공 초점 Macroscopy을 사용하여 출생 후의 소뇌 과립 세포 이동의 생체 이미징

이 절차의 전반적인 목표는 살아있는 뇌 절편에서 이동하는 뉴런을 시각화하는 것입니다. 이것은 먼저 P 10 쥐의 소뇌를 해부하여 수행됩니다. 다음 단계는 급성 소뇌 절편을 준비하고 형광 프로브로 뉴런에 라벨을 붙이는 것입니다.

그런 다음 매크로 컨포칼 이미징 또는 컨포칼 현미경을 통해 타임 랩스 실험을 수행합니다. 마지막 단계는 결과 동영상에서 뉴런을 추적하는 것입니다. 궁극적으로, 체외 현미경은 신경 세포의 이동을 조절하는 내인성 인자 또는 독성 물질의 역할을 보여주는 데 사용됩니다.

컨포칼 현미경 검사와 같은 기존 방법의 이 기술의 주요 장점은 매크로 컨포칼 이미징이 사타구니 삽입물에 직접 배치된 대뇌 예술 슬라이스를 남겨두는 느낌이 증가한다는 것입니다. 나는 먼저, 컨포칼 현미경 검사 실험을 위해 대뇌 예술 조각을 옮기고 안정화하는 데 어려움이 있었을 때 이 방법에 대한 아이디어를 가지고 있었습니다.목이 잘린 P 10 쥐 강아지 머리의 두개골에 접근하는 것으로 시작하여 가는 홍채 가위를 사용하여 두개골의 기저부에서 두개골 부위까지 두 개의 측면 절개를 섬세하게 만듭니다. 그런 다음 두 개의 3번 집게로 절개된 두개골을 제거하여 뇌와 두개골 사이의 유착을 끊습니다.

이제 주걱의 숟가락 끝으로 뇌를 퍼내고 얼음에 2ml의 차가운 HBSS와 함께 35mm 페트리 접시에 넣습니다. 이제, 실체 현미경으로 두 개의 3번 집게를 사용하여 D 열상으로 소뇌를 뇌에서 분리하십시오. 소뇌를 얼음 차가운 완충제와 함께 새 접시에 숟가락으로 떠냅니다.

그런 다음 동일한 도구를 사용하여 잔여 척수와 박리 막을 제거하고 버립니다. 15번 수술용 칼날이 있는 3번 단단한 메스 손잡이를 준비합니다. 실체 현미경으로 칼날을 사용하여 진반구와 우반구 사이의 소뇌를 자릅니다.

이제 비브라토에서 시안 아크릴 레이트 접착제를 표본 디스크에 한 방울 떨어 뜨리고 소뇌를 디스크로 옮기기 전에 용매 증기가 소멸 될 때까지 15-25 초 동안 기다립니다. 그런 다음 소뇌의 가장자리를 표본 디스크에 고정하고 10초 동안 기다립니다. 이제 매니퓰레이터를 사용하여 표본 디스크를 버퍼 트레이에 삽입하여 소뇌의 횡축이 나이프 홀더에 수직이 되도록 합니다.

명반 렌치를 사용하여 디스크를 고정하십시오. 그런 다음 HBSS로 소뇌를 조심스럽게 덮고 으깬 얼음을 냉각 수조에 넣습니다. 시편을 자르려면 청소된 블레이드를 배치하여 가장자리가 시편의 뒤쪽 가장자리 바로 뒤에 오도록 합니다.

이것을 아이싱의 시작점으로 정의하십시오. 그런 다음 forward 명령을 사용하여 끝점을 시편의 앞쪽 가장자리를 바로 지나는 것으로 정의합니다. 이제 슬라이스 두께를 180미크론으로 설정합니다.

그런 다음 절편 속도를 2.5로, 주파수를 8로 설정하고 시편 절편을 시작합니다. 소뇌당 최대 5개의 조각을 수집합니다. 잘린 넓은 멧돼지 유리 피펫을 사용하여 각 섹션을 집습니다.

얼음 위에 차가운 HBSS가 담긴 접시에 섹션을 옮깁니다. 실체 현미경으로 절편을 수집한 후 두 개의 5번 집게를 사용하여 수막을 조심스럽게 제거합니다. 또한 더 나은 프로브 로딩을 위해 LOE를 부드럽게 분리하십시오.

