Name: 공 초점 Macroscopy을 사용하여 출생 후의 소뇌 과립 세포 이동의 생체 이미징 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: 학습하세요 공초점 매크로스코피를 사용하여 출생 후 쥐 소뇌 과립세포 이동을 생체 이미징하는 방법을. 이 기술은 신경발생 및 뇌 발달 연구에 필수적인 실시간 세포 추적을 가능하게 합니다.

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- (PeReNE, Interreg 4A ERDF)이 작품은 생물 의학의 연구 및 혁신 연구소 (IRIB), 노르망디의 세포 이미징 플랫폼 (PRIMACEN), INSERM, IBiSA, 루앙 대학교, 유럽 지역 개발 기금에 의해 지원되었다 LARC - 신경 과학 네트워크 및 지역 오트 노르망디.

동물 (남성 또는 여성의 Wistar 쥐) 관리 및 실험 동물의 사용을위한 프랑스의 가이드에 따라, 태어나 공인 동물 시설 (승인 B.76-451-04)에서 사육 하였다. 실험은 유럽 공동체위원회 지침 (9 월 22 일의 63분의 2,010 / 단말, 2010)과 농업의 프랑스 교육부에 따라 권한이 부여 된 연구자 (MB, DV 및 LG)의 감독하에 실시 하였다. 미디어 및 도구 1. 준비 <ol><li> 생물 안전 캐비닛에서의 MgCl 2없이 염화칼슘 2 (1.85 g / ℓ) / 황산 (0.9767 G / L)를 포함 10 배 원액에서 멸균 수에 1X 행크의 BSS (HBSS)을 준비합니다. HBSS 용액을 1 배의 NaHCO3 (350 μg의 / ㎖)를 추가합니다. </li><li> 생물 안전 캐비닛에서, N2의 (100 배 원액)에서 보충 및 페니실린 (100 단위 / ㎖) -streptomycin (0.1 ㎎ / ㎖) 둘 베코의 수정 이글 배지 (DMEM) 영양 믹스 솔루션을 추가스트럭처 F-12 (1 : 1). </li><li> 무균 조건에서, DMSO의 세포질 형광 염료라는 세포 추적기 그린의 나누어지는 (25 μL, 2 mM)을 (1 mg을위한 1.075 ㎖) 준비합니다. 15 ML 원뿔 튜브에서 DMEM의 5ml에 하나 나누어지는을 희석. </li><li> 4 ℃에서 미디어를 유지하기 위해 작성 얼음 양동이를 준비합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 실험실 벤치 탑 및 도구의 오염을 제거. </li></ol> P10 쥐에서 소뇌의 해부 (2) <ol><li> 빠르게 척수의 시작을 얻기 위해 귀 뒤에 곡선 운영 가위로 쥐 새끼 (P10)를 목을 벨. </li><li> 참수 머리 뒤쪽 측에서 잘 홍채 가위로 코 목 피부의 중간 선 절개를 미세 홍채 가위와 뒤몽 # 3 집게와 두개골에서 피부를 분리합니다. </li><li> 섬세 두개골의 주동이의 영역으로베이스에서 두 개의 횡 절개를 만들기 위해 미세 홍채 가위를 사용합니다. 이 # 3 포셉으로 해부 두개골을 제거합니다. 브래지어를 분리같은 집게를 사용 두개골 모든 준수에서. </li><li> 얼음처럼 차가운 HBSS 매체의 2ml를 포함하는 페트리 접시에 주걱 (Ø 35mm)의 숟가락 끝으로 뇌를 전송합니다. </li><li> 실체 현미경의 무대에 얼음과 전송의 전체 큰 페트리 접시에 뇌를 포함하는 페트리 접시 (O 100mm)를 넣습니다. </li><li> 실체 현미경에서 두 # 3 집게를 사용 dilaceration에 의해 뇌에서 소뇌을 격리 할 것. 마찬가지로, 잔류 척수 및 PIAL 멤브레인을 제거합니다. </li><li> 주걱의 숟가락 끝으로 새 HBSS 채워진 페트리 접시에 소뇌 (O 35mm, 2 ml)에 전송하고 얼음에 보관하십시오. </li></ol> 급성 소뇌 조각 3. 준비 <ol><li> 두 개의 헤드로 표시된 바와 같이 실체 현미경, vermis과 오른쪽 반구 사이 소뇌 잘라 표준 메스 핸들 # 3 고체 # 15 외과 블레이드도 2A의 화살표. </li><li> 시안의 한 방울을 넣어oacrylate의 vibratome의 표본 디스크에 접착제 및 독성 용매 증기를 제거하기 위해 15 ~ 25 초를 기다립니다. </li><li> 주걱의 숟가락 끝이 절단 된 소뇌를 수집하고 깨끗한 종이 타월로 여분의 HBSS를 제거합니다. </li><li> 시편 디스크에 가까운 소뇌를 가져와. 시편 디스크에 절단 가장자리를 수정하고 10 초를 기다립니다. </li><li> 매니퓰레이터와 버퍼 트레이에 표본 디스크를 삽입하고, 너무 소뇌의 가로 축이 칼 홀더에 수직 회전. 육각 렌치와 시편 디스크를 수정하고 소뇌가 덮여 때까지 부드럽게 HBSS 매체와 버퍼 트레이를 입력합니다. </li><li> 로드 냉각 욕에 얼음을 분쇄. </li><li> 기름을 제거하기 위해 70 % 에탄올로 블레이드 세 번 청소합니다. </li><li> 칼 홀더에 블레이드를 삽입하고 나사를 체결하여 고정합니다. </li><li> 시편 (사용자의 시각으로부터) 후방 에지 뒤에 면도날 에지 바로 놓고 출발점으로 정의한다. 