Name: 리보플라빈과 혈소판 제품 및 자외선 치료 : 높은 역가 세균 오염에 대해 효과 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: 학습하세요 리보플라빈과 자외선을 이용한 혈소판 제품의 병원체 감소 기법을. 고역가 세균 오염을 효과적으로 제거하여 수혈 안전성을 높이는 이 방법의 원리와 적용을 탐색하세요.

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1. 박테리아 서스펜션 준비 : <ol><li> 스트리킹 배양 플레이트로부터, 멸균 무균 접종 루프로서 적절한 성장 배지 (표 1) 100 ㎖을 함유하는 250 ㎖의 멸균 병에 단일 콜로니를 접종한다. </li><li> 정기적으로 성장에 대한 검사 1 ~ 2 일 동안 적절한 조건 (표 1)에서 궤도 진탕 배양기에 병을 놓습니다. 140 rpm으로 진탕 속도를 설정합니다. </li><li> 무균는 23 ℃에서 20 분 동안 3,000 XG에서 두 멸균 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기 튜브에 세균 현탁액을 전송합니다. </li><li> 뜨는을 기음과 멸균 펩톤 물 15 ㎖로 각 박테리아 펠렛을 재현 탁. 소용돌이 필요. 하나의 튜브 / 용기에 중단 박테리아 문화를 결합합니다. </li><li> 주식 문화의 역가를 결정하는 제 4 당 중으로 주식 문화를 역가. </li><li> 냉장 이주까지 4에 대한77; 2 ° C 필요할 때까지. 다시 역가 사용시에 배양 단계 4.8 참조. </li></ol> 2. 혈소판 제품 준비 : <ol><li> 공인 혈액 은행에서 표준 성분 채집 술 인간의 혈소판 제품을 수집합니다. 혈소판 제품은 다음 컬렉션 스펙을 충족해야 90에서 3백60까지 mL의 부피와 -3.8 0.8 × 106 혈소판 / μL 농도. <ol><li> 혈소판 제품이 병원균 감소를위한 사전 처리에 2 시간의 최소 휴식되었는지 확인합니다. 이 2 시간 동안 교반없이 혈소판 인큐베이터에서 22 ± 2 ℃에서 제품을 보관하십시오. 모 ✲가 2 시간 동안 지속 되 혈소판 제품 혈소판 인큐베이터에서 22 ± 2 ℃에서 교반되도록. 최대 22 시간 게시물 컬렉션 제품을 사용합니다. </li></ol></li><li> 3 ㎖ 주사기를 2 mL의 샘플을 사용하여 제거 혈소판 제품의 pH (22C)를 측정한다. 제품을 위해 혈액 가스 분석을 사용하여 pH가&gt; 6.6 갖는다. 혈액 분석기를 사용하여 제품의 혈소판 혈소판 농도를 측정하기 위해 동일한 샘플을 사용한다. 제품이 0.80-3.8 × 106 혈소판 / μL 수집 농도 요구 사항을 만족해야합니다. </li><li> 시각적으로 혈소판 제품의 소용돌이를 평가한다. 생성물이있는 경우 &quot;0&quot;제품이 폐기 될 것이다 소용돌이 친다. </li><li> 직접 백색 광원에서 혈소판 가방을 잡고 짧게 혈소판 가방을 짠다. 시각적 혈소판 샘플의 소용돌이 패턴을 관찰한다. 다음 스케일을 사용하여 제품의 점수. 참고 : 2 - 긍정적 소용돌이 : 강한 콘트라스트 전체 가방을 통해 볼 수 불균일성을 소용돌이. 1 - 중간 소용돌이 : 일부 불균일 볼 수 있지만, 몇 곳에서 가난한 대비. 0 - 음의 소용돌이 : 이전과 혈소판 가방을 압박하고 남은 혼탁 동질성 </li></ol> 3. 리보플라빈과 자외선 프로세스 : <ol><li> 트란멸균 튜브 도킹 장치를 사용 리보플라빈 및 UV 광 조사 및 저장 가방 혈소판 제품 sfer. 전송 후 튜브 실러를 사용하여 빈 혈소판 단위 컬렉션 가방을 제거하고 생물학적 폐기물로 빈 가방을 버리십시오. </li><li> 그 빛 보호 바깥 랩에서 원액을 리보플라빈 500 μM의 35 ml의 주머니를 제거합니다. 멸균 독 처리 및 저장 백의 입구 라인 상 리보플라빈 키트. 내용이 혈소판 단위로 배출 허용합니다. </li><li> 리보플라빈 주머니에서 설정 리보플라빈 파우치 / 처리 및 저장 가방을 끊고 부드럽게 처리 및 저장 가방에서와 리보플라빈의 가방에 잔류 공기를 표현한다. 혈소판 생성물 소량을 보장하는 것이 아니라 혈소판 제품에 잔류하는 린스 리보플라빈 리보플라빈 파우치로 표현된다. 리보플라빈 및 혈소판 용액 처리 및 저장 백에 다시 배출 허용하고 유입 라인 클램프. 빈 리보플라빈 가방 우리를 제거튜브 실러를 보내고 및 생물학적 위험 폐기물로 빈 가방을 버리십시오. </li><li> 무균 독 조명 및 스토리지 가방의 입구 라인 상에 여성 주사기 커넥터 6 &quot;튜브 라인. 여성 주사기 커넥터에 10 ML의 주사기 배럴 (플런저 제거)에 연결합니다. </li><li> 무균 피펫을 통해 주사기 배럴에 재고 박테리아의 5 mL를 추가 할 수 있습니다. 