공 초점 광학 이미징에 의해 로즈 벵갈 Photothrombosis 생체 : 단일 선박 스트로크의 모델

여기에서는 생체 내 마우스의 체성 감각 피질에서 Rose Bengal 광혈전 혈전을 유도하기 위한 반침습적 광학 현미경 접근 방식을 설명합니다. 이미징 절차의 기술적 측면은 광혈전 이벤트의 유도에서 적용 및 데이터 수집에 이르기까지 설명됩니다.

이 절차의 전반적인 목표는 반침습적 광학 현미경 접근 방식을 사용하여 마우스의 체성 감각 피질에서 로즈 벨 광혈전 혈전성 혈전을 유도하는 것입니다. 이는 마우스를 마취하고 이미징을 위해 얇은 두개골 두개골 창을 준비함으로써 수행됩니다. 다음으로, 로즈 벵갈을 주입하고 레이저를 사용하여 광 혈전증을 유도합니다.

궁극적으로, 로즈 벵골 광혈전증에 의해 만들어진 혈전의 영향은 마취에서 회복된 후 즉시 분석될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 로즈 벵골 광혈전증이 유도된 직후 생체 내 세포 반응을 볼 수 있다는 것입니다. 이 기술을 처음 접하는 개인은 어렵고 시간이 많이 걸리기 때문에 얇은 두개골 창을 만드는 데 어려움을 겪을 수 있습니다.

시작하려면 산소와 혼합 된 불소 2-3 %로 마우스를 마취하십시오. 마우스가 유도됨에 따라 호흡이 감소하는 것에 유의하십시오. 그런 다음 마우스의 발을 꼬집습니다.

마취 상태를 확인하려면 발열 패드와 온도 프로브를 사용하여 시술 내내 체온을 섭씨 37도의 절반 이내로 유지하십시오. 그런 다음 안과 연고를 바르고 동물의 바이탈을 모니터링합니다. 산소 측정 시스템을 꼬리나 발에 끼웁니다.

분당 50-65회 호흡과 분당 300-450회 사이의 심박수를 유지하도록 마취제를 조정하십시오. 산소 포화도는 이상적으로 97-98%로 유지된다.이러한 모든 매개변수가 유지되면 장기 생존이 가능합니다. 마지막으로 수술을 위해 피부를 준비합니다.

두개골에서 수염을 면도하고 베타딘을 반복적으로 문지른 다음 에탄올을 사용하여 피부를 청소합니다. 두피를 5mm 절개하여 두개골 균열을 드러내는 것으로 수술을 시작합니다. 면봉으로 위에 있는 근막을 제거하고 bgma를 찾습니다.

다음 접착제. 두정엽 피질 위에 있는 뼈에 맞춤 제작된 스테인리스 스틸 링. bma에서 이 위치를 매핑하여 수평으로 음수 1-3mm, 양수 2-4mm를 수평으로 이동합니다.

2분 후에 접착제가 굳습니다. 그런 다음 동물을 안정시키기 위해 반지를 입체 홀더에 부착하십시오. 이제 수술 등급의 해부 현미경으로 체성 감각 피질 위의 두개골에 1-2mm 섹션을 천천히 뚫고 지그재그 드릴링 패턴을 사용하여 열이 발생하는 것을 방지하기 위해 드릴로 뚫을 때 두개골 높이를 유지하십시오.

드릴을 저속으로 사용하고 뼈가 빛나기 시작할 때 자주 휴식을 취하십시오. 두개골을 얇게 만들기 위해 지그재그 패턴으로 계속 드릴링하십시오. 얇은 두개골 창은 레이저가 장미 벵골로 채워진 혈관에 도달하여 혈전을 유도하는 데 중요합니다.

창이 충분히 얇아지면 메스를 사용하여 가벼운 압력으로 작은 선형 스트로크를 만들어 안구를 통해 혈관 구조가 명확하게 보일 때까지 얇은 뼈 층을 제거합니다. 뇌를 이미지화하려면 대물렌즈와 스테이지 사이에 동물이 플랫폼에 들어갈 수 있는 충분한 공간이 있는 현미경을 사용합니다. 반전된 스코프를 선택하는 것이 좋습니다.

