Name: 키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: 학습하세요 역유전학을 활용한 재조합 인플루엔자 백신 생성 및 키메라 마우스 모델에서 수지상 세포 이동과 CD8 양성 T 세포 증식을 분석하는 방법을. 이 기술은 백신 유도 면역의 세포 표적을 규명하여 새로운 백신 플랫폼 평가에 활용됩니다.

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마우스 실험에 대한 탁월한 기술 지원을 해주신 Sergio Gómez-Medina에게 감사드립니다. 이 연구는 라이프니츠 협회(Leibniz Association)와 라이프니츠 감염 센터(Leibniz Center of Infection)의 기금으로 지원되었습니다. A.L.은 라이프니츠 대학원에서 박사 전 펠로우십을 받았습니다.

동물 실험은 승인 된 프로토콜과 독일의 동물 보호 법률의 지침을 따라 수행 하였다. 동물 실험을 수행하는 모든 직원은 카테고리 B 또는 유럽 실험 동물 과학 연맹의 C에 따라 훈련 프로그램을 통과시켰다. 역 유전학에 의해 재조합 약독 화 인플루엔자 백신의 1 세대 참고 : 역 유전학에 의해 재조합 인플루엔자 바이러스의 생성에 대한 자세한 프로토콜은 이전의 연구 (5)에 의해 설명이 보고서의 범위를 벗어나있다. 간단히, 추위에 적응 인플루엔자 백신 (CAV)의 구조는 바이오 안전성 수준에 따라 바이오 안전성 클래스 II 캐비닛 2 (BSL2) 봉쇄를 수행하고, 아래에 자세히 단계를 포함한다. 형질 감염 프로토콜의 다음 마르티네즈 - Sobrido 등. 5. <ol><li> 재조합 체 감기 적응 인플루엔자를 생성배경으로 냉 적응 된 균주 A / Ann 나무 / 60분의 6 (H2N2)뿐만 아니라, 헤 마글 루티 닌 (HA)과 변형 뉴 라미니다 제 (NA)를 A / PR / 8 / 34 (H1N1) 균주 (사용 백신 도 1a). NA 유전자 변형 닭의 난백 알부민 (OVA) 유래 펩타이드 SIINFEKL (그림 1B)를 암호화하는 짧은 cDNA 서열에 의한 단백질 줄기 (잔류 65-72)에 보존 시퀀스의 PCR 기반의 교체로 구성되어 있습니다. SIINFEKL 펩티드는 C57BL / 6 생쥐 (12)의 응답이 I 제한된 H-2B MHC 클래스의 문맥에서 매우 면역 펩티드이다. </li><li> 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / E)이 보충 된 DMEM, 10 % 소 태아 혈청 (FBS)을 사용하여 6 웰 플레이트에 웰 당 접시 106 293T 세포. </li><li> 플라스미드 형질 전환 혼합물을 준비합니다 추가 NA 인코딩 PB2, PB1, PA, NP, M, NS 인플루엔자 A / 앤아버 / 60분의 6 변형에 대한 cDNA를하고 플라스미드의 1 μg의를 암호화하는 플라스미드 각각 1 μg의 -SIINFEKL과인플루엔자 A / PR / 8 / 34에서 HA. (/ 잘 100 μL의 최종 부피 15 μl를) 티멤를 미리 예열 추가. </li><li> RT에서 30 분 동안 형질 믹스 부화. </li><li> 잘 / 형질 믹스 100 μl를 추가하고 37 ℃에서 16 시간, 5 % CO 2 품어. </li><li> 5 시간 동안 CO 2를 33 ℃에서 DMEM 0.3 % BSA 1 % P / E로 세포 매체를 변경하고 5 %. </li><li> L-1-Tosylamide -2- 페닐 에틸 클로로 메틸 케톤 (TPCK-트립신)으로 처리 소 췌장 트립신의 1 ㎍ / ㎖의 DMSO를 함유하는 10 6 인플루엔자 허용 MDCK 세포를 추가한다. 33 ℃에서 3 일, 5 % CO 2 - 2 293T - MDCK 공동 문화를 유지한다. </li><li> 5 분 260 XG에서 원심 분리하여 MDCK-293T 세포의 공동 문화의 상층 액과 명확한를 수집합니다. </li><li> 멸균 조건 10 일 된 닭 유정란 - 9 접종. 마르티네스-Sobrido 등에 의해 나타낸 바와 같이,이를 위해, 껍질의 상부에 구멍을 만든다. 5. </li><li> 달걀 껍질 기지를 커버시간은 면봉을 사용하여 33 ℃에서 3 일간 접종 닭 알을 품어 왁스를 용융. </li><li> 감염된 유정란에서 막액을 수확 : 70 % 에탄올로 달걀 껍질을 씻으십시오. 아주 부드럽게 상부에 균열 및 멸균 집게를 사용하여 뇨 막을 제거와 계란을 엽니 다. (- 10 ml의 일반적으로 6) 가능한 한 많은 유체를 수집하기 위해 10 ML의 피펫을 사용합니다. 4 ℃에서 10 분 동안 260 XG에 원심 분리기 새로운 튜브로 뇨 삭제 유체를 전송합니다. </li></ol> 2. 추적 백신 별 내성 <ol><li> 펩타이드 함유 수지상 세포의 추적 (DCS) <ol><li> 마우스 접종, 정밀 기화기를 사용 산소 5 % 이소 플루 란으로 마취 된 마우스. 마우스 콧 구멍에 직접 방울을 통해 SIINFEKL 펩타이드를 발현하는 백신의 10 3 플라크 형성 단위 (PFU)를 포함하는 PBS의 50 μl를 관리하는 200 μL 피펫을 사용합니다. </li><li> 백신 접종 후, euthaniz 세 일이소 플루 란 마취를 통해 E 마우스는 경추 탈구시켰다. </li><li> 단지 집게로 흉곽 아래의 중간 선에서 마우스 피부를 들어 올리고 가위로 피부를 통해 작은 절개를 잘라. 5cm 길이 양쪽 끝에서 옆으로 중간 선에서 다음, 머리와 꼬리 양쪽을 향해 피부를 통해 두 2cm의 절개를 잘라 - 절개의 관점에서, 3합니다. 껍질은 다시 피부는 복막과 흉부 충치를 공개합니다. 조심스럽게 가슴을 노출 복막을 둘러싼 세포막을 통해 잘라. </li><li> 종격동이 diafragma와 케이지 리브의 바닥을 잘라 액세스 할 수 있습니다. 약간 지느러미와 기관의 복부 측면에 가까운, 완두 동맥 내측에 인접, 흉선에 횡 방향으로 인접 찾기 및 2 종격동 림프절 (mLNs)를 제거합니다. </li><li> mLNs는 곡선 집게를 사용하여 수확합니다. 림프절 아래 집게를 놓고 부드럽게를 당깁니다. DMEM 1ml를 포함하는 6 웰 플레이트에서 림프절을 배치하고 접속 .. 제거적이거나 지방 조직 주변 노드. <ol><li> 1 ml의 주사기에 부착 된 두 개의 26 G 바늘로 완전히 각각의 샘플을 애무 해줘. 다른 바늘 림프 노드를 엽니 다 파괴하면서 림프절을 애타게, 하나의 바늘을 누르고 있습니다. 이것이 제대로하면 림프절에서 붕괴 농축 세포를 배지에서 쉽게 관찰된다. 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 70 ㎛의 나일론 필터를 통해 모든 조직 재료를 전달. </li></ol></li><li> 냉장 원심 분리기 260 XG에 10 분 동안 원심 분리기 단일 세포 현탁액. 적혈구를 용해시키기 위해 적혈구 용균 (RBCL) 완충액 2 ㎖로 세포 펠렛을 재현 탁. 용해는 실온에서 3 분간 할 수있게합니다. </li><li> 얼음 - 냉각 PBS로 2 ㎖를 원심 분리하고 세포를 재현 탁 통해 RBCL 버퍼 중화. </li><li> 플레이트에 세포를 100 μL의 최종 부피 107 세포 / ml의 농도로 96 웰 플레이트를 U 자형. </li><li> 분석 블록 셀의 Fc- 수용체를 이용한 유동 세포 계측법얼음에 15 분 동안 10 6 세포 당 항 마우스 CD16 / CD32 항체의 1 μg의. </li><li> 원심 분리기 플레이트와 플레이트 쓸어 넘겨 상층 액을 버린다. 선택의 표면 항체 조합으로 개별 우물을 품어. 일반적으로 림프절에서 수지상 세포의 검출, 항체 칵테일은 다음을 포함한다 : 0.25 방지하는 CD11c의 μg의, CD11b를 0.25 μg의, MHC 클래스 II의 0.5 μg의, CD103의 0.25 μg의 100의 최종 부피에 CD8α 0.15 μg의를 μL. </li><li> 음의 게이트를 들어, 항 CD3, CD19, NK1.1 또는 혈통 칵테일 (그림 2A)의 0.25 μg의를 추가합니다. 대체 게이팅 전략뿐만 아니라 다수의 형광 염료의 적절한 보상을위한 프로토콜은 면역 게놈 프로젝트의 웹 사이트에서 찾을 수 있습니다. 원하는 표면 마커 이외에도, 칵테일에 SIINFEKL 수밖에 H-2K의 B에 대한 항체 1 μg의 추가. 이 상업적으로 이용 가능한 항체는 DC가 난의 시각화 수 있습니다SIINFEKL 펩타이드가 MHC 클래스 I.를 표면에 결합되는 N </li><li> 얼음에 30 분 동안 표면 항체와 세포를 품어. 빛 플레이트를 보호합니다. 