도 상피 세포의 막에서 LCAM의 발현으로 평가된 바와 같이 30시간 이내에 강한 CFP 및 적색 발현이 다시 나타납니다.

간내 담도계는 처음에는 붕괴되지만, 휴지 후 54시간이 지나면 다시 형성되어 간의 재생과 회복이 빨라집니다. 이러한 이미지에서, 간의 담도 상피 세포에서 독점적으로 발현되는 핵 적색 형광 단백질에 대한 형질전환 간세포는 이러한 H, 2개의 BM 체리 양성 세포의 대부분을 보여주며, 재생 시간에서 HNF 4개의 알파를 재생, 재생 시간, 0, 재생 시간, 4개의 C, 8개의 알파를 표현합니다. MTZ로 처리된 CFP 양성 간세포는 여전히 H, 2 BM 체리 발현을 유지하며, 이는 심각한 간세포 손실 시 담즙 상피 세포가 간세포로 전환됨을 나타냅니다.

이 절차를 시도하는 동안, MTT 치료 후 완전히 절제된 것을 선택하여 개발 후 용해 작용에 대한 후속 간 재생을 기억하는 것이 중요합니다. 이 기술은 간 재생 분야의 연구자들이 간 전구 물질인 세포 주도 간 재생의 기저에 있는 메커니즘을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 bilio driven liver degeneration 연구를 위해 이 지리학 세포 특이적 작동 모델을 사용하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.