이 플랫폼은 4개의 극이 있는 플레이트에 장착된 잭으로 구성된 맞춤형 스테이지에 맞도록 설계되었습니다. 마우스가 s에 배치된 후tage, 대물렌즈 인버터를 두개골 창 위에 배치한 다음 외부 광원으로 두개골을 비춥니다. 수성 대물렌즈를 사용하는 경우, 대물렌즈를 낮출 수 있는 두개골 창강에 인공 CSF를 적용해야 합니다.

이제 혈관 구조가 보이는 이미징 영역에 초점을 맞춥니다. 마우스를 현미경에 설정한 후 인공 CSF에 밀리리터당 20mg의 필터로 신선한 로즈 벵갈을 준비하고 혼합물을 살균하고 실험이 완료된 후 폐기합니다. 항상 신선하게 사용해야 합니다.

이제 561 나노미터 레이저로 두개골 창을 스캔하는 동안 꼬리 정맥을 통해 혼합물 0.1ml를 주입합니다. 5초 이내에 염료가 두개골 혈관 구조에서 쉽게 보일 수 있습니다. 충분한 염료를 주입한 후 혈전증을 위해 40-80미크론 혈관을 선택합니다.

동맥은 큰 혈관에서 작은 혈관으로의 흐름에 따라 정맥과 구별할 수 있으며 그 반대의 경우도 마찬가지입니다. 이제 선택한 용기를 레이저로 연결할 준비를 합니다. 사용 중인 시스템에 적합한 것으로 체류 시간을 늘립니다.

레이저 출력을 100%로 높이고 이미지 컬렉션을 초당 1프레임으로 설정합니다. 최대 스캔 속도로 스테이플 응고가 형성될 때까지 마우스를 스캔합니다. 일반적으로 이 작업은 약 5분 정도 걸립니다.

이상적으로는 혈전을 생성하기 위해 하나의 시야만 스캔해야 하며, 그에 따라 대물렌즈를 선택합니다. 혈전이 형성되지 않으면 혈전이 형성된 후 더 많은 염료를 사용해 보십시오. 이미징 영역에서 마우스를 제거하고 해부 현미경으로 수술을 완료할 준비를 합니다.

먼저 출혈 여부를 확인하면서 링을 조심스럽게 제거합니다. 출혈이 발생하면 실험을 종료해야 합니다. 다음으로 식오 봉합사를 사용하여 절개 부위를 봉합한 다음 절개 라인에 항생제를 바르면 통증이 완화됩니다.

bnx의 첫 번째 주사 후 3일 동안 bup printex의 피하 주사를 제공합니다. 마우스를 회수실에 넣고 보행할 수 있을 때까지 모니터링합니다. 그런 다음 청소해야 하는 가정용 케이지로 다시 넣으십시오.

종방향 이미징은 텍스트 프로토콜에 자세히 설명되어 있습니다. 이 프로토콜을 사용하여 뇌졸중은 두개골 혈관과 혈전을 형성하여 유도되었습니다. 혈전 형성은 몇 분에 걸쳐 진행되었습니다.

처음에는 혈관이 완전히 하얗고 자유롭게 흐르는 장미 벵골 염료를 점차적으로 조사하여 반응성 산소 종을 생성하여 혈전 형성을 유도하는 면역 반응을 활성화했습니다. 혈관의 완전한 폐색은 응고의 상류에 있는 혈관에 장미 벵골(rose Bengal)이 축적됨으로써 관찰되었습니다. 허혈성 뇌졸중이 혈전에 의해 발생했음을 확인합니다.

TTC 염색은 뇌경색을 감지하는 데 사용되었습니다. 건강한 조직은 제품에 붉은 형태를 형성합니다. 경색된 부위는 반응하지 않고 하얗게 유지되지만, 시술 후 5일이 지나면 뇌졸중의 징후가 분명하게 드러났습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 이 절차에 따라 온전한 마우스에서 마우스를 준비하고 장미 벵골 광혈전증을 유도하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. flow four와 같은 다른 이미징 염료로 뇌를 로드하는 것과 같은 다른 방법은 다음과 같은 추가 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 칼슘은 허혈성 사건에 어떻게 반응합니까?