Name: 설계 및 인공 세포 외 기질의 건설 (aECM) 단백질에서 대장균 피부 조직 공학 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: 배우세요 인공 세포 외 기질(aECM) 단백질의 설계 및 정제 방법을 대장균(E. coli)에서 발현시키는 기술입니다. ITC 정제법을 활용한 이 프로토콜은 조직 공학 연구에 활용됩니다.

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저자는 교육부의 AcRF 계층 1 (RG41)에서 자금을 인정하고 난양 기술 대학에서 부여를 시작하고 싶습니다. 저와 Tjin은 난양 기술 대학, 싱가포르에서 연구 학생 장학금 (RSS)에 의해 지원된다.

aECM 단백질 재조합 플라스미드 인코딩 1. 복제 <ol><li> 기능 도메인 (예, 세포 결합 도메인과 엘라스틴 같은 반복)의 아미노산 서열을 디자인. 기능 영역의 단부의 측면에 디자인 제한 부위는 서브 클로닝 소프트웨어 명령에 따른 무료 소프트웨어를 사용하여 (예 http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/)을 용이하게한다. 여기서, 의도 사이트로 소화를 한정하기 위해 기능 도메인에 존재하지 않는 유일한 제한 효소 부위를 선택한다. 다중 클로닝 부위 호스트 벡터 (MCS)에 표시 제한 부위를 선택 (예를 들어, pET22b (+))의 서브 클로닝. </li><li> 소프트웨어 명령어에 따라 웹 사이트를 이용하여 자유 염기 서열에 아미노산 서열을 해석 역방향. (예 http://www.bioinformatics.org/sms2/rev_trans.html). 확인 코돈은 E.에 최적화되어 있습니다 대장균 호스트. </li><li> 관심의 유전자는 purchas 수 있습니다ED 상업적로서 단일 가닥 올리고 뉴클레오티드는 DNA 및 어닐링을 수행 (올리고 &lt;100 염기쌍 (BP)이있는 경우, 즉) (단계 1.4 참조) 비용을 감소시킨다. 그렇지 않으면, 100 염기쌍보다 큰 유전자들은 상업적인 회사에서 구입할 수있다. </li><li> DNA 올리고 뉴클레오티드의 어닐링 <ol><li> 원하는 유전자 서열을 얻기 위해 DNA 올리고머 어닐링. 1 μg의 / μL의 최종 농도 (여과 2- 아미노 -2- (히드 록시 메틸) 프로판 -1,3- 디올, pH가 8.0, 10 mM 트리스) DNA 올리고머 버퍼 DNA 올리고 뉴클레오티드를 녹인다. </li><li> 총 40 ㎕의 혼합물을 달성하기 위해 DNA 어닐링 완충액 32 μL (10 mM의 트리스, 100 mM의 NaCl 내지 100nm의 MgCl 2)에 각 올리고머 4 μl를 추가. </li><li> 핫 플레이트를 사용하여 물을 비이커를 삶아 5 분, 95 ° C의 혼합물을 담그지. 비커를 제거하고 점차적으로 스티로폼 상자 O / N에서 설정 전체를 냉각. 올리고머는 어닐링 및 소화 할 준비가되어있다. </li></ol></리&gt; <li> 어닐링 올리고머 (즉, 삽입 라한다) 및 호스트 벡터 별도로 (즉, pET22b (+)를) 소화 해당 제한 효소를 추가합니다. 37 ℃에서 3-4 시간 동안 다음 레시피 (1-2 μg의 DNA 각각을 제한 효소 2㎕의, 총 50 ㎕의 혼합물을 10 배 제한 효소 완충액, 및 물을 최대 5 μL)을 사용. 참고 : pET22b (+) 플라스미드 벡터는 암피실린 항생제 내성과 C- 말단에 6 배 - 그의 태그가 포함되어 있습니다. pET22b (+)에 존재하는 6 배-그의 태그는 7 단계에서 웨스턴 블로 팅을 통해 표적 단백질을 식별하기 위해 그의 - 태그 항체를 사용하여 우리를 할 수 있습니다. </li><li> 각 소화 혼합물에 6 배 로딩 염료를 추가합니다. 별도로 100 V. 시각화 UV 광 조명과 1.2 %의 DNA 아가 로즈 겔에서 1 시간 동안 UV 형광 DNA 얼룩을 함유하는 1.2 % DNA 아가 로스 젤에서 DNA 사다리 포함 소화 혼합물을 실행. </li><li> 상업 젤 정화 키트를 사용하여 소화 DNA 제품을 추출하기 위해 젤을 조각입니다. 엘 루트E 50-100 NG / μL의 최소 DNA 농도를 달성하기위한 최소한의 열을 사용하여 볼륨. </li><li> 소화 된 DNA 인서트를 결찰하여 관심 순차적 유전자를 결합 (즉, DNA의 어닐링에 의해 얻어지는 엘라스틴 반복 또는 세포 결합 도메인)하기 배합하여 T4 리가 제를 사용하여 플라스미드 벡터로 (벡터의 2 μL, T4 리가 제 1 μL를, T4 내고 버퍼, X μL 삽입의 1.5 μL, 총 15 μL 혼합물 10.5-X μL 물). 2 시간 동안 실온에서 결찰 혼합물을 품어. 참고 : 삽입하는 벡터의 몰 농도는 결찰 효율을 최적화하기 위해 변화되어야한다. 조리법에있는 X 설명 삽입물의 볼륨 단계 1.7에서 용출 DNA 농도에 따라 달라집니다. </li><li> 해동 E. 대장균 DH5α 화학적으로 유능한 세포 (또는 복제 주) 얼음에. 따뜻한는 2xYT 아가 플레이트 암피실린 (25 μg의 / ㎖)를 함유하는 (표 1)에 37 ° C. </li><li> 사용하여 세포를 형질열 충격 : <ol><li> 나누어지는 깨끗하고 사전 냉장 마이크로 원심 분리기 튜브에 유능한 세포의 50 μL. 피펫 5 μL 세포로 결찰 혼합물 (100 페이지 NG 100 사이), 피펫 팅 부드럽게 위아래로 혼합합니다. 20 분 동안 얼음에 혼합물을 남겨주세요. </li><li> 2 분 동안 42 ° C의 물을 용기에 세포 혼합액을 함유하는 마이크로 원심 분리 튜브를 담그고 2 분 동안 얼음에 돌려 보냈다. 