Name: 모터 엔드 플레이트 함께 근육 주사 : 직접 모터 뉴런에 셔틀 트레이서에 대한 최소 침습 접근 (동영상) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: 배우세요 척수 운동신경에 최소 침습적 셔틀 트레이서 주사법을 모터 엔드 플레이트와 함께 근육에 적용하는 방법입니다. 이 기법은 신경해부학 연구와 신경근육 기능 장애 치료 개발에 활용됩니다.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

이 작품은 RM에 국민 건강 및 의료 연구 센터 (NHMRC) 프로젝트 연구비 지원

여기에 설명 된 모든 실험 절차는 UNSW 호주의 동물 관리 및 윤리위원회 준수하고 국민 건강과 동물 실험에 대한 의학 연구위원회 (Medical Research Council) 호주의 규정에 따라 수행되었다. 이 프로토콜의 모든 절차는 적절한 동물 관리 및 윤리위원회의 요구에 따라 수행되어야한다. 1. 아세틸 콜린 에스 테라 제 조직 화학 염색 <ol><li> 아세틸 콜린 에스 테라 제의 반응 혼합물을 제조 <ol><li> 0.1 M 인산 완충액 (PB)에 200 ml의 아세틸 티오 콜린 요오다 이드 290 mg을 추가. 900 rpm에서 교반기로 섞는다. </li><li> 연속 교반 글리신 600 mg을 추가합니다. </li><li> 생성물이 완전히 용해 될 때까지 천천히 교반하면서 연속 반응 액에 황산구리 420 mg을 추가. </li></ol></li><li> 동물 시체의 피부를 제거 절개를하여 (조직의 공유를 통해 얻은)관류 쥐 또는 마우스의 피부, 목 지역으로부터 피부를 잡고 그 다리를지나 당겨에. 각 근육을 덮고있는 근막을 제거하거나 크게 반응 용액에 근육 섬유의 충분한 노출을 보장하기 위해 천공 중 하나입니다 있는지 확인합니다. </li><li> 반응 혼합물에 몸 전체 또는 관심의 다리를 담그고 4 ° C에서 O / N을 품어. </li><li> 증류수에 2 분 동안 시체를 씻으십시오. 주의 :이 단계에서는, 근육 청색 착색 모터 엔드 플레이트 (MEP들)이 하얀 점으로 볼 수있다 나타낸다. </li><li> 3 ~ 5 초 동안 10 % 암모늄 황화물의 용액에 시체를 노출. 참고 : 근육 섬유가 빠르게 갈색으로 바뀝니다과 유럽 의회 의원이 검은 얼룩 점으로 관찰 할 수있을 것입니다. 반응을 너무 빠르게 발생하여, 근육 섬유는 황화 암모늄 용액 (예, 5 %)의 낮은 농도를 사용하여 시도 MEP들 및 근섬유 구분할 너무 어둡게 염색하는 경우. 반응 시간을 얻을유럽​​ 의회 의원과 근육 섬유 사이의 최적의 대비가 하나의 샘플에서 다른 다릅니다. 그러므로 시약 정확한 노출 시간을 정의하는 것은 곤란하다. 반응은 밀접하게 모니터링과 대비가 적절한 것으로 간주 할 때 중지해야합니다. </li><li> 증류수에 교반, 시체 두 번 세척하고 부드럽게 시체 건조 두드려. </li><li> 사진 관심의 모든 근육에 대한 유럽 의회 의원이 캡처되는 것을 보장 사지의 외측과 내측 측면 모두. </li></ol> 2. 근육 주사 모터 엔드 플레이트에서 <ol><li> 마이크로 피펫 풀러와 유리 마이크로 피펫을 당겨 (플런저와 등급 Micropipette과의 사용 권장). 해부 현미경의 도움으로, 마이크로 피펫의 루멘의 내부 직경이 약 0.5 mm가되도록 포셉 쌍 마이크로 피펫의 선단을 깰. </li><li> 사용 된 모든 수술기구 갓 멸균 및 제되어 있는지 확인외과 영역에서 멸균입니다. </li><li> 플루오로 - 골드 (증류수에 5 %)와 마이크로 피펫을 채 웁니다. </li><li> 이소 플루오 란 (2 O 4 %)을 유도 챔버에 동물을 유도 anaesthetise. 반사를 바로 잡고 있는지 확인하고 유도 실에서 제거하기 전에이 없음을 확인합니다. 