혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화
2015년 5월 14일
이 프로토콜은 무혈청 단층 방법을 사용하여 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 전구 세포는 성숙한 신경 세포 유형을 유도하거나 신경 사양 과정을 연구하는 데 사용할 수 있으며 복합 스크리닝을 위한 멀티웰 형식 확장에 적합합니다.
이 절차의 전반적인 목표는 마우스 배아 줄기 세포를 무혈청 단층 세포 배양에서 신경 계통으로 분화시키는 것입니다. 이것은 먼저 배양 용기를 젤라틴으로 코팅함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서, 배아 줄기 세포는 분화 배지에서 단일 세포 현탁액으로 결합되고 적절한 도금 밀도로 희석됩니다.
마지막 단계에서 세포는 겔 ENC 코팅 플레이트에 파종됩니다. 궁극적으로, 면역형광 현미경 검사는 관심 있는 신경 마커의 시각화를 통해 분화의 성공 여부를 확인하는 데 사용됩니다. 일반적으로 이 방법을 처음 접하는 개인은 적절한 밀도의 도금이 우수한 차별화를 달성하는 데 중요하기 때문에 어려움을 겪을 것입니다.
그리고 직간접적으로 도금 밀도에 영향을 미치는 몇 가지 요인이 있습니다. 도금하기 전에 세포는 섭씨 37도의 수조에서 1%젤라틴의 분취액을 용해될 때까지 가열합니다. 그런 다음 젤라틴을 500ml의 따뜻한 PBS와 혼합하고 젤라틴이 코팅되는 동안 표면을 코팅할 수 있을 만큼의 용액으로 세포 배양 용기 바닥을 덮습니다.
마우스 배아 줄기 세포의 sub confluent 배양액을 PBS에서 2회 헹굽니다. 그런 다음 배양액에 1ml의 해리 시약을 첨가합니다. 2-5분 후 용기를 두드려 단층을 단일 세포 현탁액으로 제거하고 총 10ml의 배지 및 세포 해리 시약에서 배양액을 수집합니다.
세포를 50ml 원뿔형 튜브로 옮기고 원심분리기에서 스핀다운합니다. 그런 다음 supinate를 조심스럽게 흡인 한 후, 튜브의 측면에 구멍을 뚫어 10 ml의 prewarm N two B 27에 펠릿을 재현탁시킵니다. 기포 생성을 피하기 위해, 이제 농도를 기록하는 세포를 세고 표에 따라 예열 N two B 27에서 웰당 부피 단위당 적절한 수의 세포로 다시 현탁시킵니다.
그런 다음 배양 용기에서 젤라틴을 흡인하고 용기를 소용돌이치지 않고 세포를 플레이트에 넣습니다. 배양물을 섭씨 37도, 이산화탄소 5%의 습한 인큐베이터에 넣습니다. 1-2일에 한 번씩 매체를 교체합니다.
신선한 N two B 27을 사용하면 세포는 면역 형광 이미징을 위해 세포를 염색하기 위해 4-6일 이내에 한 번의 발현을 분화하고 나타내기 시작합니다. 배양물에서 분화 배지를 제거하고 15 분 후에 500 마이크로 리터의 4 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정하고 2 ml의 PBS로 세포를 2 번 세척 및 투과합니다. 그런 다음 세포를 1시간 동안 배양하여 비특이적 결합을 차단합니다.
PBS 1 밀리리터에서 트윈은 방금 시연 된 것처럼 세포를 씻은 후 플레이트 로커에 혈청을 보충했습니다. 500 마이크로 리터의 마우스 IgG에서 베타 3 튜불린에 대한 배양물을 섭씨 4도의 플레이트 로커에서 하룻밤 배양합니다. 다음 날.
세포를 세척한 후 1시간 후 흔들림으로 빛으로부터 보호된 실온에서 형광 태그가 지정된 anti-US IgG 2차 항체에서 샘플을 배양합니다. 세포를 다시 헹구고 500마이크로리터의 DPI로 5분 동안 염색합니다. 마지막으로, 세포를 마지막으로 한 번 씻은 후 섭씨 4도에서 최대 2주 동안 PBS 트윈에 보관하십시오.
이미지화되기 전까지는. 이 실험에서는 신경 분화를 추적하기 위해 내인성 SOX one GFP 리포터가 있는 마우스 배아 줄기세포를 사용했습니다. 6일째에 세포를 고정하고 염색하여 신경 세포 마커 베타 3 튜불린을 만들었습니다.
