Name: 조직 학적 분석을위한 근육 저온부의 준비의 것과하지 말아야을 수행 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: 학습하세요 근육 생검의 저온절단 준비 방법으로 동결 인공물을 방지하고 조직 형태학을 보존하는 기술입니다. 이 방법은 신경근육 질환 연구와 진단에 필수적인 정확한 조직학 평가를 가능하게 합니다.

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원고 수정을 해주신 Alex Miller님께 감사드립니다. 이 연구는 Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy(SAM) 및 Muscular Dystrophy Association(218938)에서 M.G.에게 수여한 연구 보조금으로 지원되었습니다.

1. 조직 수확 및 근육 조직의 동결 <ol><li> 이소 플루 란 (2- 클로로 -2- (다이 플루오 로메 톡시) -1,1,1- 트리 플루오로 에탄)의 과다와 마우스를 안락사. 흄 후드에서이 단계를 수행 및 건조기 또는 이소 플루 란에 적신 면봉을 포함하는 벨 항아리로 보조 봉쇄 방법을 사용합니다. </li><li> 단단히 발바닥을 압박하여 죽음을 확인합니다. 이러한 자궁 전위로 안락사의 보조 방법을 사용합니다. </li><li> 근육에 느슨한 머리카락의 부착을 감소시키기 위해 70 % 알코올로 모피 젖은. 같은 # 5로 미세 집게를 사용하여 사지 떨어져 피부 껍질. </li><li> 조심스럽게 아래 뼈 (이 경우에는 전 경골근 (TA)) 관심의 근육을 분리 건에서 시작하여 제거합니다. </li><li> 근육을 절제 10월 (최적 절단 온도 화합물)에 커버 및 라벨 일회용 동결 금형 위에 올려 놓습니다. 근육이 타이에 정상적인 생리적 방향 (머리에 있는지 확인스트레칭없이 L). 대안 적으로, 작은 스티로폼 사각형에 근육을 동결 및 근육의 정확한 길이를 보장하는 곤충 핀을 사용하여 고정. </li><li> 액체 질소를 사용하여 강철 비이커 중 2- 메틸 부탄 (이소 펜탄)을 진정. 5 분 -이 평균 3 일이 걸립니다. 흰색 침전물이 비커의 바닥과 벽에 형성하기 시작할 때까지 간헐적으로 교반하십시오. 주 :이 때, 이소 펜탄 최적 동결 온도에 도달 (-150 ° C) </li><li> 냉장 2- 메틸 부탄에 근육을 포함하는 금형을 찍어. 20 초 - 15 비복근의 가자미근 (GS)과 삼두근을 추천 삼성 전자와 큰 근육 - 같은 다이어프램과 신근 심지 6 longus (EDL)와 같은 작은 근육을 동결. 너무 오래이 균열로 이어질 수 있기 위해 근육을 동결하지 마십시오. </li><li> 드라이 아이스에 냉동 조직을 전송하고 이소 펜탄 증발 (이 과정은 약 평균 15 소요 있습니다 - 20 분)을 할 수 있습니다. 알루미늄 호일에 조직을 감싸고 U에 보관ltra 저온 절편까지 (-70 ° C에서 -80 ° C). </li></ol> 2. 조직 블록을 준비하는 OCT에서 조직의 포함 <ol><li> 드라이 아이스에 전송 조직 해동을 방지하기 위해 cyrostat합니다. 전송 조직하고 30 분 동안 평형화하자 (조직의 완전 해동을 피하기 위해 -20 -24 ℃로 설정)를 챔버 저온 유지한다. </li><li> 펠티에 베이에 냉각십시오. 그라 이오 스탯이 냉각이없는 경우, 신속하게 OCT를 동결 에어로졸 냉각 스프레이를 사용합니다. 이 동결 손상을 초래할 수 있으므로 삽입시에 임의의 지점에서 근육 해동시키지 마십시오. </li><li> 시편 디스크에 10월의 균일 한 박막을 추가하고 식힌다. OCT의 대부분 동안 여전히 액체 상단에 바닥에 고정 될 때, (세로 섹션에 대한 10월에 횡단면과 평행을위한 10월에 수직) 올바른 방향에서 조직을 삽입합니다. 빨리 OCT를 동결 에어로졸 냉각 스프레이를 사용합니다. 열 내선과 조직의 unembeded 부분을 터치ractor 45 초 동안 기다립니다. </li><li> 근육 주위 OCT의 다른 얇은 층을 추가 에어로졸 냉각 스프레이 스프레이 및 이전 단계에서와 같이 열을 추출한다. </li><li> 근육 전체가 커버 될 때까지 분무하고 열 추출기 냉각 에어로졸의 조합을 사용하여 빠르게 동결 OCT를 조금씩 OCT를 계속 추가하고. </li><li> 조직 블록의 상단에 열 추출기를 넣고 5 분 동안 기다린다. </li></ol> 3. 섹션을 준비하고 근육의 미드 벨리 지역에서 섹션을 확인 <ol><li> 시편 머리에 시료를 탑재합니다. 디스크를 보호하기 위해 노브를 조입니다. 시편 디스크 시편 머리와 잘 접촉되어 있는지 확인합니다. </li><li> ° -21 내지 -24 C의 챔버 온도를 조정하고 설정 온도가 될 때까지 기다립니다. </li><li> 두께 설정 (7 μm의)를 조정; 전진 또는 일반 및 미세 설정을 사용하여 블록을 후퇴하여 블록을 잘라. </li><li> 섹션을 수집슬라이드 상에 컷 부의 부착을 용이하게하기 위해 반대 전하 간의 인력을 사용하여, 상기 슬라이드 부에의 상단을 가압하여 양전하 현미경 슬라이드를 미리 예열. </li><li> 섹션의 단면적 (CSA)를 측정하여 중간 배꼽 부분을 확인합니다. 현미경에 연결되어있는 컴퓨터를 사용하여이 촬상 소프트웨어를 수행. 주 : 위상차 이미지를 촬영하고, 전체 둘레의 근육은 소프트웨어 프로그램에 대한 추적 기능을 통해 측정된다. 이것은 CSA 모두뿐만 아니라 최소 족제비 직경 측정 (입자의 양측에 두 개의 평행 한 접선 사이의 최소 거리로 표현 섬유 단면 크기의 측정)을 수득한다. 참고 : CSA 및 최소 흰 족제비 지름 측정은 고원에 시작하면, 중간 배에 도달했습니다. </li><li> 재고는 미래 염색 -80 ° C에서 슬라이드를 보관합니다. 참고 : stainin하는 OCT를 전에 제거 할 필요가 없습니다G 절차. 슬라이드가 coverslipped되면, 그들은 즉시 염색 할 준비가 된 것입니다. </li></ol> 4. 염색 주 : 상세한 단계별 절차가 제품 데이터 시트에서 확인할 수 있고, 염색 절차 따라야하는 동안 개인의 최적화가 최적의 착색을 얻기 위해 필요할 수있다. <ol><li> 미디어 (표 참조)를 장착하는 물과 혼화하지 않기 때문에, (70 %, 95 %, 100 % 에탄올로 2 분마다) 알코올의 증가 성적 통해 슬라이드를 탈수 및 크실렌 (5 분 동안 100 %)을 보장하기 위해 함께 그것들을 취소 슬라이드는 시간이 지남에 따라 불투명가되지 않습니다. </li><li> 섹션 커버 슬립하고 건조 할 수 있습니다. 현미경으로 이미지 이미징 소프트웨어를 장착. </li></ol>

