Name: 혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: 학습하세요 마우스 배아 줄기 세포를 신경 전구체로 분화시키는 혈청이 없는 단층 배양법을. 젤라틴 코팅, 단일 세포 현탁액 제조, 면역형광 현미경으로 분화 확인하는 방법입니다.

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Work는 태국 교육부가 W.W.에 수여하는 과학기술 개발 및 진흥 장학금과 Tenovus and the Anonymous Trust가 M.P.S.에 수여하는 보조금으로 운영되었습니다.

1. 미디어 준비 참고 : 1 비율 : 일반적으로 1, B27 보충제로 보충 수정 N2 보충과로 Neurobasal 보충 DMEM / F12 : 프로토콜은 두 개의 별도의 미디어 믹스의 사용에 의존한다. <ol><li> 15 ㎖의 튜브에 성분을 혼합함으로써 변성 N2 보충제를 준비한다. 소용돌이 나이를 필터링하지 마십시오; 용액이 깨끗해질 때까지 튜브를 반전시켜 혼합한다. <ol><li> 다음 (0.01 M 염산에서 만든) 25 ㎎ / ㎖ 인슐린 1 ㎖를 추가하고 튜브를 반전하여 잘 혼합, DMEM / F12의 7.2 ml의 피펫 팅으로 시작합니다. 이 솔루션은 분명하다 때까지 몇 분 정도 걸립니다. </li><li> (물에 만든) 100 mg을 1 ㎖ / ml의 아포 트랜스페린, ml의 progesternone (에탄올에 만든) / 0.6 mg을 33 μL, 160 ㎎ / ㎖ (1 M) 퓨 트레 신 (putrescine)의 100 μl를 추가 (물에서 만든 ), 물 (10)에 만들어진 3 mM의 나트륨 셀레 나이트 () 및 7.5 % 소 혈청 알부민의 666 μL의 μL 잘 튜브를 혼합한다. -20 °에서 2.5 ml의로 나누어지는 및 저장최대 2 개월 동안 C. </li></ol></li><li> 미디어를 준비합니다. <ol><li> DMEM / F12 250 ml의 N2의 2.5 ml를 추가합니다. 잘 섞는다하지만 흔들거나 필터가 없습니다. </li><li> 로 Neurobasal 250 ml의 미디어는 B27 보충 5 mL를 추가 할 수 있습니다. 잘 섞는다하지만 흔들거나 필터가 없습니다. </li><li> : 1의 비율로 1 단계 1.2.1과 1.2.2에서 미디어를 섞는다. 1 일부의 경우 : 3 혼합이 요구 될 수있다 (단계 : 1.2.4 1 혼합 1로 보충). </li><li> 혼합 L- 글루타민 (최종 농도 0.2 mM의) 및 2- 머 캅토 에탄올 (최종 농도 0.1 mM)을 3.5 μL의 0.5 ml에 추가하고 흔들림없이 잘 섞는다. 최대 3 주 동안 4 ℃에서 미디어를 저장하고 빛에 노출시키지 마십시오. 이 마지막 믹스 N2B​​27이라고합니다. </li></ol></li><li> 젤라틴 용액을 준비합니다. <ol><li> 15 분 동안 121 ° C, 15 psi에서 초순수 및 오토 클레이브 1 % 젤라틴 용액을 준비한다. 그것은이 사용 세제 병 살균제 완전히 깨끗 것이 중요하므로 새로운 병 것이 좋다이 사용하고 오직 용도 사이 초순수 세정. 50 ㎖ 씩에 1 % 용액을 나누어지는 달 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 용해 될 때까지 37 ° C의 수조에 1 % 젤라틴 분취 따뜻한 따뜻한 인산염 완충 식염수 (PBS) 500㎖의 추가. 잘 섞는다 잘 또는 플레이트 각의 바닥을 커버하기에 충분 피펫. 적어도 30 분 동안 코트에 젤라틴을 표면을 허용합니다. </li></ol></li></ol> 2. 도금 세포 참고 :이 프로토콜은 백혈병 억제 인자 (LIF), LIF 뼈 형태 형성 단백질 4 (BMP4) 또는 MEK와 GSK3 억제제 (2I 미디어)와 LIF 또는 혈청이없는 매체와 혈청 교체와 10 %의 혈청에서 재배 마우스 ESC에 동일하게 적용 또는 LIF없이. 그러나, 분화의 타이밍 및 효율 미디어 세포 (설명을 참조)에 따라 달라질 수있다. 여기에 표시된 실험을 위해 우리는이 EGFP 기자는 O에 노크가 (46C 마우스 ESC 라인을 사용10 % 혈청 및 LIF로 GMEM 재배 Sox1 내인성 대립 유전자의 NE). 최적의 결과는 세포가 해리와 N2B27 미디어에 플레이 팅하는 것이 중요하다; N2B27 항상 세포 replating에 비해 감소 된 분화 효율 결과를 단순히 GMEM / 혈청 / LIF의 용지 변경. <ol><li> 10 % 혈청, 1 mM 나트륨 피루 베이트, 1X 비 필수 아미노산 GMEM에서 세포를 성장 0.1 M 2- 머 캅토 에탄올, 100 유닛 / ㎖ LIF (13). 