키메라 마우스 모델에서 재조합 인플루엔자 백신의 비강 관리는 점막 면역을 연구하기 위해

이 절차의 전반적인 목표는 백신 특이적 적응 면역의 생리학적 시작을 평가하는 시스템을 설명하는 것입니다. 이는 먼저 역유전학을 사용하여 특정 면역원성 펩타이드를 함유한 약독화 생독 백신을 생성한 다음 병아리 배아를 사용하여 바이러스를 증식시키는 방식으로 수행됩니다. 다음으로 백신을 접종한 마우스의 림프절에서 세포를 채취하고 팩스 분석을 사용하여 수지상 세포 이동을 추적합니다.

다음 분석에서는 면역원성 펩타이드에 반응하는 CD 8개의 양성 T 세포를 라벨링하고 백신을 접종한 마우스에 주입한 다음 팩스 분석을 수행하여 해당 세포의 증식을 측정하고 면역 반응을 보다 자세히 분석합니다. 경쟁력 있는 골수 차임 미러는 골수 세포를 발현하는 디프테리아 독소 수용체를 방사선 조사된 선천성 마우스에 주입한 다음 디프테리아 독소에 노출시켜 만듭니다. 성공적으로 고갈된 후, 마우스는 백신을 접종하고 표지된 항체와 사량체를 사용하여 CD 8개의 양성 T 세포를 식별합니다.

특정 펩타이드를 인식합니다. 이 방법은 백신의 주요 세포 및 분자 표적인 신경학적 수준에서 백신이 어떻게 작용하는지, 그리고 가장 중요하게는 현재의 예방 전략을 어떻게 개선할 수 있는지와 같은 백신학 분야의 주요 질문에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 절차를 시연하는 것은 Sanmen Medina입니다.

우리 실험실 관리자와 저는 이 프로토콜을 위해 감기 적응 균주를 사용하여 재조합 감기 적응 인플루엔자 백신을 생성합니다. A 앤 아버 6 60. 헤마글루티닌 및 A PR 8 34 균주의 변형된 뉴라미니다아제와 결합된 배경으로.

뉴라미니다아제 유전자의 단백질 줄기 염기서열의 일부는 닭 펩타이드 syn 배설물을 암호화하는 짧은 CDNA 염기서열로 대체됩니다. 이 펩타이드는 H two BMHC 클래스에서 면역 우성입니다. C 57의 제한된 반응은 6마리의 마우스를 검게 하고 추적 가능한 요소로 기능합니다.

먼저 플레이트 1, 000, 002 10%의 소 태아 혈청과 1%의 펜 연쇄상구균을 포함하는 DMEM이 있는 6웰 플레이트의 각 웰에 있는 93개의 T 세포. 다음으로, 웰당 100마이크로리터에 충분한 플라스미드 형질주입 혼합물을 준비합니다. 각 플라스미드의 마이크로그램을 결합하고 다른 튜브에 50마이크로리터의 예열 옵티 MEM 셀 배지로 튜브를 채웁니다.

transfection할 plasmid의 총량에 해당하는 lipectomy 2000 부피의 두 배를 추가하고 transfection mix를 세포에 추가하기 전에 opti MEM으로 튜브를 50μl까지 채웁니다. 실온에서 30분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 각 웰에 100마이크로리터의 트랜스펙션 혼합물을 추가하고 플레이트를 16시간 동안 인큐베이터로 옮깁니다.

다음 날, 배지를 0.3% BSA 및 1% 펜 연쇄상구균을 가진 DMEM으로 변경합니다. 그런 다음 세포를 5% 이산화탄소로 섭씨 33도로 5시간 동안 이동합니다. 5시간 후.

Tripsin이 보충된 DMEM에 100만 개의 인플루엔자 허용 MDCK 세포 오버레이를 추가합니다. 섭씨 33도의 배양 상태에서 2-3일 동안 공동 배양을 유지하여 바이러스를 생성 및 증폭한 후 5분 260G 회전을 사용하여 잔해를 제거합니다. 그런 다음 상등액을 수집하고 9-10일 된 닭 배아 난자를 멸균 상태에서 접종합니다.

이렇게 하려면 달걀 껍질 위에 구멍을 뚫고 100 x 10 x 또는 1 x 희석으로 바이러스를 추가합니다. 면봉을 사용하여 달걀 껍질을 녹인 왁스로 덮고 접종한 닭고기 달걀을 섭씨 33도에서 3일 동안 부화시킵니다. 나중에 감염된 알에서 Alan Toic 액체를 채취하십시오.

달걀 껍질을 70% 에탄올로 씻으십시오. 윗부분이 아주 완만한 균열로 계란을 열고 멸균 집게를 사용하여 Alan Toic 멤브레인을 제거합니다. 10ml 피펫을 사용하여 가능한 한 많은 액체를 수집합니다.

일반적으로 6-10 밀리리터입니다. 유체를 섭씨 4도에서 10분 동안 260gs로 원심분리하고 세척된 Alan Toic 유체를 새 튜브로 옮깁니다. 기증자 마우스를 마취하고 외과적으로 종격동에 접근한 후 구부러진 겸자를 사용하여 림프절을 적출합니다.

