혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

이 절차의 전반적인 목표는 혈관 조직 재생을 위한 관형 구조를 엔지니어링하는 것입니다. 이것은 먼저 성형 기술을 사용하여 원통형 기하학의 유형 1 콜라겐과 평활근 세포를 결합함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계는 특별히 설계된 정적 생물반응기에서 구조물을 성숙시키는 것입니다.

다음으로, 성숙한 구조체를 조심스럽게 수확하고 내피 세포를 회전벽 생물반응기 액터를 사용하여 구조체의 내강에 안착시킵니다. 궁극적으로 조직학, 대사 분석 및 기계적 테스트를 수행하여 이러한 관형 구조의 특성을 평가합니다. 이 기술의 독창성은 세포와 교원질을 결합하기 위하여 다만 1개 단계를 어떤 추가적인 육체 화학적인 처리도 없이 표적으로 한 기계적 성질을 가진 조직 엔지니어 구조물을 열매를 산출하기 위하여 이용한다 입니다.

또한, 이 구조물은 조작 및 끝 링크를 허용하는 특별히 설계된 그립 덕분에 쉽게 조작할 수 있습니다. 이 방법은 혈관 조직 재생을 위한 성장 및 리모델링 중 세포와 세포외 기질 간의 상호 작용에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 또한 힘줄, 피부 이식, 심장 패치 및 신경계와 같은 여러 표적 조직에 적용할 수 있습니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 정적 생물반응기를 제작하고 조립하기 시작하려면 저장소 및 거즈, 그립 제작, 맨드릴 캡, 하우징 몰드 조립 및 멸균 기술에 대한 세부 정보가 포함되어 있습니다. 다음으로, 175제곱센티미터 조직 배양 플라스크에서 돼지 대동맥 평활근 세포를 90% 융합될 때까지 확장합니다. 표준 배양 기술을 사용하여 세포를 수확한 다음 완전한 배양 배지에서 밀리리터당 400만 개의 세포로 재현탁합니다.

다음으로, 완충액 용액 1부, 멸균 콜라겐 용액 2부를 리터당 4g의 용액과 세포 현탁액 1부로 결합합니다. 이 순서로 혼합물의 pH를 측정하고 pH 7.0에서 7.4 사이인지 확인합니다. 그런 다음 세포 콜라겐 혼합물을 조립된 하우징 몰드 단지에 부드럽게 붓습니다.

혼합물에 기포가 없는지 확인하십시오. 콜라겐 젤을 멸균 환경에서 1시간 동안 실온에 두십시오. 1시간 후, 하우징 튜브를 제거하고 35ml의 예열 배양 배지가 들어 있는 저장소로 구조물을 조심스럽게 옮깁니다.

1주 또는 2주간의 정적 성숙을 위해 수직 위치에서 구조물을 배양합니다. 이틀에 한 번씩 배양 배지를 교체하여 하부 격막 포트에서 오래된 배지를 흡인하고 동일한 양의 신선한 배양물로 저장소를 다시 채웁니다. 보통. 원하는 경우, 처음 12시간 동안은 매시간 및 그 후 24시간마다 생화학적 분석을 위해 각 배지 교환에서 기존 배양 배지와 신선한 배양 배지 모두 1ml를 수집합니다.

멸균 조건의 배양 배지에서 구조체를 제거하고 스캐닝 레이저 간섭계의 경로에 직각으로 배치하여 1-2주간의 정적 성숙 후 구조체의 두께를 측정합니다. 생물반응기를 세포 배양 후드로 옮기고 맨드릴에서 구조체를 부드럽게 제거합니다. 자유로워지면 100ml의 신선한 배양 배지가 들어 있는 직경 40mm의 페트리 접시에 넣습니다.

다음으로, 5-10 뉴턴 로드셀과 섭씨 37도로 유지되는 PBS 수조로 확장되는 그립이 장착된 마이크로 기계 테스터를 설정합니다. 페트리 접시에서 구조체를 제거하고 종방향 테스트를 위한 특수 그립 장치에 연결하고 젤을 분쇄하지 않고 구조체의 거즈 부분에 연결하도록 설계되었습니다. 테프론 테이프를 사용하여 테스트 중 그립 장치가 미끄러지지 않도록 하십시오.