입구 라인에 클램프를 열고 세균이 혈소판 제품에 배출 할 수 있습니다. 일부 제품은 혈소판 10 ㎖ 주사기 배럴로 다시 흐르게하여 시린지 외통을 헹군다. 10 ML의 주사기 배럴을 제거합니다. </li><li> 이 무균 30 ㎖ 주사기를 부착 혈소판 제품 혼입 스톡 박테리아 있도록 유입구 두 번 최소 플러쉬. 제품이 잘 혼합 한 후, 깨끗한 50-10 mL의 주사기를 사용하여 2 ml의 전처리 샘플을 제거한다. 접종 단계에서 도입 된 모든 공기를 보장 새 주사기를 사용하거나 단계를 샘플링이 제거된다. <ol><li> 제 4 항에 따라 전처리 샘플 역가. </li></ol></li><li> 처리 및 보관 가방에서 입구 라인을 제거하고 제품의 무게. </li><li> 조명에 제품을 놓고 표준 혈소판 치료를 시작 화면의 명령을 따르십시오. <ol><li> 운영자 ID를 입력합니다. </li><li> 안전하고 조명기의 플래 튼에 가방을 탑재합니다. </li><li> 바코드 리더 또는 수동 입력 키패드를 사용하여 조명기로 샘플 ID를 입력합니다. </li><li> 스캔 제품 유형. </li><li> 석영 클램프를 닫습니다. </li><li> 조명 장치가 자동으로 에너지의 6.24 J / ㎖를 제공합니다. 일반적인 처리 시간은 5 ~ 10 분 소요됩니다. </li></ol></li><li> 치료 및 스토리지 가방의 샘플 전구 라인 상에 여성 주사기 커넥터 6 &quot;튜브 라인 처리 멸균 독에 따라. 제품이 잘 혼합 확인 후 5 ML의 주사기를 연결하고 2 ㎖의 후 처리 샘플을 제거합니다. <ol><li> 후 처리 샘 역가제 4 당 PLE. </li></ol></li></ol> 4. 세균 역가 <ol><li> 전처리 및 후 처리 샘플의 역가를 추정하고, 각 샘플의 종점 일련의 희석을 수행하는 데 필요한 5 mL로 희석 튜브의 적절한 수를 준비한다. 무균 펩톤 물 1.8 ml의 필요한 튜브를 입력합니다. </li><li> 역가가 10 배 일련 희석 방식을 사용하여 각 샘플. 무균는 제 희석 관 (10-1)에 희석 시료 0.2 mL를 옮긴다. 이 희석 와류 튜브 및 전송 다음 희석 튜브에 0.2 ml의. 희석의 필요한 수를 통해 일련의 희석을 계속합니다. <ol><li> 무균 전송 각 희석액 100 ㎕은 적절한 한천 판 (표 1)에 도금 될 수 있습니다. </li></ol></li><li> 멸균 셀 스프레더를 사용하여 균등하게 각 한천 플레이트에 샘플을 배포 할 수 있습니다. </li><li> (반전과 적절한 조건에서 판을 품어 <stroNG&gt; 주기적으로 성장 검사 1-2일 표 1). </li><li> 30-300 식민지로 번호판을 계산합니다. 보다 큰 300 식민지를 포함하는 플레이트는 (TNTC)을 계산하는 너무 많은 간주됩니다. 30 개 미만의 식민지가 포함 된 플레이트는 정량 한계 (LOQ) 이하로 간주됩니다. </li><li> 각 시료의 역가를 계산 CFU / ㎖로 결과를 기록한다. <ol><li> CFU / ㎖를 계산하기 위해 다음 식을 사용하여 <img alt="식 (1)" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li> 최저 희석 플레이트에는 콜로니가없는 경우, 검출 (LOD)의 한계를 계산하기 위해 다음 식을 사용 <img alt="식 (2)" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> 과 <img alt="식 (3)" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> 장소 : N은 P 입자 (CFU)의 낮은 수를 =자신감을 검출 할 수는 roduct. 미생물이 발견되지 않은 것이라고 P는 = 확률; 미생물을 검출하는 95 % 신뢰 위해, P는 = .05. 용액에 V = 전체 제품의 부피 판의 V = 부피 도금 (ML) × 희석 수준 </li></ol></li><li> 음성 대조군을 위해, 두 개의 한천 플레이트 각각에 계열 희석에 사용 펩톤 물 0.5 mL로 접시. 샘플을 테스트 할 같은 플레이트 유형을 사용합니다. 반전 1-2 일 정기적으로 성장을 확인하기위한 적절한 조건에서 접시를 품어. <ol><li> 성장은 어느 한천 플레이트에서 관찰되는 경우, 사용 펩톤 물 병은 폐기되어야하며 연구의 결과는 무효화됩니다. </li></ol></li><li> 양성 대조군 재 역가 사용 된 세균 배양 용 스톡. 반전 1-2 일 정기적으로 성장을 확인하기위한 적절한 조건에서 접시를 품어. 역가 기록 CFU / ㎖를 기록 ± 1.0이어야한다연구를위한 에드 재고 역가가 (섹션 1.5 참조) 유효한 것으로 간주합니다. </li></ol>

