Name: 수생 미생물 Metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: 학습하세요 해수 미생물 생물량에서 단백질과 DNA를 동시 추출하고 트립신 소화로 펩티드를 생성하여 탠덤 질량 분석을 통한 메타프로테오믹스 분석을 수행하는 방법을.

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저자는 nano-LC MS/MS를 위한 시료 준비에 대한 전문 지식과 조언을 제공한 Marcos Di Falco와 LC MS/MS 분석을 위해 University of Regina의 Zoran Minic 박사에게 감사를 표합니다. 이 작업은 NSERC(DG402214-2011) 및 CRC(950-221184) 자금의 지원을 받았습니다. 워싱턴 D.C.는 Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems와 FQRNT의 지원을 받았습니다.

1. 시약 준비 <ol><li> SDS-추출 용액을 제조 하였다 : 0.1 M 트리스 -HCl pH가 7.5, 5 % 글리세롤, 10 mM의 EDTA, 1 % SDS를. 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 사용하여 필터 소독. </li><li> 폴리 아크릴 아미드 겔에 필요한 재고 시약을 준비합니다. <ol><li> 1.5 M 트리스 - HCL pH가 8.8를 준비합니다. 실온에서 0.22 μm의 필터를 사용하여 저장소 살균 필터. </li><li> 0.5 M 트리스 - HCL pH가 6.8. 실온에서 0.22 μm의 필터를 사용하여 저장소 살균 필터. </li><li> 10 % SDS를 준비합니다. 필터를 실온에서 0.22 μm의 필터를 사용하여 멸균 저장소. </li></ol></li><li> 에 - 겔 트립신 소화 및 펩타이드 추출에 필요한 솔루션을 준비합니다. <ol><li> 100 mM의 중탄산 암모늄을 준비합니다. 4 ° C에서 0.22 μm의 필터와 저장소를 사용하여 필터 소독. </li><li> 1 M DTT의 주식을 준비합니다. -80 ° C에서 100 mM의 중탄산 암모늄 및 저장 중에 현탁. </li><li> 550 mM의 요오도 아세트 아미드 주식을 준비합니다. 현탁100 mM의 -80 ° C에서 중탄산 암모늄 및 저장. </li><li> 100 NG를 준비 / 트립신 주식 μL. -80 ° C에서 1.5 ml의 마이크로 원심 튜브에 60 μL 나누어지는 및 저장. </li><li> 포름산 1 %, 2 % 아세토 니트릴 : 추출 용액을 제조 하였다. </li><li> 5 % 아세토 니트릴 0.1 % 포름산 : 부유 솔루션을 준비합니다. </li></ol></li></ol> 2. RNA 안정화 솔루션에 보존 세포와 카트리지 필터 유닛에 세포 용해를 수행 <ol><li> 카트리지 필터 부 (1.5 ㎖)로부터 필터의 루어 록 끝에 연결된 60 mL를 주사기를 사용하여 2 ML의 마이크로 원심 튜브에 RNA 안정화 용액 추방. </li><li> 모든 세포 파편을 펠렛 17,000 XG에서 10 분 동안 2 ml의 microcentrifuge 관을 원심 분리기. 단계 2.3에서 필터를 막히게하지 않도록이 행해진 다. </li><li> 동결 / 그쪽에서 용해 한 세포에서 발생하는 모든 단백질을 캡처하는 10 K ultracentrifugal 필터 유닛에 뜨는 전송샘플 w. 펠렛을 버리지 마십시오. 그것은 단계 2.5에서 사용됩니다. 30 분 동안이나 볼륨까지 3,270 XG에서 ultracentrifugal 필터 유닛의 원심 분리를 수행은 약 600 μL로 감소했다. </li><li> P10 팁의 선단을 녹여 팁의 개방 단부와 카트리지 필터 유닛의 비 루어 록 사이드 블록. 이것은 더 추출 버퍼와 바이오 매스 단계 2.5-2.7 동안 탈출 없는지 확인합니다. </li><li> 1ml의 SDS-추출 용액에 펠릿을 중단하고 원래의 카트리지 필터 유닛으로 피펫. 카트리지 필터 유닛에 피펫하는 가장 쉬운 방법은 P1000 팁에 P200 팁을 스택과 피펫이 더블 팁을 사용하는 것입니다. </li><li> 총 부피는 약 2 mL로하므로 카트리지 필터 유닛 SDS 추출 용액 1 ㎖를 첨가하고 혼성화 오븐에서 회전하면서 실온에서 10 분 동안 배양한다. 3 구겨진 연구소는 50 ML 원뿔 튜브의 바닥에 쳐 놓습니다. 폐쇄 카트리지 필터 부의 양단을 파라 필름및 50 ㎖ 튜브에 카트리지 필터 유닛을 넣어. 뚜껑을 닫고 하이브리드 오븐에 튜브를 넣어. </li><li> 10 분 놓은 후 Sterivex는 거품 플로터에 필터와 루어 잠금 끝에 5 ML의 주사기와 장소에 고정합니다. 플로트와 15 분 동안 95 ° C의 물을 욕조에 품어. </li><li> 시원한 카트리지 필터 장치를하자 (단계 2.6에서와 같이)을 실온에서 1 시간 동안 회전한다. </li><li> (단계 230) 이전과 동일 ultracentrifugal 필터 부에 60 ml의 시린지 필터에서 SDS 추출 용액 / 세포 용 해물을 추방. 