흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착

본 절차의 전체적인 목표는 E 13 또는 E 18 흉선 정착 전구세포에 의해 생성된 T 세포의 수와 표현형 역학을 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 E 13, E 14 및 E 18 마우스 배아에서 흉선엽을 분리합니다. 두 번째 단계에서는 E 14 흉선엽을 조사한 후, 유세포 분석으로 분류한 E 13 또는 E 18 세포를 행잉 드롭(hanging drop) 방식으로 48시간 동안 정착시킵니다.

마지막 단계로, 세포가 정착된 엽을 성체 CD3 결핍 마우스의 신장 피막 아래에 이식합니다. 최종적으로, 유세포 분석법을 사용하여 키메라 동물의 혈액 내에서 E13 및 E18 흉선 정착 전구세포 자손의 존재 여부를 평가할 수 있습니다. 이 기술이 iPSC 세포 상의 인비트로(in vitro) T 세포 배양과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 정의된 전구세포로부터 3차원 분석법을 통해 완전한 T 세포 성숙을 가능하게 하는 방법과 온전한 수용 마우스로의 흉선 기관 배양 이식 방법을 결합함으로써, 흉선 슬라이스 전구세포 및 그 자손의 분화와 기능을 평가할 수 있다는 점입니다.

설치류 수술 전문 연구 엔지니어로서, 저는 이 절차를 시연하겠습니다. 이식 실험 2일 전, 층류 후드 내에서 임신한 암컷 생쥐의 복부를 70% ethanol로 소독하고 정중선 피부를 따라 세로로 절개하십시오. 피부를 양옆으로 당겨 절개 부위를 연 뒤, 핀셋과 가위로 소화관을 건드리지 않고 복막을 엽니다. 다음으로 갈래 자궁을 꺼내 가위로 질과 분리하십시오. 그런 후 40 to 50 milliliters의 DPBS가 담긴 90 by 15 millimeter 페트리 접시에 자궁을 놓고, 각 배아의 탈락막 사이를 가로 방향으로 절단하십시오.

미세 팁 가위와 미세 핀셋을 사용하여 태반과 난황낭 사이를 절개함으로써 자궁의 근육막을 제거하고 각 배아를 꺼냅니다. 그런 다음 배아를 보존하면서 양막을 제거하고, HBSS에 1% FCS가 첨가된 새 페트리 접시에 배아를 넣습니다. 흉선을 분리하기 위해, 쌍안 확대경 아래에서 배아를 하나씩 똑바로 눕힌 자세로 배치합니다.

그 다음 핀셋 하나를 흉골 연골을 따라 세로로 삽입하고, 곡선 핀셋을 사용하여 흉곽을 집어 벌립니다. 흉벽을 옆으로 당겨 기관 양측에 있는 흉선 엽을 확인합니다. 그런 다음 미세 핀셋으로 흉선 아래쪽을 집어 각 엽을 조심스럽게 제거한 후, 1% FCS가 첨가된 1 mL의 HBSS가 담긴 페트리 접시에 넣습니다.

다음으로, 두 개의 미세 핀셋을 사용하여 엽(lobe)에 손상을 주지 않으면서 주변의 결합 조직을 제거합니다. 그런 다음 3 mL의 1% FCS가 첨가된 HBSS로 엽을 세척하여 적혈구를 제거함으로써, 방금 시연한 바와 같이 CD 45.2 배아에서 분리한 E 14 흉선 엽의 태아 흉선 기관 배양 조사를 시작합니다.

엽(lobe)을 약 3시간 동안 휴지시킵니다. 그다음 갓 분리한 E 13 또는 E 18 흉선 정착 전구세포(thymic settling progenitors)를 원심 분리합니다. 펠릿(pellet)을 배양 배지에 재현탁하여 최종 농도가 배지 35 µL당 500 cells가 되도록 합니다.

그 다음 60웰 테라사키 플레이트(Terasaki plate)의 매 짝수 웰에 세포 현탁액 35 µL를 한 방울씩 떨어뜨리고, 각 방울의 표면에 조사된 엽(lobe) 하나를 플레이팅합니다. 플레이트를 닫고 뒤집어 세포들이 중력에 의해 방울의 정점에 도달하게 하며, 뒤집힌 플레이트의 윗면을 가볍게 쳐서 엽이 방울의 정점 가장자리까지 미끄러져 내려가도록 합니다. 그런 다음 뒤집힌 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건의 습윤 배양기에서 48시간 동안 배양합니다.