<ol><li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+disorders+%3A+NMD%22%5BJournal%5D)">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li>
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</ol>

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조직학 및 면역 조직 화학 다양한 신경 근육 질환의 증상과 병변의 진행을 이해하기위한 주요 도구로 사용되어왔다. 클래식, 근육 생검 먼저 포름 알데히드에 고정 후 파라핀 왁스 내장했다. 포름 알데히드는 고정 조직 구조를 보존하고 RT에서 티슈 저장 및 전송을 허용하지만, 또한 정확한 면역을 달성하기 위해 추가의 단계를 필요로 가교 효소와 단백질을 비활성화한다. 이 문제는 고정 된 섹션을 이용하여 제거되지만,이 방법은 최적의 염색 결과와 정확한 해석 14,15 구해진 고유 한 기술적 과제를 제시한다. 첫째,이자가 분해 및 분해가 몸에서 제거 후 곧 시작으로 샘플이 수술 절제 후 즉시 동결하는 것이 필수적이다. 또한 조직의 크기에 따라 변화 시간의 적당한 시간 동안 급속 냉동하고 철저해야/ 조직의 두께. 이 제대로 수행되지 않는 경우, 조직 학적 평가를 위해 쓸모 렌더링 조직 손상 발생을 동결. 동결에 따라, 조직은 즉시 절편 때까지 매우 낮은 온도 (-80 ...

