쥐 머리 Branchiomeric 근육에서 분리 및 위성 세포의 특성
2015년 7월 20일
이 프로토콜은 9 주 된 쥐의 branchiomeric 머리 근육에서 위성 세포의 분리에 대해 설명합니다. 근육은 다른 아가미 아치에서 시작. 이어서, 위성 세포 분화를 연구하기 mm 크기의 스폿 코팅에 배양했다. 이 접근 방법은 위성 세포의 팽창 및 계대를 피한다.
이 절차의 전반적인 목표는 세포 외 기질에서 배양하기 위해 첫 번째, 두 번째 및 네 번째 상완궁에서 유래한 대표 근육에서 위성 세포를 분리하는 것입니다. 젤 반점. 이것은 먼저 젊은 성인 쥐의 학살, digastric 및 levada vli 구개 근육을 해부함으로써 수행됩니다.
두 번째 단계에서는 각 근육 샘플의 위성 세포를 효소, 분해 및 지속 시간에 의해 분리합니다. 그런 다음 세포를 세포외 기질 겔에서 배양합니다. 궁극적으로, 관심 있는 근육 마커에 대한 염색을 통해 위성 세포 배양의 근육 형성의 동적 상태를 추적할 수 있습니다.
구순구개열은 인간에게 가장 흔한 두개안면 기형 중 하나입니다. 구순구개열이 있는 경우 결함을 봉합하고 정상적인 언어 발달을 위해 외과적 치료가 필요하지만 섬유증 및 결함 있는 근육 재생은 연구개 근육의 기능 회복을 방해할 수 있습니다. 구개열 복원 후, 밀리미터 크기의 엑소 세포 매트릭스 겔 스폿 코팅을 사용하여 갓 분리된 위성 세포를 배양하는 혁신적인 방법을 시연할 수 있습니다.
이렇게 하면 확장 요구 사항을 피할 수 있습니다. 이 세포를 안착화: 분리 하루 전에 8개의 웰 챔버를 100mm 페트리 접시에 넣고 접시를 차가운 표면으로 옮깁니다. 10분 후, 미리 충전된 마이크로 피펫을 사용하여 각 웰에 10마이크로리터의 세포외 기질 젤 한 방울을 분주합니다.
슬라이드를 7분 더 식힌 후 남은 젤을 완전히 제거하고 다음날 밤새 섭씨 37도에서 웰을 건조시킵니다. 학살의 근육을 해부하기 위해, 9주 된 쥐의 머리에서 피부를 제거하고 피하 주사 바늘을 사용하여 머리를 옆으로 고정한다. 실리콘 패드에서 이하선과 안면 신경을 분리하고 분비샘을 제거합니다.
그런 다음 15 번 메스 칼날을 사용하여 얼굴 신경을 조심스럽게 제거합니다. 교근 근육의 표재성 머리를 확인합니다. 다음으로, 직선 집게를 사용하여 접합 과정에서 힘줄을 원점에서 분리한 다음 해부 가위로 힘줄을 조심스럽게 자릅니다.
메스를 사용하여 학살의 표재성 머리를 하악골의 골격 측면 표면의 아래쪽 절반과 각도로 삽입할 때까지 해부합니다. 이위근의 뒤쪽 배를 절개하려면 바늘로 머리를 앙와위 자세로 고정하고 설하선과 턱밑 땀샘 위에 있는 피하 지방을 제거합니다. 위 근육의 앞쪽과 뒤쪽 배를 노출시킨 다음 뒤쪽 배의 앞쪽 힘줄을 곧게 자른 집게로 잡고 힘줄을 고막에서 기원까지 조심스럽게 절개합니다.
레바다 블리 구개근을 절개하려면 스타일로 할로이드 근육을 국소화합니다. 옆으로 당겨 조심스럽게 근육 조직을 제거합니다. 다음으로, 고막 불러(tympanic buller)를 삽입하는 levada vli palatino의 힘줄을 지역화하고 조심스럽게 해부합니다.
그런 다음 기관 뒤에서 식도를 들어 올립니다. 연구개에서 levada vli palate가 삽입되는 부위를 확인하고 근육을 풀어줍니다. 그런 다음 근육을 70% 에탄올에 담그고 항생제가 보충된 얼음처럼 차가운 PBS로 옮깁니다.
위성 세포를 분리하기 위해 각 근육을 6개의 웰 플레이트의 개별 웰로 옮기고 조직을 2mm의 작은 조각으로 자릅니다. 근육을 너무 많이 다지지 않도록 주의하세요. 다음으로, 섭씨 37도의 웰당 2.5ml의 0.1%프로나제 용액에 조직 조각을 20분마다 부드럽게 흔들면서 60분 동안 조심스럽게 배양합니다.
섬유 다발이 2.5 밀리리터의 DMEM에서 느슨한 모습을 보이면 각 웰에 말 혈청과 항생제가 보충되고 소화 된 조직을 개별 15 밀리리터 원추형 튜브로 옮깁니다. 조직 슬러리를 스핀다운하고 상층액을 디캔팅합니다. 그런 다음 각 튜브에 5ml의 배지를 추가하고 10ml 플라스틱 피펫으로 조직을 균질화합니다.
조직을 다시 스핀다운하고 상층액을 새로운 15ml 원추형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브에 배지 5ml를 더 추가하고 단편이 피펫을 쉽게 통과할 때까지 조직 조각을 다시 삼중 평가합니다. 또 다른 원심분리 후, 상등액을 적절한 해당 튜브로 끌어당기고 40마이크로미터 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 개별 50ml 튜브로 여과합니다.
