Name: 흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착 생체와 체외 분석 실험 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 56 s
Description: 배우세요 마우스 배아 흉선에서 전구 세포를 분리하고 방사선 처리 후 이식하는 방법을 통해 T 세포 분화와 기능을 분석하는 기술입니다. 이 실험은 면역학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

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파스퇴르 연구소, INSERM, 직원은 국립 드 공들인 ANR (그랜트 &#39;Lymphopoiesis&#39;), REVIVE 미래를위한 투자 프로그램 및 &quot;contre 르 암 라 리그&quot;에 의해 지원됩니다.

윤리 문 : 모든 실험은 프랑스 농업 장관의 승인을 파스퇴르 연구소 윤리 헌장에 따라 수행하고, 유럽 연합 (EU) 지침에 있었다. 농업의 프랑스 교육부의 인증을 작은 설치류 수술에 대한 교육과 조작은 모든 수술 개입을 수행한다. 주 : 5 단계 계획 순서를 나타내는 부록 표 1 참조. 태아의 1. 선택 <ol><li> 36 C57BL / 6 CD45.2의 여성, 12 여성의 CD45.1 12 C57BL / 6 CD45.1 남성 12 C57BL / 6 CD45.2 남성을 사용합니다. 남성 유전자형 중 하나와 여성을 횡단하는 것은 배아 CD45.1 / 2 및 CD45.1받는 사람 흉선 로브의 소스로 사용 TSP 또는 CD45.2의 소스로 사용 생성합니다. 하우스 개별적으로 모든 남성. </li><li> , E18 TSP 격리를위한 배아를 얻기 이십일일 이식 실험 전에 오후 6시에서 한 남성 CD45.1와 케이지 2 여성을 배치합니다. 정오 전에, 다음날 질 플러그의 존재를 확인합니다. SEPA연결 여성을 평가. </li><li> E14 배아를 얻기 위해하는 것은 TSP 식민지 될 17 일 이식 실험 전에 남성의 CD45.2를 사용하여, (1.2) 위의 절차를 반복합니다. </li><li> E13 TSP를 분리 배아를 얻기 위해 16 일 래프팅 실험 전에, 수컷 C57BL / 6 CD45.1를 사용하여, (1.2) 상기 절차를 반복한다. </li></ol> 수평 층류 후드에서 태아의 해부 (2) 참고 : 이식 실험 전에 두 일. <ol><li> 포화 밀폐 된 챔버 내에서 적어도 5 분 동안 자궁 전위에 의해 또는 CO 2 가스의 진보적 인 투여에 의해 임신 한 여성을 희생. 심장 - 호흡 운동의 결정적인 체포에 의해 죽음을 확인합니다. 70 % 에탄올로 복부 젖은. </li><li> 중간 선 복부의 피부에 세로 절개를 따로 따로 피부를 잡아 당겨 엽니 다. 소화 기관을 건드리지 않고 집게와 가위로 복막을 엽니 다. 이열 터의를 꺼냅니다우리는 가위로 질에서 분리합니다. </li><li> 40 ~ 50 ml의 DPBS를 포함하는 90 X 15mm 페트리 접시에 자궁를 놓고 각 배아의 탈락 사이에 횡 방향으로 절단. </li><li> 좋은 팁이 위의 쌍 미세 집게로, 자궁의 근육 막을 제거 태반과 난황 사이를 절단하여 배아를 꺼내와 배아를 유지하는 amnios을 제거합니다. </li><li> 페트리 접시에 배아를 배치 HBSS + 1 % 소 태아 혈청을 함유하는 90 X 15mm (FCS). E15보다 배아 나이가 들어 더 해부 전에 가위로 머리를 제거합니다. </li></ol> 흉선 3. 분리 <ol><li> 양안 확대 렌즈에서 젖은 거즈 침대에 누운 위치 (복부보기)에 누워, 배아를 놓습니다. </li><li> , 길이 방향으로 흉골의 연골을 따라 집게를 삽입 끼와 흉부 그리드를 엽니 다. 곡선 집게로, T를 시각화하기 위해 옆으로 흉부 벽을 당겨기관의 각 측면에 hymic 로브. </li><li> 조심스럽게 미세 집게로 아래 곤란하여 각 로브를 개최하고 1 ml의 HBSS + 1 % FCS를 포함하는 페트리 접시에 배치합니다. 로브를 분리하고 캡슐에 손상을주지 않고, 두 1ml를 주사기 + 26 G ⅜ &quot;바늘 주위의 결합 조직을 제거합니다. </li><li> 혈액 세포를 제거하기 위해 HBSS + 1 % FCS 3 ㎖에 로브를 씻는다. 참고 : E15 전에, 흉선 로브는 양방향 엽성 기관을 구성하는 중간에 기관 나중에 퓨즈의 각 측면에 있습니다. </li></ol> 4. 세포 현탁액 <ol><li> HBSS + 1 % FCS 1 ml를 주사기에 장착 된 두 개의 26 G 바늘로, 양안 확대 렌즈 아래 로브 떨어져 애타게. 나일론 메쉬를 통해 세포 현탁액을 필터. </li></ol> 형광 항체와 세포 정렬 5. 염색 참고 : 모든 항체는 이전에 인구의 최적의 정의 (titrat를 얻기 위해 적정있다이온) 항체의 배치에 따라 달라질 수 있습니다. <ol><li> 혈통 양성 세포를 염색하는 비오틴 항체의 칵테일의 100 μL와 4 ° C에서 15 ~ 30 분 동안 흉선 세포 (E13 또는 E18)을 품어 (항 CD19, 안티 GR1, 안티 Ter119, 안티 NK1.1 , 안티의 CD11c, 항 CD3, 안티 CD4, CD8 방지, 항 CD25). </li><li> 항체가 7 분 동안 280 XG에 4 ml의 HBSS + 1 % FCS와 튜브를 스핀 다운의 거리를 초과 씻어, 상층 액을 제거하고 다시 중단 신선한 HBSS + 1 % FCS의 펠렛을. 원심 분리를 반복합니다. </li><li> 4 ℃에서 15 분 동안 스트렙 타비 딘 마이크로 비드와 E18 비오틴 표지 세포를 품어 두 번 HBSS 1 % FCS에서 세포를 씻는다. 2 ㎖의 HBSS + 1 % FCS에 세포를 다시 일시. 대부분의 E13의 흉선 세포는 혈통 음 때문에 셀 정렬하기 전에 맥 농축이 필요하지 않습니다. </li><li> 제조업체의 지시에 따라, LS 컬럼상에서 세포를 전달. 모든 세포 현탁액 입력하면 열은 2 ㎖의 HBSS + 1 % FCS를 추가한다. 복구칼럼 4 ml를 280 x g에서 7 분 동안 세포를 원심 분리를 통해 흐르게. </li><li> 다시 중단 고갈 E18 또는 TSP 항체 믹스의 50 μL (항 CD117 APC, 안티 CD135 PE, 안티 CD127 PECy7, 항 CD24 FITC, 항 CD44 APCCy7과 스트렙 타비 딘 퍼시픽 블루 총 E13의 흉선 세포 중 하나의 펠렛을 )과 어둠 속에서 4 ° C에서 20 분 동안 품어. </li><li> 4 ㎖의 HBSS + 1 % FCS와 함께 세포를 씻어 1 ㎖의 HBSS에 요오드화 프로피 듐과 + 1 % FCS를 세포를 다시 일시. </li><li> 정렬의 TSP 린 - 200 μL 완전 배지 + 20 % FCS를 포함하는 1.5 ml의 튜브 상 (4 레이저와) 외과에서 CD44 + CD117 + CD24 낮은 CD127 + CD135 + 세포. 