근육 조직 학적 검사는 신경근 장애 1-4의 다른 유형의 이해에 중요한 역할을한다. 다른 기술과 결합 할 때, 연구자들은 병리의 증상과 진행의 더 나은 아이디어를 얻을 수 있고 치료 적 개입 5-10의 효능을 평가하는 것이 필수적이 될 수 있습니다. 절단 직전의 생리 상태를 유지하도록하지만 정확한 것으로, 조직을 적절한 방식으로 유지 될 필요가있다. 이것은 제거, 보존, 절편 및 염색시 세심한주의가 필요합니다. 조직은 광학 현미경 연구를위한 두 가지 방법으로 제조 될 수있다. (FFPE) 섹션, 포함 된 첫 번째 방법, 포르말린 고정 파라핀 조직을 파라핀 왁스 (11, 12)에 포함되기 전에 10 % 자연 버퍼 포름 알데히드에 고정해야합니다. 정착 단계는 또한 크로스 링크 내인성 PR 나은 형태를 유지하는 데 도움oteins 따라서 면역 항원에 대한 복잡한 검색 절차를 필요로하며 12 절에 효소 염색 가능성을 제거. 냉동 된 부분은, 다른 한편으로는, 미리 고정 된 또는 처리 될 필요가 없다; 따라서, 단백질은 고유 생물 입체 (13, 14)을 보유 할 수 있습니다. 또한, 동결 절편은 또한 때때로 육종 및 기타 외과 생검 (15)의 진단 수술, 예를 들어 필요한 빠른 처리 시간을 허용. 제대로 수행하지 않을 경우 그러나,이 방법은 조직 학적 검사에 대한 부분은 부적당하고 근육 구조에 대한 변경 사항을 소개 손상을 동결하는 경향이있다. 이 논문은 적절한 검사를위한 최적의 염색을 달성하기 위해 근육 조직 검사를 준비하는 가장 효과적인 방법을 개설 할 것이다.

<table><tbody><tr><td>저온 유지 장치</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., 사무실 전화 1-800-248-0123 대안: Richard Allen Scientific</td></tr><tr><td>현미경</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., 전화: 1-631-547-8500 대안: 올림푸스</td></tr><tr><td>이미지 분석 소프트웨어</td><td>니콘 이미징 소프트웨어 기초 연구</td><td>니콘 인스트루먼트 Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., 전화: 1-631-547-8500 대안: 이미지 J, 변형</td></tr><tr><td>이소플루란</td><td>14043-220-05</td><td>JD 메디컬 디스트 주식회사</td><td>1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 미국</td></tr><tr><td>OCT</td><td>4583</td><td>사쿠라 Inc.</td><td>Torrence, CA 90501 U.S.A. 대체 출처: Leica Microsystem</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific</td></tr><tr><td>일회용 조직 금형</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost plus 슬라이드</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific</td></tr><tr><td>에틸 알코올</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. 대체 출처: VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