카트리지 필터 부에 신선한 SDS 추출 용액 1 ㎖를 첨가하고 손으로 30 초 동안 혼합 한 후 60 mL의 주사기를 사용 ultracentrifugal 필터 유닛으로 추방. 이것은 모든 단백질이 제거되었는지 확인하기 위해 카트리지 필터 장치를 세척 할 것이다. </li><li> 3,270 XG 또는 필터 장치에 볼륨까지 45 분 동안 ultracentrifugal 필터 부에서 원심 분리를 수행하여 600 미만이다 μL. </li><li> 폐기 흐름을 통해 신선한 SDS-추출 용액 상단까지 ultracentrifugal 필터 장치를. </li><li> 3,270 X g에서 45 분 동안 다른 필터 유닛을 원심 분리기. </li><li> 반복 두 번 더 2.11 및 2.12 단계를 반복합니다. ultracentrifugal 필터 부에서 최종 용적을 확보하는 것은 최종 스핀의 단부에서 최대 600 μL이다. </li><li> 이 시점에서, 두 가지에 집중을 분할. 한 분획은 DNA 침전에 사용 된 단백질 침전 다른 것이다. 주 : 분별 량을 여과 바이오 매스의 양 및 제품의 의도 된 용도에 의존한다. 우리의 경우는 DNA 침전을 향해 10 % 단백질 침전을 향해 90 %로 농축 물을 분할. </li></ol> 3. 단백질 침전 <ol><li> 10 초 동안 집중 소용돌이의 하나의 볼륨에 아세톤 (50 : 50) : 4 볼륨 메탄올을 추가합니다. -20 ° C에서 밤새 품어. </li><li> 30 분 동안 17,000 XG에 스핀 다운. 뜨는을 가만히 따르다펠릿은 1 시간 (또는 건조까지)의를 Speed​​vac에서 건조 (눈에 보이지 않는 수 있음) 할 수 있습니다. 참고 : 위에 펠렛을 건조하지 마십시오이 재현 탁하는 것을 어렵게 만들 수 있기 때문이다. </li><li> SDS-추출 용액 25 μL에 펠렛을 중지. 다음로 pipetting 아래로 재현 탁 한 시간 동안 앉아 보자. </li><li> 단백질 분석 키트 및 제조 업체의 지침을 사용하여 단백질을 정량화. </li></ol> 4. DNA 강수량 <ol><li> 농축 분획을 SDS-추출 용액을 추가 500 μL 마크까지 DNA 침전에 사용한다. 이 단계는, 용액의 부피를 증가 쉽게 작동 할 수있게하는 것입니다. </li><li> 10 초 동안 소용돌이 (예 : MPC 단백질 침전 시약) 단백질 침전 시약의 0.583 볼륨을 추가합니다. 당신은 흰색 침전물 양식을 볼 수 있습니다. 참고 : 또한 사용한 페놀 : 클로로포름 추출 DNA 방법이지만 인해 낮은 볼륨에 더욱 곤란하다. 우리는을 사용하여 더 나은 DNA 수율을 얻을MPC 단백질 침전 시약. </li><li> 17,000 XG에 원심 분리기 10 분 동안 4 ℃. </li><li> 또 다른 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 뜨는을 전송하고 이소프로판올 0.95 볼륨을 추가합니다. 30 ~ 40 회 전환. </li><li> 최대 속도로 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 가만히 따르다 및 상층 액을 버린다. </li><li> 70 % 에탄올 750 μL로 두 번 씻어. </li><li> 많은 에탄올을 피펫으로 가능한 한 제거하고 자연 건조 할 수 있습니다. 참고 : 위에 DNA를 건조하지 마십시오이 재현 탁하는 것을 어렵게 만들 수 있기 때문이다. </li><li> 낮은 TE 완충액, pH가 8 (10 mM의 트리스 -HCl, 0.1 mM의 EDTA) 25 μL에 재현 탁. </li><li> dsDNA 분석 키트 제조 업체의 지침을 사용하여 DNA를 정량화. 품질을 확인하기 위해 DNA의 3 μL에 아가 로스 젤 (1 %) 전기 영동을 수행합니다. </li></ol> 5. 단백질의 SDS-PAGE 젤 <ol><li> 샘플 버퍼를 준비합니다 (950 μL 램 믈리 샘플 버퍼 50 μL의 β-머 캅토 에탄올). &lt;/ 리&gt; <li> 단백질 15 μg의에 해당하는 볼륨 또는 샘플 버퍼의 동일한 볼륨에 20 μL의 최대를 추가하고 4 분 동안 끓인다. SDS-PAGE를 수행 할 수있을 때까지 샘플은 현재 -80 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 5 % 아크릴 아미드 스태킹 젤 10 % 아크릴 아미드 해결 젤을 준비합니다. </li><li> 샘플 및 단백질 사다리의 4 μL와 젤을로드합니다. 250 kDa의 사다리 마커 때까지 일정하게 120 V에서 젤을 실행하여 바로 해결 젤에 도달했습니다. </li><li> 제조자의 지시에 따라 염색 계를 사용하여 쿠마시 염색 겔. </li></ol> 6.에서 젤 트립신 다이제스트 및 펩타이드 추출 주 : 6.10까지 여기의 모든 단계는 오염을 최소화하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 수행됩니다. <ol><li> 각 레인의 10 kDa의 사다리 마크에서 과잉 젤을 잘라. 