설계 및 인공 세포 외 기질의 건설 (aECM) 단백질에서 대장균 피부 조직 공학

이 절차의 전반적인 목표는 엘라스틴과 같은 반복을 함유하는 인공 ECM 단백질 또는 ECM의 구성 및 생산과 관련된 단계를 입증하는 것입니다. 이는 먼저 A ECM 단백질을 암호화하는 재조합 유전자를 구축함으로써 달성됩니다. 다음으로, 재조합 유전자를 박테리아 숙주에 삽입합니다.

이 시점에서 재조합 단백질은 박테리아 숙주에서 발현된 다음 세포 용해를 통해 단백질을 추출한 후 수확됩니다. 마지막 단계는 엘라스틴의 고유한 상전이 거동을 활용하는 역전이 주기(ITC)를 사용하여 단백질을 정제하는 것입니다. 폴리펩티드처럼.

원심분리 주기는 섭씨 4도와 37도에서 수행됩니다. 궁극적으로, 겔 전기영동과 웨스턴 블롯 기술은 재조합 단백질을 식별하고 그 순도를 결정하는 데 사용됩니다. 친화도 컬럼과 같은 기존 방법에 비해 이 기술의 주요 장점은 비교적 저렴하게 많은 양의 단백질을 추출할 수 있다는 것입니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 모든 인대 설계로 이 절차를 시작합니다. 올리고머가 얻어지면 DNA 올리고머를 anil하여 원하는 유전자 염기서열을 얻습니다. 먼저 DNA 올리고 완충액에 DNA 올리고뉴클레오티드를 마이크로리터당 1마이크로그램의 최종 농도로 용해합니다.

32마이크로리터의 DNA와 무릎 꿇기 완충액에 각 모든 인대 4마이크로리터를 추가하여 총 40마이크로리터 혼합물을 얻습니다. 그런 다음 핫 플레이트를 사용하여 비커에 물을 끓이고 혼합물을 5분 동안 담급니다. 섭씨 95도에서 비커를 제거하고 스티로폼 상자에서 하룻밤 동안 전체 설정을 서서히 식히면 올리고머가 이제 무릎을 꿇고 소화할 준비가 됩니다.

해당 제한 효소를 첨가하여 al oligomers 및 host vector를 각각 분해하며, Protocol Digest 텍스트에 설명된 대로 섭씨 37도에서 3-4시간 동안 분해합니다. 아가로스 겔에서 분해 산물을 실행하고 DNA를 정제한 후, 분해된 DNA 삽입물을 T 4 리가제와 플라스미드 벡터에 결찰하여 관심 유전자를 순차적으로 결합합니다. 텍스트 프로토콜에 있는 레시피를 사용하여 ligation mixture를 실온에서 2시간 동안 배양합니다.

다음으로, Ali의 열 충격을 사용하여 세포를 변형시킵니다. 50마이크로리터의 유능한 세포를 깨끗하고 미리 냉각된 마이크로 원심분리기 튜브에 넣습니다. 5마이크로리터의 결찰 혼합물을 세포에 피펫팅하고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다.

혼합물을 얼음에 20분 동안 그대로 두십시오. 그런 다음 세포 혼합물이 들어 있는 마이크로 원심분리기 튜브를 섭씨 42도의 수조에 2분 동안 담그고 다시 얼음에 2분 동안 담근다. 마이크로 원심분리기 튜브에 500마이크로리터의 SOC 매체를 추가하고 섭씨 37도에서 1시간 동안 흔들면서 배양합니다.

배양 후, 50-500 마이크로리터의 세포 결찰 혼합물을 실온으로 예열된 암피실린이 들어 있는 2배 YT 오거 플레이트에 펴 바릅니다. 하룻밤 동안 섭씨 37도에서 접시를 거꾸로 배양합니다. 다음 날, 깨끗한 피펫 팁을 사용하여 오거 플레이트에서 DNA 콜로니를 선택합니다.

식민지를 2 번씩 5 밀리리터로 성장시킵니다. 암피실린을 함유한 YT 배지를 섭씨 37도에서 하룻밤 동안 떨어뜨리고 다음날 흔들었습니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 plasmid isolation kit를 사용하여 각 colony에 대한 DNA plasmid를 추출합니다.

텍스트 프로토콜에 설명된 대로 재조합 플라스미드를 박테리아 발현 숙주로 변형시킨 후 50마이크로리터의 물로 DNA를 추출했습니다. 변형된 오거 플레이트에서 피펫 팁이 접종된 콜로니를 선택합니다. 시험관에 암피실린과 클로람페니콜 항생제가 모두 함유된 10밀리리터의 멸균 수프 또는 결핵 매체.

이 스타터 배양물을 섭씨 37도에서 225RPM으로 흔들면서 밤새 배양합니다. 그런 다음 10ml의 스타터 배양액을 1리터의 신선한 멸균 TB 배지로 옮깁니다. 3리터 erlin Meyer 플라스크에 동일한 항생제가 첨가되었습니다.

섭씨 37도에서 225 RRP M에서 2-3시간 동안 진탕하면서 배양합니다. 600 나노미터 또는 OD 600에서 배양물의 광학 밀도를 관찰하여 판독을 위해 빈 Q 수의사에 1ml의 배양물을 피펫팅하여 0.6 - 0.8에 도달했는지 확인합니다. 다음으로, IPTG로 배양을 최종 농도 1밀리몰로 유도하고 섭씨 37도에서 225RPM으로 진탕하면서 다시 4시간 동안 배양합니다.