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이 논문의 모든 저자는 현재 데루 BCT, 미라 솔 PRT 시스템의 개발 및 제조 업체에 의해 사용된다. 이 비디오 기사에 대한 출판 비용은 데루의 BCT가 지불되었다.

세균 검사는 혈액 금융 기관에서 일반적인 관행이되었다 많은 위치에 대한이 세균 오염 된 혈소판의 수혈을 방지하기 위해 기본 방법 역할을합니다. 세균의 스크리닝은 일반적 S. 같은 빠른 성장 그람 음성 박테리아의 대부분을 interdicts 있지만 티아 균, E. 대장균 및 E. 박터 클로 아카에 균, 이는 S. 같은 느리게 성장하는 그람 양성 세균을 검출하기 위해 분투 구균, 연쇄상 구균 SPP. 및 S. 표피 8. 불행히도, 이러한 세 그람 양성 세균은 환자 사망률 1 이끌었다 오염 된 혈소판이 세 단위를 함유하는 유기체 혈소판 수혈 제품의 50 %의 위쪽에 연루되어있다. 적어도 하나의 유기체가 전형적인 4-8 ml의 선별 시료 내에 포함되도록 세균의 스크리닝에 충분히 높은 것으로 혈소판 생성물 세균 역가에 의존. 세균은 4-8 ㎖의 샘플 볼륨에 캡처하는 세균 역가가 충분히 높지 않으면, 장치는 잘못 부정적인 것으로 플래그되며 이것은 수혈을 위해 해제된다. 세균 검사에 대한 대안 접근 방식은 모든 혈소판 단위에서 수행 할 수 있으며, 그 이외의 기능과 오염 생물을 렌더링 할 수있는 능동적 인 프로세스를 사용하는 것이 될 수있다. 본 연구에서는, 박테리아의 높은 역가 의도적 리보플라빈 및 UV 광 병원체 환원 공정의 총 용량을 감소 테스트 유닛 혈소판에 첨가 하였다. 박테리아 하중이 본 연구에서 테스트되었지만까지 정상적으로 기부시 혈액 제제에서 발견 초과, 본 연구는 리보플라빈 및 UV 광 프로세스가 대폭으로 오염 된 혈소판 부에서 생균의 역가를 감소시킬 수 있음을 입증하는 데 도움 5.4 로그 (세균 오염의 99.7-99.9996 % 감소) (그림 2) 2.6. ACCURA를 얻으려면TE 대수 감소 값은, 그 세균 역가 단계를 수행 할 때 작업자가 정밀 피펫 기술과 함께 양호한 무균 기술을하는 것이 중요하다. 연속 희석을 수행 부정확 한 피펫 오류의 축적, 따라서 부정확 한 역가 측정 될 수 있습니다. 본 연구에서 수집 된 데이터는 낮은 수준의, 임상 적으로 관련 균혈증 (&lt;20 CFU / 단위)에 대해 시스템을 도전 리보플라빈 및 UV 빛과 이전 작업을 지원합니다. 이전의 연구는 실제 임상 오염 이벤트를 모방하도록 설계 결과 리보플라빈 보여 UV 광은 7 일 혈소판 저장 기간 동안 박테리아의 성장을 방지하는데 효과적이었다. 선행 연구로부터의 데이터에 기초하여 모델링 혈소판 제품의 세균 오염의 현재 위험 추정치는 현재 수준에서 8만큼 98 %까지 감소 될 수 있음을 시사한다. 리보플라빈 및 자외선 공정은 세균 화면에 호의적으로 비교유일한 임상 적 세균로드 8 도전 때 혈소판 단위 세균 오염 물질을 검출하기 위해 66 %의 효과를 입증 ING. 모든 기술과 같이, 혈소판의 제품 PRT 치료는 세균 오염 혈소판 유닛으로 한계를 가지고 연관된 합병증을 방지 할 수있다. PRT 시스템은 박테리아 포자에 대해 유효하지 않으며 PRT 시스템이 여전히 남아있는 독소 수신자에 혈성 쇼크를 유발할 수 그람 음성 세균의 높은 역가를 비활성화 할 수 있더라도 따라서, 엔도톡신을 불 활성화하지 않는다. 박테리아가 높은 역가에 전파하기 전에 PRT 가장 잘 보관시 초기에 수행된다. 이 두 연구의 조합에 의해 입증 된 바와 같이 결론적으로, 리보플라빈과 자외선 과정은 모두 그람 음과 그람 양성균의 세균 부하를 감소 시키는데 효과적이며, 세균 검사에 대한 대안을 제공 할 수 있습니다. 정기적으로 가공용리보플라빈 및 UV 빛 G 혈소판 제품은 바이러스 및 기생충과 같은 다른 혈액 매개 에이전트의 잠재적 인 전송을 줄일 수 있다는 이점이 있습니다.