쥐의 주둥이를 통해 코 콘을 안전하고 마취의 유지 보수를위한 이소 플루오 란을 (O 2의 2 %) 제공합니다. 동물의 발가락을 꼬집어 부드럽게 페달 철수와 각막 반사가 모두없는 것을 확인하기 위해 동물의 눈을 누릅니다. 주 : 케타민과 xylazil의 혼합물도 사용될 수있다 (80 및 10 mg을 / kg 각각 복강 내 전달). 케타민은 일정 8 ( &quot;통제&quot;) 약물 및 준수되어야 할 것이다 약물의 구매, 사용, 저장 및 폐기와 관련된 필요한 프로토콜입니다. </li><li> 절차의 과정 동안 눈의 건조를 방지하기 위해 눈의 윤활유를 적용. </li><li> T 쉐이브argeted 사지 사용 거즈 세 클로르헥시딘의 교류 스크럽 70 % 알코올로 면도 부위를 닦아합니다. 수술 영역으로 동물을 전송합니다. </li><li> 깨끗한 underpad에 동물을 배치하고 대상 근육 (들)에 좋은 접근을 보장하기 위해 적절하게 배치합니다. </li><li> 멀리 기본 근육에서 대상 근육을 통해 피부를 들어 올려 수술 가위로 피부 절개를 만들기 위해 치아 그립 포셉 한 쌍을 사용합니다. 절개가 완전히 관심의 근육 (들)을 노출 할 수있을만큼 충분히 큰지 확인합니다. 근막에 미치는 영향을 최소화이 있는지 확인하십시오. </li><li> 정신적으로 근육 (들)에 MEP 지역의 위치와 모양을 바꾸어하는 MEP 사진을 사용합니다. 참고 : 좋은 느낌 마커가 관심의 근육 (들)에 사진에서 MEP 영역을 재현하는 데 도움 수 있습니다. </li><li> 각 S 1-2 μL의 3 ~ 4 주사, 플루오로 - 금 (MEP 지역의 전체 길이를 따라 여러 주사를 수행hould) 충분하다. 부드럽게 어떤 누출을 제거하는 근육 (들)을 닦으십시오. </li><li> 가깝게 무딘 집게로 절개 피부의 두 끝을 가져와 수술 클립 상처를 닫습니다. 상처의 전체 기간에 따라 0.1 ml의 부피 바카 인 (물 0.5 %) (또는 다른 국소 마취제)을 침투. </li><li> 오프 마취 기계의 전원을 켜고 완전히 마취에서 회복되는 때까지 동물을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 내 근육 주사의 관리 및 동물의 관류 사이에 14 일 동안 기다립니다. </li></ol> 3. 관류 <ol><li> 복강 주사에 의해 동물에게 (150 ㎎ / ㎏ 예 Lethabarb) 펜토 바르비 나트륨 용액의 치사량을 투여. <ol><li> 페달 금단의 부재 및 각막 반사에 의해 확인 된 바와 같이 마취 깊은 레벨에 도달 할 때까지 동물을 밀접하게 감시한다. </li></ol></li><li> perfusio에 둔 해부 보드의 뒷면에있는 동물의 위치를N 싱크. </li><li> 흉골의 기반을 덮고있는 피부를 들어 올려 치아 그립 포셉 한 쌍을 사용합니다. 바로 흉골 아래 강한 수술 가위와 작은 피부 절개를 한 후 그립 흉골의 칼 모양의 연골을 집게를 사용합니다. 칼 모양의 연골을 누른 상태에서 겨드랑이에 흉골에서, 흉강의 양면에 절개를 확대. </li><li> 마음을 노출 다이어프램을 잘라. <ol><li> 혈액의 응고를 방지하기 위해 직접 심장의 정점에 헤파린의 0.ml을 주입한다. </li><li> 좌심실에 캐 뉼러의 삽입을 허용하는 정점을 차단하고 신속 haemostat의 도움으로 장소에 캐 뉼러를 클램프. </li><li> 미세 가위로 오른쪽 아트리움에 절개를 즉시 연동 펌프를 시작합니다. 아트리움에서 흐르는 액체가 혈액의 거의 무료이며 간장의 색이 밝은 갈색이 될 때까지 0.1 M PB로 관류. 이어서, SOLU으로 관류동물의 몸 전체까지 파라 포름 알데히드 (0.1 M PB의 4 %)의 기 경질된다. </li></ol></li></ol> 4. 