마우스 ESC, 판의 subconfluent 문화를 얻으려면 2 걸릴 것 T25 문화 플라스크에 넣고 1 × 10 6 세포 - 3 일. </li><li> 밝은 필드 현미경으로 세포를 관찰한다. 세포가 통로 subconfluent과 준비가되면, PBS로 두 번을 씻어. 세포 분리 시약 1 ㎖를 추가하고 2 인큐베이터로 돌아 - 5 분​​. 트립신 및 다른 효소는 세포의 분리를 위해 사용될 수 있지만, 도금 밀도가 될 필요가 있으므로, 그들은 adju 세포 부착에 부정적인 영향을 미칠 수있다다네. </li><li> 세포는 플레이트로부터 리프트 시작되면, 단일 세포 현탁액으로 그들을 이동시키다 용기를 탭. 15 mL의 원심 분리 튜브에 용지 및 세포 분리 및 시약 피펫 10 ㎖의 전체에 세포를 수집. </li><li> RT에서 3 분 동안 300 XG에 세포를 스핀. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 대기음 아래 3로 pipetting에 의해 미리 예열 N2B27 10ml에 펠렛을 재현 탁 - 5 회. 아래 현탁액을 피펫 팅 할 때, 튜브의 측면에 대한 피펫은 거품을 만들지 않도록합니다. 자동 세포 계수기 또는 혈구와 세포를 세어 농도를 기록한다. </li><li> 단위 부피 당 세포의 수를 포함하는 세포 현탁액은 미리 예열 N2B27에 웰 당 도금 될 준비한다. 6 잘 접시에 cm 2 당 10,500 세포의 밀도는 (즉, 6 잘 요리 잘 당 1 × 10 5 세포)에 최적입니다. CM 2 괞 찮아 당 세포의 제안 수는 표 1을 참조하십시오세포 배양 용기의 다양한 팅 매체 볼륨. </li><li> 배양 용기로부터 젤라틴 대기음 표 1에 제시 및 부피 밀도에 따라 세포 현탁액을 접시.이 셀 중앙에 집중되므로 플레이트 소용돌이 마십시오. 37 ℃, 5 % CO 2에 습기가 인큐베이터에서 문화를 놓습니다. </li><li> 신선한 N2B27 모든 미디어를 대체하여 2 일 - 매 1 미디어를 변경합니다. 부드럽게 피펫 밀도에 영향을 다음 날에 분화 효율을 줄일 수있는 세포를 플러싱 등. 도금 후 초기 생존이 나쁜 경우, 하나의 셀을 판 : N2와 B27-보충 미디어의 3 믹스 처음 두 일 후에 N2B27로 변경. 세포 분화하기 시작하고 4 내에서 (여기에 사용 된 46C 세포주에서 기자의 녹색 형광으로 표시) Sox1 식 표시해야합니다 - 6 일. </li></ol> 3. 면역 형광 염색법 아니TE는 : 어떤 프로토콜 타입 용기에 적용될 수있다. 각 시약의 부피는 6 웰 플레이트 잘마다 설명하고 표면 영역을 확장 할 수 있습니다. Replating 나중에 낮은 가능성으로 인해 사용하지 않는 것이 좋습니다. <ol><li> 차별화 매체를 제거하고 4 %의 500 μL (v / v)의 파라 포름 알데히드를 첨가하여 세포를 고정, 15 분 동안 둡니다. </li><li> 워시 ((v / v)의 트윈 20 0.5 %와 인산염 완충 식염수)을 두 번 PBS-T의 2 ml의 세포를 Permeabilize 하시려면. 세포를 4 ℃에서 최대 2 개월 동안 PBS-T에서 유지 될 수있다. </li><li> 10 % (이차 항체와 같은 종) (v / v)의 혈청과 PBS-T의 1 ml의 PBS-T를 교체합니다. 비 특이 적 결합을 차단하는 RT에서 로커 플레이트에 1 시간 부화. </li><li> 1 시간 후, PBS-T 2 ㎖로 두 번 세포를 씻어 βIII - tubulin에 대한 500 μL 마우스 IgG의에서 부화 (10 % 혈청 PBS-T에서 1000 1 희석). 판 로커에 넣고 4 ℃에서 O / N 두십시오. </li><li> 이 단계에서, 항상 용기를 보호빛에서. 다음, (10 % 혈청 PBS-T에서 2 μg의 / ㎖로 희석) 형광 표지 항 마우스 IgG 항체 500 ㎕를 추가, T-PBS로 두 번 세포를 씻어. 실온에서 1 시간 동안 판 로커에 넣어. </li><li> 다음 DAPI의 500 μl를 추가, PBS-T로 두 번 세포를 씻어 (PBS-T에서 0.5 ㎍ / ml의 희석)과 5 분 동안 둡니다. </li><li> 다시 세포를 세척하고, PBS-T에 보관하십시오. 세포는 촬영 준비가 4 ° C에서 최대 2 주 동안 유지 될 수있다. 그것은 고정 생균 또는 다른 시간에 고정 된 세포의 GFP 강도를 비교하는 부적절한 그래서 GFP 신호가 시간이 지남에 따라 페이드 참고. </li></ol>