세포에 열 손상을 최소화하기 위해 시간을 침지 시간. </li><li> 마이크로 원심 분리기 튜브에 SOC 미디어 (표 1)의 500 μl를 추가하고 1 시간 동안 진탕 37 ° C에서 품어. </li><li> 암피실린 (25 μg의 / ㎖)를 포함, 실온으로 미리 예열 된 함유하는 2 × YT 한천 플레이트에 세포 / 결찰 혼합물 (50) 500 μl를 확산하고 판을 37 주에서 거꾸로 품어 / N (12 ~ 16 시간) . </li></ol></li><li> 다음날, 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 한천 플레이트에서의 DNA 식민지를 선택합니다. (표 2YT 배지 5ml에 콜로니를 성장1)을 포함 암피실린 (25 μg의 / ㎖) O / N) 진동 (225 rpm으로 37 ° CO / N (12 ~ 16 시간)에서. </li><li> 다음 날, 제조 업체의 프로토콜에 따라 고른 각 식민지에 대한 DNA 플라스미드를 추출하는 플라스미드 분리 키트를 사용합니다. 물 50 μL와 DNA를 용출시켰다. </li><li> 37 ° C에서 2 시간 동안 배양 (5 μL의 DNA 각각을 제한 효소 0.2 μL, 총 10 ㎕의 혼합물을 1 μL 10 배 제한 효소 완충액 및 상부까지 물) : 시험은 다음의 레서피를 이용하여 제한 효소로 소화 수행 가능성이 단계 1.6에서 1.2 %의 DNA 아가로 오스 겔에 삽입하고 실행을 포함 식민지 화면. 참고 : 소화시, 성공적인 결찰해야 두 밴드, 벡터 및 각각의 분자량에 해당 삽입 (그림 1)에 대한 하나의 각각의 결과. </li><li> 앞으로 T7 프로모터를 사용하여 DNA 염기 서열에 대한 가능성이 식민지를 보내기 및 상업 시퀀서에 프라이머를 역. </li></ol><ol><li> 시퀀싱 결과로부터 성공적으로 결찰 된 콜로니를 선택하고 E.로 형질 전환 DNA 플라스미드를 사용 대장균 발현 호스트. </li><li> 해동 E. 대장균 발현 균주 얼음 (BL21 (DE3) pLysS를). 한편, RT를 암피실린 (25 μg의 / ㎖) 및 클로람페니콜 (34 μg의 / ㎖)를 함유하는 한천 판 따뜻한. 주 : 박테리아에 존재 pLysS를 플라스미드는 BL21 (DE3) pLysS 균주는 클로람페니콜 내성 유전자를 포함 균주. pLysS를 플라스미드는 구조적으로 aECM 단백질의 새는 표현을 제한하는 표현 T7 리프레 유전자가 포함되어 있습니다. 클로람페니콜 pLysS 균주는 배양 중에 포함되어 박테리아 세포에 대해 선택하는 것이 필요하다. </li><li> 단계를 반복 1.10 E. 변형을 구하는 인공 단백질을 발현 할 준비가 대장균 세포. 파라 필름에 한천 플레이트를 감싸고 4 거꾸로 저장 6; 최대 1 개월 C. </li></ol> aECM 단백질의 3 세균 식 <ol><li> 도 2를 피펫 팁으로 변환 된 한천 플레이트에서 식민지를 선택하고 멸균 좋아요 국물 (TB) 미디어 시험관에 암피실린과 클로람페니콜 항생제를 모두 포함 (표 1) 10 ㎖에 접종을 참조하십시오. 225 rpm으로 진탕 37 ° CO / N (12 ~ 16 시간)에서이 스타터 문화를 품어. </li><li> 이전 3 L 삼각 플라스크에 같은 항생제로 보충 한 L 신선한 멸균 결핵 매체에 스타터 문화 10 ㎖. 2 ~ 3 시간 동안 225 rpm으로 진탕 37 ° C에서 문화를 품어과 문화 (OD 600)의 광학 밀도를 관찰 읽기 빈 큐벳에 문화 1 ㎖를 피펫 팅에 의해 0.6-0.8에 도달했습니다. 이전 SDS-PAGE 특성화 유도에 문화 1 ㎖를 저장합니다. <ol><li> 세포 배양액의 OD (600)를 측정하기 위해, 큐벳에서 TB 매체의 1 바이알을 제조빈 측정. 별도로, 새로운 빈 베트로 문화 플라스크에서 배양 1 ㎖를 전송합니다. 600 nm의 흡광도에서의 제어에 대해 빈 분광 광도계를 사용하여 배양 물의 광학 밀도를 측정한다. </li><li> 2 분 동안 12,000 XG에 1.5 ml의 microcentrifuge 관, 원심 분리기로 문화 샘플의 1 ml에 전송하여 (이후의 SDS-PAGE 분석을위한) 샘플을 저장하고 상층 액을 가만히 따르다. </li></ol></li><li> 최종 농도 1 mM로 이소 프로필 β-D-1- 티오 갈 락토 피 라노 시드 (IPTG)를 배양을 유도하고 다른 4 시간 동안 225 rpm으로 진탕하면서 37 ℃에서 배양한다. SDS-PAGE 특성화를위한 4 시간에서 유도의 끝에서 문화 1 ㎖를 저장합니다. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에서 1 리터의 원심 분리기 병 원심 분리기에 문화를 전송하여 세포를 수확. G / ㎖ 0.5 (pH는 8.0, 1 M 트리스, 0.01 M EDTA, 0.1 M의 NaCl), 상층 액을 버린다 TEN 버퍼에 세포 펠렛을 Resuspend 무게. </li></ol> 세균 배양 4. 용해 <ol><li> -80 ° CO / N에서 다시 정지 세포 배양을 동결. 세포를 용해시키기 위해 RT 또는 얼음 수욕 냉동 세포 배양액을 해동. 해동 동안 10 μg의 / ㎖ 디옥시리보 뉴 클레아 제 I (DNase의 I), 10 μg의 / ㎖의 리보 뉴 클레아 제 A (의 RNase I) 및 50 μg의 / ㎖의 페닐 메틸 설 포닐 플루오 라이드 (PMSF)를 첨가하고, 천천히 교반하면서 용액을 균질화한다. </li><li> 모든 세포를 재현 탁하고, 해동 후에 물 12 단백질의 용해도를 증가하여 pH 9.0 용액을 조정한다. 동질적인 일관성을 달성하기 위해 얼음에 교반 현명한 6 N NaOH를 드롭을 추가합니다. 2 mm 직경 플랫 팁, 5 초 펄스를 사용하여 얼음에 20 분 동안 초음파 중단에 의해를 Lyse. </li><li> 4 ℃에서 30 분 동안 12,000 XG에 세포 용액을 원심 분리기. 나중에 정화 4 ℃에서 깨끗하고 빈 병 및 저장소에 뜨는을 전송합니다. </li><li> 한편, -80 ° C에서 TEN 완충액 재 동결 다시 세포 펠렛을 재현 탁. 에세 번에 완전한 세포 용해를 반복 동결 / 해동 및 초음파 프로세스입니다. SDS-PAGE 특성 20 μL 세포 용 해물을 저장합니다. </li></ol> 역 전환 자전거를 사용 aECM 단백질의 정제 (5) <ol><li> 단계 4.3에서 세포 용 해물을 부씩과 엘라스틴 계 단백질 (21)의 정제를 위해 사용되는 것과 유사한 ITC를 사용 aECM 단백질을 정제로 진행. 