그런 다음 구조물을 마이크로 기계 테스터에 장착합니다. 다음으로, 먼저 구조물을 초기 표점 길이까지 늘리고 10분 동안 유지하여 세로 방향에 대한 피로 시험을 수행합니다. 그런 다음 초당 5%의 비율로 10% 순환 변형을 30회 적용합니다.

샘플이 원주 방향으로 테스트를 수행하지 못할 때까지 10% 순환 변형률의 증분 단계로 변형률을 증가시킵니다. 먼저 시편을 10mm 길이의 고리 구조로 절단합니다. 그런 다음 그립 대신 사용되는 스테인리스 스틸 막대에 링을 장착합니다.

세로 방향 테스트와 마찬가지로 먼저 구조물을 초기 표점 길이까지 늘리고 10분 동안 유지합니다. 다음으로, 초당 5%의 비율로 10% 순환 변형을 30회 적용합니다. 구조체가 성숙하고 맨드릴에서 제거되면 양쪽 끝이 저장소로 연결되는 구조를 고정하고 저장소 어셈블리에 놓습니다.

여기에 표시된 바와 같이. 저수지 외부를 30ml의 배양물로 채우십시오. 보통. 다음으로, 구조체의 내강 부피의 75%를 단백질 혼합물로 채운 다음 구조체의 양쪽 끝을 닫습니다.

단백질 용액의 누출을 방지하려면 생물 반응기를 인큐베이터 내부에 놓고 생물 반응기를 4.02 곱하기 10에서 음의 5 GForce로 1 시간 동안 회전시켜 발광이 코팅되는 동안 발광 표면을 단백질로 코팅합니다. 표준 기술로 배양된 인간 배꼽 정맥 및 경세포가 90% 융합될 때 Resus가 세포를 현탁시키고 M1 99 배양 배지를 보충할 때 수확합니다. 다음으로, 인간의 배꼽 정맥과 요로 상피 세포를 구조물의 내강으로 봅니다.

평방 센티미터당 1000 셀의 밀도로 세포 용액의 누출을 방지하기 위해 구조체의 상지를 닫으십시오. 회전벽 생물반응기 배양액에 호스트된 구조체를 음의 5G 힘에 대해 4.02 곱하기 10의 일정한 회전으로 2일 동안 배양합니다. 혈관 구조물의 정적 성숙 동안, 세포 상승 구조의 외경이 급격히 감소합니다.

여기에서 볼 수 있듯이, 구조체의 직경은 정적 배양 첫날에 초기 값의 60% 감소했습니다. 7일째까지, 구성물은 거의 85%를 감소시켰으며, 구성물의 종방향 및 원주 변형 주기는 모두 콜라겐 기반 구성물의 전형적인 점탄성 특성을 따랐습니다. 전반적으로, 구성물은 동일한 변형 범위에서 원주 방향에 비해 세로 방향에서 더 강했으며, 내피 구축물에 대해 수행된 Massen 트리콘 염색은 매우 균일한 내피를 보여주었습니다.

평활근 세포는 형태 형태와 같은 방추형을 보였고 벽을 통해 균질하게 분산되어 있는 것처럼 보였고, 내피 세포는 내강 쪽에 잘 퍼져 있는 것처럼 보였습니다. 그의 발달 후. 이 기술은 생체 역학 및 재생 의학 분야의 연구자들이 조작된 조직과 천연 조직의 기계적 거동을 탐구할 수 있는 길을 열었습니다.

이 비디오를 시청한 후에는 이제 혈관 구조가 어떻게 빠르게 엔지니어링되고 마침내 동적 에이터에서 기계적 컨디셔닝에 다루어지고 사용될 수 있을 만큼 충분히 강해질 수 있는지 잘 이해하게 될 것입니다. 우리의 노력과 결과가 생물학적 기능 조직의 발달을 위한 세포외 기질 모델에서 세포의 높은 잠재력에 대해 확신을 주었기를 바랍니다.