경추 척수 해부 및 조직학 준비 <ol><li> 복부에 동물의 시체를 놓습니다. </li><li> 메스와 신체의 정중선에서 피부를 잘라 장골의 수준으로 두개골의 기지에서 그것을 반영한다. </li><li> 을 극복하고 척추의 등 부분을 노출 척추 주위 근육을 반영합니다. </li><li> 아틀라스, 두 번째 자궁 세그먼트 (즉, C2)의 뼈 극돌기를 식별하고 대응하는 기본 등의 루트를 찾기 위해 수술 rongeurs이나 집게 한 쌍을 제거합니다. <ol><li> 영구 펠트 마커로 색칠하여 오른쪽 (C2) 루트를 확인합니다. </li><li> 하나 다음 척추를 제거하고 교류 색상 (즉, C2는, C4가, C6 및 C8은 녹색과 C3에 색 수와 오른쪽 지느러미 뿌리를 표시, C5는 C7은 T1이 COL 될 수 있습니다OR 연산 파란색). </li></ol></li><li> 작은 외과 용 바늘을 사용하여 (예를 들어, 30 게이지 바늘 G)를 부드럽게 관통 척수의 하단부를 덮는 경질 내지. 종 방향 슬릿을 만들기 위해 rostrally 바늘을 이동하는 동안이 위를 향하도록 바늘의 베벨으로, 코드에서 멀리 경질을 들어 올립니다. <ol><li> 경질을 반영한다. </li></ol></li><li> 새로운 메스 블레이드 단면 또는 두 개의 세그먼트 블록으로 척수의 횡 방향으로 잘라. <ol><li> 신중 개의 인접한 뿌리 사이 메스 블레이드 반쯤 각 블록의 좌측에 작은 기준 마크를 위해선, 각각의 블록에 대해, 인 시츄 척수 세그먼트두고. 블록의 복부 측면에서 볼 수 있도록로 기준 마크가 조직을 통해 충분히 깊은 있는지 확인하십시오. 다음 해부 조직 세그먼트의 배향을 돕기 위해, 동물의 해부에 대해 전방 또는 후방 중 하나를 가리키는, 약 45 °의 각도에서 기준 마크를 확인. </li></ol></li><li> 파라 포름 알데히드 (0.1 M PB 4 %)의 용액을 포함하는 작은, 명확하게 표시된 병에 개별 블록을 수집하고 RT O / N에 둡니다. </li><li> 수크로오스 (0.1 M PB 30 %)의 용액을 함유하는 깨끗한 병에 명확히 표시된 블록을 전송하고 적어도 이틀 동안 4 ℃에서 보관. </li><li> 극저온 금형의 세그먼트를 놓고 조직 동결 매체로 덮여. 길이 방향의 조직 학적 준비를 들어,이 위를 향 등의 측면과 블록의 방향 및 극저온 금형의 블록 방향을 기준 마크를 사용합니다. </li><li> -20 ℃에서 냉동 - 금형을 동결하고 50 μm의 두께 섹션에서 저온 유지 장치로 절단. 주 : 단면에 직접 부착 현미경 슬라이드 상에 장착 및 / N을 O 건조 남아있을 수있다. 대안 적으로, 섹션 0.1 M PB 가득 48- 웰 플레이트에 부유 할 수 있고,이어서 슬라이드 조직 절편 방향을 기준 마크를 사용하여 장착. </li></ol> 5. 요추 공동RD 해부 및 조직학 준비 <ol><li> 가 돌아왔다에 동물의 시체를 놓습니다. </li><li> 동물의 복부를 따라 중간 선 절개를 수행하고 내장을 제거합니다. 척추의 복부 측면을 노출 후부 복부 벽의 근육을 해부하다. </li><li> T13 복부 루트 뼈를 종료 짧은 꼬리 가장 리브와 인접 T13 척추를 찾습니다. <ol><li> 연속 (T13)에 의해 두 개 또는 세 개의 척추 주동이을 하나를 제거 (즉, T12, T11 및 필요한 경우, T10) 미세 수술 rongeurs와는 ​​복부 코드의 복부 측면에있는 항목의 점까지 T13 복부 루트를 따라와 영구 펠트 마커를 표시합니다. </li><li> 이 시점부터, 교호 컬러로 채색, L1, L2, L3, L4, L5, L6 및 S1에 대한 복부 루트 엔트리 포인트의 위치를​​ 식별하기 위해 동일한 절차를 반복한다. </li></ol></li><li> 4.5-4.10 LUM 절에 설명 된 것과 동일한 절차를 따라척수 해부 바. </li></ol>