사이클 4 ° C에있는 다른 온도로 수행되며, 37 ° C ( &quot;콜드&quot;라한다)는 각각 사이클 ( &quot;웜&quot;라 함). </li><li> 4 ℃에서 2 시간 동안 40,000 XG에서 세포 50ml의 원심 분리기 병에 해물, 원심 분리를 분할합니다. 세포 펠렛의 모양은 암갈색하고 콧물 보일 것입니다. </li><li> 펠렛에서 깨끗한 분리를 얻기 위해 피펫으로 상층 액을 제거합니다. 깨끗한 병 원심 상등액을 수집하고 (3 M에서 최대) 1 M의 최종 농도의 NaCl를 추가한다. 따뜻한225 rpm으로 진탕 2 시간 동안 37 ° C의 솔루션입니다. 참고 : 염화나트륨의 추가가 aECM 원인 집계 엘라스틴 성분의 전환을 트리거합니다. 상층 액을 탁 켜집니다. 단백질 농도가 충분히 높은 경우, 흰색 거품 단백질은 원심 분리 병의 측면에서 볼 수있다. </li><li> 37 ℃에서 2 시간 동안 40,000 XG에 단계 5.3에서 뜨는을 원심 분리기. 뜨는을 가만히 따르다. 금속 주걱을 사용하여 펠렛을 분쇄 및 자기 교반 막대 및 플레이트를 이용하여 4 ℃에서 격렬히 교반 O / N와 빙냉 멸균 증류수 펠릿 비트 (50 ㎎ / ㎖)에 재현 탁. 펠렛을 완전히 용해한다. </li><li> 반복 단백질의 높은 순도를 얻기 위해 5.2 다른 3-5 회 5.4 단계를 반복합니다. </li><li> 정제의 최종 사이클 후, 4 ℃에서 증류수에 대하여 투석을하여 단백질 용액을 탈염. 물 매 4의 변화에​​ 2-3 일 동안은 물에 대한 단백질 용액을 투석시간 또는 O / N 8 시간. SDS-PAGE에 대한 정제 된 단백질의 20 μl를 저장하고 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 정제 된 단백질과 상점의 나머지 부분을 동결 건조. </li></ol> SDS-PAGE 전기 영동을 사용하여 단백질의 aECM 6. 특성화 <ol><li> (분자량이 큰 경우, 더 나은 분리를 위해 8 % SDS-PAGE 겔을 사용) 12 % SDS-PAGE 겔을 준비한다. 각 시료에 2 × SDS 로딩 버퍼를 추가 가열 샘플을 10 분 동안 100 ° C에서 실행 샘플을 겔에서 1 시간 동안 100 V 또는 aECM 단백질의 분자량에 상응하는 단백질 사다리의 중간에 도달 할 때까지 젤. </li><li> 설정 SDS-PAGE에서 젤을 검색하고 페트리 접시에 1 시간 동안 젤 잠수함하는 볼륨 쿠마에게 브릴리언트 블루 얼룩 (표 2)를 추가합니다. 로커에 5 분 동안 탈색 용액 (표 2)에 린스 젤. 탈색 솔루션을 변경하고 T의 배경까지 흔들와 젤을 destain 계속그는 젤은 분명해진다. 단백질 밴드가 명확하게 볼 수 있어야합니다. </li><li> 표적 단백질의 분자량을 결정하기 위해 단백질 래더 대해 표적 단백질의 위치를​​ 비교한다. </li><li> 상기 표적 단백질의 존재를 확인하기 위해, 단계 7과 웨스턴 블롯을 수행한다. </li></ol> 웨스턴 블로 팅을 사용하여 aECM 단백질 7. 특성 <ol><li> 아니오 염색 부 (6)에서와 같이 12 % SDS-PAGE 겔상에서 샘플을 실행. </li><li> SDS-PAGE 젤보다 약간 큰 크기로 니트로 셀룰로오스 막 잘라. 동일한 크기의 여과지 4 조각을 잘라. </li><li> 웨스턴 전송 버퍼 여과지 젖은 원피스 (20 % V / V를 메탄올, 25 mM 트리스, 190 mM의 글리신, pH를 8.3), 여과지의 다른 조각 뒤에 여과지 위에 SDS-PAGE 겔을 올려 다음, 니트로 셀룰로오스 막 및 필터 종이의 마지막 다른 두 조각. 확인 전체 셋업 충분한 서부 전송 버퍼로 침수입니다. 참고 : 단백질이 접촉시 막에 결합 수로 젤 막은이 시점에서 접촉해서는 안된다. </li><li> 니트로 셀룰로오스 막이어서 웨스턴 반건식 이송 유닛으로 두 여과지를 배치하여 니트로 셀룰로오스 막 상에 단백질을 전송하고, 신중 내에 멤브레인에 SDS-PAGE 겔을 배치, 마지막에 마지막 두 젖은 여과지를 배치 SDS-PAGE 젤. 45mA, 30 분에서 서쪽 전송을 실행합니다. 전압보다 높은 30 V. 경우 버퍼를 추가 참고 : 바람직 시도와 멤브레인의 SDS-PAGE 젤을 배치하고 단백질이 접촉시 막에 결합시킬 수 있으므로 막에 불필요하게 젤을 이동하지 마십시오. </li><li> 검색하고 RT에서 2 시간 동안 (여과지로 여과 PBS pH를 7.4에서 5 % 무 지방 우유) 차단 용액으로 니트로 셀룰로오스 멤브레인을 차단. 버퍼를 차단 폐기와 린스 PBS를 추가합니다. 참고 : 새 장갑으로 변경 원치 않는 보호 자전거와 막 오염을 방지하기 위해인. </li><li> 1 PBS에 희석 차 안티 그의 항체를 품어 : 1,000 실온에서 1 시간 동안 락을 함께. 1000 항체의 1 μL (스톡 농도 1 ㎎ / ㎖)을 추가 희석 비율 (1)과, 예를 들어, 전체 막 잠길 수있는 부피 혼합물을 제조 한 용액 전체 혼합물을 999 ㎕의 PBS로. </li><li> (0.1 % 트윈 20과 함께 PBS) PBST 5ml를 가진 막을 씻어. </li><li> 1 PBS에 희석와 말 무 퍼 옥시 다제 (HRP)에 접합 된 이차 항체와 함께 품어 : 5,000 실온에서 1 시간 동안 락을 함께. 5000 항체의 1 μL (스톡 농도 1 ㎎ / ㎖)을 추가 희석 비율 (1)과, 예를 들어, 전체 막 잠길 수있는 부피 혼합물을 제조 5 ml의 전체 혼합물에 대한 4999 μL의 PBS로. </li><li> PBST 5 mL로 막을 세척하고 두 번 반복합니다. </li><li> 멤브레인을 커버하고 사용하는 기판의 지침에 따라 부화 볼륨 막에 화학 발광 기판을 적용합니다. 참고 : 단백질 검출 기판의 감도가 다를 수 있습니다, 우리는 신호를 증가시키지 않습니다 항체 농도를 증가시 매우 낮은 신호를 최대 감도와 기판을 권장합니다. </li><li> CCD 카메라 기반 이미 저를 사용하여 화학 발광 신호를 캡처. 신호가 약한 및 비특이적 인 경우 일차 및 이차 항체의 희석 비율을 조정한다. 배경 신호가 하이 인 경우 차단 용액에 이상 인큐베이션. </li></ol>