260 XG에 원심 분리기 판 5 분 동안 PBS로 두 번 2 ㎖로 세척한다. 분석을 위해 세포 계측법 튜브 흐름 세포를 전송합니다. </li></ol></li><li> 백신 특이 T 세포 증식의 평가 <ol><li> 시판 TCR 유전자 변형 마우스 (OT-I 마우스)로부터 공여 T 세포를 구하는 (C57BL / 6-TG와 (TCR aTcrb) 1100Mjb / J)가있는 모든 생성 CD8 T 세포 SIINFEKL 펩타이드에 특이. 자궁 경부 전위 다음 이소 플루 란 마취로 쥐를 안락사. 복강에 절개를 수행하여 수확 비장. DMEM / 비장의 2 ml의 비장 / S를 놓고 결합과 지방 조직을 제거합니다. </li><li> 2.1.2 및 2.1.3에 기술 된 절차에 따라, 비장으로부터 단일 세포 현탁액을 생성한다. </li><li> 상기 T 세포의 단일 세포 현탁액을 농축, 자기 비드 분리 프로토콜을 적용양 또는 음의 선택 절차 (12)를 사용. 받는 사람 세포에서 기증자를 차별화 기증자 T 세포가 CD45.2 12 표현 예를 들어받는 사람 마우스 백혈구 마커 CD45.1을 표현할 수 있도록 congenic 마우스를 사용합니다. </li><li> T 세포를 레이블링하기 위해 5 × 106 세포 / ml의 최적의 셀 밀도에 카르복시 숙신 이미 딜 에스터 (CFSE) 5 μM을 함유하는 1 ml의 PBS에서 그들을 부화. 빛 노출로부터 보호 37 ℃에서 20 분 동안 세포를 품어. 배양 후, 3 ml의 소 태아 혈청 (FBS) 5 분, 폐기 상등액 재현 탁하고 세포를 260 XG에 원심 세포 CFSE 중화. </li><li> PBS의 적절한 볼륨에서 10 분, 재현 탁 동안 260 XG에 원심 분리기 세포 용액 100 ㎕를 2 × 10 6 세포를 함유하도록. 2 × 10 6 세포 / 복고풍 궤도 동 주사 (13)를 통해 마우스를 사용하여받는 사람 congenic 쥐를 달이다. </li><li> 일 3, 4 및 5에서 수신자 사후 마우스를 안락사자궁 경부 전위 다음 이소 플루 란 마취를 사용하여 예방 접종. 종격동 림프절을 수확하고 2.1.2-2.1.5에 표시된 유동 세포 계측법에 대한 단일 세포 현탁액을 준비합니다. </li><li> 포함한 항체 칵테일 100 ㎕의 단일 세포 현탁액을 염색하여 공여 세포를 식별 : 항 - 마우스 CD3, CD4 및 CD8 항체를 0.25 μg의; 항 - 마우스 또는 CD45.1 CD45.2 항체 (공여 세포의 표현형에 따라) 0.5 μg의. CFSE (12) (그림 2B)의 희석 프로파일을 결정하기 위해 열린 (FITC) 흐름 cytometer의 FL-1 채널을 남겨주세요. </li></ol></li></ol> 유전자 특정 백신 응답을 해부 3. 키메라 마우스 주 : DTR 계 마우스 모델을 사용하여 경쟁 골수 키메라의 생성은 백신에 대한 면역 반응 동안 셀 고유 함수의 차별을 허용한다. 여기에서 우리는의 조합에 의해 기증자 C를 DTR 발현 추가 전략을 보여녹아웃 쥐 허가의 세포와 ELL 학생은 특정 세포 구획에서 면역 유전자 중 특정 기능을 연구한다. 예에서 우리는 Langerin + CD103 + 수지상의 수신자 같은 수용체 3 (TLR3)의 특정 삭제와 마우스를 생성합니다. <ol><li> 골수 공여 세포의 제조 <ol><li> 바이오 안전성 레벨 II 장에서 작업 할 수 있습니다. 독점적으로 멸균 악기를 사용하여 오염을 피하십시오. </li><li> 골수 키메라 쥐를 생성받는 사람으로 congenic CD45.1 + C57BL / 6 암컷 마우스를 사용 TLR3 사용 - / -, Langerin-DTR / EGFP, 또는 중량 마우스 기증자로 CD45.2 +를 표현합니다. congenic 기증자와받는 사람 마우스를 사용하여 유동 세포 계측법을 통해 기증자와받는 사람 세포의 분화를 허용하고이 생착을 평가 할 수 있습니다. </li><li> , 기증자의 골수 세포를 얻기 자궁 경부 전위 다음 이소 플루 란 마취와 기증자 쥐를 안락사합니다. 날카로운 가위는 발목 주위에 절개를 수행으로 M 있도록여러개 근육이 노출되어있다. </li><li> 그 다리 근육이 표시되도록 사용 무딘 집게는 엉덩이쪽으로 발목에서 부드럽게 마우스 모피를 당깁니다. </li><li> 날카로운 가위로 엉덩이의 높이와 대퇴골의 머리 위에 마우스 다리를 잘라. </li><li> 배양 접시에 얼음에 다리를 놓습니다. 빠른 작업과 뼈를 노출하는 모든 근육을 제거합니다. </li><li> 별도의 대퇴골과 경골. 가능한 세균을 제거하고 무 혈청 DMEM 5 ㎖를 함유하는 다른 페트리 접시에 즉시 배치를 5 분 동안 70 % 에탄올 용액에서 뼈를 놓는다. 잘라 뼈는 DMEM으로 골수를 날카로운 가위를 사용하여 세척 끝납니다. 5 ML의 주사기에 부착 된 26 G 바늘을 삽입하여 뼈에, 그래서 DMEM의 플러시 1 ml의 작업을 수행합니다. 뼈는 세척 후에는 흰색 (빈)보고해야합니다. </li><li> DMEM 10ml에 공여 마우스의 모든 골수 세포를 수집. 70 μm의 셀 스트레이너를 통해 수확 전달하여 골수 세포의 단일 세포 현탁액을 생성한다. </li><li> CL냉장 원심 분리기에서 4 ° C에서 10 분 동안 260 XG에서 원심 분리하여 골수 세포의 귀 단일 세포 현탁액. PBS 10 ㎖에 재현 탁 된 세포 펠렛. 2.1.3 및 2.1.4에 기술 된 바와 같이 RBCL 용액을 사용하여 적혈구를 고갈. </li><li> 혈구 또는 자동 세포 계수기를 사용하여 골수 세포를 카운트. 트리 판 블루 염색 (13)를 통해 죽은 세포의 결정에 의해 세포 생존 능력을 평가합니다. 최적으로는 적어도 80 %의 생존율을 가진 하나의 동물 수율 약 3 × 107 개의 백혈구 세포 / 마우스. </li><li> - / - 또는 중량 공여 세포 전체 골수 키메라의 경우, TLR-3을 제조. PBS 100 ㎕에서 2 × 106 세포는 이식을 위해 사용되기 때문에 최적의 세포 농도를 2 × 107 세포 / ㎖이다. 즉시 사용하지 않으면, 10 % DMSO로 느린 냉동 FBS 및 기법을 사용하여 -80 ° C에서 공여 세포를 보존. 혼합 된 키메라 모델 들어 Langerin-DTR 공여자 세포와 혼합 TLR3 - / - </sup&gt; 75:25 비율 공여 세포. 대조군 마우스를 생성하기 위해 골수 세포 중량 25 Langerin-DTR : 75의 혼합을 준비한다. </li></ol></li><li> 마우스 조사 및 이식 <ol><li> 세슘 137 소스 조사기 연령의 6~8주 사이의 여성 쥐를 조사. 쥐에게 떨어져 550 RAD 4 시간의 두 가지 용량을 제공합니다. 분할 조사는 급성 간 독성을 최소화하고, 따라서 조사 프로토콜에 의한 마우스의 치사율을 감소시킨다. </li><li> 조사 후, 2 주 동안 항생제로 치료에서 쥐를 유지한다. Baytril / ㎏의 5 mg의 - 2.5에서 식수와 항생제를주십시오. </li><li> 2 - 두 번째 조사 후 4 시간, 정맥 기증자의 골수 세포 이식 마우스. 2 × 106 세포를 함유하는 PBS 100 ㎕의 최대 음량을 사용하여 레트로 안와 분사 (13)를 통해 이소 플루 란 마취하에 공여 세포의 주입을 수행한다. </li><li> 네 개의 주 이식 후, (100)의 샘플을 평가 생착적어도 두 가지 색상을 판독 할 수있는 기계를 사용하여 유세포 분석을 통해 말초 혈액 μL. 시중에서 판매하는 형광 표지 CD45.1 및 1/100과 1/200 사이에 희석을 사용 CD45.2 항 마우스 항체를 사용, 기증자와 라디오 방지받는 사람 세포를 구분합니다. 공여 세포의 생착 최적의 말초 혈액에서 전체 조혈 세포의 적어도 80 %이어야한다. </li></ol></li><li> 예방 접종 대상이 고갈 <ol><li> 비강을 통해 재조합 라이브 감쇠 인플루엔자 백신과 쥐를 예방 접종. 마우스 접종, 정밀 기화기를 사용 산소 5 % 이소 플루 란으로 마취 된 마우스. 백신의 10 3 플라크 형성 단위 (PFU)를 포함하는 PBS의 50 μl를 관리하는 200 μL 피펫을 사용합니다. </li><li> 최종 마우스 모델을 생성하기 위해, 비강 PBS의 50 μL에 희석 DT 50 NG와 쥐를 치료​​. 3.3.1에 ​​설명 된대로 마취 된 쥐의 콧 구멍에 직접 강하에 의한 DT 드롭을 관리 할 수​​ 있습니다. 취급의 미2 일 백신 접종 후 (그림 3B)까지 예방 접종 전날 -2에 치료를 시작 매일 복용과 CE. </li></ol></li></ol>