조직 학적 분석을위한 근육 저온부의 준비의 것과하지 말아야을 수행

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

근육 생검의 조직 학적 평가는 신경 근육 질환의 병리의 개발 및 진행의​​ 이해에 필수적인 도구 역임했다. 그러나, 이렇게하기 위해, 적절한 치료는 절제 최적 염색을 달성하기 위해 조직을 보존 할 때 수행되어야한다. 조직 보존의 한 방법은 파라핀 왁스를 삽입 한 후 포름 알데히드의 조직을 고정하고 포함한다. 이 방법은 잘 형태를 유지하고 실온에서 장기간 보관이 가능하지만, 복잡하고 독성 화학 물질의 취급을 요구한다. 또한, 효과적인 면역 항원에 대한 검색 프로토콜을 필요 항원 가교, 포름 알데히드 고정 결과. 반대로, 동결 절편은 고정을 필요로하며, 따라서 생물 항원 형태를 유지하지 않는다. 이 방법은 intraopera 같은 빠른 조직 학적 평가를 필요로하는 상황에서이 특히 유용하고, 시간의 주위에 빠른 차례에 뚜렷한 장점을 제공합니다수술 적 생검을 포지티브,. 여기에서 우리는 다른 조직 학적 및 면역 학적 얼룩과 시각화를위한 근육 조직 검사를 준비하는 가장 효과적인 방법을 설명합니다.

수확 및 조직의 동결을위한 셋업은 그림 1에서 볼 수 있습니다. 절제된 조직은 건조 (그림 1A)를 방지하기 위해 PBS에 적신 거즈에 저장해야합니다. 조직들은 정확한 형태 (도 1b)을 보장하기 위해 OCT에서 침지 크라이 금형에 뻗어 올바른 방향으로 가능한 생리적 길이에 가까워 야 학적 해석에 사용하기 위해 선택되는 경우. 동결 조직 적합 펜탄 슬러리는 액체 질소로 냉각하고 이소 펜탄 작은 백색 침전물이 나타날 때까지 바닥에서 교반에 의해 달성 될 수있다. 이 시점에서, 매체는 (도 1C)를 냉동실에 적합하다. 조직은 조직 (그림 1D)의 크기 / 두께에 따라 냉장 이소 펜탄에 6-15 초에서 동결해야합니다. 동결 후, 근육 -80 &lt;이 드라이 아이스에 저장해야 지적하는 백악질 흰색을 표시하고 나중에 전송합니다강한&gt; ° C의 냉동고. <p class="jo...

여기에서는 인공물 동결을 피하기 위해 근육 생검을 동결, 포매팅, 동결 절제 및 염색하는 가장 효율적인 방법을 보여줍니다.