<ol><li>Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+Viral+Delivery+of+IGF-1+Prolongs+Survival+in+a+Mouse+ALS+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model.</a> Science. 301 (5634), (2003).</li>
<li>Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riluzole+slows+the+progression+of+neuromuscular+dysfunction+in+the+wobbler+mouse+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).</li>
<li>Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+motor+neuron+deficiency+enhances+progression+in+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).</li>
<li>Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+mutant+transgenic+mice+develop+features+of+ALS+and+frontotemporal+lobar+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).</li>
<li>Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+delivery+to+muscles+of+mdx+mice+using+lentiviral+vectors+leads+to+myogenic+progenitor+targeting+and+stable+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression.</a> Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).</li>
<li>Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+rodent+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11(2011).</li>
<li>Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).</li>
<li>Garrett, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DYNC1H1+mutation+alters+transport+kinetics+and+ERK1%2F2-cFos+signalling+in+a+mouse+model+of+distal+spinal+muscular+atrophy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy).</a> Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).</li>
<li>Bordet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+cardiotrophin-1+adenoviral+gene+transfer+on+neuromuscular+degeneration+in+transgenic+ALS+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice).</a> Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).</li>
<li>Acsadi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+survival+and+function+of+SOD1+mice+after+glial+cell-derived+neurotrophic+factor+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).</li>
<li>Azzouz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+delivery+with+retrogradely+transported+lentivector+prolongs+survival+in+a+mouse+ALS+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model.</a> Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).</li>
<li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+muscle+delivery+of+GDNF+with+human+mesenchymal+stem+cells+improves+motor+neuron+survival+and+function+in+a+rat+model+of+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS.</a> Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).</li>
<li>Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+scAAV9-SMN+Injection+Mediates+Widespread+Gene+Delivery+to+the+Spinal+Cord+and+Decreases+Disease+Severity+in+SMA+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice.</a> Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).</li>
<li>Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+motoneuron+survival+and+improved+neuromuscular+function+in+transgenic+ALS+mice+after+intraspinal+injection+of+an+adeno-associated+virus+encoding+Bcl-2%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2.</a> Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).</li>
<li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain Res. 1185, 256-265 (2007).</li>
<li>Schnapp, B. J., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+is+the+motor+for+retrograde+axonal+transport+of+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).</li>
<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Motor+Toolbox+for+Intracellular+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li>
<li>Schiavo, G., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+Alternative+energy+for+neuronal+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: Alternative energy for neuronal motors.</a> Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).</li>
<li>Gracies, J. -M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+Toxin+Dilution+and+Endplate+Targeting+in+Spasticity.+A+Double-Blind+Controlled+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Phys+Med+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study.</a> Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).</li>
<li>Van Campenhout, A., Molenaers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+motor+endplate+zone+in+human+skeletal+muscles+of+the+lower+limb%3A+anatomical+guidelines+for+injection+with+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin.</a> Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).</li>
<li>Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+characterization+of+the+motor+neuron+columns+supplying+the+rat+forelimb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb.</a> Neuroscience. 200, 19-30 (2012).</li>
<li>Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+full+length+of+the+motor+end+plate+regions+in+the+mouse+forelimb+increases+the+uptake+of+fluoro-gold+into+corresponding+spinal+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons.</a> Front Neurol. 4, 58(2013).</li>
<li>Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+motor+end+plates+in+the+mouse+hindlimb+gives+access+to+a+greater+number+of+spinal+cord+motor+neurons%3A+an+approach+to+maximize+retrograde+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport.</a> Neuroscience. 274, 318-330 (2014).</li>
<li>Baumgartner, B. J., Shine, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+of+spinal+motoneurons+following+targeted+transduction+with+an+adenoviral+vector+carrying+the+gene+for+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor.</a> Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).</li>
<li>Gransee, H. M., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+TrkB+receptor+to+phrenic+motoneurons+enhances+functional+recovery+of+rhythmic+phrenic+activity+after+cervical+spinal+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection.</a> PLoS ONE. 8 (5), e64755(2013).</li>
</ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