최대 세포 회수를 위해 1ml의 DMEM으로 스트레이너를 세척합니다. 그런 다음 세포를 스핀 다운하고 펠릿을 신선, 매체에 재현탁시키고 세포를 계수하여 분리된 위성 세포를 배양합니다. 다음으로, 세포 현탁액을 배양 배지 10 마이크로 리터 당 3 개의 세포에 1.5 배 10으로 희석한다.
그런 다음 이전에 준비된 각 세포외 기질 겔 스폿에 10마이크로리터의 세포를 추가하고 6시간 후 섭씨 37도에서 겔을 배양합니다. 각 겔 스폿에 400마이크로리터의 배양 배지를 조심스럽게 추가하고 슬라이드를 인큐베이터로 되돌립니다. 3일 후, 분리 직후 적절한 배양 배지를 추가하여 세포의 분화를 시작합니다.
갓 분리된 위성 세포의 90% 이상이 4일차까지 팩 7, 팩 7 및 MyoD를 모든 근육 그룹의 위성 세포에 의해 발현됩니다. 저의 OG는 모든 근육 그룹에서 7일째에 높게 발현됩니다. 세포외 기질인 겔 스팟에 파종한 지 4일 후, 증식하는 세포는 융합하기 시작하여 7일과 10일에 미오신 중쇄를 발현하는 작은 다핵 근
관을 형성합니다.길고 잘 조직된 근육관은 10일째에 분명합니다. Myo 튜브 경련도 관찰 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 구순구개열 근육에서 유래한 위성 세포를 연구할 수 있게 해주며 구순구개열 치료에 새로운 가능성을 제공합니다. 환자.
개요
이 프로토콜은 9주 된 쥐의 분지궁 두개 근육에서 위성 세포의 분리 및 배양을 설명합니다. 이 방법은 세포 확장 및 전달 없이 근육 형성을 연구할 수 있게 합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 근육 재생
배경
- 위성 세포는 근육 재생에 중요합니다.
- 입술과 구개 분열은 일반적인 두개 안면 기형입니다.
- 위성 세포 행동을 이해하면 이러한 상태의 치료법을 개발하는 데 도움이 될 수 있습니다.
- 이 연구는 다른 분지 호에서 나온 근육에 초점을 맞추고 있습니다.
연구 목적
- 특정 두개 근육에서 위성 세포를 분리합니다.
- 이 세포를 세포외 기질 젤에서 배양합니다.
- 특정 근육 마커를 통해 근육 분화를 추적합니다.
사용된 방법
- 쥐의 분지궁 두개 근육을 해부합니다.
- 효소 소화를 통해 위성 세포를 분리합니다.
- 밀리미터 크기의 세포외 기질 젤 스팟에서 세포를 배양합니다.
- 근육 마커에 대한 염색을 통해 분화를 추적합니다.
주요 결과
- 분리된 위성 세포의 90% 이상이 4일째에 Pax7를 발현합니다.
- 모든 근육 그룹에서 7일째에 마이오제닌이 고도로 발현됩니다.
- 10일째에 다핵 근관이 형성되어 성공적인 분화를 나타냅니다.
- 근관의 근육 척동이 관찰되어 기능적 성숙을 보여줍니다.
결론
- 이 프로토콜은 위성 세포를 연구하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 제공합니다.
- 근육 재생 메커니즘에 대한 통찰력을 제공합니다.
- 이 연구 결과는 구개 분열 환자를 위한 치료 전략에 기여할 수 있습니다.
자주 묻는 질문
Executive Industry Relevance
Isolation and characterization of satellite cells from rat head branchiomeric muscles enables precise modeling of muscle regeneration relevant to craniofacial disorders. This system supports predictive evaluation of regenerative strategies and informs early-stage therapeutic development for tissue engineering applications. The approach enhances translational continuity for muscle repair interventions in complex anatomical contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of myogenic pathways in disease-relevant craniofacial muscle systems.
- Supports biological de-risking by isolating primary satellite cells from distinct muscle origins.
- Facilitates functional target validation for regenerative medicine approaches.
Screening & Assay Development
- Provides a validated in vitro platform for quantitative assessment of myogenic differentiation.
- Standardizes assay conditions using millimeter-scale extracellular matrix gel spots.
- Enables reproducible evaluation of candidate compounds or biomaterials on muscle stem cell function.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant models for cleft palate and craniofacial muscle regeneration.
- Supports continuity from discovery to preclinical validation of tissue engineering strategies.
- Enables risk-adjusted advancement of regenerative therapies targeting muscle repair.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the early discovery and preclinical validation continuum for muscle regeneration therapies, bridging target validation and translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on satellite cell behavior and myogenic differentiation in head muscles.
- Screening: Delivers quantitative, reproducible outputs for compound or biomaterial evaluation.
- Analytics: Provides marker-based readouts (Pax7, MyoD, myogenin) for comparative analysis across conditions.
- Translational Research: Connects in vitro findings to preclinical models of craniofacial muscle repair.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse muscle regeneration studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in regenerative target selection and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability of muscle stem cell assays.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions for early-stage regenerative programs and reduces late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of muscle regeneration assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in primary muscle dissection and cell isolation techniques.
- Needs access to specialized cell culture and imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization of assay protocols and marker analysis.
- Adaptation may be needed for other muscle types or species.
- Limited by the availability of primary tissue and scalability for high-throughput applications.