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

이 절차의 전반적인 목표는 동결 아티팩트 생성과 같이 근육 생검 조직의 동결 절편을 준비할 때 발생할 수 있는 문제점들을 방지하는 것입니다. 이를 위해 먼저 액체 질소로 냉각한 2-메틸부탄을 사용하여 근육을 빠르게 동결시킵니다. 근육 생검 조직이 크라이오스탯(cryostat) 내에서 평형을 이룬 후, 에어로졸 냉각과 열 추출을 통한 급속 동결 방식을 사용하여 상온에서 최적 절단 온도(OCT) 매질에 소량씩 나누어 포매합니다.다음으로 7 µm 두께의 절편을 잘라 따뜻하게 데운 양전하 처리 유리 슬라이드로 옮깁니다. 마지막 단계는 조직의 조직학적 평가를 위해 필요에 따라 조직 절편을 염색하는 것입니다. 궁극적으로 적절하게 준비된 근육 생검 조직은 동결 아티팩트 없이 조직 조직학적 구조가 잘 보존된 결과로 나타납니다.따라서 파라핀 매립 조직 절편 제작과 같은 기존의 다른 방법들에 비해 이 기술이 갖는 주요 장점은 매우 신속하며, 내인성 항원의 구조나 기능을 변화시키지 않는다는 점입니다. 이 방법은 성장, 재생, 염증, 섬유화 및 괴사와 같이 근육 생물학의 건강 및 질병과 관련된 핵심적인 질문들에 대한 답을 찾는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술은 건강한 근육과 질병이 있는 근육의 상태를 결정할 수 있게 해주므로, 그 응용 범위는 근육 질환의 치료나 진단까지 확장됩니다.이 방법은 다양한 형태의 근이영양증에 대한 통찰을 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 암 및 에이즈의 말기 단계와 관련된 악액질이나 노인 인구의 근육 손실과 같은 다른 체계에도 적용될 수 있습니다. 흄 후드 내의 벨 자(bell jar)와 같은 2차 밀폐 장치 안에서 이소플루레인(isof fluorine)을 과량 투여하여 마우스를 안락사시키는 것으로 시작하십시오. 마우스의 발바닥 패드를 강하게 눌러 동물의 사망 여부를 확인하십시오.이제 70% alcohol로 털을 적십니다. 이는 낱개로 떨어진 털 가닥들이 근육에 달라붙는 것을 방지하기 위함입니다. 이어서 5번 미세 핀셋을 사용하여 사지에서 피부를 벗겨냅니다.건(tendon) 부분부터 시작하여 관심 근육을 뼈에서 조심스럽게 분리합니다. 본 사례에서는 전경골근(tibias anterior)을 분리합니다. 근육을 절제한 후, OCT로 덮고 라벨이 부착된 일회용 냉동 몰드 위에 평평하게 놓습니다.슬라이싱 전에 OCT를 더 추가할 것입니다. 근육이 머리부터 꼬리까지의 축을 따라 정상적인 생리학적 방향으로 놓여 있는지, 그리고 근육이 늘어나지 않았는지 확인하십시오. 이제 냉각하십시오.액체 질소를 사용하여 스틸 비커에 이소펜탄을 준비합니다. 플라스틱 스패튤라로 3~5분 동안 간헐적으로 저어줍니다. 흰색 침전물이 형성되면 이소펜탄이 최적 온도에 도달한 것이며, 이때 시료가 담긴 몰드를 용액에 담급니다.횡격막이나 최장지신근과 같은 작은 근육은 6~12초가 소요됩니다. 더 큰 근육은 15~20초가 소요되며, 과냉각 시 조직에 균열이 생길 수 있습니다. 다음 단계로 냉동된 조직을 드라이아이스 위에 올려 잔류 isopentane을 증발시키며, 여기에는 약 15~20분이 소요됩니다.조직이 건조되면 호일로 빠르게 감싸고, 섹셔닝(sectioning)이 가능할 때까지 -80 °C 냉동고에 보관하십시오. 섹셔닝 전에, 냉동된 조직을 드라이아이스에 실어 크라이오스탯(cryostat)으로 운반하십시오.조직을 -24°C에서 -20°C 사이로 설정된 크라이오스탯 챔버로 옮기고 30분 동안 평형을 유지합니다. 이 온도에서 조직은 완전히 해동되지 않습니다. 다음으로, 조직을 먼저 포매합니다.사용 가능한 경우, Peltier Bay 냉각 기능을 켭니다. 둘째, 시료 디스크 위에 OCT를 균일하고 얇게 도포하고 냉각시킵니다. 셋째, OCT의 바닥면은 얼었으나 윗면은 여전히 액체 상태일 때 조직을 삽입하며, 횡단면의 경우 조직을 OCT와 수직이 되게 배치하고 종단면의 경우 OCT와 평행하게 배치하여 방향을 잡습니다.이제 에어로졸 냉각 스프레이를 사용하여 OCT를 빠르게 동결시킵니다. 그런 다음 열 추출기로 조직의 동결되지 않은 부분을 터치하고 45초 동안 조직에 유지합니다. 이 과정의 어떤 단계에서도 근육이 해동되지 않도록 주의하십시오.크라이오스탯(cryostat)에 펠티어 베이 냉각(peltier bay cooling) 기능이 없는 경우, 에어로졸 냉각제를 사용하여 조직 주변의 OCT를 빠르게 동결시키십시오. 