각 레인 별도로 MS / MS로 분석한다. 표면적을 증가 1mm X 1mm 사각형으로 각 레인을 절감하고 모든 SQUA를 배치낮은 결합 마이크로 원심 분리기 튜브에 차선에서 입술. 모든 차선에 대해이 작업을 반복합니다. (1 % 아세트산을 건조 및 절단 곤란 해지는 겔을 방지하는데 사용될 수있다). 주 : 오염을 최소화하는 것이이 단계에서 매우 중요하므로 겔은 겔 슬라이스를 만드는 데 사용 된 유리 SDS-PAGE 겔에 몰드 생물학적 안전 캐비넷에서 수행된다. </li><li> 드 얼룩 <ol><li> 각 로​​우 결합 튜브, 개폐 덮개에 100mM의 중탄산 암모늄의 50 μL 분주하고 10 분 동안 37 ℃에서 배양한다. </li><li> 아세토 니트릴, 가까운 캡의 50 μl를 분배하고 5 분 동안 37 ° C에서 품어. </li><li> 기음과 150 μl를 폐기합니다. </li><li> 반복 6.2.1와 6.2.2 단계를 반복합니다. </li><li> 기음과 95 μl를 폐기합니다. </li></ol></li><li> 탈수 <ol><li> 50 μL 아세토 니트릴, 가까운 뚜껑을 분배하고 5 분을 기다립니다. 기음과 45 μl를 폐기하고 10 분을 기다립니다. </li></ol></li><li> 축소 <ol><li> 100 MM의 암모니아 희석 50 μL DTT (10 mM의를 분배오 수소 나트륨), 가까운 모자 및 37 ℃에서 30 분을 기다립니다. </li></ol></li><li> 알킬화 <ol><li> (100 mM의 중탄산 암모늄에 희석 55 밀리미터) 50 μL의 요오도 아세트 아미드, 가까운 뚜껑을 분배하고 37 ℃에서 20 분을 기다립니다. </li><li> 아세토 니트릴, 가까운 캡의 100 μl를 분배하고, 37 ℃에서 5 분 동안 품어. 기음과 195 μl를 폐기합니다. </li></ol></li><li> 빨래 <ol><li> 50 μL 중탄산 암모늄, 가까운 뚜껑을 분배하고 37 ℃에서 10 분 동안 품어. </li><li> 아세토 니트릴, 가까운 캡의 50 μl를 분배하고 5 분 동안 37 ° C에서 품어. 기음과 120 μl를 폐기합니다. </li></ol></li><li> 탈수 <ol><li> 50 μL 아세토 니트릴, 가까운 뚜껑을 분배하고 5 분을 기다립니다. 기음과 45 μl를 폐기합니다. </li><li> 아세토 니트릴 50 μl를 분배, 5 분을 기다립니다. </li><li> 기음과 75 μl를 폐기하고 5 분을 기다립니다. </li></ol></li><li> 소화 <ol><li> 25 ~ 30 μL NG (6)를 분배 / 유 (트립신을 μLntil 모든 젤 조각)이 적용됩니다. 닫기 모자와 실온에서 30 분을 기다립니다. </li><li> 37 ° C에서 하룻밤 (4.5 시간 최소) 품어. </li><li> 실온에서 30 분 동안 앉아 보자. </li></ol></li><li> 추출 및 펩타이드 전송 <ol><li> 추출 용액 30 μl를 분배하고 얼음에 30 분 동안 뚜껑 커버. </li><li> 기음 30 μL와 새로운 레이블 낮은 결합 관에 흡입 된 볼륨을 분배. </li><li> 추출 용액 12 μL와 (젤) 원래 튜브에 아세토 니트릴 12 μl를 분배. 닫기 모자와 얼음에 30 분 동안 품어. </li><li> 새로운 튜브에 대기음 15 μL 및 예금. </li><li> 단계를 반복합니다 (6.9.3과 6.9.4). </li></ol></li><li> 건조까지를 Speed​​vac 새로운 튜브를 놓습니다. </li><li> 부유 용액 50 μL에 재현 탁. 10 분 동안 중간에 소용돌이는 재현 탁합니다. </li><li> 나노 / LC에 적합한 나노 / LC 바이알 또는 96 웰 플레이트 중 하나에 피펫 펩타이드 솔루션MS / MS 작동합니다. </li></ol>

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샘플 보존 metaproteomic 연구에 중요하다 이전 작업은 RNA 안정화 용액 전에 단백질 추출 (28)에 셀을 저장하는 저장 버퍼 유용한 것으로 입증 하였다. 이상적으로, 샘플은 33, 34를 처리하는 동안 단백질 발현의 변화를 부정하는 현장에 보존 될 것이다. 사실, 시츄 샘플링 및 고정 기술은 선박 배치 인스트루먼트 자율 수집 및 샘플의 보존을 허용하는 개발되었다. 그러나, 이러한 기술에 대한 액세스가 항상 가능하지 않다. 그렇지 않은 일반적인 경우 샘플은 가능한 빨리 수집 후의 보존되어야한다. 여기서 우리는 일반적으로 수생 미생물에 사용되는 카트리지 필터 부, 수집 RNA 안정화 용액 저장 세포로부터 단백질을 추출하기위한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜 PR이어서 SDS-분해 용액 가열을 사용하여 세포 용해를 포함필요한 탈염 단계로 두배 ultracentrifugal 필터 유닛을 사용하여 농축 ...