최적 밀도에서 세포는 신경 전구세포와 뉴런으로 분화한 반면, 더 높은 밀도에 배치하면 SOX 1 GFP 및 베타 3 튜불린 양성 세포의 수가 감소했습니다. 세포 배양 용기의 부피는 최적의 도금 밀도에도 영향을 미칩니다. 예를 들어, 96웰 플레이트에서 성장한 세포는 그보다 약 10배 높은 세포 밀도를 필요로 합니다.
최적의 세포 밀도와 2개의 합류 세포 밀도에 도달하기 위해 6개의 웰 배양 접시에 도금된 세포. 분화 과정에서 배아 줄기세포는 점차적으로 형태를 변화시킵니다. 예를 들어, 이러한 이미지에서는 최적의 세포 밀도에서 타오르는 후 1일째부터 6일까지의 세포 및 군집 형태를 관찰할 수 있습니다.
4일째에, 세포는 SOX one GFP 기자로부터 녹색 형광 신호의 출현에 의해 증거로 신경 전구 세포가 되기 시작합니다. 그리고 6일째가 되면 대부분의 세포가 SOX 1 양성 반응을 보입니다. 일부 비신경 세포의 존재가 예상되지만 이 비디오를 시청한 후에는 단층 세포 배양에서 마우스 엠리 줄기 세포의 신경 분화를 시작하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.
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개요
본 프로토콜은 무혈청 단층 배양법을 사용하여 마우스 배아줄기세포를 신경 전구세포로 분화시키는 방법을 상세히 설명합니다. 이 접근법은 성숙한 신경 세포 유형의 생성을 가능하게 하며, 화합물 스크리닝을 위한 멀티웰 포맷 확장 적용에 적합합니다.
주요 연구 구성 요소
과학 분야
- 신경과학
- 세포 생물학
- 줄기세포 연구
배경
- 배아줄기세포는 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있습니다.
- 신경 전구세포는 신경 발달 연구에 필수적입니다.
- 무혈청 배양법은 재현성을 높일 수 있습니다.
- 적절한 도말 밀도는 성공적인 분화를 위해 매우 중요합니다.
연구 목적
- 신경 전구세포를 생성하기 위한 신뢰할 수 있는 방법을 구축한다.
- 신경 분화 과정에 대한 연구를 용이하게 한다.
- 신경 분화에 영향을 미치는 화합물을 찾기 위한 고속 스크리닝을 가능하게 한다.
사용된 방법
- 젤라틴을 이용한 배양 용기 코팅.
- 배아줄기세포의 단일 세포 현탁액 제조.
- 젤라틴이 코팅된 플레이트에 세포 파종.
- 면역형광 현미경을 이용한 분화 성공 여부 확인.
주요 결과
- 배아줄기세포의 신경 전구세포로의 성공적인 분화.
- 신경 마커의 시각화를 통한 분화 확인.
- 효과적인 분화를 위한 최적의 도말 밀도 설정.
- 화합물 스크리닝 응용을 위해 확장 가능한 방법.
결론
- 무혈청 단층 배양법은 신경 전구세포 생성에 효과적입니다.
- 면역형광법은 분화를 평가하는 신뢰할 수 있는 기술입니다.
- 이 프로토콜은 신경과학의 다양한 연구 응용 분야에 맞게 조정될 수 있습니다.
자주 묻는 질문
산업적 관련성 요약
본 프로토콜은 정의된 무혈청 단층 시스템에서 마우스 배아줄기세포로부터 신경 전구세포를 확장 가능하게 생성하는 방법을 제공하며, 이는 신경과학 신약 개발의 초기 단계 타겟 검증 및 기전적 위험 제거(de-risking)를 지원합니다. 이 방법은 신경 분화에 미치는 화합물의 효과를 평가할 수 있는 재현 가능하고 정량적인 플랫폼을 제공하여, 리드 화합물 발굴 및 전임상 파이프라인의 예측 신뢰도를 높여줍니다. 리포터 세포주 및 고밀도 배양 형식과의 호환성을 통해 경로 조절 및 타겟 결합 연구를 위한 스크리닝 워크플로우에 통합하여 활용할 수 있습니다.
바이오제약 R&D에서의 전략적 응용
초기 발견 및 타겟 검증
- 과학적 가치: 지향성 분화를 통해 신경세포 운명 결정 메커니즘의 조사와 신경발달 표적의 기능적 검증을 가능하게 합니다.
- 운용적 가치: 변동성을 줄이고 실험 및 세포주 전반에 걸쳐 재현성을 높이는 정의된 무혈청 시스템을 제공합니다.