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본 연구에서는 백신 유발 면역 생리학 및 분자 메커니즘을 규명하기 위해 이용 될 수있는 방법을 역 유전학 및 키메라 마우스 모델을 설명한다. 인플루엔자 역 유전학은 많은 실험실에서 설립 및 인플루엔자 발병 기전, 복제 및 전송 (17)을 이해하는데 주요한 역할을하고있다. 우리의 프로토콜의 핵심은 외국 항원을 표현 추위 적응 인플루엔자 백신의 구조입니다. 뉴 라미의 줄기로 짧은 cDNA를 도입 전략은 여러 그룹에 의해 설명되었지만, 연구자들은 추가적인 돌연변이 계란 백신 제조시 및 백신이 유도없이 호흡기로 복제 할 수 있음을 도입되지 않도록 할 필요 폐렴 5,12-. 바이러스 성 뉴 라미니다 제의 줄기뿐만 아니라 NS 유전자 분절과 PB1 세그먼트로서 인플루엔자 바이러스 게놈의 다른 영역들 모두 때문에 외래 서열 1의 할당을 허용9,20, 우리의 프로토콜의 수정은, 예를 들어, 인플루엔자 바이러스, 백신 합리적인 디자인 핵심 대하여 T 세포 면역 반응의 계층 구조를 이해...

