흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착 생체와 체외 분석 실험
2015년 6월 9일
이 기사는 T 세포 자손의 생성, 표현형 및 수의 동역학을 분석하여 흉선 침전 전구 세포를 특성화하는 생체 내 및 시험관 내 방법론에 대해 설명합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 E 13 또는 E 18 흉선 침전 전구 세포에 의해 생성되는 T 세포의 수와 생성의 표현형 역학을 분석하는 것입니다. 이것은 먼저 E 13, E 14 및 E 18 마우스 배아에서 흉선엽을 분리함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 E 14 흉선엽에 방사선을 조사한 다음 매달린 방울에서 48시간 동안 E 13 또는 E 18 세포를 정렬하여 유동적으로 집락화합니다.
마지막 단계에서, 집락화된 엽은 성체 CD 3 녹아웃 마우스의 신장 캡슐 아래에 이식됩니다. 궁극적으로, 유세포 분석은 키메라 동물의 혈액에서 E 13 및 E 18 흉선 침전 전구 자손의 존재를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. ine so 세포에 대한 시험관 내 T 세포 배양과 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 이 기술이 3차원 분석에서 정의된 전구세포로부터 완전한 T 세포 성숙을 허용하는 방법과 온전한 수용 마우스에서 흉선 장기 장기 배양 이식을 결합하여 흉선 세포 전구 세포와 자손의 분화 및 기능을 평가할 수
있다는 것입니다.설치류 수술 전문 연구 엔지니어로서 층류 후드에서 이식 실험 이틀 전에 임신 한 암컷 마우스의 복부에 70 % 에탄올을 투여하고 정중선 피부를 세로로 절개하고 피부를 당겨 절개 부위를 연 다음 집게와 가위를 사용하여 소화관을 건드리지 않고 복막을 엽니 다. 다음으로 이분궁을 꺼내 가위를 사용하여 질에서 분리합니다. 그런 다음 40-50밀리리터의 DPBS가 들어 있는 90 x 15mm 페트리 접시에 자궁을 넣고 각 배아의 데시두아 사이를 가로로 자릅니다.
가는 가위와 가는 집게를 사용하여 자궁의 근육막을 제거하고 태반과 난황낭 사이를 절단하여 각 배아를 꺼냅니다. 그런 다음 배아를 유지하고 있는 양막을 제거하고 HBSS와 1%FCS가 함유된 새 페트리 접시에 배아를 넣습니다. 흉선을 분리하려면 배아를 양안 확대경 아래 누운 자세로 한 번에 하나씩 놓습니다.
그런 다음 흉골 연골을 따라 집게 하나를 세로로 삽입하고 구부러진 집게를 사용하여 흉부 격자를 꼬집어 엽니다. 흉벽을 옆으로 당겨 기관 양쪽에 있는 흉선엽을 시각화합니다. 그런 다음 가는 집게로 흉선 아래를 꼬집어 각 엽을 조심스럽게 제거하고 HBSS 1ml와 1%FCS가 들어 있는 페트리 접시에 넣습니다.
그런 다음 두 개의 가는 집게를 사용하여 엽을 손상시키지 않고 주변 결합 조직을 제거합니다. 그런 다음 HBSS 3ml와 1% FCS로 엽을 세척하여 적혈구를 제거하고 태아 흉선 장기 배양을 조사하기 시작합니다. 방금 시연된 바와 같이 CD 45.2 배아에서 분리된 E 14 흉선엽.
엽을 약 3시간 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 갓 분류된 E 13 또는 E 18 흉선 침전 전구 세포를 스핀다운합니다. 펠릿을 배양 배지에서 35마이크로리터의 배지당 500세포의 최종 농도로 다시 현탁시킵니다.
그런 다음 60웰 테라사키 플레이트의 다른 모든 웰에 35마이크로리터의 세포 현탁액을 떨어뜨리고 각 방울의 표면에 조사된 엽 하나를 플레이트합니다. 플레이트를 닫고 거꾸로 뒤집어 세포가 중력에 의해 낙하의 정점 극에 도달하도록 하고 반전된 플레이트의 위쪽을 부드럽게 두드려 로브가 방울의 정점 가장자리로 미끄러지도록 합니다. 그런 다음 거꾸로 된 플레이트를 가습 인큐베이터에서 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 48시간 동안 배양합니다.