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</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

재조합 단백질 공학은 상향식 접근을 사용하여 신규 한 단백질 물질을 생성하는 다용도 기술이다. 단백질 계 물질은 관심있는 용도에 따라, 복수의 기능을 갖도록 설계 맞추어 질 수있다. 인해 복제 및 단백질 발현을 증가시키는 기술의 발전에, 그것을 재현하고 확장 가능한 방식으로 인공 단백질의 다양성을 생성하기 위해 상대적으로 간단한 (그리고 비용 효율)이되었다. 엘라스틴 유사 도메인은 정제 태그로서 역할을 할뿐만 아니라, 기계적 특성을 부여하는 것으로, 인공 단백질의 수에 혼입되어왔다. 엘라스틴 유사 서열을 함유하는 단백질 인공 용이 비싼 정제 칼럼 및 항체에 대한 필요성을 제거 ITC을 사용하여 정제 할 수있다. 이 프로토콜은 aECM 단백질 인코딩 재조합 플라스미드를 구성하는 단계를 설명합니다. 엘라스틴 같은 반복 인코딩 유전자 구입 하였다. 용폴리펩티드처럼 엘라스틴 등 고도로 반복적 단백질 서열, 그것은 순환 방향 결찰 (RDL) 전략 22 사용될 수 있...