금융위원회와 SSC 채널 크기와 입도에 따라 게이트 먼저 세포. (요오드화 프로피 듐 염색) 죽은 세포, 게이트 밖으로 이중선을 제거 지수 저울에 형광 점수. 약 100 또는 600의 TSP는 하나 또는 하나 E13 E18 흉선, respectiv로부터 얻을 수있다엘리. </li></ol> 조상 6. 식민 E14의 흉선 로브 : 매달려 드롭 기술 <ol><li> (30 회색 = 30 Gy를) CD45.2 배아에서 E14 흉선 로브, 문화 전 3 시간을 조사. 참고 : E14 또는 E15 흉선 로브가 성공적으로 T 세포 전구 세포의 수신자로 사용되어왔다. 이전 임신 일에서 흉선 로브가 제대로 개발하는 동안 아마도 상피 세포의 불완전한 발달로 인해 기관의 더 큰 크기로 조기 괴사에 나중에 임신 일 결과를받는 사람 흉선 로브를 사용. </li><li> 원심 분리기의 TSP 재 일시 세포 배양 배지 (10 % FCS와 OPTI-MEM 완전 배지, 페니실린 (50 유닛 / ㎖), 스트렙토 마이신 (50 μg의 / ㎖), 2β 머 캅토 에탄올 (50 μM))를 정렬되도록 35 μL 500 TSP가 포함되어 있습니다. </li><li> 60 잘 테라 사키 판의 다른 모든 잘 세포 현탁액의 35 μL 드롭 놓습니다. 주 :이 연속 우물에 배치하는 경우 35 μL 방울을 융합 할 수 있습니다. </li><li> 각 방울의 표면에 하나 조사 로브를 놓습니다. 테라 사키 판을 닫고 세포가 중력에 의해 드롭의 혀끝 극에 도달 할 수 있도록 거꾸로 판을 켭니다. </li><li> 히트 부드럽게 반전 플레이트의 상부는 드롭의 혀끝의 가장자리로 밀어 로브를 강제로. 37 ° C ~ + 5 % CO 2에서 48 시간 동안 가습 인큐베이터에서 반전 테라 사키 판을 품어. 받는 사람 성인 마우스 (8)의 신장 캡슐에서 식민지, 중 문화 E14의 FTOC 7 thymi, 또는 이식 후. </li></ol> 7. 태아 흉선 장기 문화 <ol><li> 35mm 페트리 접시에 전체 매체의 3 ㎖를 놓습니다. 매체에 떠있는 isopore 멤브레인 필터를 놓습니다. 포셉 (한 막에 이하 8 로브)와 멤브레인의 가장자리에 재구성 로브를 놓습니다. </li><li> 식 수용 2 ㎖를 포함, 커버없이, 35mm 요리와 함께, 90mm 페트리 접시 안에 흉선 로브를 포함하는 배양 접시를 놓습니다R, 최적의 습도를 보장합니다. 37 ° C ~ + 5 % CO 2에서 십이일 품어. </li></ol> 무균 조건에서 신장 캡슐에서 8 이식 참고 : 신장 실질이 캡슐을 형성하는 결합 조직으로 둘러싸여 있습니다. 서브 캡슐 지역은 피함으로써 이식의 개발을위한 적합한 환경 (예 흉선 로브, 췌장 또는 신생아의 마음)을 제공하는 림프 혈관에 특히 풍부하다. 이 오른쪽 신장보다 더 접근하기 때문에 이식은 일반적으로 왼쪽 신장에서 수행된다. CD3 - / - 생쥐 수컷 E15 전에 성 결정이 용이하지 않기 때문에 수신자가 이에 의한 Y 염색체에 링크 부 조직 적합성 항원 이식편 대 숙주 반응을 피하기로 하였다. <ol><li> 기구를 소독하고 수술에 따른 멸균 장갑을 착용하십시오. 케타민 10 ㎎ / ㎖ + 크 실라 1의 Mg 용액의 복강 내 주사하여 마우스를 마취 /ml의 PBS 중에 희석 (10 g의 체중 당 50 내지 100 μL), 1 mL를 주사기를 사용. 인터 반사의 부족을 확인하여 마취를 확인합니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 각각의 눈에 수력 Optimune 젤 한 방울을 놓습니다. 참고 :이 솔루션은 즉흥적 준비하고 주입하기 전에 실온에서 예열한다. 마취는 적어도 20 분 동안 지속됩니다. 마취의 정도는 모든 수술 따라 조절되어야한다. 마취는 매 20 분 투여 량의 절반 복강 내 주사에 의해 연장 될 수있다. </li><li> 수평 얇은 흐름 후드 아래, 우측에 마우스를 놓습니다. 70 % 에탄올 및 10 % 요오드 용액으로 피부에 관한 수술 부위를 소독. 집게 부분으로 바로 뒷다리의 관절 위 2cm의 길이를 따라 마우스 머리. 수술 영역을 면도. </li><li> 메스와 가위가 근육 조직을 절단 한 다음에, 첫 번째, 피부 조직의 절개 1.5 cm 길이를 확인합니다. 절개의 양쪽에 약간의 압력을가, 복강에서 신장을 강제 것이다. </li><li> 촉촉한 신장을 유지하는면 버드와 식염수를 적용합니다. 당신이 장기 노출에 어려움이있는 경우, 신장이 부착 된 주변의 지방 세포 조직을 꺼내 평평한 집게를 사용합니다. 기관 아래에 배치 면봉에 의해 복막 캐비티 중 신장을 유지한다. </li><li> 이 미세 집게로, (출혈을 방지하기 위해 실질에 손이 닿지 않도록) 캡슐에서 2~3mm의 구멍을. 전체 수술 중 지속적으로 적신 노출 신장 캡슐을 유지합니다. </li><li> 연 캡슐의 벽을 유지함으로써, 신장 캡슐에서 조심스럽게 로브를 삽입하고 가장자리 극으로 캡슐에서 이식을 밀어 넣습니다. 신장 당 6 로브까지 놓습니다. </li><li> 역 복강의 신장을 교체합니다. 근육 aponeuroses, 개별 외과 매듭 후 피부를 봉합. 10 % 포비돈 요오드 용액으로 상처 젖은. 가열 된 PA에 마우스를 놓습니다37 ° C에서 D. </li><li> 심장, 호흡과 수염 운동, 자기가 볼 총 복구 움직임을 포함 할 때까지 점막 색상의 제어에 의해 마취에서 완전히 회복 될 때까지 이식 한 마우스를 조사. 참고 : 우리는 단지 수술 후 진통제 솔루션 (Buprenorphin, 0.1 ㎎ / ㎏) 내 근육 주사를 추천 2 일 수술 후 통증을 방지하기 위해 수술을 다음과 같습니다. </li><li> 완전히 회복 될 때까지 격리에서 운영하는 동물을 유지합니다. 확인하고 감염을 방지하기 위해 매일에게 상처의 바늘을 검사합니다. 이 절차에 따라 창상 감염을 관찰하지 마십시오. 참고 : CD3에서 말초 혈액 세포의 주간 분석 - / - 이식 생쥐 우리가 파생 인구가 CD45 allotypic 마커 및 T 세포 계보 특이 항체 (그림 3)를 사용하여 E13 또는 E18 전구 세포 하나에서 유래 흉선을 감지 할 수 있습니다. </li></ol> 유동 세포 계측법에 의한 TSP의 자손 9. 분석 <ol><l난&gt; 단일 세포 현탁액을 (프로토콜 (4) 참조) 얻기 위해 개별적으로 FTOCs을 애무 해줘. </li><li> 항체 혼합물 CD45.1 PECy7, CD45.2 AmCyan, CD4 APCCy7, CD8 APC, CD3 퍼시픽 블루, Vγ5 FITC, Vδ1 체육을 인식하는 항체를 포함하고 제 5 절에 설명 된대로 품어 개별 로브에서 얼룩 세포 현탁액. </li><li> HBSS에 + 1 % FCS + 프로피 디움 요오드화물을 세포를 다시 중단하고 (그림 2의 결과를 참조) 사이토 흐름을 분석 할 수 있습니다. </li></ol>