흉선엽이 군락화된 후, 반사 반응이 부족하여 수용 동물의 마취 수준을 확인합니다. 그런 다음 각 눈에 안고 연고 한 방울을 바르고 마우스를 층류 후드 아래 오른쪽에 놓습니다. 그런 다음 뒷다리 관절 바로 위의 수술 부위를 면도합니다.
다음으로, 멸균 장갑 한 켤레를 수행하고 70% 에탄올과 10% IOD DY DER 용액으로 수술 부위를 살균합니다. 메스를 사용하여 피부 조직을 1.5cm 절개한 다음 근육 조직을 절개합니다. 이제 절개 부위 양쪽에 약간의 압력을 가하여 신장을 복강 밖으로 밀어내고 식염수로 신장을 촉촉하게 유지합니다.
후복강(retroperitoneal cavity) 바깥쪽에 면봉으로 신장을 유지하고, 두 개의 가는 집게를 사용하여 캡슐에 2-3mm의 구멍을 뚫습니다. 그런 다음 캡슐 벽을 열고 신장 기둥 가장자리 아래로 최대 6개의 흉선 이식편을 조심스럽게 밀어 넣고 신장을 후복강에 다시 놓습니다. 신경증을 일으키는 근육을 봉합한 후 개별 외과 의사의 매듭으로 피부 봉합을 합니다.
그런 다음 10% 요오드화물 포비돈 용액으로 상처를 적시고 마우스를 섭씨 37도의 가열 패드에 놓고 동물과 수술 상처가 모두 완전히 회복될 때까지 모니터링하여 집락화 전구 세포의 발달을 위해 내인성 흉선세포를 고갈시키는 가장 좋은 방법을 결정합니다. 이 실험에서는 방사선 치료 또는 5일간의 데옥시귄(deoxy guine) 치료 후 집락화된 흉선엽에서 T세포 재구성 수준을 비교했습니다. 배양 9일째에는 집락화하는 림프구의 수에 차이가 없었지만, 방사선 조사된 엽에는 12일째에 데옥시귄으로 처리한 것보다 더 많은 T세포가 포함되어 있어 E 13 및 E 18 흉선 정착 전구세포의 발달 가능성을 연구하기 위해 흉선 집락화 후 T세포 발달을 촉진하기 위해 방사선 조사가 선호되는 치료법입니다. E 14 방사선 조사된 흉선엽은 관찰된 바와 같이 두 가지 유형의 전구세포와 동일한 수로 집락화되었으며, E 13 흉선 침전 전구세포는 E 18 흉선 침전 전구세포보다 더 적은 흉선세포와 이중 양성 T 세포를 생성했습니다.
그러나 성숙한 CD 3 양성 세포의 빈도는 증가하였고, 수지상 상피 T 세포의 생산은 E 13 및 E 18 흉선 침전 전구세포의 생체 내 전위를 분석하기 위해 E 13 및 E 18 흉선 침전 전구세포의 생체 내 전위를 분석하기 위해 검출되었으며, 각 유형의 전구 세포와 함께 집락화된 흉선엽을 CD 3개의 녹아웃 수용자의 신장 캡슐 아래에 이식하였다. 예상대로 시연되었습니다. E 13 흉선 침전 전구 세포는 E 18 전구 세포보다 T 세포를 더 빨리 발생시켰지만, E 13 흉선 정착 전구 세포의 수는 전체적으로 식민지 동물에서 현저히 낮았습니다. 개발 후, 이 기술은 발달 면역학 분야의 연구자들이 T 세포 부분 집합의 특성을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다. 그 중 일부는 포유류 모델에서 엄격한 배아 기원입니다.
이 비디오를 시청한 후에는 타이멕스가 자연 환경과 경쟁 조건에서도 조상과 자손을 정착시키는 차별적이고 기능적인 경로를 추적하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
이 기사는 체내 및 체외 기술을 통해 흉선 정착 조상 세포 및 그들의 T 세포 후손을 분석하는 방법론을 설명합니다. 이 연구는 이러한 조상 세포에서 생성된 T 세포의 생성 동태, 표현형, 그리고 수에 중점을 둡니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 면역학
- 세포 생물학
- 발달 생물학
배경
- 흉선 정착 조상 세포는 T 세포 발달에 중요한 역할을 합니다.
- 그들의 동태와 분화를 이해하는 것은 면역학 연구에 필수적입니다.
- 이 연구는 마우스 배아를 이용하여 이러한 조상 세포를 탐구합니다.
- 기존 방법은 정의된 조상 세포로부터 T 세포를 완전히 성숙시키는 능력이 부족합니다.
연구 목적
- 흉선 정착 조상 세포를 특성화하는 것.