수십 년 동안 합성 및 천연 재료 모두 조직 공학1,2에서 골격으로 사용하기 위해 연구되어 왔습니다. 폴리머와 같은 합성 물질은 우수한 구조적 무결성과 조정 가능한 기계적 특성을 제공하지만 조직의 성장과 침투를 촉진하는 생체 활성이 충분하지 않은 경우가 많습니다. 반면, ECM(extracellular matrix) 단백질과 같은 천연 물질은 생물학적 활성이 우수하지만 batch-to-batch 변동성, 급격한 분해 및 면역원성 문제와 같은 한계가 있습니다. 이와 같이, 재조합 단백질은 천연 단백질의 바람직한 특성만을 모방하도록 설계될 수 있기 때문에 바람직합니다3,4.
재조합 단백질 공학은 새로운 인공 단백질 바이오폴리머의 설계 및 생산을 위한 다목적 플랫폼으로 널리 주목받고 있습니다. 유전자 염기서열을 제어함으로써 인공 단백질의 기능을 다양한 응용 분야에 맞게 조정할 수 있습니다5,6. 특히, 인공 세포외 기질(aECM) 단백질은 조직 공학, 재생 및 상처 복구 분야의 응용 분야를 위한 여러 기능을 갖도록 맞춤화할 수 있습니다2,7. 더 중요한 것은 클로닝 및 정제 기술의 발전으로 확장성이 향상되고 재조합 단백질 제조 비용이 크게 절감되었다는 것입니다. 낮은 생산비용으로 대량의 재조합 단백질을 생산할 수 있으며, 이는 임상에서 사용하기에 경제적이다5. 
인공 세포외 기질 단백질은 조직 공학 응용8-11을 위해 개발되었습니다. 예를 들어, Tirrell 등은 피브로넥틴 CS5 염기서열 및 엘라스틴 유사 반복(ELP-CS5)을 포함하는 인공 단백질을 사용하여 작은 직경의 혈관 이식편을 설계했습니다. 그들은 인간 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)가 이러한 물질에 부착하고 성장할 수 있음을 보여주었습니다12. 다른 사람들은 또한 피브로넥틴, 콜라겐, 라미닌, 피브리노겐 및 비트로넥틴에서 가져온 짧은 생체 활성 서열과 엘라스틴, 거미줄 및 콜라겐을 모방하는 구조 도메인을 통합하여 다양한 융합 단백질을 생성했습니다10. 엘라스틴 기반 aECM 단백질로 만든 벌크 가교 필름은 또한 천연 엘라스틴과 유사한 기계적 특성을 나타냈습니다(탄성 계수 범위는 0.3-0.6MPa)13. 그 후, 더 긴 피브로넥틴 단편을 포함하는 aECM 단백질은 인테그린 결합 친화성 증가로 인해 체외에서 상처 치유를 가속화하는 것으로 보고되었습니다8. 
최근에는 인테그린 특이적 인공 ECM 단백질이 Tjin과 동료들에 의해 개발되었다14. 각 aECM 단백질에는 라미닌-5, 콜라겐-IV 및 피브로넥틴과 같은 천연 인간 피부2,7,15의 ECM 구성 요소에서 가져온 생체 활성 세포 결합 도메인이 포함되어 있습니다. 예를 들어, 인테그린 α3Β1 은 laminin-5 alpha-3 chain globular domain 3 (LG3) 16,17에서 발견되는 PPFLMLLKGSTR 서열에 결합하는 것으로 나타났습니다. 그들의 보고서에서 그들은 1차 인간 피부 표피 각질세포가 존재하는 세포 결합 도메인의 유형에 따라 각 aECM 단백질에 결합하기 위해 서로 다른 인테그린을 우선적으로 결합한다는 것을 보여주었습니다.
Tjin 등의 연구에서 논의된 aECM 단백질은 인간 피부의 기계적 특성을 모방하는 탄력성을 부여하는 측면 엘라스틴 유사 도메인 {(VPGIG)2VPGKG(VPGIG)2}8을 포함합니다. 더하여, 엘라스틴 같이 반복되는 내의 lysine 잔류물의 혼입은 또한 수성 용매에 있는 전반적인 단백질 가용성을 증가합니다. 또한, 라이신 잔류물은 또한 가교결합된 aECM 막의 형성을 촉진하는 가교 부위 역할도 합니다12. aECM 단백질 염기서열 내에 엘라스틴 유사 반복을 포함하면 ITC(Inverse Transition Cycling)를 통해 단백질을 쉽게 정제할 수 있습니다14. 엘라스틴은 낮은 임계 용액 온도 (LCST) 또는 역 전이 온도 (Tt) 18-20으로 알려진 특정 온도에서 날카롭고 가역적인 상 전이를 겪습니다. 엘라스틴 및 엘라스틴 유사 반복은 LCST 아래에서 친수성 무작위 코일 구조를 채택하고 물에 용해되는 반면, LCST 이상에서는 엘라스틴이 미크론 크기 입자로 빠르게 응집됩니다. 이러한 상 전이는 가역적이므로 엘라스틴 기반 aECM 단백질이 ITC 기술을 통해 쉽게 정제될 수 있도록 활용될 수 있습니다21.
이 연구에서는 엘라스틴과 같은 반복에 융합된 생체 활성 세포 결합 도메인을 포함하는 인공 ECM 단백질을 설계, 구성 및 정제하는 일반화된 절차를 보고합니다. aECM 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 플라스미드를 설계하고 복제하는 공정에 대해 설명합니다. ITC를 사용하여 aECM 단백질을 정제하는 데 필요한 단계가 요약되어 있습니다. 마지막으로, SDS-PAGE 전기영동 및 웨스턴 블로팅을 사용하여 얻은 aECM 단백질의 순도를 측정하는 방법에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr>암피실린에 내성이 있는 <td>Novagen</td><td></td> <td>69744</td><td>T7 발현 벡터&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21(DE3)pLysS&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>C6060-03</td><td>추가 항생제 - 클로람페니콜</td></tr><tr><td>이소프로필-베타-D-티오갈락토시드(IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>I2481C</td><td>1M 원액(오토클레이브 물 포함)은 주입 전에 신선하게 만듭니다.</td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td>플라스미드 분리 키트</td></tr><tr><td>T4 리가제</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Affymetrix</td><td>11259</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol</td><td>Affymetrix</td><td>23660</td><td></td></tr><tr><td>Zymoclean&trade; 젤 DNA 회수 키트</td><td>Zymo Research</td><td>D4001</td><td></td></tr><tr><td>XL10-gold strain</td><td>애질런트 테크놀로지</td>스 <td>200315</td><td></td></tr></tbody></table>

