동종 유도 혈관 거부 및 이식 동맥 경화 마우스 모델

본 실험 절차의 전체적인 목표는 마우스에서 말단 간 대동맥 치환술(end-to-end aortic interposition grafting)을 수행하여 혈관 거부 반응과 이식 동맥경화증을 연구하는 것입니다. 이를 위해 먼저 공여 마우스로부터 복부 대동맥의 일부 분절을 채취합니다. 그 다음, 이 분절을 공여자와 유전적으로 다른 동종 수혜 마우스의 신장 내 대동맥에 정위 이식합니다.

마지막 단계에서, 이식된 혈관 분절을 적출하여 이식 동맥경화증의 발생 여부를 분석합니다. 최종적으로, 내막 증식과 내강 협착의 측정 및 조직 내 면역 세포 축적에 대한 면역조직화학 분석을 통해 이식 동맥경화증의 정도와 면역 매개 동종이식 혈관 거부반응을 평가할 수 있습니다.

일반적으로 이 절차를 처음 접하는 사람들은 미세수술 기법에 익숙해지는 데 시간이 필요합니다. 숙달하기 위해서는 높은 수준의 기민함과 연습이 필요하기 때문입니다. 하지만 꾸준히 연습한다면 대부분의 연구자가 충분히 수행할 수 있는 방법입니다. 따라서 재능 있는 신경외과 의사인 Ms. Winnie와 저희 연구실의 유능한 박사 과정 학생인 Adam Roso가 이 절차를 시연하겠습니다. 먼저, 8x 또는 30x 배율의 수술 현미경 아래에서 멸균 드레이프로 감싼 깨끗하고 얇은 플렉시글라스 보드 위에 공여자 마우스를 앙와위로 배치하는 것으로 시작하십시오.

발가락 꼬집기(toe pinch)를 통해 수술 마취가 충분히 되었는지 확인한 후, 멸균 가위로 치골에서 검상돌기까지 정중선 절개를 1회 실시합니다. 다음으로, 소형 리트랙터를 사용하여 복벽을 열고 복강을 노출시킵니다. 그 후 멸균 면봉을 사용하여 장을 동물의 왼쪽 상단으로 부드럽게 밀어냅니다.

식염수로 적신 거즈로 조직을 덮고, 생식 기관을 하방으로 이동시켜 신하대동맥과 하대정맥(IVC)의 위치를 확인합니다. 이제 5번 의료용 포셉을 사용하여 분지점 근처의 좌측 신동맥 부위에서 대동맥과 하대정맥을 분리합니다. 그런 다음 10-0 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사를 사용하여 대동맥 근처의 작은 분지들을 결찰합니다.

공여자의 대동맥과 하대정맥(IVC)을 분리한 후, 혈관을 식염수로 적시고 노출된 공동을 젖은 거즈로 덮은 다음 공여자를 멸균 구역에 둡니다. 이제 수혜자 마우스를 현미경 아래에 두고, 시연된 것과 같이 수혜자의 대동맥을 하대정맥(IVC)에서 분리합니다. 그런 다음 관심 분절의 근위부와 원위부에 약 5 mm 간격으로 4 mm 미세혈관 클램프 두 개를 장착합니다.

다음으로, 다양한 튜브 엔진 미세 가위를 사용하여 대동맥에 수평 절개를 한 번 가하고, 공여 대동맥 이식편이 들어갈 수 있도록 복부 대동맥을 0.5 mm 이내로 절제합니다. 공여물을 다시 현미경으로 옮겨 앞서 시연한 대로 3~4 mm 길이의 이식편 분절을 절단합니다. 그런 다음 25 gauge 5/8 바늘을 사용하여 절제된 대동맥을 헤파린 처리된 식염수로 세척합니다.

바늘 끝이 혈관에 닿지 않도록 주의하며, 혈관을 얼음 위에 놓인 헤파린 식염수 용기에 넣습니다. 적출 후 30분 이내에 공여 대동맥 이식편을 수혜자의 정위치에 배치하고, 이식편의 해부학적 방향을 수혜자의 방향과 일치시킵니다. 그런 다음 혈관의 외막을 부드럽게 잡고 5번 포셉을 사용하여 약간 옆으로 밀어둡니다.

이제 포셉을 사용하여 10-0 폴리아미드 모노필라멘트 봉합사가 연결된 바늘을 혈관벽의 전층으로 통과시켜, 연속 봉합을 위해 공여측 대동맥 이식편을 수혜측의 절제된 혈관에 고정합니다. 이식편의 상단과 하단 양측 9시 방향에 견인 봉합사를 배치합니다. 그런 다음 이식편 상단의 3시 방향부터 문합을 시작합니다.

두 개의 연속 봉합사로 절제된 끝단을 봉합하고, 이를 고정 봉합사에 고정합니다. 그런 다음 이식편을 뒤집어 혈관의 배측 부분까지 연속 봉합을 이어갑니다. 기시부에서 봉합을 마무리합니다.

봉합 상태를 유지하십시오. 혈관에 과도한 압력을 가하지 않도록 주의하며 봉합사를 고정하고, 아래쪽 문합 부위에도 동일하게 봉합을 반복합니다. 문합이 완료되면.

원위부 미세혈관 클램프를 풀어 혈관을 통해 혈류가 역행하도록 합니다. 출혈이 관찰되지 않으면 근위부 클램프를 풉니다. 혈류 폐쇄가 관찰되지 않으면, 포셉을 사용하여 견인 봉합사의 한쪽 끝을 살짝 잡고 혈관을 약간 옆으로 밀어 혈관의 후벽을 검사합니다.

공여 혈관과 수혜 혈관 모두에서 강한 맥동 패턴이 관찰되어 주름짐이 보이지 않는다면, 면봉을 사용하여 장을 복강 내로 되돌려 놓습니다. 마지막으로, 니들 홀더와 grof 포셉을 사용하여 5-0 polypropylene 봉합사와 연속 봉합법으로 복벽을 폐쇄합니다. 피하 폐쇄법을 사용하여 동일한 봉합사로 피부층을 봉합합니다.

수술의 성공 여부를 평가하기 위해 뒷다리의 운동 기능을 관찰할 수 있습니다. 이식 후 30일째에 이식된 대동맥 분절의 내막 증식과 내강 협착 정도를 정량화하여 면역 매개 동종이식 혈관 손상 정도를 조사합니다.

실제로 관찰된 바와 같이, 동종이식 동맥 분절에서는 유의미한 내막 증식과 루멘 폐쇄가 나타난 반면, ISO 이식 대조군 동맥 분절에서는 아무런 변화가 관찰되지 않았습니다. 또한, 면역조직화학 염색을 통해 CD4 및 CD8 양성 T 세포와 대식세포의 축적을 조사함으로써 동종이식 동맥 내로의 백혈구 모집을 평가할 수 있습니다. 예상대로, 발달 후 공여 동맥 조직의 내막 내에서 세 가지 유형의 면역 세포가 모두 검출되었습니다.

이 기술은 교통 분야의 연구자들이 동종면역 매개 혈관 감소 및 이식 동맥 경화증을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.