림프절을 1밀리리터의 DMEM이 들어 있는 6웰 플레이트로 옮깁니다. 림프절을 둘러싼 결합 조직이나 지방 조직을 제거한 후 한 바늘로 림프절을 고정하고 다른 바늘로 부러뜨려 엽니다. 이로 인해 세포가 림프절에서 배지로 파열되어 세포를 수집해야 합니다.

먼저, 모든 조직 물질을 70미크론 나일론 필터에 통과시켜 원심분리 준비가 된 세포의 현탁액을 얻습니다. 세포 펠릿을 2ml의 RBC 용해 완충액에 재현탁합니다. 용해 반응을 실온에서 3분 동안 방치하고 얼음처럼 차가운 PBS를 2ml 더 첨가하여 종료하고 텍스트 프로토콜에 따라 세포 염색을 진행합니다.

플레이트 플릭을 사용하여 항체 배양 전에 명명된 슈퍼를 제거하고 폐기해야 합니다. 시판되는 TCR 형질전환 마우스의 표지 기증자 T 세포는 5마이크로몰 CFSE로 1밀리리터의 PBS에서 500만 개의 세포를 배양합니다. 어둠 속에서 섭씨 37도에서 20분 동안 배양을 계속하십시오.

그런 다음 PBS 100마이크로리터당 200만 개의 세포를 수집하고 후안와동주사를 통해 수혜자 선천성 마우스에 100마이크로리터 볼루스를 주입합니다. 3-5일 후, 마우스를 안락사시키고, 종격동 림프절을 적출하고, 유세포 분석을 위한 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 이전과 같습니다.

그런 다음 항체 칵테일에서 단일 세포 현탁액을 염색하여 기증자 세포를 식별합니다. 분석을 위해. CFSE의 희석 프로파일을 결정하기 위해 유세포 분석기의 FL 한 채널을 열어 둡니다.

안락사된 쥐의 경골과 대퇴골을 제거하고 소독한 후 DMEM 접시에 모으십시오. 날카로운 가위를 사용하여 뼈 끝을 자르고 골수를 DMEM으로 씻어냅니다. 이제 표준 방법을 사용하여 생쥐를 조사한 후 2-4시간 후에 세슘 1 37 소스 조사기를 사용하여 6-8주 된 암컷 쥐를 조사하고, 마우스를 마취하고, 100 마이크로리터의 PBS에 200만 개의 세포를 후안와동 주입을 통해 기증자 골수 세포를 이식합니다. 생쥐에게 식수에 킬로그램 당 2.5-5mg의 바알을 공급합니다.

백신 접종 이틀 전부터 PBS 50마이크로리터에 희석된 DT 50나노그램을 마취된 쥐의 콧구멍에 한 방울씩 직접 투여합니다. 백신 접종 후 3일 동안 이 치료를 계속하십시오. 최종 마우스 모델을 생성하는 방법에 대한 자세한 내용은 텍스트 프로토콜을 참조하십시오.

마취 상태에서 비강 내 주사를 사용하여 재조합 약독화 인플루엔자를 마우스에 접종합니다. 50마이크로리터의 PBS에 200마이크로리터 피펫에서 1000 PFU의 백신을 전달하고, 양방향 프로모터의 제어 하에 인플루엔자 바이러스의 8개 분절을 암호화하는 플라스미드의 형질주입을 통해 재조합 약독화 인플루엔자 백신을 생성할 수 있습니다. 감기 적응 인플루엔자 백신은 일반적으로 감기 적응 균주의 6개 세그먼트와 H one N one과 같은 선택한 인플루엔자 균주의 HA 및 NA를 포함합니다.

추위 적응은 생쥐와 인간의 경우 상부 호흡기의 온도인 섭씨 33도에서 바이러스가 제한적으로 복제할 수 있도록 하지만, 하기도에서는 복제를 허용하지 않기 때문에 폐렴 융합을 일으킬 수 없습니다. PCR은 바이러스 뉴라미니다아제 줄기의 보존 영역을 추적 가능한 OVA 유래 펩타이드로 대체하는 데 사용되었습니다. 추적 가능한 펩타이드 모델은 백신 접종 후 3일에서 6일 사이에 마우스에 접종되었습니다.

추적 가능한 단백질 syn 분변이 폐 배출 림프절에서 검출되었습니다. 다성분 유세포 분석법은 백신 유래 항원 제시를 실시간으로 정량화하는 데 사용되었습니다. 마찬가지로, syn 분변 특이적 T 세포를 주입하면 백신 특이적 CD 8 T 세포 반응을 정량화하여 백신 접종 중 유전자 특이적 기능을 평가할 수 있었습니다.

DTR 기술과 경쟁력 있는 골수 키이라(bone marrow kyira)를 결합한 마우스 모델을 활용했습니다. 따라서 유전자 기능의 상실은 백신 접종에 대한 면역 반응 과정에서 특정 세포 구획을 표적으로 삼았습니다. 이 비디오를 시청하면 숙주에서 백신 유도 면역의 조절과 관련된 분자 및 생리학적 경로를 분석하는 방법을 잘 이해할 수 있을 것입니다.

또한 이 기술은 백신의 세포 표적을 결정하는 데 새로운 통찰력을 제공하여 새로운 백신 플랫폼의 가치를 더욱 높일 것입니다.