앞으로 사용 T를 정의하는 명령그 시험편의 전방 에지 뒤에 종점. </li><li> 2.5에서 속도를 절편 180 μm의에서 8. 트리밍 두께로 절편 주파수를 선택합니다. 조직 절편을 시작합니다. </li><li> 얼음에 보관 페트리 접시 (Ø 35mm)를 HBSS이 함유에 파스퇴르 피펫 및 전송립니다 넓은 구멍 유리를 사용하여 각 섹션을 선택합니다. </li><li> 블레이드 방해 할 때이 # 5 집게를 사용하여, 소뇌에서 신중하게 수막을 제거합니다. 소뇌 당 5 조각 (그림 2B, C)의 최대를 수집합니다. </li><li> 조심스럽게 실체 현미경 아래 두 # 5 집게와 소뇌 조각에서 수막을 제거하고 더 나은 프로브 로딩 부드럽게 소엽를 구분합니다. </li></ol> 생활의 interneurons 4. 형광 염색 <ol><li> 6 웰 플레이트 (물론 당 최대 3 조각 /)에 넓은 구멍 유리 절단 파스퇴르 피펫과 소뇌 조각을 전송합니다. HBSS 매체 기음. </li><li> L 5ml에 조각 (3 max)를 품어형광 염료의 oading 용액 (10 μM). </li><li> 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 마이크로 커버. 셀 라벨링을 용이하게 RT에서 10 분 동안 35 rpm에서 자이로 이동 테이블에 넣어. </li><li> 넓은 구멍 유리 절단 파스퇴르 피펫;없이 Transwell의 막에 전송 조각 (그림 2D 3.0 μm의 기공 크기)를 삽입합니다. 피펫 로딩 매체 기음. </li><li> 삽입물을 제거하고 DMEM의 1.9 mL로 잘 채운다. 삽입물을 교체하고 조직을 커버하는 조각 위에 DMEM 100 μl를 추가합니다. </li><li> 인큐베이터 실에서 문화 삽입 ML에서 GC를 관찰하기에 충분하다 2 시간 (37 ° C를, 5 % CO 2)가 포함 된 플레이트를 놓습니다. 삽입 막 (그림 2E)에 부착 할 수 있도록 평면 조직을 거짓말. 슬라이스가 건조되지 않도록해야합니다. </li></ol> 공 초점 Macroscopy을 통해 5 예 생체 내 이미징 <ol><li> 없이 접시를 이동인큐베이터에 플라스틱 뚜껑은 공 초점 macroscope의 스탠드에 연결합니다. macroscope의 판 삽입에 유리 덮개를 놓습니다. 37.0 ° C로 챔버의 온도를 유지 0.5 ° C를 ±, 일정한 가스 유동 (95 % O 2, 5 % CO 2) 플레이트 인서트를 통해 pH를 일정하게 유지하기 위해 함께 슬라이스를 공급한다. 시간 경과 실험 전에 2 개의 추가 시간 동안 기다립니다. </li><li> , 조직 슬라이스에서 GC 이주를 시각화 X2 건식 대물 갖춘 공 ​​초점 레이저 주사 macroscope 통해 레이저 다이오드를 이용하여 488 nm 파장의 빛으로 제제를 조명 (작동 거리 : 39mm, 직경 : 58mm, NA = 0.234), 및 500 내지 53​​0 nm의 형광 발광을 검출한다. <ol><li> GC를 미세하게 이동을 해결하려면 2.0 1.5 추가 광학 줌 배율 이미지를 획득. 하나의 초점 평면 또는 Z 축을 따라 10 개의 서로 다른 초점면 최대 12 시간 동안 매 30 분까지 GNS의 이미지를 수집합니다. </li></ol></lI&gt; <li> 필요한 경우, 유리 덮개를 분리하고 GC 마이그레이션에 미치는 영향을 연구하기 위해 10 μL 피펫과 DMEM 생물학적 활성제 또는 억제제의 작은 볼륨 (1-10 μL)를 추가합니다. </li></ol> 6. 셀 추적 <ol><li> 영화의 때마다, ImageJ에있는 ecart 형 모드를 통해 Z-스택 투영을 수행합니다. 명암을 조절하고 연속적으로 영상의 밝기 수준은 GC를 식별 및 분류의 추적을 용이하게하기 위해. 지도 (t에서 = 0) 기준 스냅 샷에 수동으로 각 위치. <ol><li> 분석한다 입자 메뉴에서 &quot;수동 추적&quot;플러그인을 사용하여 시간 경과시 각 셀의 몸의 중력 지점을 클릭하여 결정한다. 스프레드 시트에서 원시 추적 데이터를 내 보냅니다. </li></ol></li><li> 각 셀과 관련된 위치를 식별 (PHP 코드로 작성 http://primacen.fr) 스마트 집에서 만든 프로그램 ImageJ에에서 보낸 원시 추적 데이터를 재구성. 프로그램을 사용 calculat총 여행 거리와 각 셀에 대한 마이그레이션의 평균 속도를 전자. 분류와 같은 프로그램을 사용하여 적절한 필터에서 제어 및 처리 조건에서 세포 이동의 특성을 비교한다. </li></ol>

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저자가 공개하는 게 없다.