혈소판 수혈, 혈장, 적혈구 및 포장 전혈 제품은 현대 의학에서 주요 역할을하고, 각종 질환을 치료하는 중요한 유체를 교체하고 궁극적으로 생명을 구하기 위해 사용될 수있다. 혈소판은 하나 전혈에서 분리 및 풀링 transfusable 용량으로 또는 혈소판 성분 채집 술의 과정을 통해 수집되는 셀룰러 제품입니다. 몸에있는 혈소판의 주요 역할은 상처 부위에서 출혈을 멈추게하고 지혈을 유지하는 데 도움이하는 것입니다. 낮은 혈소판 세포 수 (혈소판 감소증)을 앓고있는 환자는 자발적 출혈 사건에 취약 그들의 혈소판 세포가 정상 범위로 다시 카운트 가지고 혈소판 수혈된다. 수집 된 혈소판 5-7 일까지 동안 저장되고있는 동안 일정한 교반하에 22 ± 2 ℃에서 보관된다. 혈소판 수혈의 속성을 저장 수명이 때문에 공동으로 수혈받는 사람에게 약간의 위험을 유지에도 불구하고기생충, 박테리아와 바이러스 11에 의한 이러한 제품의 ntamination. 바이러스 핵산 테스팅의 구현 (NAT)이 간염 C 바이러스 (HCV), 간염 B 바이러스 (HBV) 및 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV)와 같은 주요 혈액 매개 제제의 바이러스 전달의 위험을 상당히 감소하고있다 (5). 이러한 에이전트는 HIV 1 8,000,000 당 기부금, HCV 1 6,700,000 당 기부금 및 B 형 간염 바이러스 (15) 1 1,700,000 당 기부를하기 위해서는 캐나다 혈액 서비스에서 최근 출판은 잔여 위험을 추정하고있다. 혈소판 제품의 수백만 매년 수혈 때문에 많은받는 사람이 잠재적으로 생명을 위협하는 합병증에 노출 된 1,000 7 : 박테리아는 일반적으로 일반 대중에 덜 관심을 가너 있지만, 혈소판 제품의 세균 오염의 빈도가 높은 1로로 추정하고있다 패혈증 (6) 등을들 수있다. 연구는 시간에 그 세균 부하를 제안한다오염이 낮은으로, &lt;100 콜로니 형성 단위 (CFU) / 제품 2.16 그러나 영양이 풍부한 환경 상온 저장 전에 수혈에 위험 높은 역가에 증식하는 세균 오염 허용한다. 현재, 혈소판받는 도달 세균 오염을 방지하는 제품을 사용할 수있는 유일한 방법은 배양 승인 기반의 시스템과 치료의 신속한 테스트 포인트의 사용을 통해서이다. 요약하면, 배양 기반 시스템 혈소판 제품 4-8 ml의 샘플 병에 혈소판 생성물로부터 제거 접종이되는 세균이 제품에 증식 할 수 있도록 12 ~ 24 시간, 22 ℃에서 교반에 저장된 영양 배지를 포함. 병은 세균의 성장을위한 병을 모니터링하는 기기에 배치됩니다. 악기가 병에 박테리아의 성장을 감지하면이를 신고하고 해당 혈소판 유닛은 폐기된다. 이 과정은 빠른 촉진제를 검출하기에 합리적으로 성공하지만날개 생물, 느린 성장 종의 많은 따라서 수혈 7,12,14,16,22에 대한 발표 될 위음성 단위의 가능성을 만들어 감지 할 수있을만큼 충분히 높은 역가에 성장하지 않습니다. 세균 부하가 상당히 증가되면 배양 기반 탐지 시스템과 달리, 케어 테스트 포인트는 통상적으로 신속한 혈소판 저장 기간에서 나중에 수행된다. 높은 역가가 관리 시험의 포인트는 문화 기반 시스템보다 덜 민감하기 때문에 필요하고, 그들이 역가 ≥1 × 103 CFU / ㎖ (17)에 도달하면 만 안정적으로 박테리아를 검출한다. 그러나 이러한 테스트는 샘플링 1 시간 이내에 결과를 제공 할 수 있습니다. 이러한 테스트의 성능에 변동성은받는 사람 9 치명적인 패혈증 반응을 일으키는, 허위 부정 제품의 방출을 주도했다. 혈소판 제품의 세균 오염의 문제에 대처하기 위해 다른 방법은 병원체 환원 PROC 루틴의 사용을 통해 인오염 된 세균을 비활성화하는 대신 그들을 감지하는 시도 할 수 있습니다 ESS. UV 광과 함께, 광 증감 제로서 사용 리보플라빈, 리보플라빈 및 박테리아 3,4,8,10,19-21 UV의 국지적 인 사용을 포함한, 혈액 유래 병원균 오염 물질의 넓은 범위의 감염을 감소시키는 것으로 나타났다 병원체 환원 광 비 독성 및 비 돌연변이 유발하며, 리보플라빈 및 UV 광 처리 된 성분은 수혈 수신자뿐 아니라 혈액 제품 (18)을 처리 대 그 안전한 것으로 밝혀졌다. 간단히, 리보플라빈 분자는 박테리아, 기생충, 바이러스, 모든 유핵 세포 (예 백혈구)의 핵산 (DNA 및 RNA)와 연결할 수있다. UV 광에 노출 따라서 핵산의 복제 및 / 또는 전사를 방지하고, 13 비활성화 유기체 떠나는 핵산 (주로 구아닌 염기)의 작용기에 화학적 변화를 일으키는, 리보플라빈 활성화한다. 판 같은 Anucleated 세포수 및 적혈구 인해 핵산의 부족 리보플라빈 화학에 의해 영향을받지 않는다. 리보플라빈과 자외선 기술 이전 작업은 임상 적으로 세균 부하 (&lt;20 CFU / 제품) (8)에 오염 된 혈소판 제품을 모방하기위한 실험 설계를 사용하여 박테리아의 선택 그룹을 평가 하였다. 이 연구의 목적은 높은 역가 세균 오염에 대해 리보플라빈 및 UV 광 처리를 평가 하였다 (&gt; 1.0 × 105 CFU / ㎖) 시스템의 총 세균 환원 능력을 측정하기 플라즈마 처리 혈소판 제품. hemovigilance 연구 (1)로부터 수집 된 데이터에 기초하여, 일반적으로 발생하는 그람 음성 및 그람 양성균의 패널을 대상으로 평가를 위해 선택되고 다음 종 포함 하였다 : 표피 포도 구균, 황색 포도상 구균, 스트렙토 mitis가 각각 1 주 씩으로, 스트렙토 오게 네스, 세라 티아 균, 예 르시 니아 enterocolitica을 ,브루셀라 neotomae, 바실러스 세레 우스 (식물 양식), Esherichia 대장균, 녹농균과 폐렴 간균. B를 제외한 모든 생물, 세레 우스는 ATCC로부터 수득하고, 우선 혈액 성분으로부터 분리되는 것으로서 식별되었던 균주를 얻기에 넣었다. B. 세레 우스는이 연구에서 테스트하는 것은 오염 된 혈소판 제품에서 내부적으로 고립 된 임상 균주이다.

