성인 인간 섬유 아세포의 유도 및 확장 신경 전구 세포에 자신의 직접 변환

이 절차의 전반적인 목표는 치료 적용을 위해 환자의 피부 생검에서 유도된 신경 전구 세포를 직접 생성하여 고전적인 Yamanaka IPS 접근 방식을 단축하는 것입니다. 이는 먼저 환자로부터 펀치 생검을 수행하여 체외에서 배양할 수 있는 1차 섬유아세포 세포를 추출함으로써 이루어집니다. 두 번째 단계는 배양된 섬유아세포를 확장한 후 재프로그래밍 인자를 암호화하는 바이러스로 감염시켜 트랜스 분화를 유도하는 것입니다.

다음으로, 추정되는 전환된 유도 신경전구세포 또는 INPC 콜로니는 시각적 검증을 통해 신중하게 선택해야 하며, 이후 감염 후 약 20일 후에 수동 채취로 분리해야 합니다. 마지막 단계는 단클론성으로 신경 유도 배지에서 IPC를 확장하고, 궁극적으로 시험관 내 분화를 표적으로 삼았으며, 면역 형광 현미경 검사법은 환자가 직접 변환된 IPC를 신경 세포와 신경교세포로 분화할 수 있음을 보여주는 데 사용되어 생체 의학 응용 분야를 위한 거의 무제한의 소스가 됩니다. 이 직접 변환 기술의 장점은 유도된 청색 강력한 줄기 세포의 야마나카 유형 유도 및 후속 분화와 같은 기존 방법에 비해 두 가지입니다.

우리가 INS 세포라고 부르는 다분화능 유도 신경 줄기 세포로의 DI 전환은 상당히 빠를 뿐만 아니라 더 안전합니다. 따라서 트랜스 분화 절차는 치료 응용 분야를 위한 환자 특이적 세포를 생산하고 IPS 세포에 비해 종양 형성 위험을 현저히 낮추는 것을 훨씬 더 쉽게 달성할 수 있습니다. 이를 통해 우리는 이제 오늘날 지역 의약품 비율의 두 가지 주요 장애물을 해체할 수 있습니다.

이것이 바로 임상적 안전성과 효율성입니다. 펀치 생검을 시작하려면 환자의 피부를 소독하고 생검을 할 피부를 0.5-1 밀리리터의 메피바카인 하이드로 클로라이드 피부 내 마취합니다. 멸균된 3mm 생검 펀치를 사용하여 피부 생검을 합니다.

dobe echo의 인산염 완충 식염수 또는 DPBS와 겐타마이신 1밀리리터당 1마이크로리터로 생검을 헹굽니다. 메스와 집게를 사용하여 생검에서 지방을 제거합니다. 그런 다음 완전히 흡인하기 전에 완충액으로 생검을 두 번 더 헹굽니다.

dis paste 2로 생검을 덮고 섭씨 4도에서 16-18시간 동안 배양합니다. 배양 후 DPBS로 생검을 두 번 세척하기 전에 dys 페이스트를 완전히 흡인합니다. 핀셋으로 표피를 제거한 다음 DPBS로 생검을 두 번 더 세척합니다.

다음으로, 2ml의 콜라겐분해효소 유형 2를 넣고 튜브의 15ml 튜브로 옮깁니다. 콜라겐 분해 효소를 최대 5 밀리리터까지 첨가하십시오. 총 부피는 섭씨 37도에서 45분 동안 배양합니다.

G의 180배에서 5분 동안 샘플을 원심분리한 후 스내팅을 버립니다. 펠릿을 10 밀리리터의 DMEM 태아 송아지 혈청 겐타마이신 배지에 재현탁시킨 후 180회 G.에서 5분 동안 다시 원심분리합니다.상등액을 버리고 펠릿을 동일한 배지 1.5 밀리리터에 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 T 25 부착 조직 배양 플라스크에 옮기고 섭씨 37도에서 5%CO2로 배양하고 약 2주 후 3일마다 배지를 교체합니다.