이 프로토콜은 트랜스 웰 시스템과 공 초점 macroscopy을 통해 출생 후 개발하는 동안 세포의 이동을 연구하는 녹색 형광 염료와 GC의 형광 표지 급성 P10 쥐 소뇌 조각의 문화를 설명합니다. 이 프로토콜은 12 시간 및 실험 기간 동안 작용제 또는 신경 펩타이드의 길항제, 효소 억제제, 세포 신호 변조기 또는 독성 물질을 포함한 이주 요인을 규제의 가능한 역할의 테스트까지의 기간에 대한 세포 이동을 관찰 할 수 있습니다. 피펫 팁과 막 삽입에 작은 구멍이 배양 배지에 화합물의 투여를 용이하게 할 필요가있다. 집에서 만든 곡선 피펫 팁은 용액의 전달을 용이하게하기 위해 사용될 수있다. 조직 조각을 생활에 세포 이동 연구의 한 가지 문제는 조직 자체의 운동 세포가 어려운 추적 할 수 있다는 것입니다. 이전의 접근법은 부드럽게 SLI 안정화 제안 반면나일론 CES 메쉬 또는 래트 꼬리 콜라겐 7,17의 얇은 층은이 기술의 주요 장점은 대물 하에서 CO 2 인큐베이터에서 막 삽입에 소뇌 슬라이스를 포함 6 웰 배양 플레이트의 단순하고 직접적인 전사이고 공 초점 macroscope의. 통합 온도와 CO 2 컨트롤러는 또한 세포 이동 (9)에 필수적인 적절하고 지속적인 환경 매개 변수를 제공합니다. 따라서, 배양 조건은 슬라이스 잘 멤브레인 삽입물에 부착되기 때문에 최소화된다 관찰 및 조직의 움직임 동안에 유지된다. 조직 안정화 취득 중에 참조를 고정해야 슬라이스 에지 또는 조롱박 세포의 위치에 따라 검증된다. 또한, 플레이트의 웰에 분포 6 소뇌 조각 (12 내지 18)는 신속 동력 스테이지 및 광학 줌을 상세히 관찰 할 수있다. 때문에 건조 목적, 에피의 큰 작동 거리 (X2, 39mm)에문화 매체가 훨씬 더 쉽습니다에서 - 전망대는 화합물의 침수 및 관리 무료입니다. 따라서, CO 2 배양기 및 공 초점의 환경 매개 변수 및 문화 지원 유사성은 생물학적 시료의 최대 보존으로 이어질 macroscopy. 프로토콜의 다른 장점은 큰 뷰의 필드를 동시에 관찰 할 수있다 셀 따라서 다수이다. 예를 들어, 우리는 이전에 ML에서 반경 이주 형광 GC를의 밀도가 1,124 ± 138 세포 / mm 2 18 것을 결정했다. 공 초점 macroscopy이 (X2는, NA는 0.234를 =) 공 초점 현미경에 비해 낮은 측면 해상도 (40X, NA = 1.25)하지만이 기술은 7,18 접근 사이에 세포 GC를의 몸은 쉽게 추적 할 수 및 마이그레이션의 평균 속도는 비슷 . 이미지 인수, 조직 슬라이스와 일의 질에 대한 기술 개선 게다가라벨의 전자 품질은 성공적인 실험을위한 키 포인트입니다. 항상 해부 과정에서 얼음에 미디어와 조직을 유지, vibratome 블레이드에 기름을 제거하고 접착제와 접촉 조직의 조각을 사용하지 않습니다. 시상 및 횡단면은 각각 방사형 및 접선 마이그레이션하도록되어있다. 소뇌의 다른 대뇌 피질의 층에 적절한 검출을위한 배양의 다른 길이를 사용합니다. (8 시간까지) 긴 배양 시간은 PCL과 IGL에 많은 GC를의 이동을 감지 할 필요합니다. GC 이주 특정 시공간 윈도우 동안 생리적 과정이기 때문에, 양성 대조군은 세포가 적절하게 이동해야한다는 것이다. 특히, ML 수많은 스핀들 GC는 시상 소뇌 슬라이스 주요 건강 지표 중 하나이다. 실험을 시작하기위한, ML에서 GC 운동의 관찰이 제안된다. 실제로, 수직으로 연장 된 전지 본체와 GC의 형상은 AC를 시작 기준점으로 간주되어야연속 제어 (2 시간)과 치료 (2 시간) ML 쉽게 수행 될 수있는 기간 quisition. 셀 추적기 가족이나 유전 적 구조를 통해 표현 형광 단백질과 같은 형광 염료는 세포 이동 연구에 추적자로 사용할 수 있습니다. 때문에 GC 마이그레이션 (1 스택 매 30 분)의 느린 반응 속도로, 여러 가지 빛깔의 실험은 또한 시스템에 4 레이저 빔 (405, 488, 532, 633 ㎚)부터 순차 모드에서 사용할 수있는 수행 할 수 있습니다. 기타의 interneurons의 추적, 구심력과 원심력 방사형 마이그레이션을 고려 또한 18 실현 될 수있다. 특히, 더 적은 다수의 세포 유형을보다 쉽게​​ 넓은 시야와 로컬 라이즈 될 수있다. 마지막으로,이 프로토콜은 소뇌의 다른 개발 단계뿐만 아니라 다른 뇌 영역에서 세포 이동을 연구하는데 사용될 수있다.