<table><tbody><tr><td>Mirasol Illuminator</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mirasol 치료/보관 가방</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>혈액 분석기</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Ac&bull; T 차이&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>혈액 가스 분석기</td><td>Siemens</td><td>RapidLab 1265&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>멸균 도킹 장치</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>혈소판 인큐베이터</td><td>Helmer</td><td>PC2200</td><td></td></tr><tr><td>궤도 인큐베이터 셰이커</td><td>Lab-Line</td><td>4628</td><td></td></tr><tr><td>건식 인큐베이터</td><td>Fisher</td><td>Iso-temp</td><td></td></tr><tr><td>Class II A/B3 Biosafety Cabinet</td><td>Thermo-forma</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Sealer Sebra</td><td>Smart Sealer II</td><td></td></tr><tr><td>탁상용 원심분리기</td><td>IEC</td><td>Centra GP8R</td><td></td></tr><tr><td>10ml 주사기</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>30ml 주사기</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>5ml 희석 튜브</td><td>VWR</td><td>211-0058</td><td></td></tr><tr><td>50ml 원추형 튜브</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫</td><td>Gilson</td><td>P-200</td><td></td></tr><tr><td>마이크로피펫</td><td>Rainin</td><td>R-200</td><td></td></tr><tr><td>반복 피펫</td><td>Eppendorf</td><td>4780</td><td></td></tr><tr><td>1-200 &micro; l 필터 팁</td><td>Costar</td><td>4810</td><td></td></tr><tr><td>25 ml 일회용 혈청 피펫</td><td>Costar</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>5 ml 일회용 혈청 피펫</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>35 ml 500 &micro; M 리보플라빈</td><td>테루모 BCT</td><td>35 mL 500 &마이크로; 남&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>브루첼라 한천 5% 말 혈액</td><td>BBL</td><td>221547</td><td></td></tr><tr><td>뇌 심장 주입</td><td>Teknova</td><td>B9993</td><td></td></tr><tr><td>펩톤 워터</td><td>BD</td><td>257087</td><td></td></tr><tr><td>트립티케이스 소이 육수</td><td>BD</td><td>299113</td><td></td></tr><tr><td>트립티케이스 소이 한천</td><td>Remel</td><td>R01917</td><td></td></tr><tr><td>열 비활성화 호스 세럼</td><td>Gibco</td><td>26050</td><td></td></tr></tbody></table>

리보플라빈과 혈소판 제품 및 자외선 치료 : 높은 역가 세균 오염에 대해 효과

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

세균에 의한 혈소판 단위의 오염은 오랫동안 그들의 포스트 기부의 보관 조건에 크게 수혈 위험으로 인정되고있다. 제품은 정기적으로, 교반 진탕 기에서 22 ℃에서 박테리아의 성장을 촉진 할 수있는 조건을 저장됩니다. 혈소판 제품에 도입 될 것으로 박테리아의 총 수는 매우 낮지 만, 이들 박테리아는 잠재적으로 심각한 부작용을 초래하는 매우 높은 역가 이전 수혈로 곱할 수있다. 본 연구의 목적은 혈소판 제품의 일반적인 오염 물질로 확인 된 박테리아의 패널에 대하여 리보플라빈 기반 병원체 환원 공정을 평가하는 것이었다. 이 패널은 다음과 같은 유기체를 포함 : S.을 표피, 황색 포도상 구균, S. mitis가 각각 1 주 씩으로, S. pyogenes의, S. 티아 균, Y. enterocolitica, B. neotomae, 나 세레 우스, 대장균, 녹농균 및 K. 폐렴. 각 유닛은 혈소판 높은 세균 부하를 접종하고, 시료 b를 제거한전과 치료 후 OTH. 콜로니 형성 분석을 종점 희석 방식을 사용하여이 전처리와 후 처리 세균 역가를 결정하는 데 사용되었다. log 감소는 전처리 역가에서 후 처리 역가를 감산하여 계산 하였다. 다음 로그 감소가 관찰되었다 : S. 표피 4.7 로그 (99.998 %), 황색 포도상 구균 4.8 로그 (99.998 %), S. 3.7 로그 (99.98 %) mitis가 각각 1 주 씩으로, S. pyogenes의 2.6 로그 (99.7 %), S. 티아 균 4.0 로그 (99.99 %), Y. enterocolitica 3.3 로그 (99.95 %), B. neotomae 5.4 로그 (99.9996 %), B. 세레 우스 2.6 로그 (99.7 %), 대장균 ≥5.4 로그 (99.9996 %), 녹농균 4.7 로그 (99.998 %)과 K . 폐렴 2.8 로그 (99.8 %). 이러한 연구 결과는 박테리아 오염 프로세스와 관련된 심각한 부작용 수혈 사건의 위험을 낮출 수 도움 제안한다.

열한 다른 세균 종의 감소는 리보플라빈 및 UV 광 PRT 기반 프로세스를 사용하여 평가 하였다. 이러한 에이전트는 혈소판 제품의 일반적인 오염 물질의 일부​​를 표현하고 긍정적 인 다섯 그람 여섯 그람 음성균을 포함한다. 적어도 6 혈소판 제품은 생물체마다 평가하고, 각 제품은 혈소판 제품에 박테리아의&gt; 1.0 × 105 CFU / ml의 최종 역가를 수득 충분히 균을 접종 하였다. 처리 전 샘플 혈소판 생성물을 신속히 리보플라빈 및 UV 공정으로 처리하고, 그 후에 전처리 역가를 측정하기 위해 제거 하였다. 다음 로그 감소가 관찰되었다 혈소판 제품의 처리를 다음을 S. 표피 4.7 로그 (99.998 %), 황색 포도상 구균 4.8 로그 (99.998 %), S. 3.7 로그 (99.98 %) mitis가 각각 1 주 씩으로, S. pyogenes의 2.6 로그 (99.7 %), S. 티아 균 4.0 로그 (99.99 %), Y. enterocolitica 3.3 로그 (99.95 %), B.neotomae 5.4 로그 (99.9996 %), B. 세레 우스 2.6 로그 (99.7 %), E. 콜라이 ≥ 5.4 로그 (99.9996 %), P. 녹농균 4.7 로그 (99.998 %), K. 뉴 모니 및 2.8 로그 (99.8 %) (도 2). 리보플라빈 및 UV 처리에 대해 전술 한 바와 같이 모든 장치들은 시스템 사양을 충족. 추가의 환원 시험을 행 하였다 S. 버피 코트 유래 혈소판을 사용하여 화농. 큰 차이는 S.의 감소는 관찰되지 않았다 혈소판 성분 채집 대 버피 코트 유도 혈소판에 오게 네스 (데이터는 미도시). <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> 표 1 : 리보플라빈과 UV 광을 사용하여 평가 박테리아 종의 성장 조건. 혈소판 제품을 오염시키는 것으로 나타났다 모두 그람 양성균과 그람의 패널을 본 연구를 위해 선별 하였다. 성장 전파 할 조건 (온도 및 미디어 유형) 및 Tite의R 생물이 표시됩니다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> 그림 1 : 리보플라빈 및 UV 빛의 병원균 감소 처리. 리보플라빈은 500 μM의 농도에서 공칭 0.9 % 식염수에 용해시켰다. 액 상체는 각 제품에 접속되어 방전 멸균 하였다. 박테리아는 혈소판 각 유닛에 무균 첨가 한 다음 UV 에너지 (약 6-10 분) 6.2 J / ㎖로 처리 하였다. 이 시험 관내에서 처리 후 혈소판 부는 최종 세균 역가를 결정하는 샘플링 공부. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> 그림 2. 리보플라빈 및 UV 광으로 처리 리보플라빈 및 UV 광이 혈소판 제품의 일반 세균 오염 박테리아 하중을 감소시키기 위해 사용 된 다른 세균 종의 감소. 로그 감소 10 차이다평균 전처리 역가 평균 후 처리 역가 사이. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