설계 및 인공 세포 외 기질의 건설 (aecm) 단백질에서<em&gt; 대장균</em&gt; 피부 조직 공학

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

재조합 기술은 조정 가능한 특성을 가진 새로운 인공 단백질을 만드는 다목적 플랫폼입니다. 지난 10년 동안 자연에서 유래한 기능적 영역을 통합한(또는 새로운 단백질을 생성한) 많은 인공 단백질이 보고되었습니다. 특히, 인공 세포외 기질(aECM) 단백질이 개발되었습니다. 이러한 aECM 단백질은 피브로넥틴, 라미닌 및 콜라겐에서 가져온 생물학적 도메인으로 구성되며 엘라스틴 유사 반복, 실크 및 콜라겐 반복을 포함한 구조 도메인과 결합됩니다. 현재까지 aECM 단백질은 조직 공학 및 상처 복구에 응용하기 위해 널리 연구되어 왔습니다. 최근 Tjin과 동료들은 인간 피부 각질 세포 부착 및 증식을 촉진하도록 설계된 인테그린 특이적 aECM 단백질을 개발했습니다. 그들의 연구에서 aECM 단백질은 피브로넥틴, 라미닌-5 및 콜라겐 IV에서 가져온 세포 결합 도메인과 측면 엘라스틴 유사 반복을 통합합니다. 그들은 그들의 연구에서 개발된 aECM 단백질이 인공 피부의 기질로 사용할 수 있는 유망한 후보임을 입증했습니다. 여기에서는 이러한 aECM 단백질의 설계 및 구성과 엘라스틴의 열 반응 특성을 사용한 정제 과정을 간략하게 설명합니다.

엘라스틴 형상의 반복을 포함하는 융합 단백질을 설계에서, 전체 콘텐츠 엘라스틴, 융합 단백질 (18)의 충분한 부분을 유지하는 것이 중요하다. 이 융합 단백질 작 제물이 정제를 위해 ITC를 사용하기 위해, 그것의 엘라스틴과 같은 특성을 보유하고 있는지 확인하는 것이다. aECM 단백질 설계 및이 절에서 설명하는 순서는 특히 Tjin 등. (14)에 의해 직장에서 촬영되었다. 본 연구에서는 세 aECM 단백질은 성공적으로 pET22b (+) 발현 벡터에 클로닝 하였다. 순차 내고 먼저 엘라스틴 반복 셀 결합 도메인을 삽입하여 다음 애완 동물 벡터에 삽입 결찰 시작했다. 마지막 엘라스틴 반복의 마지막 세트는 동일한 방법을 사용하여 세포 결합 도메인의 말단에 삽입 하였다. 재조합 유전자가 성공적으로 구축 된 경우 확인하려면 각 재조합 플라스미드는 시험 37 ℃에서 3 시간 동안 XhoI에와 SalI로로 분해C.도 1은 시험 후의 ...

재조합 기술을 통해 재료 설계자는 조직 공학 응용 분야를 위한 맞춤형 기능을 가진 새로운 인공 단백질을 만들 수 있었습니다. 예를 들어, 인공 세포외 기질 단백질은 네이티브 ECM에서 파생된 구조 및 생물학적 도메인을 통합하도록 설계할 수 있습니다. 여기에서는 엘라스틴 유사 반복을 포함하는 aECM 단백질의 구성 및 정제에 대해 설명합니다.