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</ol>

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단층 신경 분화 프로토콜은 십 년 6 이상 사용되어왔다. 프로토콜 한정 배지 구성되며, 전임상위한 시스템이 더 적용될 수 단층 시스템에서 수행, 고도로 효율적인 (예, 약물 스크리닝)을 사용한다. 그러나 분화 효율을 결정하는 몇 가지 중요한 요소가있다. 이 문서에서는 이러한 요인과 각 장애물에 대한 솔루션을 지적한다. 분화 조건 도금 후 세포 밀도는 아마도 가장 중요한 인자이다. 너무 낮은 밀도로 도금하면 죽음 셀에 이르게하는 동안 너무 높은 밀도로 도금하면 세포 분화 효율을 감소시킨다. 이러한 현상으로 인해자가 분비 성장 인자 시그널링 쉽다. Fgf4는 MAPK 캐스케이드를 활성화하고 ESC 차별화 (11)를 구동하는자가 분비 성장 인자이다. LIF는 ESC에 의해 생성 된 다른 사이토 카인이다. 그것은 &lt;STAT3 경로를 활성화하고 자기 갱신을 촉진SUP&gt; 15. 이 프로토콜은 N2B27의 사용은 신경 세포...

배아 줄기 세포는 동계 또는 면역 호스트로 (키메라를 형성하여) 적절한 단계 배아 내로 재 도입 다음 모든 성인 세포 유형으로 분화 할 수있는 능력, 주입을 유지하면서 시험 관내에서 무기한 증식 용량 초기 배아 유래의 다 능성 세포이다 (기형 종 형성에 의해) 또는 해당 큐 1 체외 주제에. 신경 계통에 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화는 1995 년에 처음 설명과 morphogen 레티노 산 2-4 보충 혈청 함유 미디어에서 다세포 서스펜션 집합체의 형성 (배아 체, EBS을 (를)) 참여했다. 이후 다양한 프로토콜 신경 분화 5를 허용하도록 개발되어왔다. 여전히 응집을 이용하는 많은 다른 세포 유형으로 유도 배양 공동 여러 혈청이없는 배지의 사용을 포함한다. 모든 프로토콜은 장점을 가지고차 단점과 신경의 정확한 특성 또는 신경 세포는 또한 사용되는 프로토콜에 따라 달라집니다 생산. 이상적인 프로토콜, 강력한 확장 성이 완벽하게 정의 된 미디어와 기판을 활용, 분화 과정의 비 침습적 모니터링 의무가하고 수 신경 전구 세포의 순수한 인구의 발생을 초래할 외부 단서에 의해 구별하는 패턴 할 것 상대적으로 짧은 시간에 높은 효율과 수율 모든 신경 세포와 교세포 하위 유형으로. 지난 12 년에 우리는 저밀도, 무 혈청 접착 단층 배양 6-10 ESC 마우스에서 신경 전구 세포 및 신경 세포를 생성하는 방법을 사용하고있다. 이 프로토콜은 위에 명시된 기준 중 많은 충족 : 우리 손에 분화의 효율이 상당히 오랜 세월에 걸쳐 일관되고 다양한 세포주왔다가 상하 또는 축소 될 수있다 (우리는 성공적으로 96 웰 플레이트에서 용기를 사용 15cm 직경 디급히 드릴 말씀) 사용 된 미디어는 잘 정의되어 있습니다. 프로세스 (도파민 뉴런 6 예, 쉬와 Fgf8) 신경 가지 유형의 서브 타입의 생성을 유도하기 위해 첨가 될 수 분화의 모니터링 및 패터닝 단서의 다양한 timelapse에 현미경 의무가있다. 그럼에도 불구하고,이 프로토콜의 성공적인 응용 프로그램에 몇 가지 문제가있다. 주요 측면 중 하나는 미디어의주의 준비입니다. 우리는 항상 상업 대안의 가능성에도 불구하고 사내 매체를 준비합니다. 사용되는 보조제 중 하나 (N2, 프로토콜 참조)는 표준 상업적으로 이용 가능한 버전에 비해 수정이 있습니다. 마지막으로,이 방법의 성공적인 적용을위한 가장 중요한 단계 중 하나는 도금에 최적의 셀 밀도이다. 유도 신호 중 하나 (Fgf4 11)의 분비 자연이 필요로하는 동안 때문에 충분한 세포가 최적의 viabil을 허용 할 수 있는지 주로너무 높은 밀도의 분화에 성만과 차별화, (인해 LIF (12)의 분비 생산 가능한 부분) 손상된다. 그것은 두 매체 준비와 세포 도금 신중하게 수행하고 지속적으로 최적의 결과를 보장하는 것이 중요하다.