질병의 부재하에 면역 학적 기억의 발생이 효율적으로 접종 한 생리 기초이다. 최근, 시스템 생물학 기반의 접근 방식은 이러한 황열병 백신 성공적인 백신, 차례로, 리드 항원의 활성화를 multilineage하는 선천성 면역 반응과 수지상 세포 (DCS)의 여러 부분 집합의 활성화 강력한 유도를 유도하는 것으로 밝혀졌다 특정 T 세포 2,3-. DC가 항원 특이 나이브 T 세포 (4)를 활성화 할 수있는 능력을 가진 경우에만 면역 세포 집단이므로, 예방 접종 동안 그들의 기능의 연구는 백신에 대한 면역 반응을 이해하고 도전 병원균 미래 전략을 설계하는 것이 중요하다. 백신에 대한 면역 반응시 DC가 다른 서브 세트들의 추적을 허용하는 시스템을 제공하는 것이다 림프 조직으로 DC 이동의 정확한 동력학을 설정하기 위해 바람직하고, 것백신 특정 적응성 면역 개시 할 책임 생리 메커니즘 통찰력. 유전학을 기반 역방향 접근 방식은 가능성이 수정 생성이 목적으로 실험적으로 사용할 수있는 생균 백신을 제공합니다. 인플루엔자 연구에 구현하기 때문에, 플라스미드 - 기초 역 유전학 널리 LAIVs 포함한 재조합 인플루엔자 균주를 생성하기 위해 사용되어왔다. 표준 프로토콜은 (재조합 인플루엔자 바이러스는 Madin-다비 개과의 신장과 같은 허용 시스템에서의 증폭뿐만 아니라 여덟 인플루엔자 바이러스 분절을 함유 ambisense 플라스미드 매우 형질 세포주 (포지티브 및 네거티브 센스 RNA 모두 제조)의 다 형질을 필요 구출 MDCK) 세포 및 / 또는 닭 유정란 5. 그러나, 백신의 면역 기전을 연구하기 위해 분자 도구를 생성하는 역 유전학의 적용은 비경 남아있다. 세대수지상 세포를 포함하는 면역 세포 하위 집합의 특정 고갈을 허용하는 새로운 마우스 모델, 백신 유도 보호의 기초가되는 기본 면역 메커니즘을 이해하는 새로운 가능성을 열었다. 마우스와 인간에서의 DC 서브 세트 함수 사이의 비교는 크게, 마우스 및 인간 DC가 강하게 상동 기능적 이러한 발견 -6,7-있는 마우스 모델의 개발은 정상 상태의 DC 특이 공핍을 허용하는 것이 제안 것을 밝혔다 염증 상태 동안, 인간 DC 응답의 생리를 이해 될 수있다. 최근 마우스 모델의 수는 8,9 관심의 유전자의 프로모터 영역의 제어하에 유인원 디프테리아 독소 (DT) 수용체 (DTR)를 발현하는 유전자를 운반 생성되었다. 마우스 조직 자연스럽게 DTR을 표현하지 않기 때문에,이 모델은 DT와 마우스 접종에 따라 관심의 대상으로 유전자를 운반하는 세포의 부분 집합의 조건 고갈을 할 수 있습니다. 따라서, 우리의 abili생리 학적 과정에서 생체 내에서 특정 수지상 등의 백혈구를 소모하는 타이는 크게 DTR 기반 RO의 개발에 의해 향상되었습니다. 이들 트랜스 제닉 마우스 모델은 면역계의 개체 발생을 이해하기 위해 광범위하게 사용되었지만 그러나, 백신 개발에 따라 적용이 부족하게 테스트되지 않았다. 여기서, 인플루엔자 역 유전학 DTR 기반 경쟁 골수 키메라를 결합함으로써, 우리는 생체 내에서 백신에 대한 면역 반응 동안 백신 면역뿐만 아니라 개개의 유전자 기능의 동역학을 연구하는 방법을 제안한다. 도전 감염성 질병에 대한 새로운 백신의 임상 평가를 위해이 기술의 응용은 백신 설계 합리화 및 생체 내 백신 후보를 테스트하는 데 도움이 될 수.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&acute; s Modified Eagle Medium (DMEM 1x)</td><td>Gibco RL-Life Technologies</td><td>41965-039</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Gibco RL-Life Technologies</td><td>31985-047</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen-Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)</td><td>PAA</td><td>p11-010</td><td></td></tr><tr><td>소 혈청 알부민</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>배아 난자</td><td>Valo biomedia Gmbh</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; M 나일론 필터</td><td>Greiner-Biorad</td><td>542-070</td><td></td></tr><tr><td>적혈구 용해 완충액 (RBCL) 10x</td><td>BD Bioscience</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>CD16 / CD32 마우스 BD Fc 블록 (2.4G2)</td> <td>BD Pharmigen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)</td> <td>Biolegend</td><td>141605</td><td></td></tr><tr><td>PE-Anti-mouse CD11c (HLA3)</td> <td>BD Biosciences</td><td>553802</td><td></td></tr><tr><td>eFluor 450-안티-마우스 MHCII (Md/114.15.2)</td><td>eBioscience</td><td>48-5321-82</td><td></td></tr><tr><td>Pe-Cy7-안티-마우스 CD11b (M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101216</td><td></td></tr><tr><td>PerCp/Cy5.5-안티-마우스 CD103 (2E7)</td><td>Biolegend</td><td>121416</td><td></td></tr><tr><td>PE-안티-마우스 CD45.1 (A20)</td><td>eBioscience</td><td>12-0453-82</td><td></td></tr><tr><td>V500-안티-마우스 CD45.2 (1O4)</td><td>BD 바이오사이언</td>스 <td>562130</td><td></td></tr><tr><td>PerCp-eFluor710 -안티-마우스 CD8a (53-6.7)</td><td>eBioscience</td><td>46-0081-80</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7-안티-마우스 CD3&엡실론; (145-2611년)</td><td>Biolegend</td><td>100325</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)</td><td>eBioscience</td><td>48-0041-80</td><td></td></tr><tr><td>CFSE Proliferation dye</td><td>eBioscience</td><td>65-0850-85</td><td></td></tr><tr><td>Baytril 2.5%</td><td>Bayer</td><td>65-0850-85</td><td></td></tr><tr><td>Dymethil-Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Ovalbumin&nbsp;</td><td>분자 프로브&nbsp;</td><td>O23020</td><td></td></tr><tr><td>디프테리아 독소(DT)</td><td>시그마-알드리치</td><td>D0564</td><td></td></tr><tr><td>트립신-TPCK</td><td>, 시그마-알드리치</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>BD FACsCanto II 유세포 분석기</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo 세포 분석 소프트웨어 9.5</td><td>Flowjo inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>트리판 블루 스테인 (0.4%)&nbsp;</td><td>라이프 테크놀로지</td>스 <td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>백작 자동 세포 계수기</td><td>Invitrogen-Life Technologies</td><td>C10227</td><td></td></tr></tbody></table>

