수생 미생물 Metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포

본 절차의 목적은 해수 내 미생물 바이오매스로부터 단백질과 DNA를 추출한 후, 탠덤 질량 분석 기반의 프로테오믹스 분석을 위한 트립틱 펩타이드를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 카트리지 필터에 축적된 세포를 용해함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 초원심분리 필터 유닛을 사용하여 세포 용해물을 농축하는 것입니다.

다음으로, 용해물을 단백질 침전용과 DNA 침전용의 두 분획으로 분리합니다. 마지막 단계로, 단백질의 젤 내 트립신 소화를 수행하고 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 분석에 적합한 펩타이드를 추출합니다. 최종적으로, 후속 생정보학 분석을 통해 샘플 내에서 발현된 단백질을 식별할 수 있으며, 분리된 DNA는 메타게놈 및 16 S-R-R-N-A 유전자 분석에 사용할 수 있습니다.

기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 단백질과 DNA를 동일한 샘플에서 동시에 분리할 수 있다는 점입니다. 우선, 필터 원심분리기의 루어 락(lure lock) 끝단에 60 mL 주사기를 연결하여 카트리지 필터 유닛에서 RNA 안정화 용액을 2 mL 마이크로 원심분리 튜브로 밀어냅니다. 세포 잔해를 펠렛화하기 위해 2 mL 마이크로 원심분리 튜브를 17,000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 10 K 초원심분리 필터 유닛으로 옮겨 샘플에서 용해된 세포 유래 단백질을 포집합니다.

펠릿을 버리지 마십시오. 초원심분리 필터 유닛을 3,270 ×g에서 30분 동안 또는 부피가 약 600 µL로 줄어들 때까지 원심분리합니다. 그동안 P 10 팁의 끝부분을 녹여 카트리지 필터 유닛의 논 루어 락(non lure lock) 측을 팁의 열린 끝부분으로 막습니다.

이렇게 하면 향후 단계에서 추출 버퍼와 바이오매스가 유출되지 않도록 할 수 있습니다. 펠릿을 1 mL의 SDS 추출 용액에 현탁하여 원래의 카트리지 필터 유닛에 피펫으로 분주합니다. 카트리지 필터 유닛에 분주하는 가장 쉬운 방법은 P 200 팁을 P 1000 팁 위에 쌓아 이 이중 팁을 사용하여 피펫팅하는 것입니다. 카트리지 필터 유닛에 SDS 추출 용액 1 mL를 추가하여 총 부피가 약 2 mL가 되도록 합니다.

파라필름. 카트리지 필터 유닛의 루어 락 끝부분을 밀봉하고 카트리지 필터 유닛을 50 milliliter 튜브에 넣습니다. 그다음, 50 milliliter 원추형 튜브 바닥에 구긴 실험실용 와이프 세 장을 배치합니다.

뚜껑을 닫고 튜브를 하이브리다이제이션 오븐에 넣어 실온에서 회전시키며 10분 동안 배양합니다. 10분 후, 필터를 폼 플로터 위에 올리고 5 mL 주사기의 루어 락(lure lock) 끝부분으로 고정합니다. 이후 95 °C 항온수조에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 카트리지 필터 유닛을 실온에서 1시간 동안 회전시키며 식힙니다. 완전히 식으면, 60 mL 주사기를 사용하여 필터에서 SDS 추출 용액 및 세포 용해물을 동일한 초원심분리 필터 유닛으로 밀어내어 배출합니다.

이전과 동일하게, 카트리지 필터 유닛에 신선한 SDS 추출액 1 mL를 첨가하고 손으로 30초 동안 혼합합니다. 그런 다음 60 mL 주사기를 사용하여 필터의 내용물을 초원심분리 필터 유닛으로 밀어내어 헹구고, 모든 단백질이 제거 및 수집되었는지 확인합니다. 초원심분리 필터 유닛을 3,270 ×g에서 45분 동안, 또는 필터 유닛 내의 부피가 600 µL 미만이 될 때까지 원심분리합니다.

통과액을 버리고 초원심분리 필터 유닛에 새로운 SDS 추출 용액을 채웁니다. 필터 유닛을 3,270 ×g에서 45분 동안 더 원심분리하며, 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 마지막 원심분리가 끝났을 때 초원심분리 필터 유닛의 최종 부피가 최대 600 µL가 되도록 합니다.