설계 및 인공 세포 외 기질의 건설 (aECM) 단백질에서<em&gt; 대장균</em&gt; 피부 조직 공학

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

이 절차의 전반적인 목적은 엘라스틴 유사 반복 서열을 포함하는 인공 ECM 단백질 또는 A ECM의 구축 및 생산 과정을 보여주는 것입니다. 이는 먼저 A ECM 단백질을 인코딩하는 재조합 유전자를 구축함으로써 수행됩니다. 그 다음, 이 재조합 유전자를 박테리아 숙주에 삽입합니다.이 단계에서 재조합 단백질이 박테리아 숙주에서 발현되며, 세포 용해를 통한 단백질 추출 후 수확됩니다. 마지막 단계는 역전이 사이클링 또는 ITC를 사용하여 단백질을 정제하는 것이며, 이는 엘라스틴과 같은 폴리펩타이드의 고유한 상전이 특성을 이용합니다.원심분리 사이클은 4°C와 37°C에서 수행합니다. 최종적으로, 재조합 단백질을 확인하고 순도를 측정하기 위해 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯 기술이 사용됩니다. 친화성 컬럼과 같은 기존 방법보다 이 기술이 갖는 주요 장점은 상대적으로 저렴한 비용으로 다량의 단백질을 추출할 수 있다는 점입니다.텍스트 프로토콜에 기술된 모든 라이게이션 설계가 완료된 상태에서 이 절차를 시작하십시오. 올리고머가 확보되면, DNA 올리고머를 어닐링하여 원하는 유전자 서열을 얻습니다. 먼저 DNA 올리고뉴클레오타이드를 DNA 올리고 버퍼에 녹여 최종 농도가 1 µg/µL가 되도록 합니다.각 올리고뉴클레오타이드 4 µL를 32 µL의 DNA 및 어닐링 버퍼에 첨가하여 총 40 µL의 혼합물을 만듭니다. 그런 다음 핫플레이트를 사용하여 비커의 물을 끓이고 혼합물을 5분 동안 담급니다. 95 °C에서 비커를 꺼내고 스티로폼 박스에서 하룻밤 동안 전체 장치를 서서히 냉각시키면, 올리고머가 어닐링되어 소화 준비가 완료됩니다.본문 프로토콜의 제한효소 처리 단계(Protocol Digest)에 기술된 대로, al oligomer와 호스트 벡터를 각각 소화시키기 위해 해당 제한효소를 첨가하고 37°C에서 3~4시간 동안 반응시킵니다. 아가로스 겔 전기영동을 통해 소화 생성물을 확인하고 DNA를 정제한 후, T4 ligase를 사용하여 소화된 DNA insert를 플라스미드 벡터에 연결함으로써 목적 유전자를 순차적으로 결합합니다. 본문 프로토콜의 레시피에 따라 연결 혼합물을 실온에서 2시간 동안 배양합니다.다음으로, Ali의 방식에 따라 열 충격(heat shock)을 이용하여 세포를 형질전환합니다. 50 µL의 컴피턴트 세포(competent cells)를 깨끗하고 미리 냉각된 마이크로 원심분리 튜브에 분주합니다. 라이게이션 혼합물 5 µL를 세포에 넣고, 부드럽게 파이펫팅하여 섞어줍니다.혼합물을 얼음 위에 20분 동안 둡니다. 그런 다음 세포 혼합물이 들어 있는 마이크로 원심분리 튜브를 42 °C 항온수조에 2분 동안 담근 후, 다시 얼음 위에 2분 동안 둡니다. 마이크로 원심분리 튜브에 SOC 배지 500 µL를 추가하고 37 °C에서 1시간 동안 진탕 배양합니다.배양 후, 세포 결합 혼합물 50-500 µL를 실온으로 미리 데워둔 ampicillin 함유 2X YT 고체 배지에 도말합니다. 플레이트를 뒤집은 상태로 37 °C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 다음 날, 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 고체 배지에서 DNA 콜로니를 채취합니다.ampicillin이 포함된 2배 농도의 YT 배지 5 mL에서 콜로니를 37 °C로 하룻밤 동안 진탕 배양합니다. 다음 날, 제조사의 프로토콜에 따라 플라스미드 분리 키트를 사용하여 각 콜로니에서 DNA 플라스미드를 추출합니다.텍스트 프로토콜에 설명된 대로 재조합 플라스미드를 박테리아 발현 숙주에 형질전환한 후, 50 µL의 물로 DNA 용출물을 회수합니다. 형질전환된 아가 플레이트에서 피펫 팁으로 콜로니를 선택하여 접종합니다. 앰피실린과 클로람페니콜 항생제가 모두 포함된 10 mL의 멸균 TB 배지(terrific broth)가 담긴 시험관에 접종합니다.이 스타터 배양액을 37 °C에서 225 RPM으로 흔들어주며 하룻밤 동안 배양하십시오. 그런 다음, 동일한 항생제가 첨가된 3L 얼렌메이어 플라스크 내의 1L 멸균된 신선한 TB 배지로 스타터 배양액 10 mL를 옮기십시오.배양액을 37 °C에서 225 RPM으로 흔들어 2~3시간 동안 배양합니다. 1 mL의 배양액을 빈 큐벳에 옮겨 측정하여, 600 nm에서의 광학 밀도(OD₆₀₀)가 0.6~0.8에 도달했는지 확인합니다. 그다음, IPTG를 최종 농도 1 mM이 되도록 첨가하여 배양액을 유도하고, 37 °C에서 225 RPM으로 흔들어 4시간 더 배양합니다.배양액을 1L 원심분리 병으로 옮긴 후 4°C에서 12,000 Gs로 30분 동안 원심분리하여 세포를 회수합니다. 상층액을 제거한 후 세포 펠렛의 무게를 측정하고 10 buffer를 사용하여 0.5 g/mL 농도로 재현탁합니다. 재현탁된 세포 배양물을 -80°C에서 하룻밤 동안 냉동 보관합니다.다음 날, 냉동된 세포 배양물을 실온의 항온수조 또는 얼음 위에서 해동합니다. 세포 L에 deoxy ribonuclease one, ribonuclease a 및 phenyl methyl suen fluoride를 첨가합니다. 용액을 해동하는 동안 천천히 저어주어 용액을 균질화합니다.재현탁된 모든 세포의 해동이 완료되면, 용액의 pH를 9.0으로 조절하여 단백질의 수용성 용해도를 매우 신중하게 높입니다. 얼음 위에서 교반하며 6N 수산화나트륨을 한 방울씩 첨가하여 균질한 상태가 되도록 합니다. 그런 다음, 직경 2mm의 플랫 팁을 사용하여 5초 간격의 펄스로 얼음 위에서 20분 동안 초음파 파쇄기로 세포를 용해합니다.세포 용액을 4°C에서 12,000 Gs로 30분 동안 원심분리하십시오. 상층액을 깨끗한 빈 병에 옮겨 담고, 이후 정제를 위해 4°C에서 보관하십시오. 그동안 세포 펠렛을 버퍼 10 µL로 다시 현탁하고, 세포 용해물 20 µL를 따로 보관하십시오.SDS page 특성 분석을 위해, 재현탁된 세포 펠릿을 -80°C에서 다시 동결시켜 세포 용해를 완료합니다. 동결-해동 및 초음파 처리 과정을 최대 3회까지 반복합니다. 앞서 얻은 세포 용해물을 모아 고염 조건에서 서로 다른 온도로 원심분리 사이클을 수행하는 ITC를 사용하여 A ECM 단백질을 정제합니다.세포 용해물을 50 milliliter 원심분리 튜브에 나누어 담고, 4°C에서 40,000 Gs로 2시간 동안 원심분리합니다. 피펫팅을 통해 상층액을 제거하여 펠렛과 깨끗하게 분리합니다. 상층액을 깨끗한 원심분리 튜브에 수집하고 염화나트륨을 최종 농도가 1 M이 되도록 첨가합니다.용액을 37 °C에서 225 RPM으로 흔들어주며 2시간 동안 가온합니다. 그다음, 상층액을 37 °C에서 40,000 G로 2시간 동안 원심분리합니다.상층액을 따라낸 후, 금속 스패튤라를 사용하여 펠릿을 으깨고 얼음 위에서 펠릿 조각들을 재현탁합니다. 마그네틱 바와 플레이트를 사용하여 4°C에서 밤새 격렬하게 교반하며 멸균 증류수에 펠릿이 완전히 용해될 때까지 둡니다. 37°C에서 펠릿이 하얗게 될 때까지 이 과정을 반복하며, 이 시점에서 밤새 물에 녹인 후 원심분리합니다.단백질 용액을 얻기 위해, 정제된 단백질 20 µL를 SDS page용으로 남겨둔 후, 4 °C에서 증류수를 이용하여 단백질 용액을 투석하여 염을 제거합니다. 이때 물은 4시간마다 또는 하룻밤 동안 8시간마다 교체하며 2~3일간 진행합니다. 나머지 정제된 단백질은 여기에 표시된 대로 동결 건조합니다. 유도된 시료의 예측 분자량 위치에서 강한 단백질 밴드가 확인됩니다. 또한, laminin five A ECM에 해당하는 22 kDa 분자량의 정제 단백질 시료가 포함된 SDS page 겔이 제시되어 있습니다.A ECM 단백질의 추정 순도는 약 90에서 95%입니다. 이 수치는 SDS 겔 상에 나타난 표적 단백질과 다른 단백질 밴드의 강도 비율을 비교하여 도출되었습니다. 마지막으로, 정제된 단백질이 실제로 A ECM 단백질인지 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅을 수행하였습니다. 세 가지 A ECM 단백질의 단백질 순도를 SDS page 겔로 나타내었으며, 이를 웨스턴 블롯팅용 니트로셀룰로오스 막의 이미지와 비교하여 보여주었습니다.분석 결과, 서양고추냉이 peroxidase가 접합된 항-hexa histidine tag 항체를 사용하여 표지한 표적 단백질 collagen four A ECM 및 laminate five A ECM의 존재가 확인되었습니다. A ECM 단백질의 최종 수율은 60 milligrams per liter에서 120 milligrams per liter 사이였습니다. 이 영상을 시청한 후, 특정 응용 분야를 위해 elastin light 도메인을 포함하는 단백질을 구축하고 정제하는 방법에 대해 충분히 이해하게 될 것입니다.