<ol><li>Rodewald, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymus organogenesis.</a> Annu Rev Immunol. 26, 355-388 (2008).</li>
<li>Takahama, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Journey+through+the+thymus%3A+stromal+guides+for+T-cell+development+and+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Journey through the thymus: stromal guides for T-cell development and selection.</a> Nat Rev Immunol. 6, 127-135 (2006).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J., Moore, N. C., Owen, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MHC+class+II-positive+epithelium+and+mesenchyme+cells+are+both+required+for+T-cell+development+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MHC class II-positive epithelium and mesenchyme cells are both required for T-cell development in the thymus.</a> Nature. 362, 70-73 (1993).</li>
<li>Douagi, I., Andre, I., Ferraz, J. C., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+T+cell+precursor+activity+in+the+murine+fetal+thymus%3A+evidence+for+an+input+of+T+cell+precursors+between+days+12+and+14+of+gestation%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Characterization of T cell precursor activity in the murine fetal thymus: evidence for an input of T cell precursors between days 12 and 14 of gestation.</a> Eur J Immunol. 30, 2201-2210 (2000).</li>
<li>Calderon, L., Boehm, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergistic%2C+context-dependent%2C+and+hierarchical+functions+of+epithelial+components+in+thymic+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Synergistic, context-dependent, and hierarchical functions of epithelial components in thymic microenvironments.</a> Cell. 149, 159-172 (2012).</li>
<li>Adolfsson, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Flt3%2B+lympho-myeloid+stem+cells+lacking+erythro-megakaryocytic+potential+a+revised+road+map+for+adult+blood+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of Flt3+ lympho-myeloid stem cells lacking erythro-megakaryocytic potential a revised road map for adult blood lineage commitment.</a> Cell. 121, 295-306 (2005).</li>
<li>Kondo, M., Weissman, I. L., Akashi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clonogenic+common+lymphoid+progenitors+in+mouse+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of clonogenic common lymphoid progenitors in mouse bone marrow.</a> Cell. 91, 661-672 (1997).</li>
<li>Bhandoola, A., von Boehmer, H., Petrie, H. T., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commitment+and+developmental+potential+of+extrathymic+and+intrathymic+T+cell+precursors%3A+plenty+to+choose+from%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Commitment and developmental potential of extrathymic and intrathymic T cell precursors: plenty to choose from.</a> Immunity. 26, 678-689 (2007).</li>
<li>Ramond, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+waves+of+distinct+hematopoietic+progenitor+cells+colonize+the+fetal+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two waves of distinct hematopoietic progenitor cells colonize the fetal thymus.</a> Nat Immunol. 15, 27-35 (2014).</li>
<li>Allison, J. P., Havran, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immunobiology+of+T+cells+with+invariant+gamma+delta+antigen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The immunobiology of T cells with invariant gamma delta antigen receptors.</a> Annu Rev Immunol. 9, 679-705 (1991).</li>
<li>Anderson, G., Jenkinson, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fetal+thymus+organ+culture%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Fetal thymus organ culture.</a> CSH Protoc. , (2007).</li>
<li>Schmitt, T. M., Zuniga-Pflucker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+T+cell+development+from+hematopoietic+progenitor+cells+by+delta-like-1+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Induction of T cell development from hematopoietic progenitor cells by delta-like-1 in vitro.</a> Immunity. 17, 749-756 (2002).</li>
<li>Barbee, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skint-1+is+a+highly+specific%2C+unique+selecting+component+for+epidermal+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Skint-1 is a highly specific, unique selecting component for epidermal T cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 3330-3335 (2011).</li>
<li>Douagi, I., Colucci, F., Di Santo, J. P., Cumano, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+earliest+prethymic+bipotent+T%2FNK+progenitor+in+murine+fetal+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver.</a> Blood. 99, 463-471 (2002).</li>
<li>Malissen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+T+cell+development+in+mice+with+a+targeted+mutation+of+the+CD3-epsilon+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Altered T cell development in mice with a targeted mutation of the CD3-epsilon gene.</a> EMBO J. 14, 4641-4653 (1995).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