<table><tbody><tr><td>소 태아 혈청</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase 세포 해리 시약</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>B-27 보충제, 무혈청</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>인슐린</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>멸균 0.01 M HCl</td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>멸균 물로</td></tr> 재구성 <tr><td>Progesterone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>에탄올로 재구성</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>멸균 물로 재구성</td></tr><tr><td>아셀렌산나트륨</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td>멸균수로 재구성</td></tr><tr><td>소 알부민 분획 V</td><td>Life Technologies</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-글루타민</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>글루타민은 일반적으로 침전되므로 사용하기 전에 완전히 용해되었는지 확인하십시오</td></tr><tr><td>젤라틴</td><td>시그마</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>6-웰 조직 배양 접시</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>24-웰 조직 배양 접시</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>96-well 조직 배양 접시</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM 비필수 아미노산 용액</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>피루브산 나트륨</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-메르캅토에탄올</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>4&prime;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Protect from light</td></tr><tr><td>Mouse anti &beta; III 튜불린 IgG 항체</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>형광 표지 안티 마우스 IgG 항체</td><td>Life Technologies</td><td>A31571</td><td>빛으로부터 보호</td></tr><tr><td>25cm2 조직 배양 플라스크</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

신경 전구 세포에 마우스 배아 줄기 세포가 분화하는 능력 (ESC)는 신경 사양뿐만 아니라, 더 깊은 연구 성숙한 신경 세포 유형의 발생을 제어하는​​ 메커니즘의 연구를 허용한다. 이 프로토콜에서 우리는 무 혈청, 단층 문화를 사용하여 신경 전구 세포에 ESC의 분화하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 효율성, 확장 성 및 4 내 70 %의 신경 전구 세포 ~의 생산 결과 - 6 일. 이것은 다양한 조건 하에서 성장 다양한 균주에서 ESC에인가 될 수있다. 신경 전구 세포는 현미경으로 기능적 뉴런 및 신경교 또는 분석으로 더 분화 세포 계측법 또는 분자 기법을 흐르게 할 수있다. 분화 과정은 시간 경과 현미경에 순종하며 신경 특정 처리를 모니터링하는 리포터 라인의 사용과 결합 될 수있다. 우리는 프로세스가 ㄱ 할 수 있도록 미디어 준비 및 세포 밀도 최적화에 대한 자세한 지침을 제공E는 가장 ESC 라인 및 세포 배양 용기의 다양한 적용.