현상 소뇌 뉴런의 8 개의 서로 다른 유형의 배아 둘째 주 및 설치류 1 초 출생 후의 주 간의 순차적 일어난다. 처음에 차 종자 영역에서 발생, 미성숙 과립 세포 (GC)는 외부 과립 층 (EGL), 차 종자 영역 2에서 생산되는 마지막 뉴런이다. 처음 세 출생 후의 주 동안, 소뇌 피질 EGL, 분자 층 (ML)을 포함하여 4 개의 계층으로 구성 잎 모양 구조, 조롱박 전지 층 (PCL) 및 내부 과립 층 (IGL) (도 1). 구심 마이그레이션, 미성숙 GC를, 글루타메이트의 interneurons을 통해 약 2 일 이내에 IGL에 도달합니다. 세 번째 출생 후 주까지, EGL가 사라지고 IGL은 성인 소뇌의 과립 층 (GL) 소위 구성한다. GL에서 GC를 이끼 섬유와 유니 폴라 브러시 세포에서 흥분성 시냅스 입력을 받고,골지체 세포로부터 축삭 억제 시냅스 입력한다. ML에서 GC의 축삭은 조롱박 세포, 바구니 세포, 성상 세포, 그리고 골지 셀이 포함 GABA 성 신경 세포와 흥분성 시냅스를 확인합니다. 초기 출생 후의 설치류에서 얻은 급성 소뇌 조각의 세포 운동의 실시간 관찰 GC를이 소뇌 피질 3에서의 경로 동안 이동의 양상과 속도의 변화와 병용 자신의 모양을 수정하는 것이 보여줍니다. 생후 첫 두 주 동안, GC 전구체 적극적 EGL 상단의 증식. EGL의 중간 부분에서, GC를 postmitotic는 큰 프로세스의 접선 방향으로 이동한다. EGL-ML 국경에서 GC를 자신의 움직임을 느리게, 세포는 ML에 짧은 수직 하강 프로세스를 입력하기 시작합니다. ML에서 GC를는 수직으로 연장 된 전지 본체, 얇은 후행 처리 및 더 방대한 선두 처리를 가지며, Bergmann은 아교 섬유의 반경 방향을 따라 이동한다. 에서PCL은 GC를 자신의 움직임을 중지하지만 장기간 고정 단계 (2 시간) 후, 그들은 PCL-IGL의 국경을 넘어. IGL에서 GC를 폐해는 섬유 지지체의 부재 층의 바닥을 향해 이동한다. 주요 프로세스의 팁되면 IGL 흰색 물질 (WM) 테두리, GC를 천천히 접근하고 그들의 움직임을 중지합니다. 시상 슬라이스는 ML, PCL 및 IGL에서 마이그레이션을 방사상에 전념하는 동안 소뇌의 가로 부분은 EGL에서 접선 마이그레이션 연구에 바람직하다. (예를 들어, 소마토스타틴은, PACAP)는 지금까지 확인 된 피질 신경 펩티드 있지만 각 층에서 GC 마이그레이션 시공간 제어에 관여하는 메커니즘을 포함한 전체 GC 운동의 일부 규제 요인은 여전히 알려져 있지 1,4,5,6-이다. GC 마이그레이션 ACU에 대한 격리 된 배양 세포 또는 형광 검출 중 투과광 조명을 사용하여 비디오 카메라와 공 초점 현미경을 통해 지난 20 년 동안 연구되어왔다테 소뇌 조각. 처음 친 유성 DII, 그리고 최근 &quot;셀 트래커&quot;염료 및 세포 발현 단백질은 공 초점 형광 또는 이광자 현미경 -7,8- 사용 하였다. 성공적인 실험 프로토콜은 간단하지만 쉽지 않다 있도록 구체적인 절차의 수에 따라 달라집니다. 특히, 급성 슬라이스 수제 나일론 메쉬 네트워크 (9)와 함께 일반적으로 관측 동안에 안정해야한다. 광 조도는 다중 공 초점 현미경의 주사 방식 제안한 광독성 및 광표백을 피하기 위해 가능한 한 낮아야한다. 또한, 온도 및 CO 2는 신경 세포의 이동에 영향을 미칠 수있는 불안정 이후 주요 환경 매개 변수입니다. 촉진 및 실험 절차를 구체화하기 위해, 우리는, 조각의 움직임을 제한하는 일정한 환경 매개 변수를 보장 광표백을 감소시키고, consequ (milimeters의 순서에) 시야를 증가시키는 공 초점 macroscopy 프로토콜을 개발 한이미지 분석을 통해 추적 될 수있는 셀 (수십)의 수를 고한다면. 따라서, 180 μm의 두께 슬라이스 막 삽입에 배양하고 6- 웰 플레이트에 직접 큰 배양 챔버, 온도 및 CO 2 컨트롤러 및 진동 제어 시스템을 갖추고 상용 촛점 macroscope의 2X 전동식 대물하에 전사된다. 시간이 경과하고, Z 스택은 여러 시간 동안 약물 학적 도구를 수행하거나, 생체 활성 분자는 추가 또는 배양 배지 내에 전달 될 수있다. 이 방법은 또한 상이한 발달 단계에서 소뇌 또는 대뇌의 신경 세포의 다른 유형의 이동을 연구하기 위해 적응 될 수있다.

<table><tbody><tr><td>둘베코' s 변형 독수리 매체 (DMEM) 영양 혼합물 F-12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Hank's balanced salt solution 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1641</td><td></td></tr><tr><td>PACAP38</td><td>INRS, Canada</td><td></td><td>Bourgault et al., 200919</td></tr><tr><td>PAI-1</td><td>Calbiochem</td><td>528208</td><td></td></tr><tr><td>N-2 supplement</td><td>Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen</td><td>O973</td><td></td></tr><tr><td>시아노아크릴레이트 접착제</td><td>록타이트</td><td></td><td></td></tr><tr><td>세포 추적기 녹색 CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>폴리에스터 트랜스웰-클리어 인서트</td><td>Corning</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>페니실린-스트렙토마이신</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 세포 배양 클러스터</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시 직경 35mm</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>조직 배양 접시 직경 100mm</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>폴리프로필렌 튜브(15ml)</td><td>BD 팔콘</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>에탄올 70%</td><td>Fisher Chemical</td><td>E/0800DF/21</td><td></td></tr><tr><td>생물 안전 캐비닛 흄 후드</td><td>Thermo Scientific</td><td>MSC9 Class II A2</td><td></td></tr><tr><td>조절 가능한 부피 피펫(0.5-10 &마이크로; L)</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.018</td><td></td></tr><tr><td>자이로 로커, SSL3</td><td>Stuart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 인큐베이터, Hera Cell 150</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>진동 블레이드 마이크로톰, VT1000S</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>컨포칼 매크로스코프, TCS LSI</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>온도 조절기</td><td>PeCon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-controller</td><td>PeCon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>실체현미경, M205 C</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>작동 가위, 곡선형, 무딘/뭉툭</td>한 <td>Medicon</td><td>03.03.17</td><td></td></tr><tr><td>경화 파인 아이리스 가위, 직선, 날카롭고 날카로운</td><td>FST</td><td>149090-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #3 및 #5 겸자</td><td>FST</td><td>11293-00 및 11252-20</td><td></td></tr><tr><td>진동 주입기 블레이드/단일 가장자리</td><td>Leica Microsystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>표준 메스 핸들 #3 솔리드</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>수술용 블레이드 #15</td><td>Swann-Morton</td><td>205</td><td></td></tr></tbody></table>