두 가지 주요 분석은 T 세포의 생체 외 분화를 분석하는데 사용될 수있다. 가장 최근에보고 된 1 또는 4 내지 12 등 Noth1의 리간드, 델타 표현 BM 간질 세포 OP9 조혈 전구 세포의 공 배양된다.이 2-D 분석은에서 분석을 가능하게 고효율 민감한 수행하기 쉬운 단일 세포 수준. 그러나, 어느 쪽도 흉선 상피 세포와 직접 상호 작용을 필요로 둘 (DP)의 무대도 γδ DETC (13)의 생성, 이후 T 세포 개발을 지원합니다. FTOCs 긴 T 세포 발달 3을 분석하는데 사용되어왔다. 이 분석의 주요 강도 모두의 발생이 T 세포 구획, 흉선 상피 세포와 흉선 세포의 효율적인 3-D 상호 작용에 의해 부여 된 특성을 성숙하게된다. 우리는 여기서 두 가지 방법으로 현재, 따라서 외생 적 조상으로 효율적인 식민지를 허용 내생 흉선 세포를 고갈하는 데 사용 테스트. 모두 이온화 조사 및 구아노 처리...

T 림프구는 αβ 또는 γδ T 세포 수용체 (TCR)를 담지, 전문 기관에서 흉선 차별화. 완전히 개발 흉선은 두 가지 영역으로 구성되어 생산적 TCR의 β와 α 체인 유전자를 재 배열 흉선 세포가 프로그램의 죽음 (긍정적 인 선택으로 알려져있는 과정)에서 구출되는 흉선 조상 개발 피질, 그리고; 자기 리간드에 너무 강한 반응성과 흉선 세포를 선택한 수질은 (음 선택) 1, 2 삭제됩니다. 흉선 나중에 간엽 세포 (3)에 의해 둘러싸여 제 인두 파우치 내배엽 층에서 유래. 그것은 그 후, 연속 채용 정상 T 세포의 발달을 위해 요구되는 4 배아 일 E12과, 기점 조혈 전구 세포 식민지된다. 흉선 이민자들은 긴밀하게 규제 프로그램, 시작과 마이에 의해 조율 된, 연속적인 발달 단계를 통해 진화4처럼 그 리간드와의 상호 작용에 따라 흉선 세포의 노치 신호 전달 경로의 활성화, 델타에 의해 ntained, 흉선 상피 세포 (TEC는)에 표현 된 5. 흉선 세포 개발은 소위 CD4 시작 - CD8 - 더블 네거티브 (DN) 단계. , DN2 (CD25 + CD44 +), DN3 (CD25 + CD44 -) 및 DN4 (CD25 - CD44 -) - DN의 흉선 세포는 더 DN1 (CD44 + CD25)에 CD25 및 CD44의 발현에 따라 세분화 될 수있다. CD24 (HSA)와 CD117 (C-kit)은 더 DN1a와 b는 초기 흉선 전구 세포 (ETP)에 해당하는 5 부분 집합에 DN1 함을 세분화. 흉선 세포는 DN 단계에서 TCR δ, β와 α 사슬을 재 배열 및 사전 TCR 선택 (DN3-DN4 단계)를 거쳐. TCR (α) 체인은 긍정과 부정 실리 이전에 재 배열 CD4 + CD8 + 더블 긍정적 인 (DP) 구획에 그들은 더 통과ction의. 이 단계에서 가장 흉선이 제거되고, 단지 작은 백분율 (3~5%)는 ​​CD4 + 또는 CD8 + 도달가 T 세포를 격실 성숙. 림프 분화 경로는 다 능성 전구 세포 (MPP) 및 적혈구와 거핵 세포 6 잠재력을 잃어 림프-준비하는 다 능성 전구 세포 (LMPP)를 생성 조혈 모세포의 단계를 통해 진행한다. , 형 c-Kit (CD117)의 발현, 무서-1 및 FLT3 / Flk2 (CD135) 및 인터루킨의 검출 가능한 수준의 부재 (- LMPP는 표현형 (리니지 부정적인 린) 분화 혈액 세포 마커의 부재에 의해 정의 된 IL) -7 체인 α 수용체 (IL-7rα 또는 CD127). LMPPs 더욱 그 단계에서 골수 세포를 생성하는 능력을 상실했다고 공통 림프구 전구 세포 (CLP) 7로 분화. CLP는 림프구 (B와 T 세포), NK 세포, DC 및 선천성 림프 세포 (ILC)의 잠재력을 유지하고, CD1의 발현에 의해 LMPP 다를27 무서-1의 높은 수준의 부재. 흉선 정착 선조 (TSP)의 특성은 광범위 8 논의되었지만, 최근에 개발 된 것은 분명 9 TSP 걸쳐 변화 표현형 분화 잠재력과 기능은. 우리는 E13 (제 1 파) 또는 E18 (초 파) 중 하나에서 정렬 외과 세포에 의해 격리 TSP를 특성화하기 위해 생체 외 및 생체 내 분석을 수행. 동일 E13 및 E18 전구 세포의 수, 다른 allotypic 마커가 부착 된 식민지 유사한 개발 환경에서 그들의 자손 다음 허용 조상의 두 가지 유형의 사이에 다른 세포 고유 특성을 밝혀 조사 흉선 로브와 태아 흉선 기관 배양 (FTOC). E13 또는 E18 TSP 중 하나의 식민지 흉선 로브 인해 두 전구 세포 사이의 경쟁으로 선택하지 않고 개발을 허용했다. 식민지 흉선 로브의 생체 내 이식 더 보여 주었다 또한 T그는 E13의 성숙 자손과 E18 TSP는 생체 내에서 서로 다른 생물학적 특성을 갖는다. 제 웨이브에서 TSP를 빠르게 T 세포를 생성하고 있지만, αβ γδ T 세포의 낮은 숫자 일으킨다. 후자 중 우리는 불변 TCR, 그들은 상처 치유의 기능을 발휘하고 만 배아 발달 10시에 발생하는 표피로 마이그레이션이 Vγ5Vδ1 수지상 상피 T 세포 (DETC)를 발견했습니다. 대조적으로, TSP는 제 웨이브에서 TCR + T 세포의 높은 번호를 생성하는 시간이 오래 걸릴 DETC를 생성 할 수 없습니다.