- 조상 세포의 T 세포 후손의 생성과 표현형을 분석하는 것.
- 기존의 체외 T 세포 배양 방법을 개선하는 것.
사용된 방법
- E 13, E 14, 그리고 E 18 마우스 배아로부터 흉선 엽의 분리.
- E 14 흉선 엽의 조사 후 flow sorted E 13 또는 E 18 세포로의 침범.
- 성체 CD 세 결핵 마우스의 신 캡슐 아래 침범된 엽의 이식.
- 키메라 동물의 혈액 속 T 세포 후손의 존재를 평가하기 위한 흐름 세포 분석.
주요 결과
- 이 방법론은 정의된 조상 세포로부터 완전한 T 세포 성숙을 가능하게 합니다.
- 흉선 조상 세포의 분화와 기능의 성공적인 평가.
- 키메라 마우스 내 E 13 및 E 18 후손의 존재 증명.
- T 세포 발달 역학에 대한 이해 향상.
결론
- 이 기술은 T 세포 성숙을 연구하는 새로운 접근 방법을 제공합니다.
- 이는 포괄적인 분석을 위한 체외 및 체내 방법론을 연결합니다.
- 연구 결과는 흉선 조상 세포 생물학에 대한 이해에 기여합니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Understanding thymic progenitor kinetics enables predictive modeling of T-cell reconstitution in lymphopenic settings, informing cell therapy design. The method bridges in vitro progenitor assessment with in vivo functional validation, reducing mechanistic ambiguity in early immunotherapeutic target validation. This supports de-risking of hematopoietic stem cell and progenitor-based strategies by clarifying developmental timelines and subset-specific output.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of progenitor-intrinsic differentiation potential by isolating E13 and E18 thymic settling progenitors to assess autonomous T-cell lineage commitment.
- Operational Value: Uses CD45 allotypic markers to distinguish progenitor inputs without genetic manipulation, preserving native phenotype for accurate functional comparison.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: The hanging drop colonization assay provides a standardized, reproducible 3D microenvironment to quantify progenitor engraftment and early thymic seeding efficiency.
- Operational Value: Allows side-by-side comparison of progenitor batches under identical stromal conditions, minimizing niche variability and improving assay consistency across runs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables longitudinal tracking of mature T-cell output in vivo via grafting into immunodeficient hosts, revealing delayed but expanded E18-derived peripheral T-cell reconstitution not seen in short-term cultures.
- Operational Value: Supports assessment of durable immune reconstitution, a key predictor for long-term efficacy in T-cell replacement therapies.
Pipeline & Workflow Integration
This method situates progenitor characterization between early discovery (phenotypic screening) and preclinical validation, linking in vitro colony-forming potential to in vivo immune reconstitution metrics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by comparing progenitor subsets for intrinsic differentiation kinetics and subset bias, such as dendritic epithelial T-cell generation.
- Screening: Delivers quantitative engraftment and early colonization metrics under controlled stromal conditions, enabling progenitor batch comparability.
- Analytics: Employs flow cytometry to measure progeny phenotype, frequency, and temporal dynamics in blood and grafts, providing multiparametric readouts for comparative analysis.
- Translational Research: Connects progenitor input to functional T-cell output in vivo, enabling prediction of peripheral immune reconstitution kinetics and tissue colonization potential.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating hematopoietic or lymphoid progenitors across disease models, provided thymic stromal support and immunocompromised recipients are available.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking progenitor phenotype to defined T-cell outputs, including subset-specific maturation like dendritic epithelial T cells.
- Operational Value: Standardizes progenitor assessment via irradiation-conditioned thymic lobes and hanging drop colonization, improving inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions in progenitor-based therapies by predicting both speed and magnitude of T-cell reconstitution.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of progenitor sources based on developmental tempo and long-term output potential.
Implementation Considerations
- Requires expertise in mouse embryo dissection, thymic lobe isolation, and sterile surgical grafting under kidney capsule.
- Dependent on access to irradiated fetal thymic lobes, flow cytometry for progenitor sorting, and immunocompromised recipient strains (e.g., CD3−/−).
- Necessitates standardized hanging drop incubation conditions (37°C, 5% CO2, 48h) to ensure consistent progenitor-thymic lobe interaction.
- Requires validation of graft survival and lymphocyte egress to accurately assess peripheral T-cell reconstitution over time.
- Limited to murine systems; extrapolation to human progenitors requires cross-species thymic stromal compatibility testing.