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

백신은 인류의 가장 위대한 업적 중 하나이며 지난 세기 동안 수백만 명의 생명을 구했습니다. 역설적이게도, 백신에 대한 면역 반응을 매개하는 생리학적 메커니즘에 대해서는 알려진 바가 거의 없는데, 이는 백신 접종의 전반적인 성공으로 인해 백신 면역의 분자 및 생리학적 메커니즘에 대한 관심이 줄어들었기 때문일 수 있습니다. 그러나 인플루엔자 바이러스를 포함한 몇 가지 중요한 인간 병원체는 여전히 백신 접종에 어려움을 제기하고 있으며 면역 기반 전략의 이점을 얻을 수 있습니다. 
인플루엔자 역유전학이 약독화 생독감 백신(LAIV) 생성에 성공적으로 적용되었지만, 생체 내 백신 접종의 동역학을 추적하기 위한 추적 성분과 같은 백신 제제에 분자 도구를 추가하는 것은 다루어지지 않았습니다. 또한, 동역학 연구 중에 백혈구의 특정 고갈을 허용하는 최신 마우스 모델은 백신으로 유도된 보호의 기저에 있는 기본 면역 메커니즘을 이해할 수 있는 기회의 창을 열었습니다. 여기에서는 역유전학과 키메라 마우스 모델의 조합이 재조합, 저온 적응, 약독화 생독감 백신(LAIV)을 예로 들어 백신이 생리학적 및 분자 수준에서 어떻게 작용하는지에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 데 어떻게 도움이 될 수 있는지 설명합니다. 우리는 세포 추적자와 경쟁 골수 키메라(BMC)를 보유하고 있는 실험실에서 생성된 LAIV를 활용하여 백신 면역의 초기 동역학과 백신 특이적 적응 면역의 시작을 담당하는 주요 생리학적 메커니즘을 확인했습니다. 또한 이 기술이 백신에 대한 면역 반응 중 단일 동물의 유전자 기능 연구를 촉진할 수 있는 방법을 보여줍니다. 우리는 이 기술을 적용하여 인플루엔자, HIV, 플라스모디움 및 에볼라 바이러스와 같은 출혈열 바이러스와 같은 긴급한 의료 대책이 필요한 병원체에 대한 현재의 예방 전략을 개선할 수 있다고 제안합니다.