미생물은 유비쿼터스하고 지구의 생물 지구 화학 사이클 1에 필수적인 역할을한다. 현재, 미생물 군집의 구조와 기능을 특성화 할 수 많은 분자 접근 방법이있다. 4 - 일반적인 16S rRNA 유전자 분석 환경 (2)로부터 DNA가 PCR 증폭 된 서열이다. 16S rRNA 유전자 분석의 단점은 대사 기능 만에 거의 정보, 계통 신원 및 커뮤니티 구조에 대한 정보를 제공한다는 것이다. 메타 지노믹스, metatranscriptomics 및 metaproteomics은 사회 구조와 대사에 대한 정보를 제공하기 때문에 대조적으로, 이러한 접근한다. 8 - 메타 지노믹스, 또는 생물의 유전자 군집의 함유량의 분석은, 커뮤니티 5의 구조 및 기능적 가능성에 대한 정보를 제공한다. 강력한 있지만,이 기능은 대사 전위에 대응하지 않을 수도생물의 활동. 유기체의 유전자형은 RNA로 전사 또한 표현형의 결과, 단백질로 번역 될 수있는 각각의 유전자에 의해 표현된다. 따라서, 환경에서 미생물 활성 작용의 이해를 돕기 위해, 포스트 게놈 분석 9를 수행한다. 그것은 주어진 환경에서 전사되는 유전자 밝혀 때문에 Metatranscriptomics, 또는 RNA 전 사체의 분석에 유용합니다. 그러나 mRNA 수준은 항상 인해 병진 규제 RNA 반감기, 다중 단백질의 mRNA는 모든 사본 (10)에 대해 생성 될 수 있다는 사실에 해당 단백질 수준과 일치하지 않는다. 이러한 이유 metaproteomics 지금 환경 미생물학을위한 중요한 도구로 인식되고있다. 일반 metaproteomic은 복잡한 시료에서 단백질의 가까운 완벽하게 보완 보통 EN을 통해 정제 동시에 분석 산탄 총 프로테오믹스 방법을 사용 분석질량 분석기에서 펩타이드 및 분석에 zymatic 소화. 후속 탠덤 질량 분석 (MS / MS) &quot;펩타이드 지문은&quot;검색 단백질 데이터베이스에서 단백질 서열과 기원의 잠재적 인 단백질 (검토를 위해 11 참조)를 결정하는 데 사용됩니다. 단백체 연구는 게놈 데이터 가용성의 증가 및 민감도와 높은 처리량 단백질 식별 및 정량 (11, 12)을 허용 질량 분석기의 정확도의 증가로 지난 25 년 덕분에 먼 길을왔다. 단백질은 유전자 발현의 최종 제품이기 때문에, metaproteomic 데이터는 주어진 환경과 어떤 단백질들이 표현되어에서 활동하는 유기체를 결정하는 데 도움이됩니다. 환경 변수들의 특정 세트는 유기체 또는 커뮤니티의 표현형에 미치는 영향을 결정하기 위해 시도 할 때 유리하다. 초기에, 바다에서 MS / MS 기반 metaproteomic 연구 대상의 특정 단백질을 식별하는 데 사용되었다SAR11 해양 박테리아 (13)의 빛 구동 양성자 펌프 proteorhodopsin에 초점을 맞춘 첫 번째 연구와 미생물 계통. 최근 metaproteomic 비교 분석 복잡한 공동체 간의 차등 단백질 발현 패턴을 규명 하였다. 예를 들면 연안 북서부 대서양 14 남극 반도 5 대사의 시간적 변화의 식별을 포함한다. 다른 연구는 생산성이 높은 연안 용승 시스템 (15)에 저 영양 해양 환류에서 지리적 가로로 쪼개다 따라, 예를 들어, 공간 규모에 걸쳐 단백질 발현 패턴의 변화를 설명했다. metaproteomics의 자세한 리뷰를 위해 우리는 슈나이더 외. (2010) 9 윌리엄스 외. (2014) 16 좋습니다. 표적 단백질 체학은 또한 환경 (17, 18)의 특정 대사 경로의 발현을 정량하기 위해 최근 사용되어왔다. THERmetaproteomic 분석의 세 가지 주요 단계는 전자 있습니다. 