배양물을 1리터 원심분리기, 병에 옮기고 섭씨 4도에서 30분 동안 000Gs로 원심분리하여 세포를 수확합니다. 상등액을 버린 후 세포 펠릿의 무게를 측정하고 밀리리터당 0.5g으로 10 완충액에 재현탁합니다. 재현탁된 세포 배양액을 섭씨 영하 80도에서 하룻밤 동안 동결합니다.

다음날 냉동 세포 배양액을 실온의 수조 또는 얼음 위에서 해동합니다. L에 세포는 deoxy ribonuclease, 하나의 ribonuclease a 및 phenyl methyl suen fluoride를 추가합니다. 용액을 해동하는 동안 천천히 교반하여 용액을 균질화하십시오.

모든 재현 유탁 세포가 해동 된 후 용액을 pH 9.0으로 조정하여 매우 조심스럽게 물에 대한 단백질 용해도를 높입니다. 6 개의 N 수산화 나트륨을 얼음에서 저어 가면서 적가하여 균일 한 일관성을 얻습니다. 그런 다음 얼음 위에서 20분 동안 초음파 파괴로 세포를 이가 나고, 2mm 직경의 평평한 팁과 5초 펄스를 사용합니다.

세포 해결책을 12, 4 섭씨 온도에 30 분 동안 000 GS에 원심 분리하십시오. 슈퍼네이트를 깨끗하고 빈 병에 옮기고 나중에 정화할 수 있도록 섭씨 4도에서 보관합니다. 한편, 10 버퍼로 세포 펠렛을 다시 현탁시키고 세포 용해물 20 마이크로 리터를 절약하십시오.

SDS 페이지 특성 분석을 위해 재현탁 세포 펠릿을 섭씨 영하 80도에서 재동결하여 세포 용해를 완료합니다. 동결, 해동 및 초음파 처리 과정을 최대 3 번까지 반복합니다. 이전의 세포 용해물을 정렬하고 ITC를 사용하여 A ECM 단백질을 정제합니다.이 경우 원심분리 주기는 높은 염분 조건에서 서로 다른 온도에서 수행됩니다.

세포 용해물을 50 밀리리터 원심분리기, 병 및 40, 4°C에서 2시간 동안 000G로 원심분리기로 나눕니다. 펠릿에서 깨끗한 분리를 얻기 위해 피펫팅으로 상층액을 제거합니다. 깨끗한 원심분리기 병에 상층액을 모으고 염화나트륨을 최종 농도 1대금치까지 첨가합니다.

용액을 섭씨 37도까지 225RPM으로 흔들면서 2시간 동안 예열합니다. 다음 원심분리기. 40, 37 섭씨 온도에서 2 시간 동안 000 Gs의 상등액.

디캔팅 후, 상등액은 금속 주걱을 사용하여 펠릿을 분쇄하고 펠릿 비트를 얼음에 다시 현탁시킵니다. 펠릿이 완전히 용해될 때까지 자기 교반 막대와 플레이트를 사용하여 섭씨 4도에서 밤새 격렬하게 교반하면서 증류수를 차가운 오토클레이브합니다. 섭씨 37도의 펠릿이 흰색이 될 때까지 이 과정을 반복하며, 이 시점에서 하룻밤 동안 물에 용해되어 원심분리할 수 있습니다.

단백질 해결책을 얻기 위하여는, 4 섭씨 온도에 증류수에 대하여 그것을 투석해서 단백질 해결책을 desalt, SDS 페이지를 위한 순화된 단백질의 20 마이크로리터를 저장한 후에 2 3 일 동안 2 3 일 동안 밤새도록 매 4 시간 또는 8 시간마다 물을 바꾸십시오 여기에서 보이는 것과 같이 순화된 단백질의 나머지를 동결 건조하십시오. 강렬한 단백질 띠는 유도된 샘플에서 예측된 분자량에 있습니다. 또한 laminin five A ECM에 해당하는 22 kilodaltons의 분자량을 가진 정제 단백질 샘플을 포함하는 SDS 페이지 젤이 표시됩니다.

A ECM 단백질의 추정된 순수성은 대략 90에서 95%입니다이 가치는 SDS 젤에 존재하는 표적 단백질 및 다른 단백질 띠의 띠 강렬의 비율을 비교해서 파생되었습니다. 마지막으로, 정제된 단백질이 실제로 A ECM 단백질인지 확인하기 위해 여기에서 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 수행했습니다. 3개의 A ECM 단백질의 단백질 순도는 SDS 페이지 겔로 표시되며 웨스턴 블로팅을 위한 니트로셀룰로오스 멤브레인의 이미지와 비교됩니다.

이 분석은 말 무 과산화효소와 접합된 안티 헥사 히스티딘 태그 항체를 사용하여 태그가 지정된 표적 단백질 콜라겐 4 A ECM 및 라미네이트 5 A ECM의 존재를 보여줍니다. A ECM 단백질의 최종 수율은 리터당 60밀리그램에서 리터당 120밀리그램 사이였습니다. 이 비디오를 시청한 후에는 특정 응용 분야에서 엘라스틴 광 도메인을 포함하는 단백질을 수축하고 정제하는 방법을 잘 이해하게 될 것입니다.