흉선 엽에 정착이 완료되면, 반사 반응이 없는지를 통해 수혜 동물의 마취 수준을 확인하십시오. 그런 다음 각 눈에 안연고를 한 방울씩 바르고, 마우스를 층류 후드 아래에서 오른쪽으로 눕힙니다. 이어서 뒷다리 관절 바로 윗부분의 수술 부위를 면도하십시오.

다음으로, 멸균 장갑을 착용하고 70% ethanol과 10% IOD DY DER 용액으로 수술 부위를 소독합니다. 메스를 사용하여 피부 조직을 통해 1.5 centimeter 절개하고, 이어서 근육 조직을 절개합니다. 이제 절개 부위의 양측에 가벼운 압력을 가해 신장을 복강 밖으로 밀어내고, 생리식염수로 신장이 건조해지지 않도록 유지합니다.

면봉을 사용하여 신장을 후복막강 밖으로 유지한 상태에서, 두 개의 미세 핀셋으로 피막에 2~3mm 크기의 구멍을 냅니다. 그 다음 피막 벽을 벌린 채로 최대 6개의 흉선 엽 이식편을 신장 극의 가장자리 방향으로 조심스럽게 밀어 넣고, 신장을 다시 후복막강 내에 배치합니다. 근육을 봉합한 후 피부를 개별 외과용 매듭으로 봉합합니다.

그런 다음 상처 부위를 10% 포비돈 요오드 용액으로 적시고, 마우스를 37 °C 가열 패드 위에 올려둔 뒤, 동물과 수술 부위가 모두 완전히 회복될 때까지 관찰하여 정착 전구세포의 발달을 위해 내인성 흉선세포를 제거하는 최적의 방법을 결정합니다. 본 실험에서는 방사선 조사 또는 5일간의 deoxy guine 처리 후 정착된 흉선 엽의 T세포 재구성 수준을 비교하였습니다. 배양 9일 차에는 정착 림프구 수에 차이가 나타나지 않았으나, 12일 차에는 방사선 조사된 엽이 deoxy guine 처리된 엽보다 더 많은 T세포를 포함하고 있어, T세포 발달을 촉진하기 위한 흉선 정착 후의 선호되는 처리 방법은 방사선 조사인 것으로 나타났습니다. E 13 및 E 18 흉선 정착 전구세포의 발달 잠재력을 연구하기 위해, E 14 방사선 조사 흉선 엽에 두 유형의 전구세포를 동일한 수로 정착시킨 결과, 관찰된 바와 같이 E 13 흉선 정착 전구세포는 E 18 흉선 정착 전구세포보다 더 적은 수의 흉선세포와 이중 양성 T세포를 생성하였습니다.

그러나 성숙한 CD3 양성 세포의 빈도는 증가했으며, 수지상 상피 T 세포의 생성은 E 13 흉선 정착 전구세포의 후손에서만 검출되었습니다. E 13 및 E 18 흉선 정착 전구세포의 생체 내 잠재력을 분석하기 위해, 각 유형의 전구세포가 군락을 형성한 흉선 엽을 CD3 결핍 수용자의 신장 캡슐 아래에 이식했습니다. 방금 입증된 바와 같이, 예상대로 E 13 흉선 정착 전구세포는 E 18 전구세포보다 T 세포를 더 빠르게 생성했지만, 전반적으로 E 13 흉선 정착 전구세포가 군락을 형성한 동물에서 순환 T 세포의 수는 유의하게 더 낮았습니다. 이 기술의 발전 이후, 발달 면역학 분야의 연구자들은 포유류 모델에서 일부가 엄격하게 배아 기원을 갖는 T 세포 서브셋의 특성을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.

이 영상을 시청하고 나면, 자연 환경 및 경쟁 조건 하에서 Timex settling progenitor와 그 후손의 분화 및 기능적 경로를 추적하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.