혈소판 제품의 보관 조건은 박테리아 오염 물질이 위험한 수준까지 증식할 수 있는 이상적인 환경을 조성합니다. 이 연구의 목표는 콜로니 형성 분석을 사용하여 인간 혈소판 제품의 고역가 박테리아 오염에 대한 리보플라빈 기반 병원체 감소 프로세스를 평가하는 것이었습니다.

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

이 절차의 전반적인 목적은 리보플라빈 및 UV 기반 병원체 감소 공정을 사용하여 혈소판 제품 내 일반적인 세균 오염원의 감소 정도를 평가하는 것입니다. 이는 먼저 고역가의 세균 스톡을 준비함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 인간 혈소판 제품을 확보하여 단위 세포의 품질을 평가하는 것입니다.다음으로, 혈소판 단위에 리보플라빈(riboflavin)을 투여하고 일정 농도의 박테리아를 접종합니다. 마지막 단계는 해당 단위에 UV 광선을 조사하는 것입니다. 최종적으로, 종말 희석 도말법(endpoint dilution plating assay)으로 측정한 생존 박테리아 수를 처리 전후 샘플과 비교하여 박테리아 감소율을 측정합니다.박테리아 스크리닝과 같은 기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 리보플라빈과 UV 광선을 통해 H-I-V-H-C-V, 말라리아 및 Babesia와 같은 다른 병원균을 불활성화할 수 있다는 것입니다. 이 기술의 영향은 혈액 매개 병원균을 넘어 백혈구 및 헌혈 혈액 제제까지 불활성화할 수 있다는 점에서 더욱 확장됩니다. 이러한 요소들은 수혈 관련 이식편-숙주 병변과 같은 부작용 수혈 사건과 관련이 있어 왔습니다.저는 화합물, 특히 광화학 화합물과 핵산의 상호작용에 관한 연구를 진행하던 중, 이 방법을 통해 혈액 내 병원체를 불활성화하겠다는 생각을 처음 하게 되었습니다. 이 기술은 적혈구, 혈소판 및 혈장 단백질과는 달리, 병원체는 복제와 질병 전염에 필수적인 게놈 핵산을 포함하고 있다는 사실을 이용합니다. 따라서 혈액 제제 내에 존재하는 핵산 화학을 표적으로 삼음으로써, 적혈구, 혈소판 및 혈장 단백질 성분의 품질은 유지하면서 병원체만을 더 선택적으로 불활성화할 수 있습니다. 이제 해당 절차를 시연하겠습니다.오늘 진행하실 분들은 실험 과학자인 Nick HOA와 실험 테크니션 Denise Gilmore입니다. 먼저, 대상 박테리아 전용 배지 100 mL가 담긴 멸균 250 mL 병을 준비하십시오. 멸균 백금이를 사용하여 스트리킹 배양 플레이트의 단일 박테리아 콜로니를 배지에 접종하십시오.다음으로, 병을 궤도 진탕 배양기에 넣습니다. 셰이커 속도를 140 RPM으로 설정하고 배양물을 1~2일 동안 배양합니다. 주기적으로 배양물의 세균 성장 여부를 확인합니다.배양 후, 박테리아 현탁액을 멸균된 15 milliliter 원추형 튜브 두 개로 옮깁니다. 23 °C에서 3000 ×g로 20분 동안 원심분리합니다. 그 다음, 상층액을 흡입하여 제거하고 15 milliliters의 멸균 펩타이드수로 박테리아 펠렛을 재현탁합니다.튜브를 볼텍싱하여 부유를 돕고, 부유시킨 세균 배양액을 모아 스톡 배양액을 만듭니다. 5 mL 희석 튜브 각각에 펩타이드 워터 1.8 mL를 채웁니다. 희석하지 않은 시료 200 µL를 첫 번째 튜브에 옮기고 튜브를 볼텍싱한 다음, 200 µL를 다음 튜브로 옮깁니다.적절한 희석 배수에 도달할 때까지 반복합니다. 각 희석액 100 µL를 적절한 배양 플레이트에 옮깁니다. 멸균된 셀 스프레더를 사용하여 시료가 배지 전체에 고르게 분포되도록 도말합니다. 음성 대조군 플레이트에는 AER을 분배합니다.펩타이드 희석액 500 µL를 두 개의 한천 배지에 분주합니다. 멸균된 셀 스프레더를 사용하여 시료를 배지 전체에 고르게 도포한 후, 모든 플레이트를 뒤집어 적정 온도에서 1~2일 동안 배양합니다. 음성 대조군 플레이트에서 성장이 관찰되면 펩타이드 희석액이 오염된 것이며, 해당 역가 측정 값은 무효입니다.음성 대조군 플레이트가 음성인 경우, 콜로니 수가 30개에서 300개 사이인 모든 플레이트의 콜로니 수를 측정하십시오. 그런 다음 각 시험 샘플의 역가를 계산하고, 밀리리터당 수치를 결과로 기록하십시오. 박테리아 배양물은 4 °C에서 최대 2주 동안 냉장 보관하십시오.정확성을 위해 사용 전 배양물의 역가를 다시 측정하십시오. 마이크로리터당 0.80 내지 3.8백만 개의 혈소판 농도를 가진 90 내지 360밀리리터의 표준 성분채집 인간 혈소판 제제를 준비하십시오. 혈소판 백을 22°C의 혈소판 배양기에서 최소 2시간 동안 안정시킨 후, 사용 전까지 60 RPM으로 부드럽게 흔들어 섞어줍니다.