공 초점 macroscopy을 사용하여 출생 후의 소뇌 과립 세포 이동의 생체 이미징

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

출생 후 발달 동안, 미성숙 과립 세포 (흥분성의 interneurons)는 소뇌 피질의 내부 과립 층에 도달하는 분자 층과 조롱박 세포층에서 외부 과립 층 접선 이주하고 방사상 이동을 나타낸다. 이주 프로세스의 기본은 다양한 소뇌 기능에 적자로 이어지는, 세포 사멸 또는 뉴런의 오 배치를 유도한다. 구심력 과립 세포 이동은 최종 위치를 향해 안내하기 위해 세포의 화학 주성과 같은 세포 외 기질의 분해 등의 여러 메커니즘을 수반하지만, 각 층의 피질 세포의 이동을 조절하는 인자는 단지 부분적으로 알려져있다. 우리의 방법에있어서, 급성 소뇌 슬라이스는 P10 래트로부터 제조되며, 과립 세포를 형광 세포질 마커로 표지되고, 조직은 C 37 °에서 촛점 macroscopy하여 세포 이동의 실시간 모니터링을 시작하기 전에 4 내지 10 시간에 막 삽입에 배양 에서CO (2)의 존재. 소뇌의 다른 피질 층에서의 이송 중에, 과립 세포는 신경 세포의 이동의 조절에서의 가능한 역할을 조사하기 위해 신경 펩타이드 작용제 또는 길항제, 프로테아제 억제제, 세포 내 이펙터 또는 알코올이나 메틸 심지어 유해 물질의 차단제에 노출 될 수있다 .

서로 다른 대뇌 피질의 층 1 (그림 1) 교차으로 초기 출생 후 소뇌에서 GC를 자신의 모드와 이동 속도에 큰 변화를 나타낸다. 이 섹션은 그들의 자연 셀룰러 환경에서 GC 이동을 연구함으로써 얻을 수있는 결과의 예를 도시한다. 녹색 형광 염료로 표지 P10 쥐 소뇌 조직 조각 공 초점 macroscope (그림 3A)으로 관찰하고 우리는 GC를 18 μm의 / hr의 평균 속도 (그림 3B, C)와 ML에 방사상으로 마이그레이션을 보여준다. 지금까지의 상호 작용의 역할 / 조절 인자 및 각 층에서 피질 세포 이동의 제어에 관여하는 분자 메커니즘을 포함한 신경 교세포와 사이의 통신은 대부분 알려져 있지 않다. 따라서, 주요 문제는 이러한 피질 층 정시에 역할을 할 수 신경 펩티드, 신경 전달 물질, 및 뉴로 세포 외 기질 성분을 식별하는 것자신의 마이그레이션 과정에서 속도의 FIC 변경됩니다. 뇌하수체 아데 닐 레이트 시클 라제 - 활성화 폴리펩티드 (PACAP)은 또한 ML과 IGL 7,10,11 설치류에서의 처음 두 출생 후의 주 동안, PCL에서 주로 발견된다. 배지에 PACAP38 (10-6 M)의 적용은 ML에서 GC의 79 %의 속도 저하의 결과. 예를 들어, GC를 ML에서의 이동 속도는 PACAP38 (도 4a)의 투여 후 2.5 μm의 / 시간으로 제어 조건에서 11.9 ㎛ 인 / 시간에서 떨어졌다. 조직 - 형 플라스 미노 겐 활성제 (TPA)은 이러한 세포 유착 분자 또는 라미닌 12,13으로 세포 외 기질 (EM) 성분의 저하를 초래 단백질 분해 캐스케이드의 부재이다. tPA의 및 플라스 미노 겐, 만톤 기판은 출생 후 소뇌 14,15,16의 개발 과정에서 대뇌 피질의 층에서 검출된다. PAI-1 (10-7 M), 내인성 만톤 억제제의 투여는 78 % GC 감소ML에서 마이그레이션. 예를 들어, GC를이 PAI-1 (그림 4B)을 첨가 한 후 4.2 μm의 / 시간에 제어 조건에서 19.2 μm의 / 시간에서 ML에서 이동 속도를 감소시켰다. 이러한 결과는 PACAP가 GC의 움직임에와 세린 프로테아제 tPA의이 개발 쥐의 소뇌의 ML에서 GC를의 이동을 용이하게하는 직접 억제 효과를 발휘을 나타냅니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig1.jpg" /> 그림 1 : 출생 후 소뇌 피질에서 GC 마이그레이션의 3D 표현입니다. IGL에 1-4, EGL에 GC 프로세스와 접선 마이그레이션의 확장. 5, 버그만 아교 섬유를 따라 mL에 방사형 마이그레이션. 6, PCL에서 과도 정지상. 7, 폐해 독립적 인 방사형 마이그레이션. 8, 완료 . 빨간색 IGL GC에서 GC 마이그레이션, 과립 세포,의, EGL외부 과립 층, 어두운 보라색에서 B, 버그만의 아교 세포; G, 골지 세포, 노란색, CF, 등반 섬유, 파란색, G, postmigratory 과립 세포, 밝은 녹색의, IGL, 내부 세분화 된 계층, MFT, 이끼 섬유 터미널, 어두운 녹색, PCL, 조롱박 세포 층 밝은 자주색에서 P, 조롱박 세포, ML, 분자 층. 이 그림은 5에서 수정되었습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig2.jpg" /> 그림 2 : P10의 소뇌 조각의 전 생체 내 문화 (A) P10 쥐 해부 소뇌.. 스케일 바 = 6mm. 실체 현미경을 통해 180 μm의 두께 소뇌 조각 생활의 (B)의 현미경 사진. 스케일 바 = 3mm. (C)에서높은 배율, 소뇌의 네 대뇌 피질의 층 (EGL, ML, PCL, IGL)는 이미 구별 할 수 있습니다. 스케일 바 = 1mm. 형광 표식 한 후 (D)는, 조직 슬라이스는 6 웰 플레이트에 배양 인서트 (24mm 직경) 상에 배치된다. (E) 조직 배양 처리 된 폴리 에스테르 막과 문화 삽입의 도식 표현. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52810/52810fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig3.jpg" /> 그림 3 : 쥐 P10 소뇌의 피질 층에서 GC를 동적 마이그레이션 GC를이 녹색 세포질 형광 염료로 표지 된 P10 쥐의 소뇌 슬라이스 (A) Macroconfocal보기 (XYZ, 2D 투사).. 스케일 바는 75 μm의 =. (B) GC를 보여주는 시간 경과 영상제어 조건에서 4 시간 동안 공 초점 macroscopy으로 ML에서 운동. 별표 (*) 표시는 GC의 소마를 표시합니다. 경과 시간 (분)에 각각의 현미경 사진의 맨 아래에 표시됩니다. 스케일 바는 10 μm의 =. (C) GC의 소마에 의해 이동 한 거리에서 순차적으로 변경됩니다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig4.jpg" /> 도 4 :. GC 이주의 신경 펩타이드 프로테아제 억제제의 효과 (A) GC 2 제어 조건에서 시간과 대해 촛점 macroscopy 의해 ML에서 추적 된 다음, 뇌하수체 아데 닐 레이트 시클 라제 - 활성화 폴리펩티드 (PACAP)의 존재하에 2 시간 동안. (B)는 GC 제어 조건에서 2 시간 동안 공 초점 macroscopy 의해 ML에서 추적 한 후, 플라스 미노 겐 활성화 제 억제제 -1 (PAI-1)의 존재하에 2 시간 동안.

