소에 이펙터 및 메모리 T 세포 반응을 평가하기위한 장기 배양 인터페론-γ 효소 링크 된 Immunospot 분석의 응용 프로그램

이 절차의 전반적인 목표는 단기 및 장기 배양 인터페론 감마 L 스폿 분석을 각각 사용하여 효과기 및 기억 T 세포 반응을 모두 평가하는 것입니다. 중추 기억 반응의 평가는 13일 동안 항원 자극 하에서 소 말초 혈액 단핵 세포를 배양하여 수행됩니다. 장기 배양은 효과기 T 세포 반응이 발생하고 감소할 수 있도록 합니다.

인터루킨 2는 기억 T 세포의 유지를 위해 배양에 첨가됩니다. 13일째에는 장기 세포가 IFN 감마 포획 항체로 코팅된 L 스폿 플레이트로 전달됩니다. 개별 마이코박테리아 항원에 대한 장기 세포의 반응은 자가 항원 제시 세포의 존재 여부에 따라 평가됩니다.

APC APC는 13일째 순응에 의해 새로운 p BMC와 분리됩니다. 또한, 생체 외 조건에서 새로 분리된 pbmc의 반응은 effector 반응의 상관관계로 평가됩니다. 여러 연구에서 백신 접종 후 마이코박테리아 항원에 대한 소의 장기 배양 스봇 반응은 백신 효능과 긍정적인 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다.

또한, 장기 T 세포 배양은 주로 인간과 소 모두의 중앙 기억 T 세포를 포함하여, 장기 배양된 L 스폿 분석을 수행합니다. 60ml의 혈액은 경정맥, 정맥 천자에 의해 감염되거나 백신을 접종한 동물로부터 수집되며, P BMC는 밀도에 의해 분리됩니다. 그래디언트 원심분리.

세포 농도는 ml당 400만 개의 세포로 조정해야 합니다. 완전한 RPMI Media에서 500 마이크로 리터의 미생물 항원(이 경우 TB 10.4 및 항원 85 A)과 PPDB라고 하는 em bovis 배양의 정제된 단백질 유도체를 도금하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 각 동물에서 분리한 500마이크로리터의 pbmc를 동물당 4개의 복제물로 추가합니다.

모든 웰은 자극을 받아야 합니다. 이 단계에서는 자극이나 유사분열과 같은 제어가 필요하지 않으며 13일 동안 소의 상온인 섭씨 39도에서 플레이트를 배양합니다. 3일차와 7일차에는 각 웰 피펫팅에서 500마이크로리터를 버리고 웰 바닥의 세포층을 방해하지 않도록 주의합니다.

IL Two를 포함하는 완전한 PMI로 볼륨을 보충합니다. 플레이트를 인큐베이터에 넣습니다.10일째, 각 웰에서 750마이크로리터의 상등액을 버리고 12일째에 IL 2 없이 완전한 RPMI를 보충하고, 피펫을 낳고 IL 2 없이 완전한 RPMI로 보충된 각 웰에서 상등액 1ml를 버립니다. 또한 IFM Gamma capture antibody로 코팅할 L 스폿 플레이트를 준비하고, 첫 번째 피펫, 멀티 채널 피펫을 사용하여 각 웰에 35% 알코올 15마이크로리터를 주입하고, 이 단계는 스폿 정의를 증가시킵니다.

300마이크로리터의 PBS로 6번 잘 씻으십시오. PBS에서 ml당 8마이크로그램으로 100마이크로리터의 포획 항체를 추가합니다. 피펫팅은 모든 과정에서 신중하게 수행해야 하며, 피펫 팁이 웰 플레이트 바닥의 멤브레인에 닿거나 손상되지 않도록 비닐 봉지 안에 넣고 밤새 섭씨 4도에서 배양해야 합니다.

13일째에는 첫날에 샘플링한 동일한 동물로부터 경정맥 천자로 혈액 60ml를 채취합니다. pbmC를 분리하고 농도를 ml당 200만 개의 세포로 조정합니다. L 스폿 플레이트에 적절하게 레이블을 지정합니다.amples의 각 세트에 대해.