세포가 피부 부위 주위로 합류하면 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 트립신 EDTA를 사용하여 세포를 분할합니다. 3일마다 배지를 변경하고 세포가 합류할 때 분할하여 세포를 더욱 확장합니다. 표준 분석법으로 마이코플라스마 오염을 배제한 후, DPPS로 세포를 한 번 세척한 다음 DPBS를 흡인하고 트립신 EDTA 2.5ml를 첨가하여 직접 변환 실험을 위해 세포를 준비합니다.섭씨 37도, 5%CO2에서 5분 동안 세포를 배양한 후 플라스크를 부드럽게 두드려 세포를 분리합니다.

세포를 2.5ml의 섬유아세포 배지에 재현탁시키고 15ml 튜브로 옮깁니다. 튜브를 180배 G로 5분 동안 원심분리하고 스내팅을 흡인합니다. 1ml의 섬유아세포 배지에 세포를 재현탁시키고 위아래로 피펫팅하여 단일 세포 현탁액을 생성합니다.

도금하기 전에 세포 계수 약실을 사용하여 세포의 수를 세십시오.30, 우물 당 000개의 세포. 24웰 플레이트에서 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양하고, 점막 노출을 방지하기 위한 수술용 마스크를 포함한 적절한 개인 안전 장비와 함께 생물학적 안전 캐비닛에서 바이러스를 처리하는 5% CO2 단계를 수행해야 합니다.

먼저 감염을 수행하려면 기존 세포 배지를 100마이크로리터의 섬유아세포 배지로 교체하십시오. 그런 다음 resus는 섬유아세포 배지 1밀리리터에서 T 4, KLF 4, SOX 2 및 cmix sendi 바이러스의 해동된 분취액을 재현탁합니다. 세포에 3의 MOI로 각 바이러스를 추가하고 부드럽게 혼합하여 섭씨 37도에서 밤새 세포를 배양하고 24시간 후 5%CO2, 배지를 흡인하고 500마이크로리터의 신경 유도 배지 배양, 세포를 섭씨 39도, 지금부터 5%CO2, 감염 후 6일째에 격일로 배지를 변경합니다. 라미닌 코팅된 6웰 플레이트를 준비합니다.

DPBS 중 1마이크로그램/밀리리터 라미닌 1밀리리터를 6개의 웰 플레이트에 추가하고 감염 후 7일째 되는 날 플레이트를 섭씨 4도로 24시간 동안 유지한 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 D-P-B-S-E-D-T-A를 사용하여 세포를 분할합니다. 500마이크로리터의 D-M-E-M-F 12를 넣고 현탁액을 15ml 튜브로 옮깁니다. 그런 다음 5분 동안 180배 G로 샘플을 원심분리합니다.

상층액을 흡인하고 펠릿을 1.5ml의 신경 유도 매체 플레이트에 재현탁시키고, 라미네이트 코팅된 6개의 웰 플레이트에 세포를 플레이트화하고, RO 키나아제 억제제를 최종 농도인 10마이크로몰 배양액에 첨가합니다. 섭씨 39도, 5%CO2의 셀은 14일째부터 격일로 매체를 변경합니다. 감염 배양 후 섭씨 37도의 세포, 5%CO2 신경 상피 집락은 위상차 현미경으로 시각화된 바와 같이 감염 후 17일째 경에 명백해집니다.

감염 후 20일쯤 털을 따기 하루 전, 1 48번 털을 따기 하루 전에 수확할 수 있을 만큼 충분히 커야 합니다. 하루 후 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 라미닌이 포함된 웰 플레이트, 플레이트에서 라미네이트를 흡인하고 웰에 200마이크로리터의 신경 유도 배지를 추가합니다. 2ml의 신경 유도를 추가하기 전에 DPBS로 채취할 콜로니가 포함된 6개의 웰 플레이트를 한 번 세척합니다.