출생 후 소뇌 발달 동안, 생식대에서 유래한 미성숙 과립 세포는 최종 목적지에 도달하고 신경 네트워크를 구축하기 위해 뚜렷한 이동 방식을 보입니다. 이 프로토콜은 소뇌 절편의 준비와 신경 세포 이동을 조절하는 요인을 조사하는 데 사용되는 공초점 거시적 접근 방식을 설명합니다.

공 초점 Macroscopy을 사용하여 출생 후의 소뇌 과립 세포 이동의 생체 이미징

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

이 실험 절차의 전반적인 목표는 살아있는 뇌 절편 내에서 이동하는 뉴런을 시각화하는 것입니다. 이를 위해 먼저 P 10 쥐의 소뇌를 적출합니다. 다음 단계로는 급성 소뇌 절편을 제작하고 형광 프로브를 사용하여 뉴런을 표지합니다.그 다음으로 매크로 공초점 이미징 또는 공초점 현미경을 통해 타임랩스 실험을 수행합니다. 마지막 단계는 결과 영상에서 뉴런을 추적하는 것입니다. 궁극적으로, 엑스 비보(ex vivo) 현미경 관찰을 통해 뉴런 이동을 조절하는 내인성 인자 또는 독성 물질의 역할을 규명합니다.공초점 현미경과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은, 매크로 공초점 이미징이 그리드 인서트에 직접 놓인 뇌혈관 절편의 시야를 넓혀준다는 점입니다. 저는 공초점 현미경 실험을 위해 뇌혈관 절편을 옮기고 고정하는 데 어려움을 겪으면서 이 방법의 아이디어를 처음 얻었습니다. 먼저, 안락사시킨 P 10 쥐 새끼 머리의 두개골을 노출시킨 후, 미세 아이리스 가위를 사용하여 두개골의 기저부에서吻측(rostral region)까지 양측으로 섬세하게 두 번 절개합니다. 그런 다음 3번 핀셋 두 개를 사용하여 뇌와 두개골 사이의 모든 유착을 제거하며 분리된 두개골을 제거합니다.이제 스패튤라의 스푼 끝을 사용하여 뇌를 걷어내고, 얼음 위에 둔 2 mL의 차가운 HBSS가 담긴 35 mm 페트리 접시에 넣습니다. 그런 다음, 실체 현미경 하에서 3번 핀셋 두 개를 사용하여 뇌에서 소뇌를 분리합니다. 소뇌를 스푼으로 떠서 얼음처럼 차가운 완충액이 담긴 새 접시로 옮깁니다.그런 다음 동일한 도구를 사용하여 잔여 척수와 껍질 막을 제거하여 폐기합니다. 15번 수술용 칼날을 장착한 3번 솔리드 메스 핸들을 준비합니다. 실체 현미경 하에서 칼날을 사용하여 소뇌의 충부(vermis)와 우반구 사이를 절개합니다.이제 진동 절단기(vibratome)에서, 시료 디스크에 시아노아크릴레이트 접착제를 한 방울 떨어뜨리고 용매 증기가 날아갈 때까지 15~25초 동안 기다린 후 소뇌를 디스크로 옮깁니다. 다음으로, 소뇌의 가장자리를 시료 디스크에 고정하고 10초 동안 기다립니다. 이제 조작기(manipulator)를 사용하여 소뇌의 가로축이 나이프 홀더와 수직이 되도록 시료 디스크를 완충액 트레이에 삽입합니다.알루미늄 렌치를 사용하여 디스크를 확실히 고정하십시오. 그런 다음 소뇌를 HBSS로 조심스럽게 덮고 냉각조에 분쇄 얼음을 채웁니다. 시편을 절단하려면 깨끗한 블레이드를 배치하여 그 날 끝이 시편의 뒷면 가장자리 바로 뒤에 오도록 합니다.이 지점을 아이싱의 시작점으로 정의하십시오. 그런 다음 전진(forward) 명령을 사용하여 시료의 앞쪽 가장지를 약간 지난 지점을 끝점으로 정의하십시오. 이제 슬라이스 두께를 180 microns로 설정하십시오.그 다음, 절편 제작 속도를 2.5로, 주파수를 8로 설정하고 시료의 절편 제작을 시작합니다. 소뇌당 최대 5개의 절편을 수집합니다. 끝이 뭉툭하고 넓은 boar glass 피펫을 사용하여 각 절편을 집어 올립니다.절단된 조직 섹션들을 얼음 위에 놓인 차가운 HBSS가 담긴 디쉬로 옮깁니다. 실체 현미경 하에서 슬라이스들을 수집한 후, 5번 포셉 두 개를 사용하여 뇌수막을 조심스럽게 제거합니다. 또한, 프로브 로딩이 더 원활하게 이루어지도록 외측 올리브핵(LOE)을 부드럽게 분리합니다.시료를 절편화한 후, 끝이 뭉툭하고 넓은 보어 피펫을 사용하여 HBSS와 함께 6-웰 플레이트로 옮기며, 각 웰에 최대 3개의 절편을 넣습니다. 