이 실험에서, 우리는 신경 분화를 추적하기 위해, 내인성 Sox1-GFP 리포터와 마우스 배아 줄기 세포를 46C 세포주 (14)를 사용했다. Sox1, 신경 전구 세포에 대한 마커의 세포주, 식을 사용하여 녹색 형광으로 검출 할 수있다. 밀도 도금하여 신경 분화를 달성하는 중요한 요인이다. 마우스 배아 줄기 세포 / cm 2 10,500 88,500 개의 세포로부터 다양한 다른 밀도로 6 웰 플레이트에 플레이 팅 하였다.도 1a는 6 웰 플레이트에 다른 도금 밀도에 의해 달성 분화 효율을 나타낸다. 차별화의 날 6 일, 세포를 4 % 파라 포름 알데히드로 고정하고, 신경 세포 마커 βIII - tubulin에 대한 스테인드. 최적의 밀도 (10,500 세포 / ㎠)에서 세포를 신경 전구 세포 및 신경 세포로 분화. 이는 신경 세포 마커, βIII - tubulin에 대한 Sox1-GFP 기자와 면역에서 녹색 형광 신호에 의해 관찰되었다....

이 프로토콜은 무혈청 단층 방법을 사용하여 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 방법을 자세히 설명합니다. 이러한 전구 세포는 성숙한 신경 세포 유형을 유도하거나 신경 사양 과정을 연구하는 데 사용할 수 있으며 복합 스크리닝을 위한 멀티웰 형식 확장에 적합합니다.