재조합 인플루엔자 생균 백신의 생성은 양방향 5 프로모터의 제어하에 인플루엔자 바이러스의 8 세그먼트를 코딩하는 플라스미드의 형질 감염에 의해 달성 될 수있다. 추위에 적응 된 인플루엔자 백신은 일반적으로 감기에 적응 변형뿐만 아니라 선택의 인플루엔자 균주의 HA 및 NA (예, H1N1) (그림 1A)의 여섯 세그먼트가 포함되어 있습니다. 냉 적응의 원리는 33 ° C, 마우스 및 인간 (14) 상부 호흡기 (URT)의 온도에서 바이러스 복제 제한에 기초한다. 따라서, 백신 URT에 어느 정도 복제 할 수 있지만, 하부 호흡기 폐렴을 야기 할 수 없다. 바이러스 뉴 라미니다 아제 (NA)의 줄기에 융합 PCR 기술, 보존 영역을 사용하는 것은 추적 OVA 유래 펩타이드 (SIINFEKL) (그림 1B)로 대체되었다. 역학 연구에서 백신 별 응답을 추적하려면 우...

백신이 어떻게 작용하는지에 대한 전반적인 지식이 부족합니다. 여기에서는 수지상 세포와 T 세포 면역에 특히 중점을 두고 백신에 대한 초기 숙주 면역 반응에 대한 통찰력을 얻기 위해 역유전학과 골수 키메라 마우스를 함께 사용할 것을 제안합니다.