다음으로, 각 웰의 배지를 비운 뒤 10 $\mu$M의 형광 염료가 포함된 로딩 용액 5 mL를 첨가하고, 시료를 빛으로부터 보호하기 위해 플레이트를 알루미늄 호일로 덮습니다. 그 후, 플레이트를 35 RPM으로 설정된 교반기에 놓습니다.염료가 세포 우물에 잘 라벨링될 수 있도록 플레이트를 실온에서 10분 동안 배양합니다. 이제 이전과 동일하게 슬라이스를 3 µm 공극의 트랜스웰 인서트 막으로 옮깁니다. 그런 다음 로딩 배지를 흡입하여 슬라이스만 남깁니다.이제 인서트를 제거하고 슬라이스를 옮겨 웰을 1.9 milliliters의 DMEM으로 채웁니다. 그런 다음 인서트를 다시 넣고 조직이 잠기도록 DMEM 100 microliters를 추가로 넣습니다. 이 준비물을 2시간 동안 배양하면 과립세포가 관찰될 것입니다.뚜껑을 제거한 플레이트를 공초점 현미경의 일정한 가스 흐름이 유지되는 환경 챔버로 옮깁니다. 그런 다음 타임랩스 실험을 위해 공초점 현미경의 플레이트 인서트 위에 유리 커버를 덮습니다. 다음 단계로 진행하기 전, 챔버 내에서 세포를 2시간 동안 추가로 배양합니다.조직 절편 내에서 이동하는 과립세포를 시각화하려면, 488 nanometer 광원으로 시료를 조사하고 2배 건식 대물렌즈를 사용하십시오. Image J를 사용하여 500에서 530 nanometer 범위의 형광 방출을 검출합니다. 타임랩스 동영상의 각 이미지에 대해 표준편차 모드로 Z-stack 투영을 수행하고, 표지된 과립세포가 잘 보이도록 각 이미지의 대비와 밝기 수준을 조정하십시오. 이제 입자 분석 메뉴에서 수동 추적 플러그인을 선택하십시오.플러그인을 사용하여 타임랩스 이미지 시퀀스 전체에 걸쳐 라벨이 지정된 각 세포체의 중심점을 클릭하십시오. 그런 다음 추가 분석을 위해 원시 트래킹 데이터를 스프레드시트로 내보내십시오. 프로그램을 사용하여 각 세포와 관련 위치를 식별하는 자체 제작 스마트 도구로 Image J에서 내보낸 원시 트래킹 데이터를 재구성하십시오.각 세포의 총 이동 거리와 평균 이동 속도를 계산합니다. 출생 초기 소뇌의 과립세포는 서로 다른 피질층을 통과함에 따라 이동 방식과 속도에서 유의미한 변화를 보입니다. PM 쥐의 소뇌 조직 절편에서 CTG로 표지된 과립세포를 관찰하였습니다.설명된 바와 같이, 과립세포는 분자층에서 시간당 평균 18 microns의 속도로 방사형으로 이동했습니다. 이어서 이동 속도를 변화시킬 것으로 예상되는 약물의 효과를 테스트하기 위해 다른 표본을 사용했습니다. 배양액에 pay cap 38을 처리한 결과, 분자층 내 과립세포의 속도가 79% 감소하여 시간당 2.5 microns로 떨어졌습니다.내인성 TPA 억제제인 PI one의 투여는 과립세포 이동 속도를 대조군 속도 대비 78% 감소시켜 시간당 4.2 microns로 낮추었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 발달 중인 theory balloon에서 세포를 추적하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 수행할 때는 세포 이동의 발달 이후 필수적인 적절하고 일정한 환경 매개변수를 제공하는 것이 중요하다는 점을 기억하십시오.이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 뇌의 기능적 과정을 탐구할 수 있는 길을 열어주었습니다.

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연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

우리는 마우스 forebrain의 neuronal 이주의 실시간 videoimaging을위한 프로토콜을 설명합니다. 급속도로 이루어질 - 표시 또는 이식 neuronal 전구체의 마이그레이션은 고정 및 마이그레이션 단계의 기간 및 속도 등의 세포 이주의 다른 단계를 공부하고 비교적 빠른 수집 간격과 폭 넓은 분야 형광 이미징을 사용하여 급성 라이브 슬라이스에 기록 된 이주.