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연구

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Bioengineering

생명공학

이 비디오는 전기 분무에 의한 세포 외 기질 유래 마이크로캐리어 제조 절차를 보여줍니다. 이러한 마이크로캐리어는 네이티브 조직 특이적 미세환경을 시뮬레이션하며 장기 3D 체외 세포 배양 모델에서 안정적입니다.

전기분무에 의한 바이오스캐폴드 제작: 탈세포화된 조직의 세포외 기질에서 파생된 마이크로캐리어 스캐폴드를 생성하는 기술

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이 프로토콜의 목표는 재생 비 계 임 플 란 트의 일환으로 전 임상 평가 위한 적당 한 상처 복구에 대 한 대상 전체 기질 섬유의 생산입니다. 이러한 섬유는 빈 섬유 막에 섬유 아 세포의 문화에 의해 생성 하 고 세포 막의 해체에 의해 추출.

희생 빈 섬유 막 세포 배양을 통해 기질 섬유의 생산

본 프로토콜은 인간 유도만능 줄기 세포에서 유래한 심혈관 세포를 포함하는 메쉬 모양의 엔지니어링 된 심장 조직을 생성하여 심장 질환에 대한 세포 이식 요법의 조사를 허용합니다.

생체 내 심근 수리를 위한 인간 iPS 세포에서 파생된 메쉬 모양의 조작된 심장 조직의 준비

라만 분광법은 비 접촉에 적합한 기술, 살아있는 세포, 조직 - 엔지니어링 구조와 기본 조직의 라벨이없는 분석입니다. 소스 고유의 스펙트럼 지문가 생성 및 복수 변수 분석을 사용하여 분석할 수 있습니다.

라만 분광학을 사용하여 세포와 세포외 기질의 비 접촉, 레이블이없는 모니터링

배우세요 인공 세포 외 기질(aECM) 단백질의 설계 및 정제 방법을 대장균(E. coli)에서 발현시키는 기술입니다. ITC 정제법을 활용한 이 프로토콜은 조직 공학 연구에 활용됩니다.

설계 및 인공 세포 외 기질의 건설 (aECM) 단백질에서

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