혈소판 제제에서 2 mL 샘플을 채취하고 22 °C의 혈액 가스 분석기를 사용하여 pH가 6.6 이상인지 확인합니다. 동일한 샘플을 사용하여 혈액 분석기로 혈소판 농도를 측정해 원하는 범위 내에 있는지 확인합니다. 다음으로, 혈소판 백을 직접적인 백색 광원 아래에 두고 육안으로 검사합니다.백을 짧게 눌러 샘플의 소용돌이 패턴을 관찰하십시오. 백을 누르기 전과 후에 탁한 균질성이 유지된다면, 튜빙 도킹 장치를 사용하여 혈소판을 사용하지 마십시오. 해당 혈소판을 리보플라빈 및 UV 광조사 및 보관 백으로 옮기십시오.튜빙 실러를 사용하여 빈 혈소판 백을 제거하고 이를 생물학적 위험 폐기물로 폐기하십시오. 다음으로, 500 µM 리보플라빈 스톡 표준 용액 멸균 팩의 빛 차단 외부 포장을 제거하십시오. 리보플라빈 파우치를 처리 및 보관 백의 유입 라인에 연결하고, 내용물을 혈소판 유닛으로 배출하십시오.그 다음 리보플라빈 파우치에 파우치와 처리백 세트를 겁니다. 처리백에 남아 있는 공기를 리보플라빈 백 쪽으로 부드럽게 밀어내어 제거합니다. 소량의 혈소판 제제를 사용하여 남아 있는 리보플라빈을 혈소판 파우치 안으로 헹궈 넣습니다.리보플라빈과 혈소판 용액이 치료 백으로 다시 흘러 들어가게 하십시오. 그런 다음 유입 라인을 잠그십시오. 튜브 실러를 사용하여 빈 리보플라빈 백을 제거하고 적절하게 폐기하십시오. 멸균 상태 유지.암컷 시린지 커넥터가 달린 6인치 튜브 라인을 조명 및 보관 백의 유입 라인에 연결합니다. 튜브 라인에 10밀리리터 시린지 배럴을 부착합니다. 다음으로, 박테리아 줄기 현탁액 5밀리리터를 시린지 배럴에 넣습니다.그 다음 유입 라인 클램프를 열어 박테리아가 혈소판 제제로 배출되게 합니다. 혈소판 제제 일부가 다시 흐르게 하여 시린지 배럴을 헹굽니다. 헹군 후 시린지 배럴을 제거합니다.30 mL 시린지를 부착하고 제품이 충분히 혼합된 후 유입구를 최소 2회 플러싱합니다. 깨끗한 5 mL 시린지를 사용하여 2 mL의 전처리 시료를 채취합니다. 새 시린지를 사용하여 백에 유입된 공기를 제거합니다.그 다음 처리 백에서 유입 라인을 제거하고 혈소판 용액의 무게를 측정합니다. 먼저 운영자 ID를 입력하여 혈소판 처리를 시작한 후, 조명 장치 플레이트에 백을 장착합니다. 이어서 바코드 판독기를 사용하여 샘플 ID를 입력합니다.제품 유형과 무게를 소프트웨어에 입력하십시오. 그다음, 쿼츠 클램프를 닫아 밀리리터당 6.24 joules의 자외선 에너지가 자동으로 조사되도록 합니다. 일반적인 처리 시간은 5분에서 10분 정도 소요됩니다.그동안 UV 처리 후의 전처리 시료를 정량하고, 박테리아 생존율을 측정하기 위해 처리 후 시료를 정량한 다음, 양성 대조군으로서 보존 박테리아 배양액을 정량합니다. 보존 배양액의 정량값은 기록된 정량값의 mL당 CFU 기준 1 log 단위 이내여야 합니다. 리보플라빈과 UV 광기반 병원균 감소 기술 공정을 사용하여 11종의 서로 다른 박테리아 종의 감소율을 평가하였습니다.유기체당 최소 6개의 혈소판 제제를 평가하고 각각 접종하였습니다. 충분한 세균 농도로, 밀리리터당 최종 타이터가 10,000 CFU를 초과하도록 하여 처리 전 샘플을 채취하였으며, 리보플라빈 및 UV 처리 직후의 샘플을 처리 전 용액과 비교하여 채취하였습니다. 리보플라빈과 UV 광선 처리를 통해 모든 세균 부하가 최소 2.6 log 단위, 즉 약 400배 감소하였습니다.고농도 박테리아를 이용한 이러한 연구들에 이어, 임상적으로 더 관련성이 높은 스파이크 농도를 사용하여 추가 연구를 수행할 수 있습니다. 이는 실제로 헌혈 시 제품에 존재할 수 있는 박테리아 수준을 나타냅니다. 이러한 저농도 스파이크 연구의 목적은 박테리아의 증식을 억제하고, 실온에서의 장기 보관 기간 동안 배양 음성 상태를 유지할 수 있는 방법의 능력을 평가하는 것입니다.이 기술이 도입된 이후, 연구자와 의료 전문가는 광범위한 병원체를 불활성화하는 능력을 평가하고, 수혈 전파성 질환의 확산을 방지하기 위해 이 기술을 활용할 수 있게 되었습니다. 이 영상을 시청한 후에는 리보플라빈과 UV 광선으로 처리한 고도로 오염된 혈소판 제제에서 박테리아의 로그 감소(log reduction)를 측정하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

treatment-platelet-products-with-riboflavin-uv-light-effectiveness

Research

연구

JoVE Journal

Immunology and Infection

면역학 및 감염학

이 문서는 전체 혈액 기부에서 준비 병원체 불 활성화에 대한 요격 피 시스템과 치료를 두 번 복용 버피 코트의 혈소판 중점을 생산 외 레브로 대학 병원에서 사용하는 프로세스를 설명합니다.