근육 타겟팅 및 신경 근육 상태의 실험적인 치료에 해당하는 α 운동 신경에 치료 유전자의 후속 역행 전송은 새로운 전략이 아니다. 예를 들어, 이러한 전달 방법은 SOD1의 마우스 및 래트에서 1,9-12 ALS 진행의 다른 단계에서뿐만 아니라 SMA 13 마우스에서 신경 근육 퇴행을 지연시키기 위해 사용되어왔다. 유망한 동안, 이러한 유전자 치료 시나리오의 효능은 제한되었다. 이러한 관점에서, 우리는 척수 운동 뉴런에 의한 도입 유전자의 흡수는 근섬유의 모터 단부 판의 선택적 타겟팅함으로써 개선 될 수 있음을 제안한다. 이는 전술 한 연구에서, 바이러스 벡터의 근육 내 주사가 표적 근육 MEP 영역의 위치에 대한 참조없이 수행 된 것을 주목하는 것이 중요하다. 모터의 단부 판 분포의 고객 분석을 통하여뒷다리와 앞다리의 (유럽 의회 의원)는 몇 가지 원칙이 등장했다. 먼저, MEP 영역은 근육의 전체 폭에 걸쳐있는. 또한, MEP들 일관...

이러한 운동 신경 질환과 같은 신경 학적 조건에서 결과 spinal- 자발적인 운동뿐만 아니라 뒤센 근위축증 제어의 손실 영향을받는 개인의 일상 생활에 높고 오래 지속 영향을 쇠약 상태이다. 지난 10 년간, 중지 또는 적어도 이러한 신경 근육 질환의 해로운 영향을 지연하는 것을 목표로 연구 노력은 세계의 많은 의사와 과학자에 대한 우선 순위왔다. 이와 관련하여,이 신경 근육 질환을 모방 동물 모델의 최근의 발전은 이러한 조건 1-13의 발생과 진행을 기초로 생리적 인 메커니즘 근본적인 통찰력을 구하는 수단이되어왔다. 이들 신경 근육 질환의 치료는 척수에 직접 액세스를 필요로하며, 척수 주사 14,15 의해 달성 될 수있다. 유전자 치료의 최근 발전은 또한 상단의 가로 무늬 근육을 타겟으로하고척수 1,9-13의 복부 경적 내에 위치 대응 α 운동 신경 셔틀 치료 유전자 낮은 사지. 그러나, 일단이 유망한 전략은 이들 신경의 조건의 결과를 개선하지 못했다. 그것은 이러한 불량한 결과가 될 수 있다고 결론 공정 동안, 적어도 부분적으로, 이러한 보호 유전자의 낮은 효율에 기인 한 이러한 유전자 전달 방법의 낮은 효능을 배제 할 수 없다. 모터 엔드 플레이트 (유럽 의회 의원)는 운동 신경을 α에서 발생하는 대형 주변 모터 섬유의 축삭 터미널로 들여 골격 myofibres의 전문 영역입니다. 함께, 말초 신경 섬유 종말과 유럽 의회 의원은 즉, 신경 근육 접합부, 시냅스 자극이 신경 전달 물질의 선행 성 릴리스, 아세틸 콜린에 의해 트리거하는 사이트를 형성한다. 중요한 것은, 말초 신경 섬유 및 MEP들 사이의 관계를 임시 저장 양방향이고적인는 다른 모터뿐만 아니라 멀리 신경 세포에서 대한 분자와 세포 기관의 수송을 담당하지만, 16-18 인 somata. 이러한 해부학 적 고려 사항에 비추어, 유럽 의회 의원은 해당 운동 신경에 전달 및 유전 물질의 후속 역행 전송을 위해 선택의 대상이 될 것으로 보인다. 이러한 맥락에서, 운동 신경 전달의 성공은 크게 바이러스 벡터 및 근육의 MEP들 19-20의 근육 내 주사 사이의 거리에 의존한다는 놀라운 일이 아니다. 그러나 놀랍게도, 실험실 쥐 및 마우스에 myofibres MEP 영역의 정확한 위치는, 선택의 두 종의 신경 근육 질환 모델, 최근까지 사용할 수 없었다. 우리는 쥐와 마우스 21-22 여러 앞다리 근육의 MEP 지역의 종합적인지도를 제작했다. 최근에, 우리는 MEP (R)의 조직의 세부 사항을 보여 주었다마우스 뒷다리 (23)의 여러 근육 egion 우리는 현재 쥐의 뒷다리에있는 유럽 의회 의원의 기능을 분석하고 있습니다. 우리의 손에, 이러한 근육의 전체 MEP 영역에 관한 역행 추적자의 근육 내 주사는 이전에보고 된 것보다 더 많은 척수 세그먼트에 걸쳐있다 더 레이블 모터 뉴런에 상승했다. 여기에서 우리는 외부 표면 상에뿐만 아니라 뒷다리의 깊이에 걸쳐 최저 소비 효율을 표시 위치 및 마우스와 래트 모두에서 근육 앞다리은 지난 몇 년 동안 개발 된 프로토콜을 제시한다.