장기 세포와 APC, APC가 없는 장기 세포 및 생체 외 세포. Ellis 스폿 플레이트 세척 웰에서 tween이 포함된 300마이크로리터의 PBS와 함께 포획 항체를 폐기합니다. 여섯 번 반복하고 버리고 액체와 피펫을 씻습니다.

50마이크로리터의 갓 분리된 p BMC를 장기 세포에 할당된 우물로 넣습니다. 플러스 APC. L spot assay plate와 병렬로 유세포 분석으로 세포의 표현형을 평가하기 위해 완전한 RPMI의 well당 200μlit로 L spot Plate의 다른 well을 차단합니다.

적절하게 라벨링된 둥근 바닥 96웰 플레이트에 새로 분리된 50마이크로리터의 세포. 이것은 반응하는 세포의 표현형을 결정하기 위해 황색 반점 분석과 함께 수행되는 보조 분석입니다. 5%CO2 인큐베이터에서 섭씨 39도에서 90분 동안 플레이트를 배양하여 항원 제시 세포가 부착되도록 합니다.

또한 이 90분 배양 단계 동안 200ml의 완전한 RPMI를 배양하여 예열합니다. 24웰 플레이트에서 장기 배양된 세포를 수확합니다. 각 동물의 쿼드 복제본을 하나의 15mil 원뿔형 튜브로 결합합니다.

400 Gs.Discard에 5 분 동안 관을 원심 분리기는 관 역환에 의하여 상등액을 버리고, 세포 펠릿을 밀어내고 PBS의 5 mls를 온화하게 필요하다면 펠릿을 resuspend 추가하십시오. 세포를 두 번 세척한 다음 세포 농도를 ml 당 200, 000 세포로 조정하십시오. 90분 배양 후 인큐베이터에서 LPO 플레이트와 전체 RPMI를 꺼냅니다.

LPO 플레이트를 플레이트 셰이커에 30초 동안 놓습니다. 그런 다음 따뜻하고 완전한 RPMI 웰당 150마이크로리터의 플레이트 반전 피펫으로 비접착 세포를 제거합니다. 접시를 흔들고 세척액을 버리십시오.

세 번 반복하고, 가능한 한 많은 액체를 버리고, 부착성 APC가 포함된 적절한 웰에 각 항원을 웰당 100마이크로리터씩 추가합니다. 그런 다음 장기 배양된 세포 현탁액의 웰당 100마이크로리터를 피펫팅합니다. 200, ML당 000개의 세포를 장기 세포와 APC로 라벨링된 우물로 넣습니다.

이 단계에서 추가된 장기 세포는 이미 우물에 있는 APC와 동일한 동물에서 유래한 것인지 확인하십시오. APC와 다른 동물의 장기 배양 세포를 혼합하지 마십시오. 또한, 장기 배양 세포 현탁액의 웰당 100마이크로리터를 ml당 200, 000개의 세포 농도로 피펫으로 장기 반응 평가를 위한 APC가 없는 웰에 넣습니다.

항원 제시가 없는 경우, 단기 세포 웰당 100마이크로리터를 추가하고, 생체 외 반응 평가를 위해 새로 분리하고 ML당 200만 개의 세포로 조정합니다. 유세포 분석을 수행하는 경우, 둥근 바닥 96을 세척하고 웰 플레이트를 세척한 후 동일한 절차에 따라 장기간 새로 분리된 세포와 항원을 웰에 추가합니다. IFN 감마 LPO 플레이트에 사용되며 5 % CO2 인큐베이터에서 섭씨 39도에서 밤새 플레이트를 배양합니다.

접시가 평평하게 놓여 있는지 확인하고 14일째에는 접시를 쌓지 마십시오. 웰과 세척 플레이트의 유체를 6회 버리고 트윈이 포함된 PBS 웰당 300마이크로리터를 플레이트 셰이커에 올려 세척 전과 세척 사이에 10초 동안 매번 놓습니다. 그런 다음 동일한 양의 증류수로 한 번 씻고 PBS가 함유된 트윈으로 추가로 여섯 번 씻습니다.

마지막으로, PBS 웰당 300마이크로리터로 셀을 두 번 세척합니다. 종이 타월이나 흡수 패드에 접시를 두드려 세척액을 제거합니다. 1% 소 혈청 알부민으로 PBS에 희석된 ml당 5마이크로그램의 검출 항체 웰당 100마이크로리터를 추가합니다.

