쥐 머리 Branchiomeric 근육에서 분리 및 위성 세포의 특성

본 절차의 전반적인 목적은 제1, 제2, 제4 인두궁에서 유래한 대표 근육으로부터 위성 세포를 분리하여 세포외 기질 겔 스팟(Gel spots) 상에서 배양하는 것입니다. 이를 위해 먼저 성체 쥐의 교근, 이복근 및 구개범장근을 적출합니다.

두 번째 단계에서는 효소 소화 및 처리 시간을 통해 각 근육 샘플로부터 위성 세포를 분리합니다. 그 다음, 분리된 세포를 세포외 기질 겔 위에서 배양합니다. 최종적으로, 관심 있는 근육 마커의 염색을 통해 위성 세포 배양물의 근분화 역동적 상태를 추적할 수 있습니다.

구순구개열은 인간에게서 가장 흔히 발생하는 두개안면 기형 중 하나입니다. 구개열이 있을 경우, 결손 부위를 폐쇄하고 정상적인 언어 발달을 가능하게 하기 위해 외과적 수술이 필요합니다. 그러나 섬유화와 결함이 있는 근육 재생은 연구개 근육의 기능적 회복을 저해할 수 있습니다. 구개열 수술 후, 밀리미터 크기의 세포외 기질 겔 스팟 코팅을 사용하여 갓 분리한 위성 세포를 배양하는 혁신적인 방법을 시연할 수 있습니다.

이렇게 하면 확장 과정이 필요하지 않습니다. 분리 하루 전, 8-well chamber slide를 100 millimeter Petri dish에 넣고 dish를 차가운 표면에 둡니다. 10분 후, 미리 충전된 마이크로 피펫을 사용하여 각 well에 extracellular matrix gel 10 microliter 한 방울씩을 분주합니다.

슬라이드를 7분 더 냉각시킨 후, 남은 젤을 완전히 제거하고 다음 날 37 °C에서 밤새 웰을 건조시킵니다. 저작근을 해부하려면 9주 된 쥐의 머리에서 피부를 제거하고 피하 주사 바늘을 사용하여 머리를 옆으로 고정합니다. 실리콘 패드 위에서 귀밑샘과 안면신경을 분리한 다음 샘을 제거합니다.

다음으로 15번 메스 날을 사용하여 안면 신경을 조심스럽게 제거합니다. 교근의 표층두를 확인합니다. 그다음 직선 핀셋을 사용하여 광대돌기 기시부로부터 힘줄을 분리한 후, 해부 가위로 힘줄을 조심스럽게 절단합니다.

메스를 사용하여 하악각과 하악지 외측면의 하단부 부착 지점까지 교근의 표층두를 박리합니다. 이복근의 후복을 박리하려면, 바늘로 머리를 앙와위로 고정하고 설하선과 악하선 위에 덮인 피하 지방을 제거합니다. 이복근의 전복과 후복을 노출시킨 다음, 직선 핀셋으로 후복의 전측 힘줄을 잡고 고실포의 기시점까지 힘줄을 조심스럽게 절개하여 박리합니다.

levada vli palatino 근육을 박리하려면 stylo halloid 근육의 위치를 확인하십시오. 이를 외측으로 당기고 근육 조직을 조심스럽게 제거합니다. 다음으로, tympanic buller에 삽입되는 levada vli palatino의 건 위치를 확인하고 조심스럽게 박리하십시오.

그런 다음 기관 뒤에서 식도를 들어 올립니다. levada vli palate가 삽입된 연구개 부위를 확인하고 해당 근육을 절단하여 분리합니다. 그 후 근육을 70% ethanol에 담갔다가 항생제가 첨가된 얼음처럼 차가운 PBS로 옮깁니다.

위성 세포를 분리하려면, 각 근육을 6-웰 플레이트의 개별 웰로 옮긴 후 조직을 2 mm 크기의 작은 조각으로 자릅니다. 이때 근육을 너무 잘게 다지지 않도록 주의하십시오. 다음으로, 조직 조각을 웰당 2.5 mL의 0.1% pronase 용액에 넣고 37 °C에서 60분 동안 배양하며, 20분마다 가볍게 흔들어 줍니다.

섬유 다발이 느슨해진 모습이 보이면, 각 웰에 말 혈청과 항생제가 첨가된 DMEM 2.5 milliliters를 넣고 소화된 조직을 각각의 15 milliliter 원추형 튜브로 옮깁니다. 조직 슬러리를 원심 분리하여 상층액을 따라냅니다. 그 다음, 각 튜브에 배지 5 milliliters를 추가하고 10 milliliter 플라스틱 피펫으로 조직을 균질화합니다.

조직을 다시 원심 분리하고 상층액을 새로운 15 milliliter 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 튜브에 배지를 5 milliliter 더 추가하고, 파편이 피펫을 통해 쉽게 통과할 때까지 조직 조각들을 다시 Trituration 합니다. 다시 한번 원심 분리한 후, 상층액을 해당 튜브로 옮기고 세포 현탁액을 40 micrometer 스트레이너로 여과하여 각각의 50 milliliter 튜브에 담습니다.

세포 회수율을 극대화하기 위해 스트레이너를 1 mL의 DMEM으로 세척합니다. 그런 다음 세포를 원심 분리하고, 펠렛을 신선한 배지에 다시 현탁한 뒤 세포 수를 측정하여 분리된 위성 세포를 배양합니다. 이어서, 세포 현탁액을 배지 10 µL당 1.5 × 10³ cells 농도로 희석합니다.

그다음, 이전에 준비한 각 세포외 기질 젤 스팟에 세포 10 µL를 첨가하고, 6시간 후 37 °C에서 젤을 배양합니다. 각 젤 스팟에 배양액 400 µL를 조심스럽게 첨가하고 슬라이드를 다시 인큐베이터에 넣습니다. 3일 후, 분리 직후에 적절한 배양액을 첨가하여 세포 분화를 유도합니다.

갓 분리된 위성 세포의 90% 이상이 Pax7을 발현합니다. 4일 차가 되면 모든 근육군의 위성 세포에서 Pax7과 MyoD가 발현됩니다. Myogenin은 7일 차에 모든 근육군에서 높게 발현됩니다. 세포외 기질 겔 스폿(gel spots)에 파종한 지 4일 후, 증식하는 세포들이 융합하여 작은 다핵 근관(myotubes)을 형성하기 시작하며, 이는 7일 및 10일 차에 myosin heavy chain을 발현합니다.

10일 차가 되면 길고 잘 조직된 근관(myotube)이 뚜렷하게 나타납니다. 또한 근관의 수축(twitching)을 관찰할 수 있습니다. 본 프로토콜은 쥐의 머리 근육에서 유래한 위성 세포 연구를 가능하게 하며, 구개열 환자 치료를 위한 새로운 가능성을 제시합니다.