<table><tbody><tr><td>Fluoro-Gold</td><td>Fluorochrome, LLC</td><td>Nil</td><td>5%Drummond</td></tr> <tr><td>PCR Micropipets 1-10 &micro로 희석; l</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td>플런저 포함</td></tr><tr><td>아세틸 티오 콜린 요오드 시</td><td>그마 생명 과학</td><td>A5751-25G</td><td></td></tr><tr><td>구리 (II) 황산염 무수</td><td>시그마 - 알드리치</td><td>61230-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek OCT 화합물</td><td>Sakura Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>글리신</td><td>Ajax Finechem</td><td>1083-500G</td><td></td></tr><tr><td>덱스트란, 테트라메틸로다민 및 비오</td>틴 <td>Life Technologies</td><td>D-3312</td><td>증류수에 건조</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Provet</td><td>ISOF00</td><td>1000 mg/g 이소플루란 흡입 증기</td></tr><tr><td>Autoclip 9mm 상처 클립</td><td>Texas Scientific Instruments, LLC</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Lethabarb Enthanasia Injection</td><td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td><td></td><td></td>LETHA450</tr><tr><td>포름알데히드 용액</td><td>Ajax Finechem</td><td>A809-2.5L PL</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus 유리 슬라이드</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>황화암모</td>늄 <td>Sigma-Aldrich</td><td>A1952</td><td>10%로 희석</td></tr><tr><td>Marcain Spinal 0.5%(Bupivacaine hydrochloride)</td><td>Astrazenca</td><td></td><td>0.25%로 희석</td></tr></tbody></table>

모터 엔드 플레이트 함께 근육 주사 : 직접 모터 뉴런에 셔틀 트레이서에 대한 최소 침습 접근

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

척수 운동 뉴런의 무결성에 영향을주는 질환은 신경 쇠약 상태 사이. 지난 수십 년 동안, 이들 신경 근육 질환의 여러 동물 모델의 개발을 지연 시키거나 이러한 상태의 진행을 역전 겨냥한 다른 치료 시나리오와 과학계를 제공했다. 뉴런의 역행 기계 활용함으로써, 이러한 접근 중 하나는 척수 운동 뉴런에 대응하는 셔틀 치료 유전자 순서 골격근을 대상으로하고있다. 일단 유망하지만, 이러한 유전자 전달 방법의 성공은 지금까지 수득 보였다 형질 운동 뉴런의 차선 수에 의해 방해되어왔다. 모터 엔드 플레이트 (MEP들)는 운동 뉴런 α 척수 직접 시냅스 접촉 골격 근육에 고도의 전문 영역이다. 이와 관련하여,이 점에 유의하는 것이 중요하다 지금까지 노력하는 역행운동 뉴런에 전사 유전자 표적 근육 MEP 영역의 위치를​​ 참조하지 않고 제조 하였다. 여기에서는 간단한 프로토콜 1) 골격근의 표면상의 최저 소비 효율 정확한 위치를 드러내 2) 운동 뉴런으로 근육 내 전달 및 역행 트레이서 후속 최적 역행 수송을 안내하기 위해이 정보를 사용을 설명한다. 우리는 유럽 의회 의원의 타겟팅을 통해 척수의 운동 신경 세포에 치료 유전자의 역행 전송 조사에 더 많은 연구에서 이러한 추적 실험의 결과를 활용할 수 있도록 노력하겠습니다.

아세틸 콜린 에스 테라 조직 화학적 염색은 근육의 폭을 가로 지르는 운동 단부 판의 위치를 알 수있다. (1) 전체의 래트 앞다리 수행 이러한 염색의 결과를 도시한다. 그것은 암모늄 황화물 용액의 농도를 최적화하기 위해 제안된다 (예., 5~7% 대신 10 %)뿐만 아니라 시편 용액에 침지하는 시간은 근육 섬유에 비특이적 백그라운드 염색이 너무이면 과도한.도 2는 마우스 상완 삼두근 근육 모터 엔드 플레이트 영역의 길이를 따라 역행 신경 추적자 주사 후 경추 척수 표지 운동 뉴런의 열을 도시한다. 역행 표지 운동 뉴런은 전형적. 척수의 여러 세그먼트를 가로 질러 연장하는 종 방향 열을 형성하는 3 SEL 통해 얻은 표지 척수 운동 뉴런의 상이한 수를 도시한다상완 삼두근에 모터 엔드 플레이트 영역 표적화 ective 플루오 골드. MEP 영역의 특정 구획 타겟팅 ...