첫 번째 단계는 샘플 수집, 세포 용해 단백질의 농도를 포함하는 샘플을 준비한다. 해양 미생물의 시료 채취는 대개 일반적으로 0.22 ㎛의 카트리지를 사용하여, 자유 살아있는 미생물 세포의 포착을 위해 여과 하였다 큰 진핵 세포, 입자 및 입자 - 관련 박테리아를 제거하는 프리 필터를 통해 해수를 여과 수반 필터 유닛 (19, 20). 이러한 필터는 플라스틱 실린더 incased하고 필터 부 내에서 수행 될 수있다 세포 용해 단백질 추출 프로토콜은 유용한 도구가 될 것이다. 바이오 매스가 얻어지면, 세포 단백질 추출을 위해 용해 될 수 있도록한다. 여러 방법이 구아니딘 염산 용해 21 및 나트륨 도데 실 설페이트 (SDS) 기반 분해 방법을 포함하여, 또한 사용될 수있다. SDS와 같은 세정제, concentrati 많은 단백질 유형을 파괴하고 세포막을 가용화에 매우 효율적이지만0.1 %가 하류 단백질 소화와 MS 분석 (22)을 방해 할 수있는만큼 낮은 기능. 주요 관심사의 이온 소스 (23) 내부의 역상 액체 크로마토 그래피와 이온의 축적 억제 또는 해상력, 트립신 소화 효율에 SDS의 부정적인 효과이다. 두 번째 단계는 단백질 초기 트립신 펩티드의 1 차 아미노산 서열을 확인하는 데 사용할 수있는 AM / z 단편화 패턴의 결과로 LC MS / MS 분석 하였다 효소 소화 받는다 분류 및 분석한다. 다양한 소화 방법이 사용될 세제의 종류뿐만 아니라 질량 분광법 하류 흐름에 따라 수행 될 수있다. 우리의 프로토콜에서, SDS 겔로부터 제거하여 1-D의 PAGE 전기 영동 세제 오염을 제거하기 위해 이용된다. 이러한 막 단백질로서, 용해하기 어려운 단백질의 분석은, 높은 concen의 사용을 필요SDS 또는 다른 세제의 trations. 이는 SDS 겔 전기 영동과의 호환성 문제로 이끈다. 연구의 목적은 단백질을 용해하기 어려운 이들의 가용화가 필요한 경우, 관 - 겔 시스템 (22, 24)을 사용할 수있다. 튜브 - 겔법은 전기를 사용하지 않고 겔 매트릭스 내의 단백질을 포함한다. 그 후 가용화에 사용되는 모든 세제는 단백질 소화하기 전에 제거됩니다. 세 번째 단계는 생물 정보학 분석이다. 이 단계에서 MS / MS 데이터 펩티드는 펩티드 및 단백질 시료에 존재하는 결정으로 변환 뉴클레오티드 서열의 데이터베이스에 대해 검색된다. 펩타이드의 동정은 대하여 검색되는 데이터베이스에 의존한다. 해양 metaproteomic 데이터는 일반적으로 참조 게놈, 이러한 글로벌 오션 샘플링 데이터 세트 25 metagenomic 데이터뿐만 아니라 경작 리에서 단일 세포 증폭 된 게놈 구성 데이터베이스에 대해 검색됩니다(26, 27)를 neages. metaproteomic 데이터 5를 도출되었을 단백질 식별은 또한 동일한 샘플로부터 metagenomic 서열의 포함으로 증가시킬 수있다. 여기서 우리는 미생물 바이오 매스로부터 MS / MS 기반 분석에 적합한 펩티드를 여과 수집하고 RNA 안정화 용액에 기억의 생성을위한 프로토콜을 제공한다. 여기에 설명 된 프로토콜은 DNA와 단백질이 모든 단계가 단백질로 이어지는 및 DNA의 침전이 동일 그래서 동일한 샘플에서 고립 될 수 있습니다. 단지 하나의 필터는 단백질 및 DNA 추출 둘 필요가 있기 때문에 실용적 관점에서, 적은 여과가 필요하다. 우리는 또한이 프로토콜이 이전에 발행 된 프로토콜의 조합, 적응 및 수정을 통해 만들어진 것을 인정하고 싶습니다. 세포 용해 단계 (2011) 28. 사이토 등의 알에서 적응하고 구성 요소를 소화에 - 겔 트립신은 Shevche에서 적응NKO 등. (2007) 29.