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

본 절차의 전반적인 목표는 백신 특이적 적응 면역의 생리적 개시를 평가하는 시스템을 설명하는 것입니다. 이를 위해 먼저 역유전학을 사용하여 특정 면역원성 펩타이드를 포함하는 약독화 생백신 인플루엔자를 생성하고, 이후 병아리 배아를 이용하여 바이러스를 증식시킵니다. 다음으로 백신 접종 마우스의 림프절에서 세포를 수확하며, FACS 분석을 통해 수지상 세포의 이동을 추적합니다.다음 분석에서는 면역원성 펩타이드에 반응하는 CD8 양성 T 세포를 표지하여 백신 접종 쥐에 주입한 후, FACS 분석을 통해 해당 세포의 증식을 측정함으로써 면역 반응을 더욱 상세히 분석합니다. 경쟁적 골수 키메라(competitive bone marrow chimera)는 방사선 조사를 받은 동계 쥐에 디프테리아 독소 수용체를 발현하는 골수 세포를 주입한 후, 디프테리아 독소에 노출시켜 제작합니다. 성공적으로 세포 고갈이 이루어지면 쥐에게 백신을 접종하고, 표지된 항체와 테트라머를 사용하여 CD8 양성 T 세포를 식별합니다.특이적 펩타이드의 인식. 이 방법은 백신이 신경학적 수준에서 어떻게 작용하는지, 백신의 주요 세포 및 분자 표적은 무엇인지, 그리고 가장 중요하게는 현재의 예방 전략을 어떻게 개선할 수 있는지와 같은 백신학 분야의 핵심 질문들에 답하는 데 도움을 줄 수 있습니다. 시연 절차는 Sanmen Medina이 진행합니다.본 연구실 관리자와 저는 이 프로토콜을 통해 냉적응 균주인 A Ann Arbor 6 60을 배경으로 하고, A PR 8 34 균주의 헤마글루티닌과 변형된 뉴라미니다아제가 결합된 재조합 냉적응 인플루엔자 백신을 제조합니다.뉴라미니데이스 유전자의 단백질 스토크 서열 일부가 닭 펩타이드 syn fecal을 코딩하는 짧은 CDNA 서열로 교체되었습니다. 이 펩타이드는 H2 BMHC 클래스에서 매우 강한 면역 우세성을 보이며, C 57 black six 마우스의 제한적 반응 중 하나로 작용하여 추적 가능 요소로 기능합니다.먼저 6-웰 플레이트의 각 웰에 1,000,002개의 T 세포를 10% fetal bovine serum과 1% pen strep이 포함된 DMEM과 함께 분주합니다. 다음으로, 웰당 100 µL 분량의 플라스미드 트랜스펙션 혼합물을 준비합니다. 각 플라스미드 1 µg을 혼합하고, 다른 튜브에 예열된 Opti-MEM 세포 배지를 50 µL까지 채웁니다.세포에 트랜스펙션 혼합물을 첨가하기 전, 트랜스펙션할 플라스미드의 총량에 해당하는 2배 부피의 lipectomy 2000을 넣고 opti MEM으로 튜브의 최종 부피를 50 microliters까지 채웁니다. 이를 실온에서 30분 동안 방치합니다. 그 다음, 각 웰에 트랜스펙션 혼합물 100 microliters를 첨가하고 플레이트를 인큐베이터로 옮겨 16시간 동안 배양합니다.다음 날, 배지를 0.3% BSA와 1% pen strep가 포함된 DMEM으로 교체합니다. 그 다음 세포를 33 °C, 5% carbon dioxide 조건에서 5시간 동안 배양합니다. 5시간 후.Trypsin이 첨가된 DMEM에 현탁된 100만 개의 인플루엔자 감염 가능 MDCK 세포를 층으로 추가합니다. 바이러스를 생성하고 증폭시키기 위해 33 °C 배양 조건에서 공동 배양을 2~3일 동안 유지합니다. 이후, 260 G에서 5분간 원심분리하여 부스러기를 제거합니다. 그런 다음 상층액을 수집하여 멸균 조건 하에서 부화 9~10일 된 닭 배아란에 접종합니다.이를 위해 달걀 껍질 상단에 구멍을 내고 바이러스를 100배, 10배 또는 1배로 희석하여 주입합니다. 면봉을 사용하여 녹은 왁스로 달걀 껍질을 밀봉하고, 접종된 달걀을 33 °C에서 3일 동안 배양합니다. 이후, 감염된 달걀에서 Allantoic fluid를 수확합니다.계란 껍질을 70% ethanol로 세척합니다. 윗부분을 매우 조심스럽게 깨뜨려 계란을 열고, 멸균 핀셋을 사용하여 알란토이막(Alan Toic membrane)을 제거합니다. 10 milliliter 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 액체를 수집합니다.통상적으로 6~10 mL를 사용합니다. 4 °C에서 260 ×g로 10분 동안 원심분리한 후, 상층액인 요막액을 새 튜브로 옮깁니다. 공여자 마우스를 마취하고 외과적으로 종격동에 접근한 다음, 곡선 핀셋을 사용하여 림프절을 채취합니다.림프절을 1 mL의 DMEM이 담긴 6-웰 플레이트로 옮깁니다. 림프절 주변의 결합 조직이나 지방 조직을 제거한 후, 바늘 하나로 림프절을 고정하고 다른 바늘로 이를 터뜨립니다. 이렇게 하면 림프절 내의 세포들이 배지로 방출되어 세포를 수집할 수 있게 됩니다.먼저, 모든 조직 물질을 70 micron 나일론 필터에 통과시켜 원심분리에 적합한 세포 현탁액을 얻습니다. 세포 펠렛을 2 mL의 RBC Lysing buffer에 재현탁합니다. 실온에서 3분 동안 용해 반응이 일어나도록 둔 후, ice cold PBS 2 mL를 첨가하여 반응을 종료하고 텍스트 프로토콜에 따라 세포 염색을 진행합니다.항체 배양 전, 플레이트를 튕겨 상층액을 제거하고 버려야 합니다. 상용 TCR 형질전환 마우스로부터 얻은 공여 T 세포에 라벨을 붙이고, 5 million 개의 세포를 5 µM CFSE가 포함된 1 mL PBS에 넣고 배양합니다. 37 °C의 암소에서 20분 동안 배양을 진행합니다.그다음 세포를 PBS 100 µL당 200만 개가 되도록 수집하고, 후안정맥 주사(retroorbital sinus injection)를 통해 수용체 동종계통 마우스에 100 µL의 볼루스로 주입합니다. 3~5일 후, 마우스를 안락사시키고 종격동 림프절을 채취하여 이전과 동일한 방법으로 유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁액을 준비합니다.그 다음, 항체 칵테일로 단일 세포 현탁액을 염색하여 공여자 세포를 식별합니다. 분석을 위해, 유세포 분석기의 FL 1 채널 하나를 비워 두어 CFSE의 희석 프로파일을 결정하십시오.안락사시킨 마우스의 경골과 대퇴골을 적출하고 소독한 후, DMEM이 담긴 배양 접시에 수집합니다. 날카로운 가위로 뼈 끝을 자르고 골수를 DMEM 속으로 밀어내어 배출시킵니다. 이제 표준 방법으로, 세슘 137 방사선 조사기를 사용하여 6~8주령의 암컷 마우스에 방사선을 조사합니다. 방사선 조사 2~4시간 후, 마우스를 마취시키고 PBS 100 µL에 현탁된 200만 개의 공여 골수 세포를 안와하 정맥 주사(retroorbital sinus injection)를 통해 이식합니다. 이후 2주 동안 마우스의 음용수에 kg당 2.5~5 mg의 Baal을 공급합니다.백신 접종 2일 전부터 시작하여, PBS 50 µL에 희석한 50 ng의 DT를 마취된 마우스의 콧구멍에 한 방울씩 직접 투여합니다. 이 처치를 백신 접종 후 3일까지 지속합니다. 최종 마우스 모델을 생성하기 위한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.마취 상태에서 비강 내 주사를 통해 마우스에게 재조합 생백신 인플루엔자를 접종합니다. 200 microliter 피펫을 사용하여 50 microliters의 PBS에 희석된 1000 PFU의 백신을 투여합니다. 재조합 생백신 인플루엔자의 제조는 양방향 프로모터의 제어 하에 인플루엔자 바이러스의 8개 분절을 인코딩하는 플라스미드를 트랜스펙션함으로써 이루어질 수 있습니다. 저온 적응 인플루엔자 백신은 일반적으로 저온 적응 균주의 6개 분절과 H one N one과 같이 선택한 인플루엔자 균주의 HA 및 NA를 포함합니다.저온 적응을 통해 바이러스가 생쥐와 인간의 상기도 온도인 33 °C에서만 제한적으로 복제되게 함으로써, 하기도에서의 복제를 방지하여 폐렴 유발을 막을 수 있습니다. PCR을 사용하여 바이러스 뉴라미니데이스 stem의 보존 영역을 추적 가능한 OVA 유래 펩타이드로 교체하였습니다. 이렇게 제작된 추적 가능 펩타이드 모델을 백신 접종 후 3일에서 6일 사이에 생쥐에 접종하였습니다.추적 가능한 단백질 syn fecal이 폐 배출 림프절에서 검출되었습니다. 백신 유래 항원 제시를 실시간으로 정량화하기 위해 다매개변수 유세포 분석법이 사용되었습니다. 마찬가지로, syn fecal 특이적 T세포를 주입하여 백신 특이적 CD8 T세포 반응을 정량화함으로써 백신 접종 중 유전자 특이적 기능을 평가하였습니다.DTR 기술과 경쟁적 골수 이식을 결합한 마우스 모델이 활용되었습니다. 이를 통해 백신 접종에 따른 면역 반응 과정 중 특정 세포 구획에서 유전자 기능의 소실을 유도했습니다. 이 영상을 시청하신 후에는 숙주 내 백신 유도 면역 조절에 관여하는 분자 및 생리학적 경로를 분석하는 방법을 충분히 이해하시게 될 것입니다.또한, 이 기술은 백신의 세포 표적 결정에 새로운 통찰력을 제공하여, 새로운 백신 플랫폼의 가치 평가를 더욱 촉진할 것입니다.