<table><tbody><tr><td>90 × 15mm 및 35 × 15mm 플라스틱 조직 배양 페트리 접시.</td><td>TPP</td><td>T93100/T9340</td><td>샘플링</td></tr><tr><td>26g &frac38; " 0.45 x 10mm 주사기, 바늘</td><td>BD, Plastipak</td><td>300015</td><td>셀 서스펜션</td></tr>, <tr><td>나일론 메쉬 볼트 천, 살균 50/50mm 조각.</td><td>SEFAR NITEX</td><td>03-100/32</td><td>세포 여과</td></tr><tr><td>에탄올 70%.</td><td>VWR</td><td>83801.36</td><td>무균 작용</td></tr><tr><td>요오드 포비돈 10%(베타딘)</td><td>MEDA Pharma</td><td>314997.8</td><td>무균 작용</td></tr><tr><td>케타민 100mg/ml(원료</td>)<td>MERIAL</td><td></td><td>마취</td></tr><tr><td>자일라진 100mg/ml PBS(원료</td>)<td>Sigma</td><td>X1251-1G</td><td>마취 및 근육 이완제</td></tr><tr><td>부프레노르핀 0.3mg/ml 원료 AXIENCE</td><td></td><td></td><td>모르핀성 진통제</td></tr><tr><td>안과 젤 (0.2% 사이클로스포린)</td><td>Schering-Plough Animal Health</td><td></td><td>눈 보호</td></tr><tr><td>DPBS (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>14040-174</td><td>배아 분리</td></tr><tr><td>HBSS Hanks' Balanced Salt Solution (+ CaCl2, MgCl2)</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>24020-091</td><td>혈액을 씻어내고 배아 해부</td></tr><tr><td>OPTI-MEM I GlutaMAX I</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>51985-026</td><td>배양용 배지</td></tr><tr><td>태아 송아지 혈청</td><td>EUROBIO</td><td>CVFSVF00-0U</td><td>배양용 첨가제</td></tr><tr><td>페니실린 및 스트렙토마이신</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>15640-055</td><td>배양용 항생제</td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>GIBCO Life Technology</td><td>배</td><td>양용 31350010 첨가제</td></tr><tr><td>LEICA MZ6 해부 현미경</td><td>LEICA</td><td>MZ6</td><td>10445111 Occular W-PL10x/23</td></tr><tr><td>Cold lamp source</td><td>SCHOTT</td><td>VWR KL1500 compact</td><td>2개의 거위목 섬유 적응</td></tr><tr><td>실리콘 엘라스토머</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td>Dissecting Pad</td></tr><tr><td>Spoon, 원형 및 천공</td><td>Fine Science Tools</td><td>10370-18</td><td>Fine 해부 도구</td></tr><tr><td>Fine 홍채</td><td>가위 Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>Vannas 스프링 가위</td><td>Fine Science Tools</td><td>15018-10</td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>집게: Dumont #5/45 Inox 11 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11253-25</td><td>해부 도구</td></tr>, <tr><td>파인 스트레이트 워치메이커 집게 2켤레, Dumont #5, 11cm 파인 팁.</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-20</td><td>해부 도구</td></tr><tr><td>폴리아미드 실(바늘 포함) 6-0 C-3 3/8c</td><td>ETHICON</td><td>F2403</td><td>봉합</td></tr>사 바늘 <tr><td>홀더</td><td>MORIA/F.S.T.</td><td>12060-02</td><td>봉합</td></tr>사 <tr><td>가열 패드</td><td>VWR</td><td>100229-100</td><td>마취 중 마우스 온도 유지</td></tr><tr><td>멤브레인 Isopore RTTPO2500</td><td>DUTSCHER</td><td>44210</td><td>FTOC</td></tr><tr><td>Terasaki 60 웰 플레이트</td><td>FISHER</td><td>1x270 10318801</td><td>교수형 드롭 기술</td></tr><tr><td>용 거즈 면봉 살균 7.5 x 7.5 cm</td><td>Hydrex</td><td>11522</td><td>소독 용액 적용</td></tr><tr><td>형광 또는 비오틴 표지 항체</td><td>BD Biosciences, Biolegend 또는 e-Biocsiences&nbsp;</td><td>클론 번호는 아래 표를 참조하십시오</td><td>. 염색 세포</td></tr><tr><td>MACS Columns/Streptavidin Microbeads</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401/130-048-101</td><td>Cell depletion</td></tr><tr><td>Mice</td><td>Charles Rivers Laboratories (CD45.1) and Janvier Labs&nbsp; (CD45.2)</td><td>C57BL/6 CD45.1 또는 CD45.2</td><td>세포 및 흉선엽 공급원</td></tr><tr><td>생쥐</td><td>CDTA Orl&eacute; ans, 프랑스</td><td>CD 3 epsilon Ko CD45.2</td><td>접목 실험</td></tr></tbody></table>