이 단계에서 농축액의 부피를 측정하고 이를 두 부분으로 나눕니다. 한 부분은 DNA 침전물 준비에, 다른 한 부분은 단백질 침전물 준비에 사용합니다. 단백질 침전을 위해 농축액 1부피당 50:50 비율의 메탄올과 아세톤을 4부피 추가하고 10초 동안 볼텍싱한 후, -20 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.

다음 날, 혼합물을 17,000 ×g에서 30분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 따라낸 후, 펠렛을 speed vac에서 1시간 동안 건조시킵니다. 펠렛을 과하게 건조하면 재현탁이 어려울 수 있으므로 주의하십시오.

펠릿을 25 µL의 SDS 추출 용액에 현탁합니다. 1시간 동안 그대로 둔 후, 피펫팅을 통해 다시 현탁합니다. 오염을 최소화하기 위해 생물안전작업대(BSC) 내에서 텍스트 프로토콜에 상세히 기술된 대로 단백질에 대해 SDS page를 수행하고, 각 레인의 10 kDa 래더 표시 아래에 있는 과잉 젤 부분을 잘라냅니다.

각 레인을 탠덤 질량 분석기로 분석합니다. 표면적을 넓히기 위해 각 레인을 1 mm × 1 mm 크기의 정사각형으로 각각 자르고, 해당 레인에서 나온 모든 조각을 저흡착 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 모든 레인에 대해 이 과정을 반복하며, 겔이 건조되어 자르기 어려워지는 것을 방지하기 위해 1% Acetic acid를 사용할 수 있습니다.

텍스트 프로토콜에 기술된 대로 겔 내 트립신 소화 및 펩타이드 추출을 진행하거나, DNA 침전에 사용할 농축 분획에 SDS 추출 용액을 가해 500 µL 표시선까지 채워 DNA 침전을 수행합니다. 이 단계는 단순히 용액의 부피를 늘려 작업 효율을 높이기 위한 것입니다. 그다음, MPC 단백질 침전 시약과 같은 단백질 침전 시약을 0.583 부피만큼 첨가하고 볼텍싱합니다.

10초 동안 하얀 침전물이 형성되면, 4 °C에서 17,000 ×g로 10분간 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 다른 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 0.95 부피의 isopropanol을 추가한 뒤 30~40회 뒤집어 섞어줍니다. 그 후 4 °C에서 최대 속도로 10분간 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 따라내어 버립니다. 이어서 70% ethanol 750 µL로 펠렛을 두 번 세척합니다.

피펫팅을 통해 에탄올을 최대한 제거한 후, 펠렛을 공기 중에서 건조시킵니다. DNA를 과하게 건조시키지 마십시오. 너무 건조되면 재현탁이 어려울 수 있습니다. 25 µL의 low T buffer P8에 펠렛을 재현탁합니다.

이중 가닥 DNA 분석 키트와 제조사의 지침을 사용하여 DNA를 정량합니다. 또한, DNA 3 µL를 사용하여 아가로스 겔 전기영동을 수행함으로써 품질을 확인합니다. 펩타이드들은 탠덤 질량 분석법(tandem spectrometry analysis)으로 분석되었습니다. 샘플당 23,000개 이상의 스펙트럼이 생성되었으며, 이를 통해 펩타이드와 단백질을 식별하였습니다.

Blast P와 metagenome analyzer 소프트웨어 패키지를 결합하여 메타 프로테옴의 분류학적 및 기능적 조성을 분석하였습니다. 데이터셋에서 alpha proteobacteria로 할당된 단백질이 가장 높은 비중을 차지했으며, 이들 중 대다수는 SAR R 11 클레이드로 할당되었습니다.

Alpha Proteobacteria의 Roter 분류군 또한 높은 비율로 나타났으며 확인되었습니다. 주로 표층수에서 발견되었습니다. 박테리아 질병과 관련된 단백질은 표층과 엽록소 최대층 사이에 고르게 분포되어 있었으나, 편모 박테리아 단백질은 엽록소 최대층에서 더 많이 확인되었습니다.

Gamma proteobacteria 단백질은 수층 전체에 고르게 분포되어 있었으나, beta proteobacteria 단백질은 주로 표층에서 발견되었습니다. 이 기술을 완전히 익히면 적절히 수행했을 때 3일 이내에 완료할 수 있습니다.