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

본 실험 과정의 전체적인 목표는 무혈청 단층 세포 배양법을 통해 마우스 배아줄기세포를 신경 계통으로 분화시키는 것입니다. 이를 위해 먼저 배양 용기를 젤라틴으로 코팅합니다. 두 번째 단계에서는 배아줄기세포를 분화 배지 내에서 단일 세포 현탁액으로 만든 후, 적절한 도말 밀도로 희석합니다.마지막 단계에서는 세포를 gel ENC가 코팅된 플레이트에 분주합니다. 최종적으로, 면역형광 현미경을 사용하여 관심 있는 신경 마커를 시각화함으로써 분화의 성공 여부를 확인합니다. 일반적으로 이 방법이 처음인 경우, 적절한 밀도로 플레이팅하는 것이 양호한 분화를 달성하는 데 매우 중요하므로 어려움을 겪을 수 있습니다.도말 밀도에 직접적 또는 간접적으로 영향을 미치는 여러 요인이 있습니다. 세포를 도말하기 전, 1% gelatin 분주액을 37 °C 항온수조에서 완전히 녹을 때까지 가온합니다. 그런 다음 gelatin을 500 mL의 따뜻한 PBS와 혼합하고, gelatin이 코팅되는 동안 세포 배양 용기의 바닥 표면이 덮일 정도의 적당량의 용액을 채웁니다.아포화 전 상태(sub confluent)의 마우스 배아 줄기세포 배양액을 PBS로 2회 세척합니다. 그 후, 배양액에 해리 시약 1 mL를 첨가합니다. 2~5분 후, 용기를 가볍게 두드려 단층 세포를 단일 세포 현탁액으로 분리하고, 배지와 세포 해리 시약 총 10 mL로 배양물을 수집합니다.세포를 50 milliliter 원뿔형 튜브로 옮기고 원심분리기로 침전시킵니다. 그런 다음 상층액을 조심스럽게 흡입하여 제거한 후, 튜브 벽면에 팅팅 쳐서 펠릿을 미리 데워둔 N two B 27 10 milliliters에 재부유시킵니다. 기포가 생기지 않도록 주의하며 세포 수를 측정하여 농도를 기록하고, 표에 따라 미리 데워둔 N two B 27을 사용하여 웰당 단위 부피당 적절한 세포 수로 재부유시킵니다.그런 다음 배양 용기에서 젤라틴을 흡입하여 제거하고, 용기를 흔들지 않은 상태에서 세포를 플레이팅합니다. 배양물을 37 °C, 5% carbon dioxide 조건의 습윤 배양기에 넣습니다. 배지는 1~2일마다 교체합니다.신선한 N2 B27 보충제를 첨가하면, 세포는 분화를 시작하며 4~6일 이내에 Sox1 발현을 나타내므로, 면역형광 이미징을 위해 세포를 염색합니다. 배양물에서 분화 배지를 제거하고 500 µL의 4% Paraformaldehyde로 세포를 고정합니다. 15분 후, Tween이 포함된 PBS 2 mL로 세포를 2회 세척 및 투과화합니다. 그 다음, 세포를 1시간 동안 인큐베이션하여 비특이적 결합을 차단합니다.방금 시연한 바와 같이 세포를 세척한 후, 혈청이 첨가된 PBS tween 1 mL 내에서 플레이트 로커를 이용하여 반응시킵니다. 마우스 beta three tubulin 항체 500 µL를 배양액에 첨가하고 4 °C의 플레이트 로커에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날,세포를 세척한 후, 샘플을 형광 표지된 anti-US IgG 2차 항체와 함께 빛을 차단한 상태로 실온에서 1시간 동안 쉐이킹하며 배양합니다. 세포를 다시 헹군 다음, 500 µL의 DPI로 5분 동안 염색합니다. 마지막으로 세포를 한 번 더 세척한 후, 4 °C의 PBS tween에 보관하여 최대 2주까지 저장합니다.이미징 전까지 유지합니다. 본 실험에서는 신경 분화를 추적하기 위해 내인성 SOX1 GFP 리포터가 발현된 마우스 배아줄기세포를 사용하였습니다. 6일 차에 세포를 고정하고 신경세포 마커인 beta III tubulin으로 염색하였습니다.최적 밀도에서 세포는 신경 전구세포와 뉴런으로 분화되었으나, 더 높은 밀도로 배치했을 때는 SOX 1 GFP 및 beta 3 tubulin 양성 세포의 수가 감소하는 결과가 나타났습니다. 세포 배양 용기의 부피 또한 최적의 도말 밀도에 영향을 미칩니다. 예를 들어, 96-well 플레이트에서 배양된 세포는 그보다 약 10배 더 높은 세포 밀도가 필요합니다.6-well 배양 접시에 세포를 분주하여 최적의 세포 밀도와 2배의 합류도(confluence) 세포 밀도에 도달하게 합니다. 분화 과정 동안 배아줄기세포의 형태는 점진적으로 변화합니다. 예를 들어, 이 이미지들에서는 최적 세포 밀도에서 분화를 시작한 후 1일부터 6일까지의 세포 및 콜로니 형태를 관찰할 수 있습니다.4일 차에는 SOX1 GFP 리포터에서 녹색 형광 신호가 나타나는 것으로 알 수 있듯이, 세포들이 신경 전구세포가 되기 시작합니다. 그리고 6일 차가 되면 대부분의 세포가 SOX1 양성을 띱니다. 일부 비신경 세포의 존재는 예상되는 결과입니다. 이 영상을 시청한 후에는 단층 세포 배양에서 마우스 배아 줄기세포의 신경 분화를 유도하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Research

연구

JoVE Journal

Developmental Biology

발생생물학

우리는 모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 시험 관내 분화의 효율을 개선하기위한 새로운 프로토콜을 개발했습니다. 차별 ES 전지는 모터 뉴런이 같은 immunohistochemical 기술을 사용의 연결 및 모터 신경 세포 마커의 표현에 의해 입증 기능을 인수했습니다.

모터 뉴런에 마우스 배아 줄기 세포의 효율적인 분화

이 비디오는 무혈청 배지를 사용하여 마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 프로토콜을 보여줍니다. 무혈청 배지에 현탁된 배아 줄기 세포의 원하는 농도는 젤라틴으로 코팅된 커버슬립에 도금됩니다. 최적의 세포 밀도에서 세포는 자가분비 신호 인자를 생성하고, 이 인자는 무혈청 배지의 신경 분화 유도 인자와 함께 배아 줄기 세포가 신경 전구세포로 분화되도록 촉발합니다.