근육 내 흡수 및 해당 운동 뉴런으로의 분자 역행 수송의 효능은 모터 엔드 플레이트(MEP)에 대한 주입 부위의 위치에 따라 달라집니다. 여기에서는 운동 뉴런으로의 추적자의 역행 수송을 최적화하기 위해 골격근에서 MEP를 찾는 방법을 설명합니다.

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

다음 실험의 전반적인 목적은 근육 내 주사 후 척수 운동 뉴런으로 향하는 신경 해부학적 추적자의 역행성 수송 효능을 높이는 것입니다. 이는 모의 표적 조직에서 아세틸콜린에스테라제 조직화학 반응을 유도하여 동물 근육 내 운동 종판의 위치를 식별함으로써 달성됩니다. 두 번째 단계에서는 운동 종판 영역의 전체 범위에 걸쳐 역행성 추적자의 근육 내 주사를 수행합니다.관심 근육에 투여한 후, 추적자가 척수까지 운반될 수 있도록 동물을 14일 동안 유지합니다. 운동 종판 영역의 전체 길이를 최종적으로 목표로 하는 운동 신경세포는 형광 현미경으로 관찰했을 때 설치류 척수의 여러 분절에 걸쳐 뻗어 있는 더 많은 표지된 운동 신경세포를 생성합니다. 본 연구의 함의는 척수 손상 및 근위축성 측삭 경화증을 포함한 신경근 기능 장애 치료법 개발로 확장됩니다.이 방법은 최소 침습적인 방식이며, 따라서 척수 및 운동 뉴런에 치료 유전자를 전달하는 임상적으로 유의미한 방법입니다. 일반적으로 이 방법에 익숙하지 않은 연구자는 살아있는 동물의 근육 내에서 운동 종판(motor endplate) 영역을 시각화할 수 없기 때문에 어려움을 겪을 수 있습니다. 근육 내 주사는 운동 종판의 위치를 근육 위로 정신적으로 전이시켜 생각해야 하므로, 이 기술의 시각적 시연이 매우 중요합니다. 근육 내 주사를 위한 운동 종판 지도를 제작하려면, 먼저 피부를 제거한 표본이나 해당 사지를 반응 혼합액에 담가 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하십시오. 다음 날 아침, 사체를 증류수로 2분 동안 세척하십시오.이 단계에서 근육은 파란색을 띠며 운동 종판(motor end plates)은 흰색 점으로 나타납니다. 사체를 황화암모늄에 담근 후 세 번 세척하고, 사지를 닦아 건조시킨 뒤 MEP 영역을 검출하고, 대조도를 분석하여 운동 종판 부위의 살아있는 근육에 주입합니다. 먼저, 마이크로피펫 풀러를 사용하여 플런저가 장착된 단계별 유리 마이크로피펫을 제작합니다. 다음으로, 해부 현미경을 사용하여 핀셋으로 마이크로피펫의 팁을 부러뜨려 각 루멘의 내경이 약 0.5 millimeters가 되도록 합니다.그런 다음 풀 피펫에 flora gold를 채웁니다. 이제 마취된 동물에게 안구 윤활제를 도포하고 주사할 부위의 털을 깎습니다. 거즈를 사용하여 클로르헥시딘과 70% alcohol로 깎은 부위를 세 번 번갈아 가며 닦아냅니다.그런 다음 동물을 깨끗한 언더패드 위에 올려 표적 근육

intramuscular-injections-along-motor-end-plates-minimally-invasive

Research

연구

JoVE Journal

Neuroscience

신경과학

이 문서에서는, 우리는 50 μm의 루멘과 유리 모세관 바늘을하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 크게, 뇌 손상을 감소 약물의 수동적 확산을 최소화하고 쥐 두뇌에 정확한 타겟팅을 수 있습니다.

마약, 바이러스성 벡터, 또는 세포 이식 전달 Microinjections 깊은 뇌 구조의 타겟팅

신경 전구체 이식은 보호 및 / 또는 척수 상해 (SCI)과 모터 신경 장애, amyotrophic 패스 경화증 (ALS)에 분실 / 역기능 자궁 phrenic 모터 뉴런을 교체 유망 전략이다. 우리는 ALS와 SCI의 쥐 모델에서 자궁 경부 척수 복부 혼까지 셀 전송을위한 프로토콜을 제공합니다.