<table><tbody><tr><td>Sterivex -GP 0.22 &뮤; m 필터 유닛</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td>샘플링</td></tr><tr><td>RNAlater 안정화 솔루션</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td>샘플링</td></tr><tr><td>트리스&nbsp;</td><td>바이오 베이직</td><td>77-86-1 또는 TB0196-500G</td><td>단백질 추출/SDS 페이지 젤</td></tr><tr><td>DTT</td><td>시그마-알드리치</td><td>D0632-1G</td><td>단백질 추출</td></tr><tr><td>SDS</td><td>바이오 베이직</td><td>15-21-3</td><td>단백질 추출/SDS 페이지 젤</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>바이오 베이직</td><td>6381-92-6</td><td>단백질 추출</td></tr><tr><td>글리세롤</td><td>피셔 사이언티픽</td><td>56-81-5</td><td>단백질 추출</td></tr><tr><td>10K Amicon 필터</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>단백질 추출</td></tr><tr><td>메탄올</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-4L</td><td>단백질 침전</td></tr><tr><td>아세톤</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-64-1</td><td>단백질 침전</td></tr><tr><td>MPC 단백질 침전 시약</td><td>진원지</td><td>mmP03750</td><td>DNA 침전</td></tr><tr><td>2-프로판올</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td>DNA 침전</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR 어세이 키트</td><td>, Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>DNA 정량화</td></tr><tr><td>, Qubit 단백질 어세이 키트</td><td>, Life Technologies</td><td>Q33211</td><td>단백질 정량화</td></tr>, <tr><td>수크로오스</td><td>바이오 베이직</td><td>57-50-1</td><td>SDS PAGE 겔</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Rad</td><td>161-0800</td><td>SDS PAGE 겔</td></tr><tr><td>APS</td><td>Bio Rad</td><td>161-0700</td><td>SDS PAGE 겔</td></tr><tr><td>30% 아크릴 아미드</td><td>바이오 라드</td><td>161-0158</td><td>SDS 페이지 젤</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>SDS PAGE 젤</td></tr><tr><td>글리신</td><td>바이오 라드</td><td>161-0718</td><td>SDS PAGE 젤</td></tr><tr><td>B- 메르 캅토 에탄올</td><td>바이오 베이직</td><td>60-24-2</td><td>SDS PAGE 젤</td></tr><tr><td>Laemmli 샘플 버퍼</td><td>바이오 라드</td><td>161-0737</td><td>SDS PAGE 젤</td></tr><tr><td>정밀 플러스 단백질 만화경 사다리</td><td>Bio Rad</td><td>161-0375EDU</td><td>SDS PAGE 젤</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>VWR</td><td>CABDH6044-4</td><td>인 젤 트립신 다이제</td></tr><tr><td>스트 NH4HCO3</td><td>Bio Basic</td><td>1066-33-7</td><td>인 젤 트립신 다이제</td></tr>스트 <tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>인 젤 트립신 다이</td></tr>제스트 <tr><td>포름산</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500ML</td><td>인 젤 트립신 다이제</td></tr><tr>스트<td>HPLC grade H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-4L</td><td>인-젤 트립신 다이</td></tr>제스트 <tr><td>요오도아세트아미드</td><td>바이오 베이직</td><td>144-48-9</td><td>인-젤 트립신 다이제</td></tr>스트 트립신 프로<tr><td></td><td>메가</td><td>V5111</td><td>인-젤 트립신 다이제</td></tr>스트 <tr><td>단백질 LoBind 튜브 1.5 ml</td><td>에펜도르프</td><td>22431081</td><td>인-젤 트립신 다이제스트</td></tr><tr><td>2 ml ROBO 바이알 9 mm</td><td>Candian Life Science</td><td>VT009/C395SB</td><td>인-젤 트립신 다이제스트</td></tr><tr><td>PP BM 인서트, 스프링 없음</td><td>Candian Life Science</td><td>4025P-631</td><td>인 젤 트립신 다이제스트</td></tr></tbody></table>

수생 미생물 metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

메타유전체학(metagenomics), 메타전사체학(metatranscriptomics) 및 메타단백질체학(metaproteomics)과 같은 메타오믹스(Meta-omics) 기술은 미생물 군집 구조와 대사를 이해하는 데 도움이 될 수 있습니다. 강력하기는 하지만, 균유전체학(metagenomics)만으로는 기능적 잠재력만 설명할 수 있습니다. 다른 한편으로, 메타단백질체학(metaproteomics)은 군집의 발현된 현장 대사 및 기능을 설명할 수 있게 합니다. 여기에서는 세포 용해, 단백질 및 DNA 분리를 위한 프로토콜뿐만 아니라 펩타이드 분해 및 카트리지 필터 장치(예: Sterivex 필터 장치)에 수집되고 RNA 안정화 용액(예: RNAlater)에 보존된 해양 미생물 세포에서 추출에 대해 설명합니다. 질량 분석 기반 단백질체학 연구에서 펩타이드 및 단백질의 식별은 펩타이드 탠덤 질량 스펙트럼을 번역된 뉴클레오티드 염기서열 데이터베이스와 비교하여 수행됩니다. 검색 데이터베이스에 샘플의 메타게놈을 포함하면 질량 스펙트럼에서 식별할 수 있는 펩타이드와 단백질의 수가 증가합니다. 따라서 이 프로토콜에서는 DNA가 동일한 필터에서 분리되어 나중에 메타유전체학(metagenomic) 분석에 사용할 수 있습니다.