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착<em&gt; 생체</em&gt;와<em&gt; 체외</em&gt; 분석 실험

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

흉선 정착 전구 세포를 특성화하는 lymphopenic 환자에서 T 세포의 교체를위한 전략을 고안하는 것이 필수적, T 세포의 발달 단계 전 흉선을 이해하는 것이 중요하다. 우리는 체외에서 보완이에 의해 쥐의 배아 일 13, 18 thymi에서 전구 세포를 정착 흉선을 공부하고 생체 기술에 모두 &quot;매달려 드롭&quot;방법에 따라. 이 방법은 E13 및 / 또는 E18 그들의 자손 다음 따라서 CD45 allotypic 마커에 의해 구별 흉선 조상을 조사 태아 흉선 로브를 식민지화 허용했다. 인구 중 하나와 식민지가 가능한 경쟁력있는 선택적 압력을 제거하는 동안 혼합 인구 식민는 전구 세포의 생물학적 특성 세포 자치 차이를 분석하는 허용한다. 식민 흉선 로브는 또한 t의 인구 역학 생체 내 성숙 된 T 세포의 자손의 수 분석 면역 결핍받는 수컷 마우스에 이식 할 수있다그는 면역 체계와 다른 조직과 장기의 식민지를 주변. 태아 흉선 기관 배양 E13 전구 세포 모두에 빠른 속도로 개발 CD3 + 세포를 성숙 것으로 나타났다 및 수지상 상피 T 세포로 알려진 표준 γδ T 세포 하위 집합에 상승했다. 이에 비해, E18 전구 세포는 분화가 지연 및 수지상 상피 성 T 세포를 생성 할 수 없었다. - / - 흉선 이식 CD3의 말초 혈액의 모니터링 마우스는 더 E18의 흉선 정착 전구 세포는, 시간에 따라, 단기적 태아 흉선에서 감상 할 수없는 기능을 자신의 E13에 비해 성숙한 T 세포의 큰 번호를 생성하는 것으로 나타났다 기관 배양.

식민지화 선조의 가장 개발을 허용 내인성 흉선 세포의 흉선 로브를 고갈시키는 방법을 선택하기 위해, 우리는 방사선 조사 후 식민 흉선 로브에서 T 세포 재구성의 수준 또는 5 일 데 옥시 구아노 신 (D-GUA) 치료를 비교 하​​였다. 결과 배양 9 일째에 아무런 차이가 없을 때, 방사 로브 따라서 일 12시, 조사 후 T 세포의 발달을 얻었다 D-구아 처리보다 더 바람직하고, 또한 D-구아 처리보다 더 T 세포를 함유하는 것으로 나타 흉선 식민지 (그림 1). E13과 E18 TSP의 개발 가능성을 연구하기 위해, 우리는 E14는 전구 세포의 두 가지 유형의 동일한 수의 혼합물로 흉선 로브를 조사 식민지. 결과는 E13의 TSP는 달리 적은 흉선 세포와 E18 TSP 이하 DP하지만,을 야기 할 것으로 보여, E13 TSP는 DETC 및 CD3 +의 높은 주파수 세포 (그림 2) 성숙 생성합니다. 생체 냄비를 분석하려면...

이 기사는 T 세포 자손의 생성, 표현형 및 수의 동역학을 분석하여 흉선 침전 전구 세포를 특성화하는 생체 내 및 시험관 내 방법론에 대해 설명합니다.