루게릭병과 외상 척수 상해에서 자궁암 복부 호른를 타겟팅하는 Intraspinal 세포 이식

우리는 제공 추적기에 대한 실질적인 가이드를...

멀티 컬러의 신경 회로 지형을 공개

출처: Mohan, R.,  et al. 운동 종판을 따라 근육 주사: 추적자를 운동 뉴런으로 직접 셔틀하는 최소 침습적 접근 방식. J. Vis. 경험. (2015년)이 비디오는 모터 종판(MEP)에서 근육 주사를 통해 형광 뉴런 추적자를 운동 뉴런으로 표적으로 전달하는 방법을 보여줍니다. 쥐를 준비하고, 추적자를 주입하고, 신경 치료 잠재력에 대해 표지된 운동 뉴런을 평가하는 것과 관련된 단계를 간략하게 설명합니다.

운동 종판을 따라 근육 주사를 통해 추적자를 쥐 운동 뉴런으로 직접 셔틀

Transsynaptic tracing은 다중 시냅스 회로를 통해 주변 대상을 조절하는 중심 원심성을 분석하기 위한 강력한 도구가 되었습니다. 여기에서는 시냅스경이 횡단하는 광견병 바이러스를 활용하여 기능적인 뇌 회로를 식별하고 국소화하는 프로토콜을 제시한 다음, 식별된 뉴런 그룹 간의 회로에서 특정 연결을 검증하기 위한 고전적인 요로 추적 기술을 제시합니다.

Transsynaptic는 콜레라 독소와 바이오틴 덱스 트란 아민 두 번 라벨로 이어 (僞) 바이러스에 주변 대상에서 추적

이 보고서는 짧은 지속 가벼운 마취 쥐의 요추 척수의 siRNA의 지역화 된 형질에 대한 막내 바늘 구멍의 간단하고 빠른 방법을 설명합니다.

마우스의 빠른 비 침습 요추 경 막내 주사를 통해 생체 siRNA의 형질과 척수에있는 유전자 넉다운에

병리학적 조건에서 뇌 재구성을 연구하기 위해 우리는 혈액 뇌 장벽을 우회하여 뇌로 단백질을 직접 전달하기 위해 미량삼투압 펌프를 사용했습니다. 그런 다음 단백질의 영향으로 뇌 연결성의 변화를 연구하기 위해 요로 추적자를 주입합니다.

Miniosmotic의 주입 펌프 및 요로의 트레이서의 배달 병태 생리 학적 조건에서 뇌 조직 개편을 연구에

이 프로토콜에서는 쥐 척수 조직으로 retrogradely 운송할 수 있는 바이러스 성 벡터의 주입을 보여 줍니다. 벡터는 시 냅 스에서 찍은 이며 대상 뉴런의 세포 체에 이송. 이 모델은 중요 한 척추 경로 또는 유전자 치료 응용 프로그램에 대 한 대상 셀의 역행 추적에 적합 합니다.

직접 분사 Lentiviral 벡터의 하이라이트 쥐 척수에서 여러 모터 통로

트랜스제닉 형광 마우스를 사용하여, 살아있는 동물에서 무손상 좌골 신경의 운동 및 감각 축삭 내 엔도솜 및 미토콘드리아의 신호전달의 생체내 축삭 수송을 평가하기 위해 상세한 프로토콜이 기술된다.

축삭 수송의 생체 내 이미징을위한 툴킷 확장

이 글에서는 성체 마우스에서 CNS 표적 치료제의 테스칼 내 전달 방법을 자세히 설명하며, 프로토콜의 정확성과 반복 주사 허용에 중점을 둡니다. 이 연구에는 안티센스 올리고뉴클레오타이드가 SOD1-ALS 모델 마우스에서 돌연변이 SOD1 발현을 감소시킨 검증 연구 결과가 포함되어 있어, 신경퇴행성 질환 전임상 연구에서 이 접근법의 유용성을 뒷받침합니다.

SOD1-ASO의 요추 수막내 주사, 인간 SOD1-G93A ALS 마우스에서 정밀한 중추신경계 표적 지정과 예측 효능을 위한 방법

배우세요 척수 운동신경에 최소 침습적 셔틀 트레이서 주사법을 모터 엔드 플레이트와 함께 근육에 적용하는 방법입니다. 이 기법은 신경해부학 연구와 신경근육 기능 장애 치료 개발에 활용됩니다.

모터 엔드 플레이트 함께 근육 주사 : 직접 모터 뉴런에 셔틀 트레이서에 대한 최소 침습 접근

더 많은 동영상 탐색