데모, 우리는 표면과 캐나다 북부의 해안 바다의 엽록소 최대에서 수집 한 두 개의 해수 샘플에 프로토콜을 수행 하였다. 바다에서, 해수 6-7는 L이 3 μm GF / d를 전치 필터를 통과하면서, 그때는 월시 균체 외. (20)의 프로토콜은 다음 0.22 μm의 카트리지 필터 장치에 수집되었다. 세포는 추가 처리 될 때까지 즉시 RNA 안정화 용액에 저장 하였다. 이 여기에 제시된대로 연구실로 돌아온 우리는 프로토콜을 수행. 농축 된 세포 용 해물을 나누었다; DNA는 볼륨의 나머지 10 %에서 침전되는 동안 단백질은 체적의 90 %에서 침전시켰다. 우리는 24 ~ 26 μg의 단백질 및 이들 샘플에서 높은 품질의 DNA의 250-308 NG (그림 1)을 회복했다. 겔의 트립신 분해 펩티드의 추출과, 우리 Orbitrap 엘리 결합 나노 LC를 사용하여 MS / MS 분석을 실시한 후, 펩티드테 질량 분석기 (써모 피셔 사이언 티픽, 월섬, MA, 미국). ...

이 프로토콜은 바닷물에서 수집한 미생물 바이오매스에서 단백질과 DNA를 추출 및 농축한 후 탠덤 질량 분석 기반 단백질체 분석에 적합한 트립틱 펩타이드를 생성하기 위한 것입니다.

수생 미생물 Metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

본 절차의 목적은 해수 내 미생물 바이오매스로부터 단백질과 DNA를 추출한 후, 탠덤 질량 분석 기반의 프로테오믹스 분석을 위한 트립틱 펩타이드를 생성하는 것입니다. 이는 먼저 카트리지 필터에 축적된 세포를 용해함으로써 수행됩니다. 두 번째 단계는 초원심분리 필터 유닛을 사용하여 세포 용해물을 농축하는 것입니다.다음으로, 용해물을 단백질 침전용과 DNA 침전용의 두 분획으로 분리합니다. 마지막 단계로, 단백질의 젤 내 트립신 소화를 수행하고 액체 크로마토그래피-탠덤 질량 분석법 분석에 적합한 펩타이드를 추출합니다. 최종적으로, 후속 생정보학 분석을 통해 샘플 내에서 발현된 단백질을 식별할 수 있으며, 분리된 DNA는 메타게놈 및 16 S-R-R-N-A 유전자 분석에 사용할 수 있습니다.기존 방법과 비교했을 때 이 기술의 주요 장점은 단백질과 DNA를 동일한 샘플에서 동시에 분리할 수 있다는 점입니다. 우선, 필터 원심분리기의 루어 락(lure lock) 끝단에 60 mL 주사기를 연결하여 카트리지 필터 유닛에서 RNA 안정화 용액을 2 mL 마이크로 원심분리 튜브로 밀어냅니다. 세포 잔해를 펠렛화하기 위해 2 mL 마이크로 원심분리 튜브를 17,000 ×g에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 10 K 초원심분리 필터 유닛으로 옮겨 샘플에서 용해된 세포 유래 단백질을 포집합니다.펠릿을 버리지 마십시오. 초원심분리 필터 유닛을 3,270 ×g에서 30분 동안 또는 부피가 약 600 µL로 줄어들 때까지 원심분리합니다. 그동안 P 10 팁의 끝부분을 녹여 카트리지 필터 유닛의 논 루어 락(non lure lock) 측을 팁의 열린 끝부분으로 막습니다.이렇게 하면 향후 단계에서 추출 버퍼와 바이오매스가 유출되지 않도록 할 수 있습니다. 펠릿을 1 mL의 SDS 추출 용액에 현탁하여 원래의 카트리지 필터 유닛에 피펫으로 분주합니다. 카트리지 필터 유닛에 분주하는 가장 쉬운 방법은 P 200 팁을 P 1000 팁 위에 쌓아 이 이중 팁을 사용하여 피펫팅하는 것입니다. 카트리지 필터 유닛에 SDS 추출 용액 1 mL를 추가하여 총 부피가 약 2 mL가 되도록 합니다.파라필름. 카트리지 필터 유닛의 루어 락 끝부분을 밀봉하고 카트리지 필터 유닛을 50 milliliter 튜브에 넣습니다. 그다음, 50 milliliter 원추형 튜브 바닥에 구긴 실험실용 와이프 세 장을 배치합니다.뚜껑을 닫고 튜브를 하이브리다이제이션 오븐에 넣어 실온에서 회전시키며 10분 동안 배양합니다. 10분 후, 필터를 폼 플로터 위에 올리고 5 mL 주사기의 루어 락(lure lock) 끝부분으로 고정합니다. 이후 95 °C 항온수조에서 15분 동안 배양합니다. 그런 다음 카트리지 필터 유닛을 실온에서 1시간 동안 회전시키며 식힙니다. 완전히 식으면, 60 mL 주사기를 사용하여 필터에서 SDS 추출 용액 및 세포 용해물을 동일한 초원심분리 필터 유닛으로 밀어내어 배출합니다.이전과 동일하게, 카트리지 필터 유닛에 신선한 SDS 추출액 1 mL를 첨가하고 손으로 30초 동안 혼합합니다. 그런 다음 60 mL 주사기를 사용하여 필터의 내용물을 초원심분리 필터 유닛으로 밀어내어 헹구고, 모든 단백질이 제거 및 수집되었는지 확인합니다. 초원심분리 필터 유닛을 3,270 ×g에서 45분 동안, 또는 필터 유닛 내의 부피가 600 µL 미만이 될 때까지 원심분리합니다.