6개의 Well 플레이트의 웰당 중간은 얇은 바늘을 사용하여 콜로니 주위를 긁어내어 주변 세포를 제거하고 피펫 팁을 사용하여 콜로니를 골라서 기계적으로 세포를 선택합니다. 50 마이크로 리터에 200 마이크로 리터 피펫 맨 세트에 장착. 각 콜로니를 라미네이트 코팅된 48웰 플레이트의 한 웰로 옮기고 위아래로 10회 피펫팅하여 기계적으로 단일 세포 현탁액을 생성합니다.

R 키나아제 억제제를 최종 농도 10마이크로몰로 세포에 첨가합니다. 48웰 플레이트의 세포를 섭씨 37도, 5%CO2에서 이틀 동안 성장시킵니다. 세포가 80-90%co 유창성에 도달할 때까지 2일마다 배지를 교체하십시오.

뉴런 계통 배양에 대한 IPC의 분화를 위해 IPC의 확장 및 동결 보존을 위한 텍스트 프로토콜을 참조하십시오. 라미네이트 코팅 플레이트의 셀. 이전과 마찬가지로 세포가 약 70% confluent일 때 배지를 신경 diff 배지로 변경하고 3주 동안 격일로 배지를 계속 변경합니다.

분화 과정에서 세포를 분열하지 마십시오 3 주 후, 세포는 더 성숙한 뉴런과 신경 세포 아형을 얻기 위해 뉴런 마커 TUJ 1을 발현해야합니다. IPC의 분화를 위해 최대 3개월까지 분화를 계속하며, 특히 신경교교세포(glial lineage)를 향합니다. 신경교세포(glial precursor cell)로의 분화를 유도하기 위해 표피 성장 인자(epidermal growth factor)의 밀리리터당 20나노그램을 포함하는 배지를 신경교세포(glial duction)로 변경합니다.

배지의 절반을 제거하고 약 2주 동안 격일로 새로운 배지로 교체하십시오. 이 기간 동안 세포는 2주 후 100% co fluency에 도달할 때 10 micromolar R kinase inhibitor의 존재 하에서 1-3으로 분할되어야 합니다. 세포가 거의 합류할 때 배지를 상업적으로 이용 가능한 성상세포 배지로 변경하고, 약 7일 후에 2일마다 배지를 계속 변경함으로써 세포가 성상세포 마커를 발현하기 시작함으로써 세포를 성상세포로 더욱 분화시킵니다.

분화 프로토콜 동안 세포가 100% 융합되면 1:2 비율로 분할합니다. 10 Micromolar RO kinase inhibitor의 존재 하에서, T 4K LF four, SOX 2 및 cmix sendi 바이러스에 의한 섬유아세포의 감염 및 신경 유도 배지 조건에서의 배양은 섬유아세포의 형태학의 변화와 그에 따른 콜로니의 출현을 초래하였다. 감염 발생 후 17일이 지나면 단클론 세포주가 확장되어 SOX 2, SOX 1 neston 및 PAC 6과 같은 신경 줄기 세포 마커와 증식 마커 KI 67에 대해 양성으로 염색될 수 있지만 다능성 관련 마커 T 4는 발현되지 않습니다.

또한, 세포 배양 배지에 신경 세포 성장 인자를 첨가함으로써, 신경전구세포는 성상세포 분화를 적용하여 뉴런으로 분화될 수 있습니다. 프로토콜 유도 신경전구세포주는 또한 전형적인 형태학적 변화 분석 및 GFAP에 대한 염색에 의해 판단되는 신경교세포계로 분화될 수 있습니다. 이러한 직접 전환을 통해 우리는 3-4주 이내에 환자 섬유아세포로부터 다능성 유도 신경 전구 세포를 생성합니다.

이 세포는 수많은 생물 의학 응용 분야에 사용될 수 있습니다. 이 기술의 의미는 알츠하이머 병 및 파킨슨 병과 같은 신경 퇴행성 질환뿐만 아니라 기타 신경 질환의 치료, 진단 및 모델링으로 확장됩니다.