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

본 절차의 전체적인 목표는 E 13 또는 E 18 흉선 정착 전구세포에 의해 생성된 T 세포의 수와 표현형 역학을 분석하는 것입니다. 이를 위해 먼저 E 13, E 14 및 E 18 마우스 배아에서 흉선엽을 분리합니다. 두 번째 단계에서는 E 14 흉선엽을 조사한 후, 유세포 분석으로 분류한 E 13 또는 E 18 세포를 행잉 드롭(hanging drop) 방식으로 48시간 동안 정착시킵니다.마지막 단계로, 세포가 정착된 엽을 성체 CD3 결핍 마우스의 신장 피막 아래에 이식합니다. 최종적으로, 유세포 분석법을 사용하여 키메라 동물의 혈액 내에서 E13 및 E18 흉선 정착 전구세포 자손의 존재 여부를 평가할 수 있습니다. 이 기술이 iPSC 세포 상의 인비트로(in vitro) T 세포 배양과 같은 기존 방법보다 갖는 주요 장점은, 정의된 전구세포로부터 3차원 분석법을 통해 완전한 T 세포 성숙을 가능하게 하는 방법과 온전한 수용 마우스로의 흉선 기관 배양 이식 방법을 결합함으로써, 흉선 슬라이스 전구세포 및 그 자손의 분화와 기능을 평가할 수 있다는 점입니다.설치류 수술 전문 연구 엔지니어로서, 저는 이 절차를 시연하겠습니다. 이식 실험 2일 전, 층류 후드 내에서 임신한 암컷 생쥐의 복부를 70% ethanol로 소독하고 정중선 피부를 따라 세로로 절개하십시오. 피부를 양옆으로 당겨 절개 부위를 연 뒤, 핀셋과 가위로 소화관을 건드리지 않고 복막을 엽니다. 다음으로 갈래 자궁을 꺼내 가위로 질과 분리하십시오. 그런 후 40 to 50 milliliters의 DPBS가 담긴 90 by 15 millimeter 페트리 접시에 자궁을 놓고, 각 배아의 탈락막 사이를 가로 방향으로 절단하십시오.미세 팁 가위와 미세 핀셋을 사용하여 태반과 난황낭 사이를 절개함으로써 자궁의 근육막을 제거하고 각 배아를 꺼냅니다. 그런 다음 배아를 보존하면서 양막을 제거하고, HBSS에 1% FCS가 첨가된 새 페트리 접시에 배아를 넣습니다. 흉선을 분리하기 위해, 쌍안 확대경 아래에서 배아를 하나씩 똑바로 눕힌 자세로 배치합니다.그 다음 핀셋 하나를 흉골 연골을 따라 세로로 삽입하고, 곡선 핀셋을 사용하여 흉곽을 집어 벌립니다. 흉벽을 옆으로 당겨 기관 양측에 있는 흉선 엽을 확인합니다. 그런 다음 미세 핀셋으로 흉선 아래쪽을 집어 각 엽을 조심스럽게 제거한 후, 1% FCS가 첨가된 1 mL의 HBSS가 담긴 페트리 접시에 넣습니다.다음으로, 두 개의 미세 핀셋을 사용하여 엽(lobe)에 손상을 주지 않으면서 주변의 결합 조직을 제거합니다. 그런 다음 3 mL의 1% FCS가 첨가된 HBSS로 엽을 세척하여 적혈구를 제거함으로써, 방금 시연한 바와 같이 CD 45.2 배아에서 분리한 E 14 흉선 엽의 태아 흉선 기관 배양 조사를 시작합니다.엽(lobe)을 약 3시간 동안 휴지시킵니다. 그다음 갓 분리한 E 13 또는 E 18 흉선 정착 전구세포(thymic settling progenitors)를 원심 분리합니다. 펠릿(pellet)을 배양 배지에 재현탁하여 최종 농도가 배지 35 µL당 500 cells가 되도록 합니다.그 다음 60웰 테라사키 플레이트(Terasaki plate)의 매 짝수 웰에 세포 현탁액 35 µL를 한 방울씩 떨어뜨리고, 각 방울의 표면에 조사된 엽(lobe) 하나를 플레이팅합니다. 플레이트를 닫고 뒤집어 세포들이 중력에 의해 방울의 정점에 도달하게 하며, 뒤집힌 플레이트의 윗면을 가볍게 쳐서 엽이 방울의 정점 가장자리까지 미끄러져 내려가도록 합니다. 그런 다음 뒤집힌 플레이트를 37 °C, 5% CO2 조건의 습윤 배양기에서 48시간 동안 배양합니다.흉선 엽에 정착이 완료되면, 반사 반응이 없는지를 통해 수혜 동물의 마취 수준을 확인하십시오. 그런 다음 각 눈에 안연고를 한 방울씩 바르고, 마우스를 층류 후드 아래에서 오른쪽으로 눕힙니다. 이어서 뒷다리 관절 바로 윗부분의 수술 부위를 면도하십시오.다음으로, 멸균 장갑을 착용하고 70% ethanol과 10% IOD DY DER 용액으로 수술 부위를 소독합니다. 메스를 사용하여 피부 조직을 통해 1.5 centimeter 절개하고, 이어서 근육 조직을 절개합니다. 이제 절개 부위의 양측에 가벼운 압력을 가해 신장을 복강 밖으로 밀어내고, 생리식염수로 신장이 건조해지지 않도록 유지합니다.면봉을 사용하여 신장을 후복막강 밖으로 유지한 상태에서, 두 개의 미세 핀셋으로 피막에 2~3mm 크기의 구멍을 냅니다. 그 다음 피막 벽을 벌린 채로 최대 6개의 흉선 엽 이식편을 신장 극의 가장자리 방향으로 조심스럽게 밀어 넣고, 신장을 다시 후복막강 내에 배치합니다. 근육을 봉합한 후 피부를 개별 외과용 매듭으로 봉합합니다.그런 다음 상처 부위를 10% 포비돈 요오드 용액으로 적시고, 마우스를 37 °C 가열 패드 위에 올려둔 뒤, 동물과 수술 부위가 모두 완전히 회복될 때까지 관찰하여 정착 전구세포의 발달을 위해 내인성 흉선세포를 제거하는 최적의 방법을 결정합니다. 본 실험에서는 방사선 조사 또는 5일간의 deoxy guine 처리 후 정착된 흉선 엽의 T세포 재구성 수준을 비교하였습니다. 배양 9일 차에는 정착 림프구 수에 차이가 나타나지 않았으나, 12일 차에는 방사선 조사된 엽이 deoxy guine 처리된 엽보다 더 많은 T세포를 포함하고 있어, T세포 발달을 촉진하기 위한 흉선 정착 후의 선호되는 처리 방법은 방사선 조사인 것으로 나타났습니다. E 13 및 E 18 흉선 정착 전구세포의 발달 잠재력을 연구하기 위해, E 14 방사선 조사 흉선 엽에 두 유형의 전구세포를 동일한 수로 정착시킨 결과, 관찰된 바와 같이 E 13 흉선 정착 전구세포는 E 18 흉선 정착 전구세포보다 더 적은 수의 흉선세포와 이중 양성 T세포를 생성하였습니다.그러나 성숙한 CD3 양성 세포의 빈도는 증가했으며, 수지상 상피 T 세포의 생성은 E 13 흉선 정착 전구세포의 후손에서만 검출되었습니다. E 13 및 E 18 흉선 정착 전구세포의 생체 내 잠재력을 분석하기 위해, 각 유형의 전구세포가 군락을 형성한 흉선 엽을 CD3 결핍 수용자의 신장 캡슐 아래에 이식했습니다. 방금 입증된 바와 같이, 예상대로 E 13 흉선 정착 전구세포는 E 18 전구세포보다 T 세포를 더 빠르게 생성했지만, 전반적으로 E 13 흉선 정착 전구세포가 군락을 형성한 동물에서 순환 T 세포의 수는 유의하게 더 낮았습니다. 이 기술의 발전 이후, 발달 면역학 분야의 연구자들은 포유류 모델에서 일부가 엄격하게 배아 기원을 갖는 T 세포 서브셋의 특성을 탐구할 수 있는 길을 열게 되었습니다.이 영상을 시청하고 나면, 자연 환경 및 경쟁 조건 하에서 Timex settling progenitor와 그 후손의 분화 및 기능적 경로를 추적하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

characterization-thymic-settling-progenitors-mouse-embryo-using-vivo

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 신생아 chimeras의 생성뿐만 아니라 2 광자 현미경으로 해부하고 예 생체내 이미징에 대한 thymus의 준비를위한 단계별 지침을 제시한다.