통과액을 버리고 초원심분리 필터 유닛에 새로운 SDS 추출 용액을 채웁니다. 필터 유닛을 3,270 ×g에서 45분 동안 더 원심분리하며, 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 마지막 원심분리가 끝났을 때 초원심분리 필터 유닛의 최종 부피가 최대 600 µL가 되도록 합니다.이 단계에서 농축액의 부피를 측정하고 이를 두 부분으로 나눕니다. 한 부분은 DNA 침전물 준비에, 다른 한 부분은 단백질 침전물 준비에 사용합니다. 단백질 침전을 위해 농축액 1부피당 50:50 비율의 메탄올과 아세톤을 4부피 추가하고 10초 동안 볼텍싱한 후, -20 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다.다음 날, 혼합물을 17,000 ×g에서 30분 동안 원심 분리합니다. 상층액을 따라낸 후, 펠렛을 speed vac에서 1시간 동안 건조시킵니다. 펠렛을 과하게 건조하면 재현탁이 어려울 수 있으므로 주의하십시오.펠릿을 25 µL의 SDS 추출 용액에 현탁합니다. 1시간 동안 그대로 둔 후, 피펫팅을 통해 다시 현탁합니다. 오염을 최소화하기 위해 생물안전작업대(BSC) 내에서 텍스트 프로토콜에 상세히 기술된 대로 단백질에 대해 SDS page를 수행하고, 각 레인의 10 kDa 래더 표시 아래에 있는 과잉 젤 부분을 잘라냅니다.각 레인을 탠덤 질량 분석기로 분석합니다. 표면적을 넓히기 위해 각 레인을 1 mm × 1 mm 크기의 정사각형으로 각각 자르고, 해당 레인에서 나온 모든 조각을 저흡착 마이크로 원심분리 튜브에 넣습니다. 모든 레인에 대해 이 과정을 반복하며, 겔이 건조되어 자르기 어려워지는 것을 방지하기 위해 1% Acetic acid를 사용할 수 있습니다.텍스트 프로토콜에 기술된 대로 겔 내 트립신 소화 및 펩타이드 추출을 진행하거나, DNA 침전에 사용할 농축 분획에 SDS 추출 용액을 가해 500 µL 표시선까지 채워 DNA 침전을 수행합니다. 이 단계는 단순히 용액의 부피를 늘려 작업 효율을 높이기 위한 것입니다. 그다음, MPC 단백질 침전 시약과 같은 단백질 침전 시약을 0.583 부피만큼 첨가하고 볼텍싱합니다.10초 동안 하얀 침전물이 형성되면, 4 °C에서 17,000 ×g로 10분간 원심분리합니다. 원심분리 후, 상층액을 다른 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 0.95 부피의 isopropanol을 추가한 뒤 30~40회 뒤집어 섞어줍니다. 그 후 4 °C에서 최대 속도로 10분간 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 따라내어 버립니다. 이어서 70% ethanol 750 µL로 펠렛을 두 번 세척합니다.피펫팅을 통해 에탄올을 최대한 제거한 후, 펠렛을 공기 중에서 건조시킵니다. DNA를 과하게 건조시키지 마십시오. 너무 건조되면 재현탁이 어려울 수 있습니다. 25 µL의 low T buffer P8에 펠렛을 재현탁합니다.이중 가닥 DNA 분석 키트와 제조사의 지침을 사용하여 DNA를 정량합니다. 또한, DNA 3 µL를 사용하여 아가로스 겔 전기영동을 수행함으로써 품질을 확인합니다. 펩타이드들은 탠덤 질량 분석법(tandem spectrometry analysis)으로 분석되었습니다. 샘플당 23,000개 이상의 스펙트럼이 생성되었으며, 이를 통해 펩타이드와 단백질을 식별하였습니다.Blast P와 metagenome analyzer 소프트웨어 패키지를 결합하여 메타 프로테옴의 분류학적 및 기능적 조성을 분석하였습니다. 데이터셋에서 alpha proteobacteria로 할당된 단백질이 가장 높은 비중을 차지했으며, 이들 중 대다수는 SAR R 11 클레이드로 할당되었습니다.Alpha Proteobacteria의 Roter 분류군 또한 높은 비율로 나타났으며 확인되었습니다. 주로 표층수에서 발견되었습니다. 박테리아 질병과 관련된 단백질은 표층과 엽록소 최대층 사이에 고르게 분포되어 있었으나, 편모 박테리아 단백질은 엽록소 최대층에서 더 많이 확인되었습니다.Gamma proteobacteria 단백질은 수층 전체에 고르게 분포되어 있었으나, beta proteobacteria 단백질은 주로 표층에서 발견되었습니다. 이 기술을 완전히 익히면 적절히 수행했을 때 3일 이내에 완료할 수 있습니다.

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수생 미생물 Metaproteomics 워크 플로우 : 탠덤 질량 분석 기반 분석에 적합 트립신 펩티드로 세포

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