섭씨 39도에서 120분 동안 플레이트를 배양합니다. 이 배양 단계에서 사용 30분 전 또는 웰에 검출 항체를 첨가한 후 90분 후에 제조업체의 지침에 따라 VTA stain A BC AP 키트 표준물질의 알칼리성 인산가수분해효소 용액을 준비합니다. 120분 배양 후 트윈이 포함된 PBS에 시약을 희석하고, 트윈이 함유된 PBS 웰당 300마이크로리터로 플레이트 반전 세척 플레이트로 검출 항체를 6회 폐기합니다.

종이 타월에 접시를 두드려 세척액을 제거합니다. 그런 다음 알칼리성 인산가수분해효소 용액 웰당 100마이크로리터를 추가합니다. 플레이트를 실온에서 45분 동안 배양합니다.

액체를 버리고 PBS Containing tween으로 각 플레이트를 6번 세척합니다. 제조업체의 지침에 따라 vector blue AP substrate three kit에서 기판 용액을 준비합니다. pH 8.2에서 0.1 몰 트리스 HCL 완충액에 시약을 희석합니다.

피펫 : 50 마이크로 리터의 기판 D. 각 웰은 파란색이 약 30 분 동안 발생하기 시작할 때까지 실온에서 배양합니다. 액체를 버리고 다량의 증류수가 담긴 플레이트를 세척하십시오. 바닥 플레이트를 제거하여 웰의 멤브레인 세척 뒷면을 노출시키고 플레이트를 자연 건조시킵니다.

면역 스팟 이미지 분석기를 사용하여 반응을 측정하거나 반응이 측정될 때까지 플레이트를 실온의 어두운 곳에 보관합니다. 반응 기질의 안정성이 높기 때문에 기질 질은 수년 동안 보존됩니다. 유세포 분석에 의한 표현형 및 사이토카인 반응을 평가하는 경우, 둥근 바닥 96에 도금된 세포의 표준 염색 절차를 수행하고, APC의 유무에 관계없이 웰 플레이트를 대표하는 TCM, 감염된 동물 및 비감염 동물의 유인 생체 외 IFN 감마 L 스폿 반응을 보여줍니다.

m bovis에 대한 특이적 반응은 PBDB 또는 ESAT six, CFP 10 항원 자극으로 평가합니다. 플레이트 바닥의 반점은 노란색 반점 분석의 착색 제품입니다. 각 반점은 일반적으로 개별 사이토카인 생성 세포를 나타내며, 감염된 동물의 세포와 함께 IFN 감마를 생산하는 T 세포의 정량적 측정을 제공합니다.

반점 형성 세포 또는 SFC로 나타나는 장기 IFN 감마 L 스폿 반응은 명확하게 시각화되며, 항원 자극에 대한 반응으로 IFN 감마 생성은 감염되지 않은 소의 세포와 감염되거나 감염되지 않은 소의 자극되지 않은 세포에서 거의 또는 전혀 관찰되지 않습니다. 강력한 T-세포 반응은 TCM과 같이 poke weed mitogen에 대한 반응과 PPDB 및 ESAT six에 대한 ex vivo 반응으로 발생해야 합니다. CCFP 10은 모든 3M bovis 감염 동물에서 검출되었으며 대조 동물에서 TCM 및 생체 외 반응이 최소 또는 전혀 검출되지 않았습니다.

감염된 동물에 의한 최적의 TCM 반응을 위해서는 APC의 존재가 필요했으며, 이는 장기간 배양된 세포에 의한 반응이 크게 감소한 것에서 알 수 있습니다. 자가 APC가 없는 경우, em, bovis 감염 동물 및 비감염 동물로부터 반점 형성 세포가 제시되었습니다. 각 동물의 SFC 수는 PPDB에 대한 반응으로 중복 샘플에서 10개에서 6번째 세포의 평균 SFC 수로 계산되었으며, 감염 상태, APC의 존재 또는 부재 및 배양 기간에 따라 다른 배지 단독 반응, 즉 장기 배양 대 생체 외 배양에 따라 다른 반응을 뺀 값입니다.