intranasal-administration-recombinant-influenza-vaccines-chimeric

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

출처: Lenhard, A. 외. 바이러스 공동 감염 시 폐 렴 구균이 집착자에서 병원체로 전환되는 마우스 모델은 연령에 따른 악화된 질병을 재현합니다. J. Vis. 경험 (2022)이 영상은 인플루엔자 바이러스가 폐 렴구 균을 정착자에서 병원체로 전환시키는 쥐 공동 감염 모델을 보여줍니다. 박테리아 정착, 바이러스 감염, 질병 진행에 관련된 단계를 개괄합니다.

바이러스 공동 감염 후 폐렴구 균 의 병원성 전이를 연구하기 위한 마우스 모델

Source: Wang, M., et al, Evaluation of T Follicular Helper Cells and Germinal Center Response During Influenza A Virus Infection in Mice. J. Vis. Exp. (2020).This video demonstrates intranasal infection of a mouse with a pathogenic influenza virus to establish a respiratory tract infection. The procedure outlines the administration of the virus into the nasal cavity. The virus enters host cells, replicates, and activates the immune system.

Intranasal Infection of a Mouse with a Pathogenic Influenza Virus

이 비디오는 마우스의 비강 내 BCG 면역을 보여주며, 선천성 면역 반응과 적응 면역 반응을 모두 활성화하여 폐 상주 기억 T 세포와 효과기 B 세포의 발달로 이어져 마이코박테리움 감염에 대한 보호를 강화합니다.

마우스 모델에서 BCG를 사용한 비강 내 면역

이 비디오는 한랭 적응 재조합 인플루엔자 바이러스를 만드는 방법을 보여줍니다. 이 연구는 인간 세포를 양방향 플라스미드로 형질주입한 후 저온 배양에서 배양하여 백신 생산에 적합한 바이러스를 생성하며, 따뜻한 조건에서 복제가 감소하는 것이 특징입니다.

백신을 위한 재조합 생독감 인플루엔자 바이러스 생성

우리는 쥐의 하기도에 헤모필루스 인플루엔자를 기관 내 접종하는 절차를 보여줍니다. 이것은 마우스 모델에서 기도 염증을 조절하는 신호 경로를 연구하는 데 매우 유용한 도구입니다.

의 내부 기관 관리<em&gt; 헤모필루스 인플루엔자</em&gt; 마우스 모델에서기도 염증을 연구하는

인플루엔자 A 바이러스 (IAVs)는 중요 한 인간의 호흡기 병원 균. IAVs pathogenicity 이해 하 고 새로운 백신 접근의 전 임상 시험 수행 인간의 생리를 흉내 낸 동물 모델은 필요. 여기, 우리가 IAV pathogenesis, 체액 성 반응과 감염 마우스 모델을 사용 하 여 백신 효능을 평가 하는 기법을 설명 합니다.

감염 마우스 모델에서 인플루엔자 A 바이러스 연구

이 연구에서는 선물이 인플루엔자 바이러스 감염 후 murine tracheal 점 막에서 2 광자 intravital 이미징 및 세포 상호 작용 분석을 수행 하는 프로토콜. 이 프로토콜은 호흡기 감염 시 면역 세포 역학을 공부 하는 연구자와 관련이 있을 것입니다.

영상 셀 상호 작용 Tracheal 점 막에서 2 광자 Intravital 현미경 검사 법을 사용 하 여 인플루엔자 바이러스 감염 중

여기 선물이 vivo에서 백신의 평가 위한 우아한 프로토콜 효과 호스트 면역 반응. 이 프로토콜은 바이러스 성, 세균성, 백신 모델 또는 기생 병원 균에 대 한 적응 될 수 있다.

호스트 병원 체 응답 및 쥐에 백신의 효능 평가

이 논문은 인플루엔자 바이러스 감염의 마우스 모형에 있는 Tfh 및 GC B 반응을 평가하는 프로토콜을 기술합니다.

인플루엔자 A 바이러스 감염 중 T 여포 도우미 세포 및 발아 센터 반응 평가

이 프로토콜은 IAV의 비강내 투여 및 마우스 폐 손상 및 폐 세포 유형에 대한 관련 전사 변화의 다운스트림 분석에 대한 지침을 제공합니다.

인플루엔자 감염 후 이형성 및 기능적 폐포 복구 모델링

학습하세요 역유전학을 활용한 재조합 인플루엔자 백신 생성 및 키메라 마우스 모델에서 수지상 세포 이동과 CD8 양성 T 세포 증식을 분석하는 방법을. 이 기술은 백신 유도 면역의 세포 표적을 규명하여 새로운 백신 플랫폼 평가에 활용됩니다.

키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

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