- 예측적 가치: 화합물로 유도된 신경 전구세포 수율 및 마커 발현의 변화 평가를 지원하여, 표적 결합 및 경로 조절에 대한 정보를 제공합니다.
스크리닝 및 분석법 개발
- 과학적 가치: 화합물 스크리닝 및 신경 분화의 표현형 평가에 적합한 균질한 신경 전구세포 집단을 생성합니다.
- 운용적 가치: 확장 가능한 플레이팅 밀도 최적화를 통해 다중 웰 포맷(예: 96-well)에 적용 가능하며, 이를 통해 중~고처리량 분석 응용이 가능합니다.
- 분석 준비도: 면역형광법, 유세포 분석 및 분자적 판독법과 호환되어 분화 효율 및 마커 발현에 대한 다중 파라미터 분석이 가능합니다.
중개 및 전임상 연구
- 중개적 연속성: 신경 전구세포 생성부터 기능적 뉴런 및 글리아 성숙까지의 진행을 가능하게 하여, 질환 관련 모델링을 지원합니다.
- 기전적 리스크 감소: 리포터 라인(예: SOX1-GFP)을 사용하여 신경 지정 과정을 실시간으로 모니터링함으로써, 계통 결정 및 분화 역학 연구를 용이하게 합니다.
- 전임상적 유용성: 신경 성숙 및 글리아 분화에 미치는 화합물의 효과 평가를 가능하게 하여, 안전성 약리학 및 작용 기전 연구를 지원합니다.
파이프라인 및 워크플로 통합
이 방법은 초기 발굴 연속체에 부합하며, 신경 분화의 기전적 분석을 통해 타겟 검증을 지원하고 신경과학 포트폴리오 내 화합물 스크리닝을 위한 분석법 개발을 가능하게 합니다.
- 발견 생물학(Discovery Biology): 지향성 분화 및 마커 기반 리드아웃을 통해 신경발달 경로의 가설 검증과 타겟 검증을 지원합니다.
- 스크리닝(Screening): 단층 배양에서 어세이 표준화 및 재현성을 가능하게 하며, 일관된 신경 전구세포 생성을 위해 플레이팅 밀도를 핵심 파라미터로 설정합니다.
- 분석(Analytics): 면역형광법(예: SOX1-GFP, βIII-tubulin) 및 유세포 분석법을 통해 분화 효율과 화합물 반응을 측정하는 정량적 출력값을 제공합니다.
- 중개 연구(Translational Research): 초기 신경 전구세포 생성과 이후 기능적 뉴런 및 글리아로의 성숙 과정을 연결하여 전임상 단계의 연속성을 지원합니다.
- 기업 내 재사용(Enterprise Reuse): 정의된 확장 가능한 프로토콜을 통해 여러 ESC 라인, 배양 용기 및 스크리닝 캠페인에서 재사용이 가능하며, 재개발 노력을 줄여줍니다.
운영 및 기업 영향
- 과학적 가치: 신경 분화 경로의 기전적 모호성을 줄임으로써 타겟 검증의 예측 신뢰도를 높입니다.
- 운영적 가치: 표준화된 무혈청 조건은 여러 실험실과 세포주 전반에서 재현성과 확장성을 향상시킵니다.
- 전략적 가치: 신경 계통 결정 및 분화 효율에 미치는 화합물의 영향을 조기에 평가함으로써 go/no-go 결정에 정보를 제공합니다.
- 포트폴리오 영향: 기전적 리스크 제거 및 경로 검증을 통해 신경과학 타겟의 리스크 조정 우선순위 설정을 지원합니다.
실행 시 고려 사항
- 줄기세포 배양, 분화 기술 및 면역형광 현미경 분석에 대한 전문 지식이 필요합니다.
- CO2 인큐베이터, 원심분리기, 현미경 및 젤라틴, N2B27, 해리 시약, 항체와 같은 시약의 사용 가능 여부에 따라 달라집니다.
- 재현성을 보장하기 위해 사용자 및 사이트 전반에 걸쳐 도말 밀도와 젤라틴 코팅 절차의 표준화가 필요합니다.
- 다른 ESC 라인이나 리포터 구조체에 적응시키기 위해서는 세포 파종 밀도 및 분화 타이밍의 최적화가 필요할 수 있습니다.
- 실제적인 제한 사항으로는 도말 밀도에 대한 민감성과, 세포 뭉침이나 불완전한 단일 세포 현탁액 형성을 방지하기 위한 세심한 단층 해리 과정이 필요하다는 점이 있습니다.