차단 혈액 시스템을 사용하여 준비 및 더블 복용 버피 코트의 혈소판 제품의 병원체 불 활성화

출처: Cheng, C., et al. 리보플라빈-5'-인산염의 가시광선 광분해를 통한 병원체 비활성화. J. Vis. 경험. (2022년)이 비디오는 병원성 박테리아에 대한 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN)의 광독성 효과를 평가하는 방법을 보여줍니다. 박테리아 배양은 증가하는 농도의 FMN에 노출되고 가시광선으로 조명되어 세포 구성 요소를 손상시키는 활성 산소종(ROS)을 생성합니다. 그런 다음 생존 박테리아를 정량화하여 용량 의존적 생존율 감소를 평가합니다.

빛 활성화 플라빈 모노뉴클레오티드를 사용한 박테리아 비활성화

출처: Cheng, C., et al. 리보플라빈-5'-인산염의 가시광선 광분해를 통한 병원체 비활성화. J. Vis. 특급 (2022).이 비디오에서는 L-메티오닌, 니트로 블루 테트라졸륨(NBT) 및 플라빈 모노뉴클레오티드(FMN)를 포함하는 완충 반응 혼합물에 보라색 광선을 조사하여 활성 산소종(ROS) 생성을 유도합니다. 이것은 박테리아 비활성화와 분광법으로 검출 가능한 포르마잔의 형성으로 이어집니다.

활성 산소종 생성을 통한 빛 유도 박테리아 불활성화의 정량화

출처: 자오, K. 외 5-아미놀레불린산 매개 광역학 치료가 황색포도상구균 바이오필름에 미치는 영향을 연구하기 위한 시험관 내 모델. J. Vis. 경험 (2018)이 영상은 그람 양성 박테리아 바이오필름에 대한 항균 효과를 평가하는 광역학 치료 프로토콜을 시연합니다. 바이오필름은 네 그룹으로 나뉩니다: 두 그룹은 광감성 전구체를, 두 그룹은 완충제를 받습니다. 모든 종은 어두운 환경에서 배양되며, 이후 전구체 처리된 그룹과 완충 단독 그룹에 적색광 노출을 합니다. 반응성 산소 종은 전구체와 빛을 모두 받는 그룹에서만 생성되어 박테리아 세포 사멸을 초래합니다. 치료 효능을 평가하기 위해 모든 그룹에서 생존 가능성을 비교합니다.

광감감제 전구체를 이용한 박테리아 바이오필름의 광 활성화 처리

이 비디오는 인체 혈소판 제품의 고역가 박테리아 오염에 대한 리보플라빈 및 자외선 기반 병원체 감소 과정을 보여줍니다. 이 과정은 박테리아 오염과 관련된 심각한 수혈 부작용의 위험을 낮추는 데 도움이 될 수 있습니다.

박테리아를 제거하기 위한 혈소판 제품의 리보플라빈과 자외선 처리

임플란트 - 관련 감염은 중요한 임상 합병증입니다. 이 연구는 임플란트 - 관련 감염을 방지하기 위해 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)를 사용하여 접근 방식을 설명 지속적인 혈소판 농도와 PRP를 준비 프로토콜을 제시하고, PRP의 새로 확인 된 항균 특성 및 항균 특성을 조사에 대한 관련...

준비를 한 다음 감염을 방지하기 위해 새로운 접근 방식으로 PRP<em&gt; 체외에서</emPRP의&gt; 항균 속성

여기, 선물이 Candida albicans biofilm의 성장에 레드 빛 응용 프로그램의 결과 평가 하는 프로토콜. 635 nm의 파장 및 87.6 J·cm-2 의 에너지 밀도와 비 코히어런트 레드 라이트 장치 48 h에 대 한 칸디 다 albicans biofilms의 성장에 걸쳐 적용 되었다.

규제 Candida albicans Biofilm 성장에 붉은 빛으로 매일 광선 요법

여기에서는 낮은 강도의 청색 및 보라색 광 조사 하에서 플라 빈 모노 뉴클레오티드 (FMN)의 광분해 중에 생성 된 활성 산소 종으로 병원성 박테리아를 비활성화하는 프로토콜을 제시합니다. FMN 광분해는 위생 공정을위한 간단하고 안전한 방법으로 입증되었습니다.

리보플라빈-5'-인산염의 가시광선 광분해를 통한 병원체 불활성화

프로응고제 혈소판 형성은 혈전증 위험 증가와 상관관계가 있습니다. 여기에는 인간 혈액에서 세척된 혈소판을 분리하기 위한 정확한 프로토콜이 제시되어 있으며, 이는 프로코아응고제 혈소판의 특징인 포스파티딜세린 및 미세소포 방출의 노출을 정량화하기 위한 것입니다.

인간 정제 혈소판에서 포스파티딜세린 노출 및 미세소포 방출을 측정하여 응고제 혈소판 특성 분석

이 프로토콜은 LED 패널 광원과 결합된 96웰 플레이트 형식을 사용하여 항균 광역학 불활성화(aPDI)에서 잠재적인 광감작제의 효과를 평가하기 위한 간단하고 경제적인 방법을 설명합니다. 이 접근 방식을 사용하면 다양한 농도, 화합물 및 박테리아 균주를 포함한 여러 실험 조건을 동시에 테스트할 수 있습니다.

박테리아 광역학 불활성화에서 광활성 분자를 평가하기 위한 LED 기반 체외 스크리닝

학습하세요 리보플라빈과 자외선을 이용한 혈소판 제품의 병원체 감소 기법을. 고역가 세균 오염을 효과적으로 제거하여 수혈 안전성을 높이는 이 방법의 원리와 적용을 탐색하세요.

리보플라빈과 혈소판 제품 및 자외선 치료 : 높은 역가 세균 오염에 대해 효과

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