검체를 자른 후 잘린 넓은 멧돼지 피펫을 사용하여 일부 HBSS와 함께 각 웰에 최대 3개의 슬라이스를 적재하는 6개의 웰 플레이트로 옮깁니다. 다음으로, 적재 된 각 매체를 비운 후, 빛으로부터 샘플을 보호하기 위해 형광 염료의 10 마이크로 몰을 포함하는 로딩 용액 5 밀리리터를 잘 추가하고 호일로 플레이트를 덮습니다. 그런 다음 35RPM으로 설정된 돌연변이자에 플레이트를 놓습니다.

플레이트를 실온에서 10분 동안 배양하여 염료가 세포 웰에 라벨을 붙일 수 있도록 합니다. 이제 이전과 같이 슬라이스를 3미크론 기공이 있는 트랜스웰 인서트의 멤브레인으로 옮깁니다. 그런 다음 로딩 매체를 흡인하고 조각만 남깁니다.

이제 인서트와 슬라이스를 제거하여 웰에 1.9ml의 DMEM을 채웁니다. 그런 다음 삽입물을 다시 끼우고 조직을 덮기 위해 100마이크로리터의 DMEM을 더 추가합니다. 이 제제를 2시간 동안 배양하면 과립 세포가 보입니다.

뚜껑이 없는 플레이트를 컨포칼 현미경에서 일정한 가스 흐름이 있는 환경 챔버로 옮깁니다. 그런 다음 타임 랩스 실험을 위해 컨포칼 현미경의 플레이트 인서트에 유리 덮개를 놓습니다. 진행하기 전에 세포를 챔버에서 2시간 더 배양합니다.

조직 절편에서 이동하는 과립 세포를 시각화하려면 488나노미터 광으로 제제를 비추고 2배 건조 대물렌즈를 사용합니다. 이미지 J를 사용하여 500에서 530나노미터의 형광 방출을 감지합니다.타임랩스 영화의 각 이미지에 대해 표준 편차 모드를 사용하여 Zack 프로젝션을 수행하고 각 이미지의 대비와 밝기 수준을 조정하여 레이블이 지정된 과립 셀을 쉽게 볼 수 있도록 합니다. 이제 입자 분석 메뉴에서 수동 추적 플러그인을 선택합니다.

플러그인을 사용하여 타임랩스 이미지 시퀀스 전반에 걸쳐 라벨링된 각 세포체의 중심점을 클릭합니다. 그런 다음 추가 분석을 위해 원시 추적 데이터를 스프레드시트로 내보냅니다. 프로그램을 사용하여 각 셀과 관련 위치를 식별하는 스마트 홈메이드 도구를 사용하여 Image J에서 내보낸 원시 추적 데이터를 재구성합니다.

각 셀의 총 이동 거리와 평균 이동 속도를 계산합니다. 출생 후 소뇌 초기에 과립 세포는 서로 다른 피질층을 통과함에 따라 이동 방식과 속도에 상당한 변화를 보입니다. PM 랫드 소뇌 조직 절편에서 CTG 표지된 과립 세포를 검사했습니다.

설명한 바와 같이, 과립 세포는 시간당 18미크론의 평균 속도로 분자층에서 방사상으로 이동했습니다. 그런 다음 이동 속도를 변화시킬 것으로 예상되는 약물의 효과를 테스트하기 위해 다른 제제를 사용했습니다. 배양 배지에 페이 캡 38을 적용하면 분자층의 과립 세포가 79% 빠르게 감소하여 시간당 2.5미크론으로 떨어졌습니다.

내인성 TPA 억제제인 PI one을 투여하면 과립세포 이동 속도가 제어 속도에서 시간당 4.2미크론으로 78% 감소했습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 개발 이론 풍선에서 세포를 추적하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다. 이 절차를 시도하는 동안 발달 후 세포 이동에 필수적인 적절하고 지속적인 환경 매개변수를 제공하는 것을 기억하는 것이 중요합니다.

이 기술은 신경과학 분야의 연구자들이 뇌의 사실적 과정을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.