성인 마우스 Forebrain의 급성 슬라이스에 Neuroblast 마이그레이션의 시간 경과 영상

출처 : Chan, U.,  et al., 소뇌 과립 뉴런 형태 및 시냅스 발달을 연구하기 위해 In vivo Postnatal Electroporation을 활용합니다. J. Vis. 특급. (2021).이 비디오는 형광 단백질로 표지된 마우스의 사전 고정된 뇌 조직 절편을 이미징하여 소뇌 과립 뉴런 발달 분석을 보여줍니다. 컨포칼 현미경으로 고해상도 Z-stack 이미지를 캡처하고 신경돌기 길이, 수지상 발톱 형성, 표면적 및 부피를 포함한 구조적 매개변수를 측정하여 시냅스 형성을 연구합니다.

다양한 발달 단계에서 소뇌 과립 뉴런의 시냅스 형성 시각화

출처: Bénard, M., et al. 컨포칼 매크로를 사용한 출생 후 소뇌 과립 세포 이동의 생체 외 이미징. J. Vis. 특급 (2015년)이 비디오는 출생 후 쥐의 뇌에서 소뇌 절편에 있는 과립 세포의 생체 외 이동을 추적하는 컨포칼 매크로스코픽 방법을 보여줍니다.

공초점 광조법을 사용한 출생 후 소뇌 과립 세포 이동의 생체 외 이미징

Neuroblast 이주는 출생 후 신경에 근본적인 이벤트입니다. 우리는 급성 뇌 조각의 시간 경과 영상을 사용하여 생체 내 출생의 일렉트로 그들의 이주 이후의 시각화하여 neuroblasts를 효율적으로 표시하기위한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 비디오 추적하여 neuroblast 역학의 정량 분석​​에 대한 설명을 포함한다.

마우스 급성 뇌 조각의 Neuroblast 마이그레이션의 생체 내 출생 일렉트로 및 시간 경과 영상

신경 세포의 형태 형성 및 마이그레이션 적절한 두뇌 발달의 기초가 중요 이벤트입니다. 여기서 우리는 유 전적으로 배양 소뇌 과립 뉴런과 형태와 신경 세포의 이동성 특성의 평가를위한 개발 소뇌를 조작하는 방법을 설명합니다.

소뇌 과립 신경 세포의 유전자 조작<em&gt; 체외</em&gt;와<em&gt; 생체</em&gt; 신경 세포의 형태와 마이그레이션을 연구하는

소뇌 외부 과립 층은 개발 뇌에서 가장 큰 교통 증폭의 사이트입니다. 여기, 우리는 배아의 날 (14) 병아리 배아에서 생체 전기와 소뇌 조각의 문화를 사용하여 확산의 절정에이 계층에 유전자 변형을 대상으로하는 프로토콜을 제시한다.

예 생체 병아리 소뇌 조각의 문화가 공간적으로 Electroporation에 과립 세포 전구체의 표적

이 프로토콜은 방사형으로 이동하는 피질 뉴런의 직접 관찰에 대한 지침을 제공합니다. utero electroporation, organotypic 슬라이스 문화, 그리고 시간 경과 공 촛점 이미징은 결합 뉴런에 관심 유전자의 overexpression 또는 downregulation의 효과를 직접적이고 동적으로 연구하고 개발하는 동안 그들의 차별을 분석합니다.

배아 마우스 두뇌의 organotypic 슬라이스 문화에서 마이 그 레이션 뉴런의 저속 공 촛점 이미징<em&gt; Utero에서</em&gt; 일렉트로 포 레이션

여기, 우리 confocal 현미경 검사 법 및 라이브 이미징 기술을 위해 적당 한 마우스 배아에서 electroporated 뇌 organotypic 슬라이스 문화를 생성 하는 저렴 하 고 안정적인 방법을 제공 합니다.

전 Utero Electroporation 및 마이그레이션 GABAergic 수의 라이브 이미징 배아 마우스 두뇌의 Organotypic 조각 문화

이 프로토콜은 신경 질리오 혈관 구조, 상호 작용 및 건강하고 병들인 조건 둘 다에 있는 기능의 세로 화상 진찰에 사용될 수 있는 만성 두개골 창 이식 기술을 기술합니다. 그것은 종종 선호하는 동안, 몇몇 중요한 한계를 가지고 있는 경두개 화상 진찰 접근에 대한 보완적인 대안으로 봉사합니다.

마우스에서 신경 면역 역학의 생체 내 이미징에서 반복적인 능력을 발휘하는 정밀한 두뇌 매핑

여기에서 우리는 출생 후 뇌 발달 과정에서 마우스 소뇌에서 과립 뉴런의 시냅스 형성을 시각화하는 방법을 설명합니다.이 세포는 시냅스 구조를 개선하고 시냅스를 형성하여 전체 뇌 회로에 통합됩니다.

소뇌 과립 뉴런 형태 및 시냅스 발달을 연구하기 위해 생체 내 출생 후 전기천공법 활용

현재 방법은 쉽게 사용할 수 있는 유전적으로 암호화된 칼슘 지표를 사용하여 예쁜꼬마선충에서 생체 내 고해상도 하위 구획 칼슘 이미징을 위한 비비율계량 접근 방식을 설명합니다.

생체 내에서 처리되는 신경 칼슘의 세포 내 이미징

학습하세요 공초점 매크로스코피를 사용하여 출생 후 쥐 소뇌 과립세포 이동을 생체 이미징하는 방법을. 이 기술은 신경발생 및 뇌 발달 연구에 필수적인 실시간 세포 추적을 가능하게 합니다.

공 초점 Macroscopy을 사용하여 출생 후의 소뇌 과립 세포 이동의 생체 이미징

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