이제 근육 주변에 OCT를 얇게 한 층 더 추가하고 에어로졸 냉각 스프레이를 뿌린 후, 이전 단계와 같이 열 추출기로 열을 제거합니다. 전체 근육이 다 덮일 때까지 소량씩 OCT를 계속 추가하고, 에어로졸 냉각 스프레이와 열 추출기를 병용하여 OCT를 빠르게 동결시키십시오.그런 다음 조직 블록 상단에 열 추출기를 놓고 5분 동안 기다린 후 절편 제작을 진행합니다. 이제 검체를 검체 헤드에 장착할 준비가 되었습니다. 먼저 노브를 조여 디스크를 고정하십시오.챔버 온도가 -24°C에서 -20°C 사이에 도달하는 동안 시편 디스크가 시편 헤드에 잘 밀착되어 있는지 확인하십시오. 챔버가 설정 온도에 도달하면 절편 두께를 7 µm로 설정하고 블록 트리밍을 시작하십시오. 조동나사와 미동나사를 사용하여 블록을 이동시키십시오.절편을 수집할 준비가 되면, 절편의 상단을 램프로 가열하여 양전하를 띤 슬라이드 위에 눌러 부착합니다. 올바르게 동결되었다면 조직면은 분필 같은 흰색으로 보여야 합니다. 하지만 동결이 제대로 되지 않았거나 마운팅 과정에서 해동된 조직은 붉은색 또는 분홍색으로 나타납니다.슬라이드는 향후 분석을 위해 초저온 냉동고에 보관할 수 있습니다. 조직의 중간 복부 섹션은 이미징 소프트웨어 패키지의 트레이싱 기능을 사용하여 위상차 이미지로부터 단면적을 측정함으로써 식별할 수 있습니다. 이 분석을 통해 면적과 최소 페렛 직경(minimum ferret diameter) 측정값을 모두 얻을 수 있습니다.이 측정값들이 정체되기 시작하면 복부 중앙에 도달한 것입니다. 제조업체에서 대부분의 염색 프로토콜에 대한 단계별 지침을 제공하지만, 최적의 염색 강도를 얻기 위해서는 개인적인 최적화 과정이 필요할 수 있습니다. OCT는 제거할 필요가 없습니다.최적의 면역 염색을 위해서는 습윤 챔버를 반드시 사용하십시오. 섹션의 건조를 방지하기 위해 젖은 페이퍼 타월 위에 파라필름을 덮고 작은 상자 안에 밀봉하여 보관해야 합니다. 면역 염색을 하지 않는 영구 표본 슬라이드의 염색 과정에서는 염색 프로토콜에 따라 농도가 높아지는 알코올 시리즈를 통해 슬라이드를 탈수시키십시오.마운팅 매질은 물과 섞이지 않으므로, 슬라이드를 100% xylene에 5분 동안 담가 투명하게 만듭니다. 이렇게 하면 시간이 지나도 슬라이드가 불투명해지는 것을 방지할 수 있습니다. 그런 다음, 염색된 전경골근 복부 중앙 부위의 절편을 마운팅하고 이미징하는 과정을 진행합니다.헤마토실린과 에오신을 사용합니다. 적절하게 처리된 절편은 일관된 형태를 보이며 전체적으로 균일하게 염색됩니다. 반면, 냉동 손상이 발생했거나 조기에 해동되어 부적절하게 처리된 근육은 형태적으로 여러 군데 끊어짐이 나타나며 찢어진 밀(shredded wheat)과 같은 모습으로 보입니다.이 절편들을 대상으로 면역조직화학 염색도 수행하였습니다. 염색 결과는 만족스러웠습니다. Fibronectin은 녹색으로 염색되었으며, dappy는 청색으로 관찰됩니다.이 영상을 시청한 후, 근육 구조 평가를 위해 근육 생검 조직으로부터 양질의 동결 절편을 제작하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 기술을 숙달하고 모든 단계를 적절히 수행한다면, 전체 과정은 약 4~5시간 내에 완료할 수 있습니다. 본 절차를 수행하는 동안, 시술 후 근육 조직이 해동되지 않도록 주의하는 것이 중요합니다.성장 및 재생과 같은 추가적인 질문에 답하기 위해 면역 염색 및 인시튜 하이브리다이제이션(in situ hybridization)과 같은 다른 방법들을 수행할 수 있습니다.

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연구

JoVE Journal

Medicine

의학

플래시 마우스 배아 뇌 조직을 동결 sectioning위한 방법은 다음과 같습니다이 비디오에서 보여주었다. 그라 이오 스탯를 사용하기위한 유용한 팁을은 결과 조직의 섹션 균열 및 기타 왜곡 무료로되는 것을 보장하기 위해 절단하는 동안 사용할 수있는 문제 해결 방법을 포함하여 제공됩니다.

플래시 동결 E12.5 마우스 브레인 Cryosectioning

이 비디오는 근육 조직을 스냅 동결하고 얇은 부분을 얻는 절차를 설명합니다. 이 기술은 대장암 마우스 모델에서 암 관련 악액질을 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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