2 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 현장 영상에서

본 연구진은 흉선의 생체 내 영상 획득을 위한 새로운 실험실 도구 및 프로토콜을 개발하였습니다. 이러한 기술은 T 세포 발달이 일어나는 흉선 내의 "니치(niches)"를 식별하는 데 도움이 될 것입니다.

2 - 광자 현미경을 사용하여 마우스 Thymus의 Intravital 영상

이 동영상은 3차원 흉선 배양 시스템을 사용하여 iPSC 유래 미성숙 T 세포에서 기능적 항원 특이적 T 세포를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다. iPSC 유래 미성숙 T 세포를 내인성 림프구가 고갈된 마우스 태아 흉선엽과 함께 배양한 결과, T 세포가 성공적으로 성숙하여 CD8αβ+ MHC 클래스 I+ iPSC 유래 흉선 이민자(iTE)를 형성했습니다.

iPSC 유래 흉선 이민자를 생성하기 위한 3차원 흉선 배양 시스템

마우스 배아 줄기 세포는 OP9-DL1 공동 배양 시스템을 사용하여 in vitro에서 T 세포로 분화할 수 있습니다. 이 절차를 성공적으로 수행하려면 시약/세포 유지 관리 및 주요 기술에 민감한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 여기에서는 이러한 중요한 매개변수에 대해 논의하고 이 기술의 채택을 장려하기 위한 자세한 프로토콜을 제공합니다.

T 세포의 유도 체외 마우스 배아 줄기 세포에서

현재의 2D 배양 시스템이 in vivo 시나리오를 모방하지 않기 때문에 in vitro에서 수질 흉선 상피 세포를 연구하는 것은 대체로 성공적이지 못했습니다. 본 명세서에 기술된 3D 배양 시스템(변형된 피부 유기형 배양 모델)은 mTEC 증식, 분화 및 난잡한 유전자 발현의 유지를 재현하는 데 탁월한 것으로 입증되었습니다.

수질 흉선 상피 세포의 증식, 분화 및 무차별 유전자 발현을 지원하는 3D의 Organotypic 공동 문화 모델

이 프로토콜은 마우스 착상 전 배아 계통 명세서를 연구하는 단백질 발현의 정량적 분석 시츄, 단일 셀을 수행하는 방법을 제시한다. 포배의 수집에 필요한 절차, 단백질의 면역 검출을 전체 마운트, 공 초점 현미경, 핵 세분화 및 이미지 분석에 샘플 영상은 설명한다.

단백질 발현의 정량 분석​​은 마우스 착상 전의 배아에서 리니지 사양을 공부하기

침입하는 대 식세포가 순환하는 전구체로부터 성인 조직으로 지속적으로 모집되는 동안, 상주하는 대 식세포는 발달 중에 그들의 조직을 뿌리고, 전구체로부터의 더 이상의 입력없이 유지된다. 상주 대 식세포의 전구 세포는 최근 확인되었다. 여기, 우리는 상주 macrophage progenitors의 유전 적 운명 매핑 방법을 제시한다.

Flow Cytometry에 의한 마우스 태아의 적혈구 전구 세포 (Erythromyeloid Progenitors)와 그 자손의 동정

이 종이에 우리는 ELISA를 사용 하 여 마우스에서 T-종속 및 T-독립 면역 글로불린 (Ig) isotype 응답 하는 프로토콜을 설명 합니다. 이 방법은 단독으로 사용 하거나 흐름 함께에서 cytometry 쥐 T-종속 및 T 독립적인 항 원 면역 다음에 Ig 중재 하는 B 세포 isotype 응답 차이 식별 하는 연구를 수 있게 됩니다.

Thymus 종속 및 독립 Thymus 면역 글로불린 Isotype 반응 효소 연결 된 Immunosorbent 분석 결과 사용 하 여 마우스의 특성

프로토콜의 목표는 레이저 스캐닝 현미경 마우스 눈의 앞쪽 챔버에 thymic 임 플 란 트에 의해 thymocytes의 경도 intravital 실시간 추적을 보여주는 것입니다. 각 막의 투명도는 이식의 vascularization 지속적으로 녹음 시 조 셀 모집 및 성숙한 T 세포 출구 수 있습니다.

레이저 스캐닝 현미경 검사 법에 의해 눈의 앞쪽 챔버에 Thymocytes의 비보에 추적 실시간

본 문서에서는 3차원(3D) 흉선 배양 시스템에 의해 종양 항원 특이적 유도 만능 줄기 세포 유래 흉선 이주자(iTE)를 생성하는 새로운 방법을 설명한다. iTE는 증식, 기억 형성 및 종양 억제 능력을 가진 순진한 T 세포와 밀접하게 관련된 T 세포의 균질한 서브세트이다.

뮤린 유도 만능 줄기 세포 유래 종양 항원 특이적 흉선 유이주자를 생성하는 3차원 흉선 배양 시스템

이 문서에는 ex vivo 공상 장기 형태로 결합 될 수 있는 메 추 라 기 및 닭 배아에서 순수 배아 조직 분리 하는 방법을 제공 합니다.

배아 조직과 Thymus 예제를 사용 하는 메 추 라 기-닭고기 공상 기관의 형성의 절연

배우세요 마우스 배아 흉선에서 전구 세포를 분리하고 방사선 처리 후 이식하는 방법을 통해 T 세포 분화와 기능을 분석하는 기술입니다. 이 실험은 면역학 연구에 중요한 통찰을 제공합니다.

흉선의 특성 사용하여 마우스 배아에서 전구 세포를 정착

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