Generating Neural progenitors from Embryonic Stem Cells in Serum-Free Monolayer Cultures(무혈청 단층 배양에서 배아 줄기 세포로부터 신경 전구체 생성)

이 동영상은 마우스 배아 줄기 세포(mESC)에서 신경전구세포(NPC)를 체외에서 생성하는 방법을 보여줍니다. mESC는 현탁액에서 배양되어 배아체(EB)를 형성한 다음, 부착 배양에서 레티노산 처리를 통해 NPC로 분화하도록 유도됩니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전구 세포를 생성하는 기술

이 비디오는 신경 전구 세포를 뉴런으로 분화시키는 세포 배양 방법을 선보였습니다. 성장 인자로 보충된 영양이 풍부한 배지에서 세포를 배양함으로써, 전구 세포는 발달된 축삭돌기와 수상돌기를 가진 뉴런으로 성숙했습니다. 안정화제는 세포 생존력을 보장하고 분화 과정 전반에 걸쳐 산화적 손상으로부터 보호했습니다.

신경전구세포(Neural Progenitor Cells)를 뉴런(Neuron)으로 분화(Differentiation of Neural Progenitor Cells into Neuron)

이 비디오는 배아 줄기 세포를 기능하는 시냅스를 가진 뉴런의 네트워크 집단으로 분화하는 기술을 보여줍니다. 배아 줄기 세포가 뉴런으로 분화하고, 뉴런 네트워크 형성을 유도하고, 네트워크 뉴런으로 배양을 풍부하게 하는 단계를 간략하게 설명합니다.

마우스 배아 줄기세포를 네트워크화된 뉴런 집단으로 분화(Differentiating Mouse Embryonic Stem Cells into a Networked Neuron Population)

배아 배양에 활용 혈청 특히 신호의 상호 작용을 포함하는 연구 실험의 결과에 영향을 미칠 수있는 알 수없는 구성 요소가 포함되어 있습니다. 여기서 우리는 혈청 산소 배양 시스템을 활용하고 16-40 시간 동안 배양 한 중간 회임 마우스 배아가 자궁에서 개발 태아에 비해 형태 개발을 전시 것을 보여줍니다.

무 혈청 전체 배아 배양 시스템에서 마우스 배아 개발

우리는 두 개 또는 세 개의 차원 배양체를 발생시키기위한 뮤린 배아 줄기 세포를 사용하는 기술을 설명한다. 우리는 다음 전구 세포 마커 면역과 면역에 의해 분화의 상태를 분석하기 위해 레티노 산, 방법에 의한 배아 신체 세포의 신경 분화를 유도하는 방법을 설명합니다.

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

여기, 전자13 마우스 배아 절 예 하에서 신경 줄기 세포의 분리에 대 한 새로운 microsurgical 기술을 소개합니다.

절연 및 마우스 배아 신경 줄기 세포의 문화

여기서 제시된 것은 인간 배아 줄기 세포의 단일 세포 배양및 이들의 후속 분화를 신경 전구 세포로 의하기 위한 프로토콜이다. 이 프로토콜은 간단하고 견고하며 확장 가능하며 약물 스크리닝 및 재생 의학 응용 분야에 적합합니다.

인간 배아 줄기 세포의 단세포 배양을 이용한 효율적인 신경 분화

여기서, 우리는 배아 줄기 세포에서 뉴런으로 빠르고 효율적인 분화를 지시하는 저렴한 비용과 조작하기 쉬운 방법을 설립했습니다. 이 방법은 실험실 간의 대중화에 적합하며 신경 학적 연구를위한 유용한 도구가 될 수 있습니다.

시험관 내 마우스 배아 줄기 세포로부터의 신경 분화

우리는 매달려 드롭 방법을 사용하여 신경 세포로 마우스 배아 줄기 세포의 체외 분화에 대한 절차를 설명합니다. 또한 RT-qPCR, 면역형광, RNA-seq 및 유동 세포종을 통해 포괄적인 현상 분석을 수행합니다.

마우스 배아 줄기 세포에서 신경 전조및 뉴런의 분화 및 특성화

학습하세요 마우스 배아 줄기 세포를 신경 전구체로 분화시키는 혈청이 없는 단층 배양법을. 젤라틴 코팅, 단일 세포 현탁액 제조, 면역형광 현미경으로 분화 확인하는 방법입니다.

혈청이없는 단층 문화 마우스 배아 줄기 세포의 신경 분화

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